CN111184029B - 荧光假单胞菌在双子叶杂草和白粉病防除中的应用及其菌剂、制备和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了荧光假单胞菌在双子叶杂草和白粉病防除中的应用，所述荧光假单胞菌的拉丁名为Pseudomonas fluorescens，菌株号为CZ，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No:4118。本发明的细菌发酵上清及其乙酸乙酯粗提物对双子叶杂草种子萌发和幼苗茎叶生长具有抑制作用，对烟草白粉病有防治作用；利用CZ菌株制备的菌剂，能有效抑制双子叶杂草种子萌发和幼苗生长及防治白粉病，相对于传统农药，本发明菌剂对双子叶杂草，特别是反枝苋的控制效果可达90％以上，对烟草白粉病防效达86％以上，并且本发明菌剂使用成本低、绿色安全。

Description

荧光假单胞菌在双子叶杂草和白粉病防除中的应用及其菌 剂、制备和使用方法
技术领域
本发明涉及微生物农药领域，尤其涉及荧光假单胞菌在双子叶杂草和白粉病防除中的应用及其菌剂、制备和使用方法。
背景技术
烟田常见杂草有：反枝苋、马齿苋、狼尾草、稗草、马唐、野花黑麦等，杂草能与烟草竞争生存空间而影响烟株生长发育，尤其是缓苗后的团棵期到旺长期，常见反枝苋、马齿苋、狼尾草和马唐等杂草高于烟苗的现象。此外，由二孢白粉菌(Erysiphe cichoracearumDC)侵染引起的白粉病是主要的叶部病害。烟草白粉病在我国主要烟区均有发生，在温暖湿润的华南和西南烟区，如云南、湖北、福建、广东、广西、贵州和重庆时有暴发流行，已经成为制约烟草农业正常生产的重要因素。
目前，对烟草烟田杂草和白粉病的防治，仍然以化学防治为主。有研究表明，细菌及其某些代谢产物能够抑制杂草种子萌发和茎叶生长，具有一定的除草活性。细菌除草剂的主要来源是根际有害细菌(deleterious rhizobacteria，DRB)和杂草致病菌，主要包括假单胞菌属、欧文氏菌属、黄杆菌属、柠檬酸杆菌属、无色杆菌属、肠杆菌属和产碱杆菌属，而鲜少有根际促生细菌的除草活性研究。此外，生物防治具有安全绿色的特点，利用各种生防微生物控制烟草土传病害(黑胫病和青枯病)已被广泛报道，而防治叶部病害(白粉病)的生防微生物研究较少。在国家提出减肥减药的双减政策下，发掘新的生防资源并研发高效生物农药是防治杂草和白粉病的重要途径之一。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CZ菌株是一种对烟草花叶病毒有拮抗作用的生防细菌。本发明人在近期的研究中首次发现CZ菌株的发酵上清以及乙酸乙酯粗提物对烟草白粉病菌和烟田杂草具有抑制作用；而该细菌对烟草白粉病菌和烟田杂草的生防活性尚未报道。因此，针对上述问题，有必要提出进一步地解决方案。
发明内容
本发明旨在提供荧光假单胞菌在双子叶杂草和白粉病防除中的应用及其菌剂、制备和使用方法，以克服现有技术中存在的不足。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
荧光假单胞菌在双子叶杂草和白粉病防除中的应用，所述荧光假单胞菌的拉丁名为Pseudomonas fluorescens，菌株号为CZ，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No:4118。
优选地，所述双子叶杂草为反枝苋。
一种含荧光假单胞菌的菌剂，所述荧光假单胞菌的菌株号为CZ，保藏号为CGMCCNo:4118。
优选地，所述菌剂包括所述荧光假单胞菌的菌体和代谢产物中的至少一种。
优选地，所述荧光假单胞菌在所述菌剂中的活菌数含量在108cfu/mL以上。
优选地，所述菌剂还包括吐温20，所述吐温20的体积占所述菌剂总体积的0.8％-1.5％。
优选地，所述吐温20的体积占所述菌剂总体积的1％。
含荧光假单胞菌的菌剂的制备方法，包括步骤：细菌发酵培养72h后，离心去菌体，添加1％的表面活性剂吐温20。
含荧光假单胞菌的菌剂的使用方法，包括步骤：将所述菌剂稀释10-20倍，喷洒茎叶2-4次，每次间隔7-10天。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的细菌发酵上清及其乙酸乙酯粗提物对双子叶杂草种子萌发和幼苗茎叶生长具有抑制作用，对烟草白粉病有防治作用；利用CZ菌株制备的菌剂，能有效抑制双子叶杂草种子萌发和幼苗生长及防治白粉病，相对于传统农药，本发明菌剂对双子叶杂草，特别是反枝苋的控制效果可达90％以上，对烟草白粉病防效达86％以上，并且本发明菌剂使用成本低、绿色安全。
附图说明
图1为CZ粗提物对反枝苋等杂草种子萌发的抑制效果图，其中，(a)列为对照组，(b)列为实验组，(1)-(6)组依次为反枝苋、狼尾草、稗草、马唐、野花黑麦、马齿苋；
图2为CZ发酵上清、粗提物及菌剂对反枝苋幼苗茎叶生长的抑制效果图，其中，(a)列为对照组，(b)列为实验组，(b1)组为使用发酵上清，(b2)为使用粗提物，(b3)为使用菌剂；
图3为CZ发酵上清对反枝苋等杂草幼苗茎叶生长抑制效果图，其中，(a)列为对照组，(b)列为实验组，图中标号1-6依次为反枝苋、狼尾草、稗草、马唐、野花黑麦、马齿苋；
图4为CZ发酵上清、粗提物对烟草白粉病的控制效果图，其中，(1)列为施药前，(2)列为施药后，(a)组为对照组，(b1)组为使用发酵上清，(b2)组为使用粗提物。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。如本文所用术语“由…制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由…组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由…组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
说明书和权利要求书中的近似用语用来修饰数量，表示本发明并不限定于该具体数量，还包括与该数量接近的可接受的而不会导致相关基本功能的改变的修正的部分。相应的，用“大约”、“约”等修饰一个数值，意为本发明不限于该精确数值。在某些例子中，近似用语可能对应于测量数值的仪器的精度。在本申请说明书和权利要求书中，范围限定可以组合和/或互换，如果没有另外说明这些范围包括其间所含有的所有子范围。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本发明人采用细菌传统分离方法，从植烟土壤中获得了一株荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)CZ菌株，CZ菌株已于2010年8月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所；保藏号为CGMCC No:4118。Pseudomonas fluorescens CZ菌株为革兰氏阴性菌，在LB培养基上形成圆形、透明菌落；显微镜下可见直杆状细胞，大小约为0.7×2.4μm。利用生理生化鉴定和细菌通用16Sr DNA引物测定菌株的16S rDNA-PCR产物的序列，并在数据库中进行相似性搜索来鉴定菌株。根据生理生化特性和16S rDNA序列鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)。
1.本发明中CZ菌株的培养、活性物质及菌剂制备
CZ菌株活化及液体种子培养：将该菌株斜面种子划线转接到LA培养基固体斜面上，28℃培养1d活化菌株。挑取单菌落接种到含LB液体培养基的三角瓶中，28℃，150rpm条件下摇床培养2d获得液体种子。
CZ菌株发酵罐大量培养：将液体种子按1％(V/V)的比例接入发酵罐中的LB液体培养基中，在8000mL发酵罐中的培养条件控制在：温度28℃，搅拌速度150rpm，发酵时间3d。
CZ发酵产物中活性物质提取：将发酵3d的菌液8000rpm离心15min去菌体，为发酵上清。上清用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相。于-0.1kPa压力40℃下旋转蒸发除去乙酸乙酯，浓缩干燥后，按1000mL用20mL脱水甲醇，洗脱，为乙酸乙酯粗提物，4℃保存备用。
CZ菌剂制备：经发酵罐培养72h获得的微生物菌体及其代谢物，于8000rpm离心15min去菌体，为发酵上清。添加0.8-1.5％体积的表面活性剂吐温20，本实施例中添加量为1％体积，制成CZ菌剂。需保证CZ菌株在菌剂中的活菌数含量在108cfu/mL以上。
2.本发明的供试病原菌的培养及杂草催芽播种
本发明的供试杂草为反枝苋、狼尾草、稗草、马唐、野花黑麦、马齿苋，按杂草常规催芽和播种方法进行。
供试病原菌为烟草白粉病菌(Erysiphe cichoracearum DC)为人工气候室或温室7-8月中温中湿时自然发病。
3.本发明CZ的发酵上清、粗提物及菌剂对杂草的防除试验
3.1抑制杂草种子萌发试验
采用平皿滤纸法测定CZ粗提物对杂草种子萌发的抑制效果。挑选健康的反枝苋、狼尾草、稗草、马唐、野花黑麦、马齿苋种子，用0.1％的升汞表面消毒10s，无菌水冲洗3次后，置于平皿中室温浸种2h。在直径9cm的平皿中加入3mL粗提物(预先过0.22μm滤膜除菌)，对照加同体积的甲醇，放上滤纸片浸润。待甲醇挥发后，加2mL无菌水浸润滤纸片，摆放入杂草种子。每皿4重复，28℃培养3-5d，保持湿润。测量种子的发芽率、观察根芽长，按下式计算抑制率。
Figure GDA0002448591060000081
Figure GDA0002448591060000082
由图1看出，与对照处理相比，CZ粗提物处理对反枝苋、狼尾草、稗草、马唐、野花黑麦、马齿苋6种杂草种子的萌发和根芽生长均有一定的抑制效果。由表1统计可知萌发抑制率分别为88.89％、80.00％、67.50％、91.67％、95.24和92.31％。
表1 CZ粗提物对反枝苋等杂草种子萌发的抑制效果
Table 1 The inhibition effect of CZ on germination of Amaranthusretroflexusand etc.in greenhouse
Figure GDA0002448591060000083
3.2抑制杂草幼苗茎叶生长试验
采用茎叶喷雾法测定CZ发酵上清、粗提物及菌剂对杂草幼苗的抑制效果。在9×9cm的播种盒中，装入培养基质土，均匀洒播杂草种子后覆盖细沙。28℃相对湿度70％条件下培养。待幼苗2-3叶时，茎叶喷雾发酵上清、粗提物或菌剂，分别设置培养基、甲醇或清水为对照。每处理3盒重复，3-5d观察记录死亡株数，计算死亡率和除草效果。
从图2能够看出，CZ发酵上清、粗提物和菌剂对烟田双子叶杂草反枝苋幼苗的茎叶生长具有较好的抑制作用。表2统计结果表明防治效果分别为91.11％、79.09％、96.67％。实验中还发现，CZ发酵上清对单子叶杂草(狼尾草、稗草、马唐、野花黑麦、马齿苋)的茎叶生长没有抑制作用(图3)。
表2 CZ发酵上清、粗提物和菌剂对反枝苋的防治效果
Table 2 The inhibition effect of CZ on Amaranthus retroflexus ingreenhouse
Figure GDA0002448591060000091
4.本发明CZ发酵上清、乙酸乙酯粗提物及菌剂对烟草白粉病的防治试验
4.1室内生物测定试验
采用喷雾法测定发酵上清、乙酸乙酯粗提物对白粉病的室内控制效果。发生白粉病的5-7叶期幼苗，喷施发酵上清或乙酸乙酯粗提物，以不喷施为对照处理。每处理6株，每株喷施全部发病叶片，2-3d拍照记录控制效果。
由图4看出，发生白粉病的幼苗，喷施CZ发酵上清或乙酸乙酯粗提物处理的植株，48h后叶面上的白粉病菌菌丝显著被抑制；而不喷施的对照植株其白粉病情显著上升。显示CZ发酵产物对烟草白粉病有较好的控制效果，可制备CZ菌剂用于大田白粉病的防治。
4.2药效试验
采用叶面喷雾法进行白粉病的温室防治试验。将CZ菌剂用水稀释15倍，菌量约为106-108cfu/mL，在发病初期第一次施药，间隔7-10天，再喷药一次。每处理设置4次重复，每重复10株，喷雾均匀。以30％氟菌唑可湿性粉剂(日本曹达株式会社)5000倍液为白粉病对照药剂。于末次施药后10d调查一次病情，每处理调查全部烟株。按GB/T23222-2008《烟草病虫害分级及调查方法》，以叶片为单位进行分级调查。按下式计算预防效果，对各处理防治效果采用DPS-7.05数据处理系统软件——邓肯氏新复极差法进行方差分析。
Figure GDA0002448591060000101
Figure GDA0002448591060000102
由表3统计可知，叶面喷施CZ菌剂的处理对白粉病的防效为86.68％，略低于对照药剂30％氟菌唑可湿性粉剂的防效90.09％，但仍具有较好的控制效果。
表3 CZ菌剂对烟草白粉病的田间防治效果
Table 1 The inhibition effect of CZ on tobacco powdery mildew ingreenhouse
Figure GDA0002448591060000111
综上所述，本发明的细菌发酵上清及其乙酸乙酯粗提物对双子叶杂草种子萌发和幼苗茎叶生长具有抑制作用，对烟草白粉病有防治作用；利用CZ菌株制备的菌剂，能有效抑制双子叶杂草种子萌发和幼苗生长及防治白粉病，相对于传统农药，本发明菌剂对双子叶杂草，特别是反枝苋的控制效果可达90％以上，对烟草白粉病防效达86％以上，并且本发明菌剂使用成本低、绿色安全。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims (1)

1.荧光假单胞菌在白粉病和反枝苋防除中的应用，其特征在于，所述荧光假单胞菌的拉丁名为Pseudomonas fluorescens，菌株号为CZ，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No:4118。
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