CN111109082A - 提高西番莲初代培养成活率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高西番莲初代培养成活率的方法，包括以下步骤：(1)初代培养基制备；(2)外植体培育：选择西番莲枝条，将枝条剪成含有1‑2个芽的茎段，剪去部分叶片，扦插于育苗盆内，置于大棚，扦插时喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，每隔5‑10天喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，栽培一段时间后取枝条作为外植体进行组培；(3)外植体消毒：剪去枝条的叶片，将枝条剪成多段，腋芽位于茎段中部，用含有HgCl2和抗坏血酸的消毒液消毒；(4)外植体接种及培养。本发明的方法，培养外植体材料，将材料置于棚内培养，进行前期杀菌等处理，提高外植体的清洁度，缩短HgCl2消毒时间，使初代培养污染率降低至15％以下。降低外植体褐化率，提高成活率。
Description
技术领域
本发明涉及农作物组培的技术领域，特别涉及一种提高西番莲初代培养成活率的方法。
背景技术
西番莲是西番莲科西番莲属的多年生常绿木质藤本植物，原产南美洲的巴西至阿根廷一带，在我国主要分布在台湾、广东、福建、广西、云南等省，它集食用、药用、油用和绿化观赏为一体，经济价值高。西番莲果实中果汁含量占果重30％-40％，富含人体必需的17种氨基酸、有机酸及VC、SOD、磷、钙、铁、钾、蛋白质等多种营养成分，具有很高的营养价值。目前我国西番莲扩繁主要采用实生苗与蔓条扦插繁殖，生产中存在较多问题，如实生苗的培育种子萌发率与成活率低，缓苗期长、抗病性低、后代性状差异大等问题；蔓条扦插繁殖若操作不当会加快品种退化、病害增加致使产量降低，这些问题影响和制约了西番莲的生产与加工。利用组织培养方法对西番莲进行快繁研究，可以对西番莲植株进行脱毒，克服无性繁殖率低、繁殖速度慢的缺点，加上组织培养不受季节和气候等因素的制约，具有节约土地资源，速度快，质量高，技术密集，便于集约化管理和工厂化生产的优点。目前西番莲组培快繁存在很多问题，其中外植体消毒过程中污染率高，褐化死亡率高，初代培养成活率低的问题，严重影响组培效率。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高西番莲初代培养成活率的方法，从而克服西番莲组培过程中污染率、褐化死亡率高，初代培养成活率低的缺点。
为实现上述目的，本发明提供了一种提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)初代培养基制备；
(2)外植体培育：选择西番莲枝条，将枝条剪成含有1-2个芽的茎段，剪去部分叶片，扦插于育苗盆内，置于大棚，扦插时喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，之后每隔5-10天喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，栽培一段时间后取枝条作为外植体进行组培；
(3)外植体消毒：剪去枝条的叶片，将枝条剪成多段，腋芽位于茎段中部，然后用含有HgCl2和抗坏血酸的消毒液消毒；
(4)外植体接种及培养。
优选地，上述技术方案中，初代培养基的制备方法包括以下步骤：
(1)初代培养基配方：MS基本培养基、6-BA 0.5-1.5mg/L、IBA 0.05-0.15mg/L、抗坏血酸0.001-0.02g/L、水解酪蛋白0.2-0.3g/L、蔗糖20-40g/L、琼脂4-7g/L；
(2)调节培养基PH至5.8-6.0，分装在容器中，在容器口塞上棉塞，包覆牛皮纸并扎牢，然后在110-120℃条件下高压灭菌15-20min。
优选地，上述技术方案中，步骤(2)中剪去部分叶片为剪去叶片的2/3-3/4。
优选地，上述技术方案中，步骤(2)中药剂包括杀菌剂、杀虫剂和防控病毒药剂中的一种或几种混合；喷洒时不同的药剂交替使用；其中，所述杀菌剂包括咪鲜胺、多菌灵、噁霉灵中的一种或几种混合；所述杀虫剂包括高效氯氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒中的一种或几种混合；所述防控病毒药剂包括阿泰灵、毒氟磷中的一种或几种混合。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)中的消毒液包括质量浓度为0.05-0.15％HgCl2+0.005-0.05g/L抗坏血酸。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)外植体消毒为：剪去枝条的叶片，置于质量浓度为2-4％的洗洁精溶液中浸泡10-15min，再用流水冲洗20-30min，然后置于杀菌剂溶液中浸泡10-15min，在超净工作台上用消毒液浸泡3-6min，再用无菌水冲洗多次。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)中将枝条剪成3-9cm的小段。
优选地，上述技术方案中，步骤(3)中将枝条剪成6-9cm的小段。
优选地，上述技术方案中，步骤(4)外植体接种前对茎段进行处理，在超净工作台上切去茎段切口处0.3-1cm左右，接入培养基中的外植体长度保持5-7cm，将茎段接种在初代培养基上。
优选地，上述技术方案中，步骤(4)中茎段接种在初代培养基上，置于温度为24-26℃、湿度低于40％的培养室中培养，光强为2000-3000lx，光照时间10-12h/天。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提高西番莲初代培养成活率的方法，在大棚中培养外植体材料，对材料进行前期杀菌、杀虫及抗病毒处理，提高外植体的清洁度，缩短HgCl2消毒时间。使初代培养污染率降低至15％以下。
(2)在消毒液HgCl2溶液和初代培养基中加入抗坏血酸，降低外植体褐化率，提高成活率，外植体褐化死亡率低于5％。
(3)外植体接入初代培养基的长度在5-7cm，有利于茎段中的营养物质输送到芽点，促进芽点萌发生长。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1
一种提高西番莲初代培养成活率的方法，包括以下步骤：
(1)初代培养基制备：初代培养基配方为：MS基本培养基、6-BA 1.0mg/L、IBA0.1mg/L、抗坏血酸0.01g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节培养基PH至5.8-6.0，分别分装在三角瓶中，每升分装20瓶，共配置100瓶，瓶口塞上棉塞，包裹一层牛皮纸并用线绳扎牢，在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，取出冷却备用。
(2)外植体培育：从大田选择生长健壮的西番莲枝条，将枝条剪成含1-2个芽的茎段，剪去叶片的2/3-3/4，在大棚内扦插于直径大于20cm的育苗盆内，扦插时喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂(1000倍液咪鲜胺+1000倍液高效氯氰菊酯+1000倍液阿泰灵)，之后每周喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，相同功效的不同药剂交替使用，预防病虫产生抗药性，加强水肥管理，栽培15天后取枝条作为外植体进行组培。
(3)外植体消毒：从大棚取回枝条，剪去叶片，在2％的洗洁精溶液中浸泡15min，流水冲洗30min，在1000倍液多菌灵中浸泡10min，将枝条剪成6-8cm的小段，腋芽位于茎段中部，在超净工作台上用0.1％HgCl2+0.01g/L抗坏血酸浸泡4min，无菌水冲洗4次。
(4)外植体接种：在超净工作台上切去茎段切口处0.3-1cm左右，接入培养基中的外植体长度保持在5-7cm，将茎段接种在初代培养基上，每个三角瓶内一个茎段，置于温度24-26℃、湿度低于40％的培养室中培养，光强2000lx，光照时间10h/天。
接种20天时，统计外植体污染率为12％，褐化死亡率3.4％、成活率85％。
污染率＝污染茎段数/接种茎段数
褐化死亡率＝(褐化茎段数+死亡茎段数)/(接种茎段数-污染茎段数)
成活率＝成活茎段数/接种茎段数
实施例2
一种提高西番莲初代培养成活率的方法，包括以下步骤：
(1)初代培养基制备：初代培养基配方为：MS基本培养基、6-BA 1.0mg/L、IBA0.1mg/L、抗坏血酸0.01g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节培养基PH至5.8-6.0，分别分装在三角瓶中，每升分装20瓶，共100瓶，瓶口塞上棉塞，包裹一层牛皮纸并用线绳扎牢，在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，取出冷却备用。
(2)外植体培育：从大田选择生长健壮的西番莲枝条，将枝条剪成含1-2个芽的茎段，剪去叶片的2/3-3/4，在大棚内扦插于直径大于20cm的育苗盆内，扦插时喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂(1000倍液咪鲜胺+1000倍液高效氯氰菊酯+1000倍液阿泰灵)，之后每周喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，加强水肥管理，栽培15天后取枝条作为外植体进行组培。
(3)外植体消毒：从大棚取回枝条，剪去叶片，在2％的洗洁精溶液中浸泡15分钟，流水冲洗30min，在1000倍液多菌灵中浸泡10min，将枝条剪成6-8cm的小段，腋芽位于茎段中部，在超净工作台上用0.1％HgCl2浸泡4min，无菌水冲洗4次。
(4)外植体接种：在超净工作台上切去茎段切口处0.3-1cm左右，接入培养基中的外植体长度保持在5-7cm，将茎段接种在初代培养基上，每个三角瓶内一个茎段，置于温度24-26℃、湿度低于40％的培养室中培养，光强2000lx，光照时间10h/天。
接种20天时，统计外植体污染率为10％，褐化死亡率16.7％，成活率75％。
实施例3
一种提高西番莲初代培养成活率的方法，包括以下步骤：
(1)初代培养基制备：初代培养基配方为：MS基本培养基、6-BA 1.0mg/L、IBA0.1mg/L、抗坏血酸0.01g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节培养基PH至5.8-6.0，分别分装在三角瓶中，每升分装20瓶，共100瓶，瓶口塞上棉塞，包裹一层牛皮纸并用线绳扎牢，在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，取出冷却备用。
(2)外植体消毒：从大田栽培的植株上选取生长健壮的枝条，剪去叶片，在2％的洗洁精溶液中浸泡15分钟，流水冲洗30min，在1000倍液多菌灵中浸泡10min，将枝条剪成6-8cm的小段，腋芽位于茎段中部，在超净工作台上用0.1％HgCl2+0.01g/L抗坏血酸浸泡6min，无菌水冲洗4次。
(3)外植体接种：在超净工作台上切去茎段切口处0.3-1cm左右，接入培养基中的外植体长度保持在5-7cm，将茎段接种在初代培养基上，每个三角瓶内一个茎段，置于温度24-26℃、湿度低于40％的培养室中培养，光强2000lx，光照时间10h/天。
接种20天时，统计外植体污染率为26％，褐化死亡率24.3％、成活率56％。
实施例4
一种提高西番莲初代培养成活率的方法，包括以下步骤：
(1)初代培养基制备：初代培养基配方为：MS基本培养基、6-BA1.0mg/L、IBA0.1mg/L、抗坏血酸0.01g/L、水解酪蛋白0.3g/L、蔗糖30g/L、琼脂6g/L，调节培养基PH至5.8-6.0，分别分装在三角瓶中，每升分装20瓶，共100瓶，瓶口塞上棉塞，包裹一层牛皮纸并用线绳扎牢，在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，取出冷却备用。
(2)外植体培育：从大田选择生长健壮的西番莲枝条，将枝条剪成含1-2个芽的茎段，剪去叶片的2/3-3/4，在大棚内扦插于直径大于20cm的育苗盆内，扦插时喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂(1000倍液咪鲜胺+1000倍液高效氯氰菊酯+1000倍液阿泰灵)，之后每周喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，加强水肥管理，栽培15天后取枝条作为外植体进行组培。
(3)外植体消毒：从大棚取回枝条，剪去叶片，在2％的洗洁精溶液中浸泡15分钟，流水冲洗30min，在1000倍液多菌灵中浸泡10min，将枝条剪成3-4cm的小段，腋芽位于茎段中部，在超净工作台上用0.1％HgCl2+0.01g/L抗坏血酸浸泡4min，无菌水冲洗4次。
(4)外植体接种：在超净工作台上切去茎段切口处0.3-1cm左右，接入培养基中的外植体长度在2-3cm，将茎段接种在初代培养基上，每个三角瓶内一个茎段，置于温度24-26℃、湿度低于40％的培养室中培养，光强2000lx，光照时间10h/天。
接种20天时，统计外植体污染率为7％，褐化死亡率18.3％、成活率76％。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (10)
1.一种提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)初代培养基制备；
(2)外植体培育：选择西番莲枝条，将枝条剪成含有1-2个芽的茎段，剪去部分叶片，扦插于育苗盆内，置于大棚，扦插时喷一次杀菌、杀虫及防控病毒的药剂，之后每隔5-10天喷一次药剂，栽培一段时间后取枝条作为外植体进行组培；
(3)外植体消毒：剪去枝条的叶片，将枝条剪成多段，腋芽位于茎段中部，然后用含有HgCl2和抗坏血酸的消毒液消毒；
(4)外植体接种及培养。
2.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(1)初代培养基的制备方法包括以下步骤：
(1)初代培养基配方：MS基本培养基、6-BA 0.5-1.5mg/L、IBA 0.05-0.15mg/L、抗坏血酸0.001-0.02g/L、水解酪蛋白0.2-0.3g/L、蔗糖20-40g/L、琼脂4-7g/L；
(2)调节培养基PH至5.8-6.0，分装在容器中，在容器口塞上棉塞，包覆牛皮纸并扎牢，然后在110-120℃条件下高压灭菌15-20min。
3.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(2)中剪去部分叶片为剪去叶片的2/3-3/4。
4.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(2)中药剂包括杀菌剂、杀虫剂和防控病毒药剂中的一种或几种混合；喷洒时不同的药剂交替使用；其中，
所述杀菌剂包括咪鲜胺、多菌灵、噁霉灵中的一种或几种混合；
所述杀虫剂包括高效氯氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒中的一种或几种混合；
所述防控病毒药剂包括阿泰灵、毒氟磷中的一种或几种混合。
5.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(3)中的消毒液包括质量浓度为0.05-0.15％HgCl2+0.005-0.05g/L抗坏血酸。
6.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(3)外植体消毒为：剪去枝条的叶片，置于质量浓度为2-4％的洗洁精溶液中浸泡10-15min，再用流水冲洗20-30min，然后置于杀菌剂溶液中浸泡10-15min，在超净工作台上用消毒液浸泡3-6min，再用无菌水冲洗多次。
7.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(3)中将枝条剪成3-9cm的小段。
8.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(3)中将枝条剪成6-9cm的小段。
9.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(4)外植体接种前对茎段进行处理，在超净工作台上切去茎段切口处0.3-1cm左右，接入培养基中的外植体长度保持5-7cm，将茎段接种在初代培养基上。
10.根据权利要求1所述的提高西番莲初代培养成活率的方法，其特征在于，步骤(4)中茎段接种在初代培养基上，置于温度为24-26℃、湿度低于40％的培养室中培养，光强为2000-3000lx，光照时间10-12h/天。
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