CN116836896A - 一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂及其制备方法，属于微生物技术领域。本发明菌剂包含复合微生物菌液和微生物菌剂载体。本发明筛选得到一株枯草芽孢杆菌，与副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌组成复合功能微生物菌剂，对于棉花枯萎病具有明显的防治效果；并使用菌菇渣为原料制备菌剂载体，对于微生物提供保护作用，保证微生物持续稳定的发挥作用，从而减少菌剂的使用量，经济效益显著。

Description

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂及其制备方法

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂及其制备方法。

背景技术

棉花枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的真菌性病害，在世界各地普遍发生，严重危害棉花生产。该病的致病机制是病原菌侵染棉花维管束等部位，堵塞导管，阻滞水分和养分运输，并产生毒素，影响棉花的新陈代谢，导致死苗、枯叶、落蕾、减产、纤维品质劣变等危害。

目前防治棉花枯萎病的主要方法有药物防治、科学的田间管理、选用抗病品种以及生物防治。这些方法有各自的优点和局限。化学药剂在棉花病害防治中有一定的作用，在棉花枯萎病的防治中应用也比较广泛。通常在播种前用稀释的抗菌剂402药液或多菌灵胶悬剂浸种，以达到杀灭病原菌的目的。常见的杀菌农药有多菌灵、甲基托布津、56％醚菌酯百菌清、41％聚砹嘧霉胺、克黄枯、20％硅唑咪鲜胺、枯黄基因素、棉花三清等。化学药剂用于零星病区的病株和局部土壤处理效果较显著。然而，化学药剂毒性较大，且绝大多数药剂都易挥发，农药经过口、吸呼道或直接接触而大量进入施药人体内，易引起急性中毒。且绝大多数化学药都具有致癌、致畸、致突变的性质，农药进入食物链后，会在各级生物体内积累，严重危害人和动物的健康。

科学的田间管理包括轮作、秋耕深翻、合理密植、及时清除病苗等方法。但受到种植习惯和自然环境的影响，轮作在推广应用时存在一定困难，且枯萎病菌在土壤中存活的时间较长，短期轮作达不到明显的防治效果，长期轮作又不容易实施。秋耕深翻和合理密植等田间管理方法均无法彻底杀灭病原菌，对棉花枯萎病的防治作用有限。

使用抗病品种是一种经济有效的防病措施，目前应用比较广泛。但抗病品种的选育周期较长，研发成本较高；有些品种抗性尚不能满足生产需要；棉花枯萎病菌易变异，存在致病力分化的现象，当大面积栽培单一抗病品种时，存在抗病性丧失的风险。

与上述防治相比，生物防治具有专一性强、安全性高、环境友好等优点。例如，中国专利申请CN202210041121.5，其公开了一种用于防治棉花枯萎病的微生物有机肥，其包括以下重量份数的原料：鲜鸡粪80-120份；桃树叶粉、百部粉和樟脑粉混合物4-6份；鸡蛋壳粉14-16份；改性麦饭石粉9-11份；魔芋粉12-14份；微生物发酵液24-26份；胍胶12-13份；海藻酸钠12-13份；硼酸12-13份和过磷酸钙15-17份。然而目前的生物防治手段，多采用与各类营养物质组合的方式，成分复杂，菌种活性低稳定性差，根本无法针对性的防治，防治效果也比较差，加之成分复杂，制造成本和使用成本居高不下，很难真正落地应用。

因此如何开发一种成分简单、并对棉花枯萎病有高效防治效果的生物防治方法是目前亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的问题，提供一种菌种简单并可高效针对性防治棉花枯萎病的微生物菌剂。

为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂，所述菌剂包含复合微生物菌液和微生物菌剂载体。

进一步的，所述复合微生物菌液包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、副地衣芽孢杆菌（ Bacillus paralicheniformis）以及环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）。

更进一步的，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的保藏编号为CGMCCNo.27647，申请人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年6月16日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明枯草芽孢杆菌为发明人于2022年在山东省临沂市临沭县某农业示范园白菜根围土壤中分离得到。

分离方法：采用5点取样法，取根围土壤后分别装入灭菌的容器中，将土样7g加入50mL无菌水中，200r/min下于摇床振荡培养2h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于LB平板上，于28-30℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

平板对峙法：选取培养2d的棉花枯萎病菌菌饼(直径5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼15mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照。28-30℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

生物学特性：革兰氏阴性菌，杆状，菌体大小：长2-3μm、宽0.8-0.9μm，产芽孢、芽孢中生至偏端生。菌落圆形，表面光滑，不透明，边缘完整。

所述副地衣芽孢杆菌（ Bacillus paralicheniformis）的保藏编号为CGMCCNo.1.15832，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2016年9月20日；所述环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）的保藏编号为CGMCCNo.1.8819，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年10月21日。所述副地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心订购流程开放购买。

更进一步的，所述复合微生物菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌三种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到1×10⁹-2×10⁹CFU/ml，得到三种菌的菌悬液，再将三种菌的菌悬液按照体积比1:1:1混合，得到复合微生物菌液。

更进一步的，所述LB培养基的组成为：酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0；并蒸汽高温121℃灭菌20min。

所述磷酸盐缓冲液为市售产品，也可自行配制，配制方法为：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可得。

进一步的，所述微生物菌剂载体为生物炭，具体制备方法为：将菌菇渣晾干后粉碎，使用质量浓度为10-20%的盐酸浸没菌菇渣，浸泡1-2h后，水洗到中性，干燥；再将5g干燥好的菌菇渣粉末、5g氯化锌、5g氯化铁分散于100mL去离子水中，搅拌混合均匀后，加入碳酸氢钠，调节体系pH为9-10，持续搅拌30min后，过滤，并用水冲洗固体产物1-3次，最后将固体产物密封后置于真空马弗炉中，在500-600℃氮气下限氧碳化1-2h，得到生物炭。

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)复合微生物菌液的制备；

(2)微生物菌剂载体的制备；

(3)将复合微生物菌液按照固液比10mL:10g加入微生物菌剂载体，进行充分吸附，再进行干燥后，得到终产品。

本发明微生物菌剂的使用方法为：在播种时，施用菌剂，施用剂量为1kg/亩-3kg/亩。

本发明微生物菌剂对于棉花枯萎病致病菌尖孢镰刀菌具有良好的防控作用，同时可以促进棉花生长，提升产量。

有益效果：（1）本发明筛选得到一株枯草芽孢杆菌，与副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌组成复合功能微生物菌剂，三者等比例组合后，存在协同增效的作用，可产生酚类、黄酮类、生物碱类等生物活性物质，这些物质具有直接杀菌的作用，对于棉花根部致病菌具有良好的抑制作用，特别是对于棉花枯萎病具有明显的防治效果；同时，可有效提升棉花抗性，提升其产量和品质；三种功能菌株为细菌组合，细菌培养时间较短，培养效率优于真菌；另外，细菌较之真菌，对复杂恶劣环境的耐受能力更强，在实际土壤根际环境中的适应性更强；

（2）本发明使用菌菇渣为原料制备菌剂载体，经过氯化锌和氯化铁的混合改性，氯化锌在高温下汽化，形成大量不规则的空隙结构，更利于微生物的负载，于此同时，形成的四氧化三铁粒子生物炭表面附着，磁性颗粒的存在，利于微生物的固定和吸附，对于微生物提供保护作用，保证微生物持续稳定的发挥作用，从而减少菌剂的使用量；

（3）本发明菌剂在土壤中会形成优势菌群，迅速占领植物体上一切可能被病原物侵染的位点，竞争枯黄萎病原菌的营养和氧气，使得其无处生存；同时可增加植物体内吲哚乙酸、乙烯等生长调节素的生成，增强根尖活力、促进作物的生长发育，间接的提高作物的抗病性。

附图说明

图1为本发明实施例1-3以及对比例2-4所得复合微生物菌液对于尖孢镰刀菌的平板对峙实验图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。

实施例1

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂，所述菌剂包含复合微生物菌液和微生物菌剂载体。

所述复合微生物菌液包括枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌。

所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27647，申请人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年6月16日。

枯草芽孢杆菌为发明人于2022年在山东省临沂市临沭县某农业示范园白菜根围土壤中分离得到。

分离方法：采用5点取样法取根围土壤后分别装入灭菌的容器中，将土样7g加入50mL无菌水中，200r/min下于摇床振荡培养2h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于LB平板上，于28-30℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

平板对峙法：选取培养2d的棉花枯萎病菌菌饼(直径5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼15mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照。28-30℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为枯草芽孢杆菌。

生物学特性：革兰氏阴性菌，杆状，菌体大小：长2-3μm、宽0.8-0.9μm，产芽孢、芽孢中生至偏端生。菌落圆形，表面光滑，不透明，边缘完整。

所述副地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.15832，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2016年9月20日；所述环状芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.8819，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年10月21日。所述副地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心订购流程开放购买。

所述复合微生物菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌三种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到1×10⁹CFU/ml，得到三种菌的菌悬液，再将三种菌的菌悬液按照体积比1:1:1混合，得到复合微生物菌液。

所述LB培养基的组成为：酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0；并蒸汽高温121℃灭菌20min。

所述磷酸盐缓冲液为市售产品，也可自行配制，配制方法为：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可得。

所述微生物菌剂载体为生物炭，具体制备方法为：将菌菇渣晾干后粉碎，使用质量浓度为10%的盐酸浸没菌菇渣，浸泡1h后，水洗到中性，干燥；再将5g干燥好的菌菇渣粉末、5g氯化锌、5g氯化铁分散于100mL去离子水中，搅拌混合均匀后，加入碳酸氢钠，调节体系pH为9-10，持续搅拌30min后，过滤，并用水冲洗固体产物1次，最后将固体产物密封后置于真空马弗炉中，在500℃氮气下限氧碳化1h，得到生物炭。

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)复合微生物菌液的制备；

(2)微生物菌剂载体的制备；

(3)将复合微生物菌液按照固液比10mL:10g加入微生物菌剂载体，进行充分吸附，再进行干燥后，得到终产品。

实施例2

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂，所述菌剂包含复合微生物菌液和微生物菌剂载体。

所述复合微生物菌液包括枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌。

所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27647，申请人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年6月16日。

枯草芽孢杆菌为发明人于2022年在山东省临沂市临沭县某农业示范园白菜根围土壤中分离得到。

分离方法：采用5点取样法取根围土壤后分别装入灭菌的容器中，将土样7g加入50mL无菌水中，200r/min下于摇床振荡培养2h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于LB平板上，于28-30℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

平板对峙法：选取培养2d的棉花枯萎病菌菌饼(直径5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼15mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照。28-30℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为枯草芽孢杆菌。

生物学特性：革兰氏阴性菌，杆状，菌体大小：长2-3μm、宽0.8-0.9μm，产芽孢、芽孢中生至偏端生。菌落圆形，表面光滑，不透明，边缘完整。

所述副地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.15832，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2016年9月20日；所述环状芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.8819，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年10月21日。所述副地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心订购流程开放购买。

所述复合微生物菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌三种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到1.5×10⁹CFU/ml，得到三种菌的菌悬液，再将三种菌的菌悬液按照体积比1:1:1混合，得到复合微生物菌液。

所述LB培养基的组成为：酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0；并蒸汽高温121℃灭菌20min。

所述磷酸盐缓冲液为市售产品，也可自行配制，配制方法为：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可得。

所述微生物菌剂载体为生物炭，具体制备方法为：将菌菇渣晾干后粉碎，使用质量浓度为15%的盐酸浸没菌菇渣，浸泡1.5h后，水洗到中性，干燥；再将5g干燥好的菌菇渣粉末、5g氯化锌、5g氯化铁分散于100mL去离子水中，搅拌混合均匀后，加入碳酸氢钠，调节体系pH为9-10，持续搅拌30min后，过滤，并用水冲洗固体产物2次，最后将固体产物密封后置于真空马弗炉中，在550℃氮气下限氧碳化1.5h，得到生物炭。

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

(1)复合微生物菌液的制备；

(2)微生物菌剂载体的制备；

(3)将复合微生物菌液按照固液比10mL:10g加入微生物菌剂载体，进行充分吸附，再进行干燥后，得到终产品。

实施例3

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂，所述菌剂包含复合微生物菌液和微生物菌剂载体。

所述复合微生物菌液包括枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌。

所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.27647，申请人保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2023年6月16日。

枯草芽孢杆菌为发明人于2022年在山东省临沂市临沭县某农业示范园白菜根围土壤中分离得到。

分离方法：采用5点取样法取根围土壤后分别装入灭菌的容器中，将土样7g加入50mL无菌水中，200r/min下于摇床振荡培养2h后，使用无菌纱布过滤得悬浮液并采用10倍系列稀释法得到10倍稀释液。分别取100μL稀释液均匀涂布于LB平板上，于28-30℃恒温培养箱中培养48h后，挑取颜色、光泽度、大小和类型不同的单菌落，划线纯化菌株，统一编号后转入LB斜面培养基中，用80％灭菌甘油保存，置于-70℃保存备用。

平板对峙法：选取培养2d的棉花枯萎病菌菌饼(直径5mm)置于PDA平板中央，在距离菌饼15mm处呈三点对称的3个点打孔(直径5mm)并注入100μL供试菌株的发酵培养液，以加入100μLNB为对照。28-30℃恒温培养48h后，观察和测量抑菌带的大小，实验重复三次，选出抑菌圈最大的菌株，即为枯草芽孢杆菌。

生物学特性：革兰氏阴性菌，杆状，菌体大小：长2-3μm、宽0.8-0.9μm，产芽孢、芽孢中生至偏端生。菌落圆形，表面光滑，不透明，边缘完整。

所述副地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.15832，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2016年9月20日；所述环状芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.1.8819，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，原始保藏日期为2008年10月21日。所述副地衣芽孢杆菌和环状芽孢杆菌均可通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心订购流程开放购买。

所述复合微生物菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌三种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到2×10⁹CFU/ml，得到三种菌的菌悬液，再将三种菌的菌悬液按照体积比1:1:1混合，得到复合微生物菌液。

所述LB培养基的组成为：酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0；并蒸汽高温121℃灭菌20min。

所述磷酸盐缓冲液为市售产品，也可自行配制，配制方法为：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可得。

所述微生物菌剂载体为生物炭，具体制备方法为：将菌菇渣晾干后粉碎，使用质量浓度为20%的盐酸浸没菌菇渣，浸泡2h后，水洗到中性，干燥；再将5g干燥好的菌菇渣粉末、5g氯化锌、5g氯化铁分散于100mL去离子水中，搅拌混合均匀后，加入碳酸氢钠，调节体系pH为9-10，持续搅拌30min后，过滤，并用水冲洗固体产物3次，最后将固体产物密封后置于真空马弗炉中，在600℃氮气下限氧碳化2h，得到生物炭。

一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂的制备方法，包括以下制备步骤：

（1）复合微生物菌液的制备；

（2）微生物菌剂载体的制备；

（3）将复合微生物菌液按照固液比10mL:10g加入微生物菌剂载体，进行充分吸附，再进行干燥后，得到终产品。

对比例1

本对比例，除了在微生物菌剂载体的制备过程中不使用氯化锌和氯化铁改性外，其余原料和制备方法均同实施例3。具体为：

微生物菌剂载体为生物炭，具体制备方法为：将菌菇渣晾干后粉碎，使用质量浓度为20%的盐酸浸没菌菇渣，浸泡2h后，水洗到中性，干燥；再将5g干燥好的菌菇渣粉末分散于100mL去离子水中，搅拌混合均匀后，加入碳酸氢钠，调节体系pH为9-10，持续搅拌30min后，过滤，并用水冲洗固体产物3次，最后将固体产物密封后置于真空马弗炉中，在600℃氮气下限氧碳化2h，得到生物炭。

对比例2

本对比例，除了在复合微生物菌液制备中不添加枯草芽孢杆菌外，其余原料和制备方法均同实施例3。具体为：

复合微生物菌液的制备方法为：将副地衣芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌两种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到2×10⁹CFU/ml，得到两种菌的菌悬液，再将两种菌的菌悬液按照体积比1:1混合，得到复合微生物菌液。

对比例3

本对比例，除了在复合微生物菌液制备中不添加副地衣芽孢杆菌外，其余原料和制备方法均同实施例3。具体为：

复合微生物菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌以及环状芽孢杆菌两种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到2×10⁹CFU/ml，得到两种菌的菌悬液，再将两种菌的菌悬液按照体积比1:1混合，得到复合微生物菌液。

对比例4

本对比例，除了在复合微生物菌液制备中不添加环状芽孢杆菌外，其余原料和制备方法均同实施例3。具体为：

复合微生物菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌以及 副地衣芽孢杆菌两种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到2×10⁹CFU/ml，得到两种菌的菌悬液，再将两种菌的菌悬液按照体积比1:1混合，得到复合微生物菌液。

性能测试：

供试棉花品种：棉花979，新疆金丰源种业股份有限公司提供；

棉花尖孢镰刀菌菌株：由临沂市农业科学院研究室分离自棉花根腐病样，并鉴定和保存；

抑菌效果验证，平板对峙试验：

在PDA培养基平皿中央接种病原菌，在病原菌周围距培养皿边缘1cm处等距离打孔（φ＝7mm），每孔接入本发明实施例3、对比例2-4复合微生物菌液10μＬ，置28-30℃培养箱培养，待对照菌落长满培养皿，观察抑菌圈，结果如图1所示，对于棉花尖孢镰刀菌，本发明实施例微生物菌液均表现出了良好的抑菌效果，而对比例2-4缺少了菌种的微生物菌剂，均呈现了减弱的趋势，可以说明，本发明三种菌种之间具有良好的协同增效作用，对于棉花枯萎病主要致病菌尖孢镰刀菌具有良好的防效。

盆栽实验：

棉花尖孢镰刀菌接种体制备：

将保存至斜面的尖孢镰刀菌菌株活化转接到PDA培养基，培养7天，备用。将高粱粒沸水煮30分钟，取200g放入罐头瓶中，高压灭菌12min。每瓶接入活化后的病原菌，25±1℃培养10天，备用。

取健康土壤装盆，尖孢镰刀菌病原菌接种体按照0.5%的接种量在栽培前与土壤拌匀，设置S1-S8，8个实验组，S1-S3施用本发明实施例1-3所得微生物菌剂，S4-7施用对比例1-4所得微生物菌剂，S8为空白对照，不施用任何菌剂。每组重复三次，结果取平均值。菌剂在播种后随种施入。施用量菌按照1kg/亩。

棉苗株高至5cm时进行疏苗，苗龄为15d，每盆保留1株，按常规方式进行管理，于播种后40、60、80d观察记录发病株数。

病情严重度分级如下：

0级：棉株健康，无病叶，生长正常；

1级：棉株1-2片子叶变黄萎蔫；

2级：棉株2片子叶和1片真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状；

3级：棉株2片子叶及2片及以上真叶变黄萎蔫，叶脉呈黄色网纹状或青枯状，棉株矮化或萎蔫；

4级：棉株所有叶片发病，棉株枯死。

病情指数及相对防效按下述公式计算：

病情指数=∑(发病棉花株数×病情级别数)/(棉花总株数×病情最高级别数)×100；

相对防效(%)=(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100。

实验结果如表1所示：

表1盆栽实验结果

从表1中数据也可以看出，本发明实施例菌剂对于棉花枯萎病有着良好的防效，防治效果在75%以上，性能优异。而改变了载体制备方法和菌剂组成的对比例1-4，由于载体对微生物的相互作用下降以及菌种间的协同作用减弱，导致了防效的下降。由此可见，本发明菌剂中菌种的选择以及载体的制备为本发明的关键技术点，缺一则效弱。

需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (7)

1.一种防治棉花枯萎病的微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂包含复合微生物菌液和微生物菌剂载体。

2.根据权利要求1所述防治棉花枯萎病的微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌液包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、副地衣芽孢杆菌（ Bacillusparalicheniformis）以及环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）。

3.根据权利要求2所述防治棉花枯萎病的微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的保藏编号为CGMCC No.27647，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述副地衣芽孢杆菌（ Bacillus paralicheniformis）的保藏编号为CGMCC No.1.15832，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所述环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）的保藏编号为CGMCC No.1.8819，购自于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

4.根据权利要求2所述防治棉花枯萎病的微生物菌剂，其特征在于，所述复合微生物菌液的制备方法为：将枯草芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌以及 环状芽孢杆菌三种菌株活化后分别接种到LB培养基中，在150r/min，30℃恒温震荡培养12h，4000r/min的条件下离心5min，弃去上清液，收集菌体加入磷酸盐缓冲液，使悬浮液的菌体浓度达到1×10⁹-2×10⁹CFU/ml，得到三种菌的菌悬液，再将三种菌的菌悬液按照体积比1:1:1混合，得到复合微生物菌液。

5.根据权利要求4所述防治棉花枯萎病的微生物菌剂，其特征在于，所述LB培养基的组成为：酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0；并蒸汽高温121℃灭菌20min。

6.根据权利要求1所述防治棉花枯萎病的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂载体为生物炭，具体制备方法为：将菌菇渣晾干后粉碎，使用质量浓度为10-20%的盐酸浸没菌菇渣，浸泡1-2h后，水洗到中性，干燥；再将5g干燥好的菌菇渣粉末、5g氯化锌、5g氯化铁分散于100mL去离子水中，搅拌混合均匀后，加入碳酸氢钠，调节体系pH为9-10，持续搅拌30min后，过滤，并用水冲洗固体产物1-3次，最后将固体产物密封后置于真空马弗炉中，在500-600℃氮气下限氧碳化1-2h，得到生物炭。

7.一种权利要求1-6任意一项所述防治棉花枯萎病的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下制备步骤：

(1)复合微生物菌液的制备；

(2)微生物菌剂载体的制备；

(3)将复合微生物菌液按照固液比10mL:10g加入微生物菌剂载体，进行充分吸附，再进行干燥后，得到终产品。