CN116926017A - 一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体 - Google Patents

一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，对于饲料作物源黄单胞菌致病变种具有较强的裂解效果，该应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体为黄单胞菌噬菌体XNJP8，其于2022年03月17日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2022272。本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8安全性高，可用作为制备试剂盒以及生物类消毒剂或生物类农药的有效成分，防治由黄单胞菌引起的饲料作物各类细菌性疾病。

Description

一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体
技术领域
本发明涉及噬菌体领域，具体来说，涉及一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体。
背景技术
养殖业随着产业的发展和深入，规模已经越来越大，畜禽在人们的生活中的需求加大催生了养殖业的蓬勃发展，养殖业的大面积养殖对传统的饲料供应提出了新的要求和高的标准。而随着农业农村部相关公告的指出，2020年7月1日起，饲料生产企业需要停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲料，从而极大的提高了饲料作物无抗种植的重要性。
大豆和油菜是我国传统饲料作物，其产量及品质对我国畜牧养殖业具有极大的影响。黄单胞菌属于黄单胞菌科黄单胞菌属，革兰氏阴性菌，专性好氧，化能有机营养型植物病原菌。其中油菜黄单胞菌大豆致病变种[Xanthomonas campestris pv.glycines(Nakano)Dye]是大豆细菌性斑疹病病原菌。野油菜黄单胞菌(X.campestris)是油菜黑腐病病原菌。
当前，相关技术中对于黄单胞菌引起植物细菌性疾病的防控技术，一方面是以化学防治为主，但从现有的防治情况来看，效果均不理想。另一方面，随着近年来国家在农作物上减抗、无抗的号召，国内外学者积极研究新兴的抗细菌生物制剂，由于黄单胞菌噬菌体具备对目标细菌的专一高效裂解能力，能显著降低环境中致病菌的数量，可控制或减少疾病的发生和流行。因此，噬菌体可作为抗细菌感染制剂使用，故本发明提出了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体。
发明内容
针对相关技术中的问题，本发明提出一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
为此，本发明采用的具体技术方案如下：
一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，对于饲料作物源(如大豆，油菜等)黄单胞菌致病变种具有较强的裂解效果，应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体为黄单胞菌噬菌体XNJP8（Xanthomonas sp.phage XNJP8），其于2022年03月17日被保藏于中国典型培养物保藏中心（中国武汉武汉大学），保藏编号为CCTCC NO.M2022272。
进一步的，黄单胞菌噬菌体XNJP8为烈性噬菌体，有一呈多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径为45～60nm，尾部的长度为10～15nm，尾部直径为8～10nm，属于Autographiviridae科噬菌体。
通过采用上述技术方案，从电镜中观察噬菌体的形貌，可知该噬菌体具有多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，有助于头部的核酸注入宿主菌中，还可有效识别宿主菌表面的特殊受体。
进一步的，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
进一步的，基因组测序组装结果显示，黄单胞菌噬菌体XNJP8基因组长度为44594bp，GC含量为62.4％。
进一步的，通过生物信息学软件对基因组进行注释，发现黄单胞菌噬菌体XNJP8的基因组上共编码55个蛋白，不编码tRNA基因，未发现已知的耐药基因和毒力基因。
进一步的，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8在感染复数MOI＝0.00001条件下培养24h，效价达到6×1010PFU/mL以上。
感染复数(MOI)是噬菌体数量与细菌数量的比值，是研究噬菌体感染细菌与产出噬菌体子代量效关系的重要依据。本发明的黄单胞菌噬菌体只需添加少量，即可侵染黄单胞菌增殖获得大量子代噬菌体。本发明为工业化生产噬菌体杀菌剂提供了优质噬菌体菌株来源。
进一步的，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8在pH＝4～11的条件下具有耐性，在48h内效价降低不超过1个数量级。
通过采用上述技术方案，可知在pH4或者pH11，即在酸性或者碱性条件下，本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8具有优异的耐性，当防治环境在pH＝4～11之间时，本发明的黄单胞菌噬菌体均可以起到有效的防治作用。
进一步的，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8经紫外辐射8h后，效价降低不超过1个数量级。
通过采用上述技术方案，当防治环境中紫外线较强时，采用本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8具有良好的耐受性，效价降低较少，能够对病原菌起到有效的防治作用。
根据本发明的另一个方面，提供了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体在制备冻干粉中的应用。
本发明的有益效果为：
1)本发明提供了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，在大豆，油菜等饲料作物生产过程中，利用噬菌体对相关细菌性病害进行防治，对于饲料作物源黄单胞菌致病变种具有较强的裂解效果，一方面可以减少因细菌性病害带来的经济损失，另一方面可以显著降低饲料作物生产过程中抗生素的使用，从饲料源头的减抗替抗来带动后续养殖业的减抗替抗。
2)本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8安全性高，可用作为制备试剂盒以及生物类消毒剂或生物类农药的有效成分，防治由黄单胞菌引起的饲料作物各类细菌性疾病。
3)本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8对紫外线、酸碱性环境具有较高的耐受性，适用于不同的防治环境中，能够对由黄单胞菌引起的饲料作物细菌性病害起到较好的生物防治效果。
4)本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8是从自然界中分离的烈性噬菌体，供试噬菌体不含毒力基因或不良基因，该噬菌体的DNA无法编码可能引起潜在的健康风险的蛋白，不存在携带溶源基因的可能。
5)本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8为严格的烈性噬菌体，对宿主菌具有高度专一性和裂解性，并且具有较广的宿主范围，对49株不同地域来源的黄单胞菌的裂解率高达90％；黄单胞菌噬菌体XNJP8可作为应用于环境消毒的各种产品的有效成分，例如包括但不限于以液体浸泡、喷洒、与含水性载体联合使用等形式对配水系统、灌溉设施、养殖业设施、公共及私人设施或其他环境表面进行消毒去污，可有效控制目标细菌的生长及活性；所述液体浸泡、喷洒形式包括但不限于洗涤剂、消毒剂、去污剂等；所述含水性载体包括但不限于磷酸盐缓冲液、TSB培养基、LB培养基、氯游离水等。
6)本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8无法识别10株供试非致病性有益细菌中的任何一株，说明其特异性良好。
7)本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8可以作为一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体在制备冻干粉中的应用，且对由黄单胞菌引起的饲料作物细菌性病害具有较好的生物防治效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是根据本发明实施例的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体XNJP8的噬菌斑图片；
图2是根据本发明实施例的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体XNJP8的电镜图片；
图3是溶原性实验中出现噬菌斑样品的结构示意图；
图4是溶原性试验中未出现噬菌斑样品的结构示意图。
具体实施方式
为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点。
根据本发明的实施例，提供了一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体。
以下实例中，所涉及菌株代号均为本公司的命名方式编号。
黄单胞菌噬菌体XNJP8，保藏编号为CCTCC NO.M2022272，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022.03.17；
黄单胞菌(Xanthomonas sp.)，保藏编号为ACCC 11705，保藏单位为中国农业微生物菌种保藏管理中心，可通过向保藏单位联系购买获得。
野油菜黄单胞菌(X.campestris)，保藏编号为CGMCC 1.3408，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，可通过向保藏单位联系购买获得。
以下实例中：
TSB液体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL；
TSA固体培养基的配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL；
TSA平板：将TSA固体培养基灭菌后倾倒在无菌平板上，冷却凝固后制成TSA平板；
TSB半固体琼脂培养基配方为：胰蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，氯化钠5g，琼脂7g，蒸馏水1000mL；
SM液配方：氯化钠5.8g，硫酸镁2g，1mol/L Tris-HCl 50mL，明胶0.25g，蒸馏水1000mL。
实施例1：黄单胞菌噬菌体XNJP8的分离制备及纯化培养
本发明中黄单胞菌噬菌体XNJP8的来源样品采集于江苏省南京市江宁区农村生活污水，经双层滤纸过滤后低速常温离心，再用0.22μm滤膜过滤上清。
噬菌体的分离：
(1)取10mL过滤后的上清液，加入10mL 2倍TSB液体培养基中，同时加入1mL噬菌体宿主菌XNJ-5对数期菌液，放置于28℃条件下过夜培养；
(2)取上述培养物，在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，备用；
(3)取0.5mL噬菌体宿主菌XNJ-5对数期菌液，加入5mL、40℃TSB半固体琼脂培养基中混匀，倾倒于TSA平板上，制备成含有宿主菌的双层平板；
(4)取备用的上清液10μL，滴在已凝固的双层平板上，在无菌条件下风干后，放置于28℃过夜培养，形成噬菌体点滴斑。
噬菌体的纯化：
(1)用牙签挑取噬菌体点滴斑，移至1mL SM液中震荡1min；
(2)进行10倍梯度稀释，取102、104和106稀释液分别加入噬菌体宿主菌对数期菌液0.5mL，混合均匀；
(3)静置15min后，将上述混合液加入5mL、40℃TSB半固体琼脂培养基中，混匀后立刻倾倒于TSA平板上，摇匀平置5min，待其凝固，置于28℃温箱过夜培养后观察，获得含有单个噬菌斑的双层平板；
(4)挑起单个噬菌斑，移至1mL SM液中，按照上述方式纯化至少3次以上，最终在平板上形成形态大小一致的噬菌斑；
(5)用牙签挑取形态大小一致的单个噬菌斑，置于含有1mL对数期宿主菌菌液的50mL TSB液体培养基中，28℃条件下180rpm过夜摇培；
(6)取培养物在8000rpm条件下离心10min，用0.22μm滤膜过滤上清，得到纯化噬菌体溶液，即为黄单胞菌噬菌体XNJP8。黄单胞菌噬菌体XNJP8在黄单胞菌菌苔上产生单一的圆形噬菌斑，参照图1。黄单胞菌噬菌体XNJP8，保藏编号为CCTCC NO.M2022272。
实施例2：黄单胞菌噬菌体XNJP8的电镜观察
取实施例1制得的纯化噬菌体溶液作电镜观察：取20μL样本滴于铜网上，待其自然沉淀15min，用滤纸从侧面吸收多余液体，加1滴2％磷钨酸于铜网上，染色10min，用滤纸从侧面吸去染液，干燥后做电镜观察。
结果如图2所示，在电子显微镜下观察黄单胞菌噬菌体XNJP8形态发现，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8为烈性噬菌体，有一呈多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，头部直径为45～60nm，尾部的长度为10～15nm，尾部直径为8～10nm。
实施例3：黄单胞菌噬菌体XNJP8颗粒制备及基因组的提取与测序
(1)取实施例1制得的纯化噬菌体溶液100mL，依次加入浓度为5mg/mL的DNaseI 20μL、RNaseA 20μL，37℃条件孵育60min后加入5.84g NaCl，待溶解后置于冰浴中1h；
(2)4℃条件下，11000rpm离心10min，将离心后的上清液转移至新的离心管中，加入固体PEG8000，使其终浓度为10％(w/v)，待PEG8000完全溶解后，冰浴1h；
(3)再在4℃条件下，11000rpm离心20min，加入1mLSM液重悬沉淀，即获得噬菌体颗粒浓缩液，4℃保存待用。
采用λ噬菌体基因组DNA试剂盒提取噬菌体核酸并进行测序。经过核苷酸测序，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
将黄单胞菌噬菌体XNJP8的序列在NCBI网站上比对可得该噬菌体属于Autographiviridae科噬菌体。
基因组测序组装结果显示，XNJP8基因组长度为44594bp，GC含量为62.4％。通过生物信息学软件对基因组进行注释，发现XNJP8的基因组上共编码55个蛋白，不编码tRNA基因，未发现已知的耐药基因和毒力基因。
实施例4：黄单胞菌噬菌体XNJP8效价的测定
用SM液做稀释液，将黄单胞菌噬菌体XNJP8(由实施例1制得)的原液10倍梯度逐级稀释至108倍。分别取105、106、107及108稀释度的噬菌体培养液1000μL与其宿主菌菌液300μL均匀混合，静置15min使其与细菌表面的受体充分结合。将上述混合液加入4mL冷却至50℃的半固体琼脂培养基中，混匀后立即铺于已凝固的固体琼脂平板上，待琼脂凝固后于28℃倒置培养6～8h。每个稀释度需做三个平行样，计数时取此稀释度的三个平行样的平均数。其中，噬菌体效价(PFU/mL)＝平均噬菌斑数×稀释倍数；
从表1可以得出，黄单胞菌噬菌体XNJP8培养12h后具有1010PFU/mL以上的效价。
表1培养12h后黄单胞菌噬菌体XNJP8的效价
培养时间 4h 8h 12h
噬菌体XNJP8效价(PFU/mL) 6.7x108 2.7x1010 6.5x1010
实施例5：黄单胞菌噬菌体XNJP8的毒力基因或不良基因缺失检测试验
本实施例选取103种经鉴定源自病原细菌体内溶源性噬菌体的毒力基因如表2所示，通过测定黄单胞菌噬菌体XNJP8的全基因组并对其进行生物信息学分析，以确定其是否含有下列毒力基因。结果显示，黄单胞菌噬菌体XNJP8不含有下列毒力基因或不良基因，所以无法编码可能引起潜在健康风险的蛋白，因此黄单胞菌噬菌体XNJP8不会影响人或动物体的健康。
表2病原细菌体内溶源性噬菌体的主要已知毒性基因
实施例6：毒理实验
实验小鼠20只，雌雄各半，适应性饲养三天后，随机分为两组(噬菌体组、对照组)，每组10只(雌雄各5只)，给予噬菌体组剂量为1010PFU/kg的黄单胞菌噬菌体XNJP8，对照组给予等量生理盐水，连续给药15d，将实验鼠断颈处死，检查内脏情况。
实验结果显示，此剂量的黄单胞菌噬菌体XNJP8对小鼠日常行为没有影响。解剖检查内脏未见异常。黄单胞菌噬菌体XNJP8具有生物安全性，可作为农作物病害防治制剂。
实施例7：黄单胞菌噬菌体XNJP8对黄单胞菌最佳感染复数(MOI)的测定
挑取宿主菌黄单胞菌XNJ-5单个菌落，接种到盛有3mL TSB液体培养基的试管中，在温度为28℃的摇床中，180rpm条件下过夜振荡培养，得到宿主菌悬液。将宿主菌悬液以1∶100比例转接到10mL TSB液体培养基，在温度为28℃、转速为180rpm条件下振荡培养至对数前期。按照MOI分别为100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001、0.00001、0.000001、0.0000001的比例分别加入噬菌体XNJP8纯化液(由实施例1制得)和噬菌体宿主菌(MOI＝纯化噬菌体溶液效价/噬菌体宿主菌浓度)，加入TSB液体培养基使各管总体积相同。在28℃摇床中180rpm振荡培养24h。培养完毕后10000g离心10min并收集上清培养液，采用双层平板法测定各处理噬菌体效价。各点均作双份复管培养取平均值，以产生最高噬菌体效价的MOI为最佳感染复数。实验重复3次。
表3不同感染复数下黄单胞菌噬菌体XNJP8的效价
由表3可知，培养24h条件下，噬菌体XNJP8效价达到最高6.8×1010PFU/mL时，其MOI＝0.00001。说明仅需少量初始黄单胞菌噬菌体，即可完成大量增殖。噬菌体XNJP8为工业化生产噬菌体杀菌剂提供了优质噬菌体菌株来源。
实施例8：黄单胞菌噬菌体XNJP8的pH和温度稳定性的测定
8-1：不同pH条件下黄单胞菌噬菌体XNJP8的稳定性
取无菌EP管分别加入pH＝1～14的TSB液体培养基900μL，将上述EP管置于25℃的恒温水浴中，待温度平衡后加入100μL纯化噬菌体溶液(实施例7制得)，使其初始效价为1×1010PFU/mL，室温下静置。分别于反应1h、4h、8h、24h及48h时进行取样，将各处理样本进行适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。实验重复3次。
表4噬菌体XNJP8在不同pH条件下的稳定性
结果如表4所示，黄单胞菌噬菌体XNJP8在pH＝4～11的条件下具有耐性，在48h内效价降低不超过2个数量级。表明其在中性、微酸和微碱条件下有较好的稳定性。
在pH＝3的酸性条件下和pH＝12的碱性条件下，噬菌体XNJP8的效价有一定程度的下降，但是与pH＝7条件下相比，效价下降约3个数量级，表明其在酸性和碱性条件下有较好的耐受性。在pH＝13的极碱性条件下处理8小时后，噬菌体XNJP8仍具有活性。
8-2：不同温度条件下黄单胞菌噬菌体XNJP8的稳定性
将效价为3.2×109PFU/mL的噬菌体XNJP8(实施例7制得)，分别置于20℃，40℃以及60℃条件下，定期取样检测其效价。
表5黄单胞菌噬菌体XNJP8在20℃条件下的稳定性
表6黄单胞菌噬菌体XNJP8在40℃条件下的稳定性
表7黄单胞菌噬菌体XNJP8在60℃条件下的稳定性
由表5～表7可知，20℃条件下，噬菌体XNJP8具有较好的稳定性，20℃条件下，噬菌体XNJP8存放2周后效价无明显降低；40℃条件下，噬菌体XNJP8在处理120h后效价下降约1个数量级；60℃条件下，噬菌体XNJP8在20h内效价下降约1个数量级。由此表明，噬菌体XNJP8在20～40℃条件下都具有较好的稳定性。
实施例9：黄单胞菌噬菌体XNJP8对紫外线的耐受能力测试
取10mL效价为3.2×109PFU/mL的XNJP8噬菌体(由实施例7制得)平铺于90mm无菌培养皿中后将其放入超净工作台内，置于紫外灯(20w，20cm)下照射。分别于0min、60min、8h、12h、24h、36h、72h取样并将其置于暗处30min后采用双层平板法测定噬菌体效价。
表8黄单胞菌噬菌体XNJP8在紫外线照射下的稳定性
结果如表8所示，紫外线照射8h时，黄单胞菌噬菌体XNJP8的效价下降一个数量级，因此，本发明的噬菌体对紫外线的耐受性较强。
实施例10：黄单胞菌噬菌体XNJP8对不同来源地的黄单胞菌的裂解能力试验
采用双层平板点滴法测定噬菌体的裂解谱。分别挑取自辽宁、陕西、山西、新疆、江苏和黑龙江等6省分离获得的49株黄单胞菌的单菌落，将其接种于盛有3mL TSB液体培养基的试管中，28℃下180rpm过夜培养，制得各株细菌菌液。取500μL菌悬液分别与TSB半固体琼脂培养基混合铺于普通琼脂平板上，取5μL纯化噬菌体XNJP8溶液(由实施例1制得)点滴于平板上，待自然风干后28℃过夜培养，观察结果。
表9黄单胞菌噬菌体XNJP8对不同来源地的黄单胞菌的裂解结果
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注：“+++”完全透亮；“++”中等透亮；“+”轻微透亮；不裂解的为“-”。
结果如表9所示，噬菌体XNJP8对不同来源地的黄单胞菌均具有较强的裂解能力，其裂解率可达90％。黄单胞菌噬菌体XNJP8具有较宽的裂解谱。
实施例11：黄单胞菌噬菌体XNJP8对非致病性有益细菌的裂解试验
挑取5株非致病性根瘤菌，5株非致病性枯草芽孢杆菌分别接种于盛有3mL TSB液体培养基的试管中，30℃下180rpm培养8h，制得各株细菌菌液。取300μL菌悬液分别与TSB半固体琼脂培养基混合铺于普通琼脂平板上。分别取5μL纯化噬菌体XNJP8溶液(由实施例1制得)滴于平板上，待自然风干后30℃培养24h，观察结果。
表10黄单胞菌噬菌体XNJP8对非致病性有益细菌的裂解试验
注：“+++”完全透亮；“++”中等透亮；“+”轻微透亮；不裂解的为“-”。
结果如表10所示，在本实施例中，噬菌体XNJP8均无法识别上述10株非致病性细菌。说明供试噬菌体具有极强的宿主特异性，且对微生物群落无损伤作用。
实施例12：黄单胞菌噬菌体XNJP8溶原性鉴定
将100μL(OPFU/mL，1.0×104PFU/mL，1.0×105PFU/mL，1.0×106PFU/mL，1.0×107PFU/mL)的噬菌体XNJP8(实施例7制得)与100μL黄单胞菌XNJ-5(1.0×108cfu/mL)分别混合后接种于含有10mL TSB液体培养基的50mL离心管中，28℃下振荡培养48h。将所获混浊培养液在TSA平板上梯度稀释涂布，置于28℃培养箱中培养48h。在TSA平板上挑取30～50个单菌落的中心部位，将其置于含有200μL TSB液体培养基的EP管中，于28℃下振荡培养24h；随后向EP管中加入终浓度为0.5μg/mL的丝裂霉素C，继续培养12h；将所获培养液用0.22μm滤膜过滤除菌后点滴在XNJ-5双层平板上，置于28℃培养；同时将效价为1.0×107PFU/mL的噬菌体XNJP8(实施例7制得)点滴在双层平板上作为阳性对照。24h后观察双层平板，如果出现噬菌斑，则证明噬菌体XNJP8为溶原性噬菌体。
结果显示，对照平板均有噬菌斑出现(图3)，而所有试验平板均无噬菌斑出现(图4)，说明黄单胞菌噬菌体XNJP8不具有溶原性，为烈性噬菌体。
实施例13：浊度法检测黄单胞菌噬菌体XNJP8对黄单胞菌的抑菌率
挑取宿主菌XNJ-5的单菌落接种于盛有3mL TSB的试管中，28℃下180r/min过夜培养至浑浊，制得宿主菌菌液；将效价为2×1010PFU/mL的噬菌体XNJP8(实施例7制得)以无菌水逐步梯度稀释至各处理组效价。如表11所示，取100μL XNJ-5菌液与100μL各稀释处理的噬菌体XNJP8分别加入各盛有10mL TSB液体培养基的50mL离心管中，同时以100μL XNJ-5菌液与10mL TSB液体培养基混合后的处理作为阳性对照，28℃、120r/min培养24h，用浊度仪测各处理组浑浊度值。抑菌率＝(阳性处理浊度-处理组浊度)/阳性处理浊度×100％；
表11黄单胞菌噬菌体XNJP8对黄单胞菌的抑菌效果
由表11可知，约101PFU/mL的噬菌体XNJP8对XNJ-5的抑菌率即可达到88.56％单胞菌噬菌体XNJP8在极低的剂量下即可有效抑菌杀菌。
实施例14：黄单胞菌噬菌体XNJP8的冻干粉的制备
步骤1，发酵培养：将黄单胞菌噬菌体XNJP8和宿主菌XNJ-5种子液接种到发酵培养基中，28℃下发酵4～30h，获得噬菌体发酵液，发酵液经0.22μm膜除菌，获得噬菌体发酵液；
步骤2，分离提取：将步骤1中的发酵液通过采用絮凝、离心或膜过滤中的一种或多种分离工艺，获得发酵除菌清液和菌体；
步骤3，无菌包装：将步骤2中的发酵除菌清液无菌包装，获得噬菌体XNJP8的水剂；向步骤2中的噬菌体水剂添加菌体量1～10倍量的保护剂，乳化混匀后干燥，粉碎过筛，无菌包装，获得噬菌体XNJP8粉剂；
步骤4，储存保藏：将步骤3获得的粉剂，置于-30～30℃的温度条件下进行储存保藏。本发明噬菌体粉剂可直接应用到田间。
实施例15：黄单胞菌噬菌体XNJP8对大豆细菌性斑疹病的防治
将大豆种子以20％的次氯酸钠溶液消毒20分钟，用无菌水冲洗干净，再置于含有湿润滤纸的平板中，25℃下催芽，出芽后播种于装有等比例灭菌营养土和蛭石的花盆中，每盆5株。待大豆长出三片复叶后，可接种使用。
选取健康大豆300株，随机分为5组(噬菌体3组、对照组和空白组)，每组60株。噬菌体实验组各处理为：将噬菌体XNJP8粉剂(实施例14制得)以无菌蒸馏水进行稀释，使其终浓度分别为1x104PFU/mL、1x105PFU/mL及1x106PFU/mL。
将黄单胞菌(Xanthomonas sp.)ACCC 11705单菌落接入TSB培养基中，28℃下220r·min-1摇培24h，6000r离心收集细菌菌体，以无菌蒸馏水将细菌菌体配制成1x108CFU/mL浓度的菌液，将菌液以直接喷雾的方法接种至除空白组外的供试大豆叶片上，空白组给予喷洒等量无菌生理盐水；接种菌液6h后，将噬菌体各处理组液体均匀喷洒至相应组别大豆叶片上，对照组及空白组大豆叶片喷洒等量无菌生理盐水。上述处理接种后均在透明塑料薄膜罩内保湿3天，置于28～30℃，湿度90％条件下培养。自接种起统计第7d、15d及20d的大豆细菌性斑疹病的发病率，发病率＝发病株数/总株数×100％。
表12黄单胞菌噬菌体XNJP8对大豆细菌性斑疹病的影响
时间 104PFU/mL 105PFU/mL 106PFU/mL 对照组 空白组
0d 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
7d 8.3％ 5％ 0％ 26.7％ 0％
15d 31.7％ 20％ 11.7％ 71.7％ 0％
20d 36.7％ 28.3％ 13.3％ 81.7％ 0％
由表12可知，对照组的大豆在接种20d时，大豆细菌性斑疹病的发病率达到81.7％。而噬菌体各实验组中，噬菌体XNJP8浓度越高，大豆发病率越低；噬菌体XNJP8浓度为106PFU/mL时，接种20d后，大豆发病率保持在15％以内。表明黄单胞菌噬菌体可以用作生物杀菌剂，有效防治大豆细菌性斑疹病。
实施例16：黄单胞菌噬菌体XNJP8对油菜黑腐病的防治
将油菜种子经0.1％HgCl2消毒20分钟，用无菌水冲洗干净。均匀播种于无菌小钵承装的无菌土壤中，待生长至三叶期时选取健康油菜300株，随机分为5组(噬菌体3组、对照组和空白组)，每组60株。噬菌体实验组各处理为：将噬菌体XNJP8粉剂(实施例14制得)以无菌蒸馏水进行稀释，使其终浓度分别为1x104PFU/mL、1x106PFU/mL及1x106PFU/mL。
将野油菜黄单胞菌(X.campestris)CGMCC 1.3408单菌落接入TSB培养基中，28℃下220r·min-1摇培24h，6000r离心收集细菌菌体，以无菌蒸馏水将细菌菌体配制成1x108CFU/mL浓度的菌液，将菌液以直接喷雾的方法接种至除空白组外的供试油菜叶片上，空白组给予喷洒等量无菌生理盐水；接种菌液6h后，将噬菌体各处理组液体均匀喷洒至相应组别油菜叶片上，对照组及空白组油菜叶片喷洒等量无菌生理盐水。上述处理接种后均在透明塑料薄膜罩内保湿3天，置于25～28℃，湿度90％条件下培养。自接种起统计第5d、10d及15d的油菜黑腐病的发病率，发病率＝发病株数/总株数×100％。
表13黄单胞菌噬菌体XNJP8对油菜黑腐病的影响
时间 104PFU/mL 105PFU/mL 106PFU/mL 对照组 空白组
0d 0％ 0％ 0％ 0％ 0％
5d 6.7％ 3.3％ 0％ 26.7％ 0％
10d 11.7％ 11.7％ 5％ 46.7％ 0％
15d 20％ 16.7％ 10％ 91.7％ 0％
由表13可知，对照组的油菜在接种15d时，油菜黑腐病的发病率达到91.7％。而噬菌体各实验组中，噬菌体XNJP8浓度越高，油菜发病率越低；噬菌体XNJP8浓度为106PFU/mL时，接种15d后，油菜发病率保持在10％以内。表明黄单胞菌噬菌体可以用作生物杀菌剂，有效防治油菜黑腐病。
综上所述，借助于本发明的上述技术方案，本发明的黄单胞菌噬菌体XNJP8安全性高，可用作为制备试剂盒以及生物类消毒剂或生物类农药的有效成分，防治由黄单胞菌引起的饲料作物各类细菌性疾病。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体为黄单胞菌噬菌体XNJP8，其于2022年03月17日被保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M2022272。
2.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8为烈性噬菌体，有一呈多面体立体对称的头部和可伸缩的尾部，属于Autographiviridae科噬菌体。
3.根据权利要求2所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述头部直径为45～60nm，所述尾部的长度为10～15nm，所述尾部直径为8～10nm。
4.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8基因组长度为44594bp，GC含量为62.4％。
6.根据权利要求5所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8的基因组上共编码55个蛋白，不编码tRNA基因，未发现已知的耐药基因和毒力基因。
7.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8在感染复数MOI＝0.00001条件下培养24h，效价达到6×1010PFU/mL以上。
8.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8在pH＝4～11的条件下具有耐性，在48h内效价降低小于2个数量级。
9.根据权利要求1所述的一种应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体，其特征在于，所述黄单胞菌噬菌体XNJP8经紫外辐射8h后，效价降低小于1个数量级。
10.权利要求1所述的应用于饲料作物细菌病害的黄单胞菌噬菌体在制备冻干粉中的应用。
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