CN113337479B - 一种河流弧菌噬菌体yzu.v.f.p-21612c及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种河流弧菌噬菌体YZU.V.F.P‑21612C及其应用，该噬菌体经鉴定具有独特的基因组结构特征，属于一种新型噬菌体，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年12月7日，保藏编号为CCTCC NO：M2020867。本发明获得河流弧菌噬菌体YZU.V.F.P‑21612C，对河流弧菌具有高效裂解活性，并能减少或抑制其生物被膜的形成，可作为抑菌剂控制水产品暂养水体或加工环境、器具等环境中河流弧菌的繁殖与代谢、减除环境或器具上形成的生物被膜，有效降低河流弧菌的污染和传播，从而降低养殖和食品安全风险。

Description

一种河流弧菌噬菌体YZU.V.F.P-21612C及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种霍氏肠杆菌噬菌体YZU.P.A-5及其作为生物抗菌剂在食品生产、贮藏环境中的抑菌应用。

背景技术

河流弧菌(V.fluvialis)是一种嗜盐性弧菌，广泛存在于河流或出海口水中，可导致鱼虾贝等多种水生动物患病，是海水养殖的主要病原菌之一，可造成巨大经济损失。河流弧菌同时也是一种食源性病原体，人体通过摄入污染的水、食物而感染，主要引起人类急性胃肠道炎症，典型症状是水样便、腹痛、轻到中度脱水、常伴有发热，在孟加拉国和印度引发过大规模疫情，在美国也偶有报道。目前，水产品的细菌性疾病的治疗和预防的手段主要是使用抗生素，然而，细菌耐药性和药物残留等问题已日益严峻。

目前用于控制水产品加工环境中致病菌生长的常规抑菌剂主要有化学制剂，但其对环境的污染也无法满足近年来人们对绿色环保的需求。近年来出于对食品安全和绿色保鲜的需求，人们从动植物或微生物中提取一些天然成分作为生物抑菌剂，如ε-聚赖氨酸、大蒜素、壳聚糖、茶多酚等。这些抑菌剂虽能抑制河流弧菌的生长，但效果不佳、且制备成本高。此外，河流弧菌在生长过程中，极易在食品、加工器具的表面形成生物被膜，被膜内的细菌对常规保鲜剂、抑菌剂的抵抗能力可以提高数百倍，很难被清除，从而导致持续性污染，给水产品和肉制品加工和保鲜带来严重危害。因此亟需开发新型生物保鲜剂应用于水产和肉制品加工与贮藏。

噬菌体因其宿主专一性，自然界资源丰富，安全环保等优势受到了人们的广泛关注，世界各国在噬菌体资源、生物学特性以及在各种基质中的抑菌等方面开展了大量研究，在美国和欧洲国家已经形成沙门氏菌、李斯特菌等病原菌的商品化生物抑菌剂，在食品生产和加工、动植物养殖和加工等环境中控制病原菌的生长繁殖具有高效、廉价、安全等优势。国内外对河流弧菌噬菌体的研究不够多，高效专一的河流弧菌噬菌体抑菌剂探讨仍不充分。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种对河流弧菌具有强烈裂解作用的噬菌体，该噬菌体可以有效抑制动物养殖环境和食品生产环境中河流弧菌的生长与代谢，为动物和食品清洁生产提供一种安全、高效、廉价的生物抗菌产品。

本发明还提供所述噬菌体的应用。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一种河流弧菌噬菌体(Vibirofluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年12月7日，保藏地址：武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M 2020867。

本发明所述的河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C在抑制河流弧菌中的应用。

进一步地，所述河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C在抑制水产品暂养水体或加工环境、器具环境中河流弧菌的繁殖与代谢中的应用。

进一步地，所述河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C在抑制或者清除水产品暂养水体或加工环境、器具环境中河流弧菌所产生的生物被膜中的应用。

本发明所述的河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C在制备河流弧菌抑菌剂或者生物抗菌剂中的应用。

其中，所述河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C分离物或培养物作为抑菌剂成分。

其中，所述抑菌剂制备为：将河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C与对数生长期的河流弧菌菌液混合，室温放置，然后加到LB液体培养基，恒温振荡过夜培养；将培养物离心收集上清液，过滤，收集噬菌体增殖液，加PEG 8000和NaCl，摇匀至溶解，过夜；离心去上清液；加SM缓冲液，室温反应；使用氯仿抽提；离心回收含YZU.V.F.P-21612C颗粒的亲水相，将获得的YZU.V.F.P-21612C颗粒与SM缓冲液混合，制成噬菌体抑菌剂母液。

本发明所述河流弧菌抑菌剂或者生物抗菌剂的使用过程，包括如下步骤：

将河流弧菌噬菌体抑菌剂母液用水稀释并制成喷洒液或淋洗液，对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少水产品及其环境、加工器具表面的河流弧菌载量或降低和抑制生物被膜的形成。

本发明中河流弧菌噬菌体YZU.V.F.P-21612C具有以下生物学特征：

(1)形态学特征：通过透射电镜观察，YZU.V.F.P-21612C头部对称，直径约为46.26nm，无尾，形态学特征归属盖噬菌体科。

(2)噬菌体核酸类型：YZU.V.F.P-21612C为dsDNA噬菌体。

(3)噬菌体基因组特征：YZU.V.F.P-21612基因组全长为39726bp，其中编码基因总长度分别为42806bp，平均长度为903bp，占总长的92.8％，GC含量为49.38％，有44个开放阅读框(ORFs)。YZU.V.F.P-21612的44个ORFs编码蛋白中有12个ORFs在数据库中未找到同源性基因，34个ORFs编码的蛋白找到同源性序列，其中包括22个假设蛋白(hypotheticalprotein)，和11个已知蛋白功能的序列。在Genbank数据库比对数据显示YZU.V.F.P-21612是一株新的噬菌体。

(4)具有强烈裂解河流弧菌性能。

(5)能够抑制和消除河流弧菌生物被膜形成。

本发明将上述河流弧菌噬菌体YZU.V.F.P-21612C制备成一种河流弧菌噬菌体抑菌剂，专门用于控制水产品及其环境、加工器具中河流弧菌的污染和生长，减少水产品安全的风险。分别取100μL YZU.V.F.P-21612C噬菌体液与等体积对数期生长期的河流弧菌菌液混合，室温放置10min，然后加到10mL LBS液体培养基中，37℃，150rpm恒温振荡过夜培养；将培养物转至灭菌离心管，5000×g离心10min后收集上清液，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌。收集噬菌体增殖液，加0.93g PEG 8000，0.58g NaCl，摇匀至溶解，4℃过夜；10000×g 4℃离心20min，去上清液；加0.5mL SM(1L：NaCl 5.8g，MgSO₄.7H₂O 2.0g，1M Tris-HCl(pH7.4)50mL)溶液，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提30s；3000×g 4℃离心15min回收含有噬菌体颗粒的亲水相。将获得的YZU.V.F.P-21612C颗粒与SM缓冲液按1:10比例混合，制成噬菌体抑菌剂母液。

本发明河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C制备的制剂可以单独或复配作为抑菌剂的主要成分，有效抑制动物养殖环境和食品生产环境中河流弧菌的生长与代谢，为动物和食品清洁生产提供一种安全、高效、廉价的生物抗菌产品，并且为加入其他抑菌剂成分做出复配抑菌剂做准备。

有益效果：与现有技术相比较，本发明分离获得能够专项高效裂解河流弧菌的噬菌体YZU.V.F.P-21612C，具有独特的形态和基因组特征，是一株全新的有效抑制河流弧菌的噬菌体。该噬菌体YZU.V.F.P-21612C可以应用于制备绿色、廉价的河流弧菌抑制剂中。

本发明的噬菌体制备形成的生物抑菌剂能够在培养基和水产品的贮藏中有效控制河流弧菌的生长，同时可以高效抑制河流弧菌菌膜的形成，并且容易制备成喷洒液或淋洗液，对水产品及其环境、加工器具中的河流弧菌进行清除，减少该菌的污染；本发明的噬菌体属于天然生物材料，基因组中不含任何毒力基因，没有毒副作用，可以作为水产品及其储放器皿、环境的抑菌剂，降低河流弧菌传播和引发食源性疾病的风险。

附图说明

图1噬菌体YZU.V.F.P-21612C噬菌斑形态。

图2噬菌体YZU.V.F.P-21612C透射电镜图片。

图3噬菌体YZU.V.F.P-21612C全基因组图谱。

图4噬菌体YZU.V.F.P-21612C在培养基中对河流弧菌生长的抑制作用。

图5噬菌体YZU.V.F.P-21612C对河流弧菌生物膜的抑制作用。图中黑色柱状图(Control)表示未加噬菌体的河流弧菌(CICC21612)对照组；白色柱状图(Blank)为未加菌液的空白对照组；柱A-E分别为105、106、107、108、109PFU/mL浓度噬菌体处理的试验组。

图6噬菌体YZU.V.F.P-21612C对河流弧菌生物被膜的去除作用。图A表示未加噬菌体的河流弧菌(CICC21612)对照组，图B表示加噬菌体YZU.V.F.P-21612C作用4h后的实验组。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。

本发明试验用噬菌体宿主菌河流弧菌(Vibrio Fluvialis，菌株号：CICC21612)，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

实施例1

噬菌体分离及纯化制备

噬菌体分离

污水样品采自江苏省扬州市农贸市场。取30mL污水样品放入50mL离心管，5000×g离心10min，取5mL上清液加入到5mL LBS液体培养基中，同时加入100μL对数生长期的河流弧菌菌株CICC21612，37℃，100rpm摇床培养过夜；将试管中培养物转至无菌离心管中，4℃，5000×g离心10min，取上清过0.22μm滤膜，得到噬菌体原液。

用SM缓冲液(1L：NaCl 5.8g，MgSO4.7H2O 2.0g，1M Tris-HCl(pH7.4)50mL)对噬菌体原液按体积比进行10梯度稀释，取100μL稀释的噬菌体悬液与100μL对数生长期的河流弧菌在室温下混合10min，再加入5mL LBS半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的LBS固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在37℃恒温培养箱中培养。

在上述出现噬菌斑的双层平板上挑取透明单个空斑至1mL SM缓冲液中，混匀，4℃放置24h；次日用无菌的SM缓冲液对噬菌体液进行倍比稀释(10^-1-10^-7)，取各个稀释度的噬菌体液体100μL与100μL对数生长期的河流弧菌在室温下混合10min，再加入5mL LBS半固体培养基，混匀，快速倾倒在事先制好的LBS固体培养基上，制成双层平板，凝固后倒置放在37℃恒温培养箱中培养。重复双层平板法的操作3次，得到的噬菌斑大小一致后，即认为分离到的是纯的噬菌体，挑取50个噬菌体空斑至1mL SM缓冲液中，混匀，4℃放置24h；于次日取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得噬菌体分离液，4℃保存备用。采用双层平板检测纯化噬菌体裂解效果。在5mL融化好的LBS半固体培养基中加入100μL河流弧菌培养物(对数生长期的河流弧菌CICC21612菌液)，立即倾倒在底层LBS固体培养基上，在室温下放置10min，待培养基凝固后，在划分好的区域中分别滴加各液体增殖后的噬菌体(即噬菌体分离液)10μL，在无菌操作台中吹干后将平板倒置于37℃培养箱中培养，筛选在菌株CICC21612平板上的裂解圈呈现明亮清澈的噬菌体，得到一株噬菌体，命名为YZU.V.F.P-21612C。

噬菌体的纯化

取100μL河流弧菌噬菌体YZU.V.F.P-21612C噬菌体分离液与100μL对数期生长期的河流弧菌菌液混合，室温放置10min，然后加入10mL LBS液体培养基，37℃，150rpm恒温振荡培养过夜；将培养物转至灭菌离心管，5000×g离心10min后收集上清，通过0.22μm微孔滤膜过滤除菌；收集噬菌体增殖液，加0.93g PEG 8000，0.58g NaCl，摇匀至溶解，4℃放置过夜；4℃条件下10000×g离心20min，去上清，加0.5mL SM[1L：NaCl 5.8g，MgSO₄.7H₂O 2.0g，1MTris-HCl(pH7.4)50mL]溶液，室温作用1h；加入等体积氯仿抽提30s；3000×g离心15min，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，即为噬菌体纯化液；用双层平板检测纯化噬菌体滴度，具体程序为：用SM缓冲液对噬菌体纯化液进行10倍梯度稀释(10^-1-10^-7)，取各稀释度的噬菌体稀释液100μL与100μL对数生长期的河流弧菌在室温下混合10min，再加入5mL LBS半固体培养基，混匀，倾倒在LBS固体培养基上，凝固后倒置放在37℃恒温培养箱中过夜培养，对形成的空斑进行人工计数，计算滴度。同时用河流弧菌CICC21612(对数期)进行空斑计数并计算滴度。结果显示纯化后YZU.V.F.P-21612C对菌株CICC21612滴度达到10⁹PFU/mL以上，在稀释平板上形成的噬菌斑明亮清澈、大小均一(如图1所示)。

噬菌体YZU.V.F.P-21612C形态特征

用透射电镜观察噬菌体微观形态特征。采用磷钨酸负染色法，将铜网有膜的一面朝上，取10μL噬菌体YZU.V.F.P-21612C纯化液(10⁹PFU/mL)滴于铜网上，吸附15min后吸干水分，取出铜网，自然干燥2-3min。然后在铜网上滴加2％的磷钨酸(PTA)水溶液进行染色，2min后取下，用吸水纸吸干水分，空气中干燥5min，用透射电镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照分析。YZU.V.F.P-21612C微观形态如图2所示，噬菌体YZU.V.F.P-21612C呈现头部对称，直径约为46.26nm，无尾，形态学特征归属盖噬菌体科。

噬菌体YZU.V.F.P-21612C基因组特征

将上述制备的噬菌体YZU.V.F.P-21612C纯化液(10⁹PFU/mL)加DNase I至终浓度5μg/mL，RNase A至1μg/mL，37℃温育1h；加入EDTA(pH 8.0)至终浓度20mmol/L；加蛋白酶K至终浓度50μg/mL，加SDS至终浓度0.5％(mg/mL)，混匀，56℃孵育1h；加入等体积平衡酚(pH8.0)振荡抽提，5000×g离心10min，收集上层水相；用等体积氯仿抽提，5000×g离心10min，收集上层水相；加入1/10体积3mol/L NaAc(pH 5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜；4℃，12000×g离心10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，沉淀在空气中干燥10min；用适量TE(pH 8.0)混悬沉淀，应用GeneQuant核酸定量仪进行噬菌体DNA定量，-20℃保存；提取获得的噬菌体DNA送至上海凌恩生物基因测序有限公司进行Illumina Hiseq测序。

噬菌体DNA测序结果(如图3所示)YZU.V.F.P-21612基因组全长为39726bp，其中编码基因总长度分别为42806bp，平均长度为903bp，占总长的92.8％，GC含量为49.38％，有44个开放阅读框(ORFs)。YZU.V.F.P-21612的44个ORFs编码蛋白中有12个ORFs在数据库中未找到同源性基因，34个ORFs编码的蛋白找到同源性序列，其中包括22个假设蛋白(hypothetical protein)，和11个已知蛋白功能的序列，同源性在43％至100％之间。与Genbank数据库中噬菌体基因组数据比对显示YZU.V.F.P-21612是一株新的噬菌体。同时，基因组分析结果显示YZU.V.F.P-21612不存在任何已知的毒力基因。结合噬菌体的生理生化特征，初步鉴定为河流弧菌噬菌体，命名为河流弧菌噬菌体(Vibiro fluvialis phage)YZU.V.F.P-21612C。将该噬菌体保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：武汉武汉大学；保藏编号：CCTCC NO：M 2020867；保藏时间为2020年12月7日。

实施例2

噬菌体YZU.V.F.P-21612C在培养基中的抑菌作用

将河流弧菌(菌株CICC21612)按10⁵CFU/mL接种到30mL LBS液体培养基，噬菌体处理组中分别加入噬菌体YZU.V.F.P-21612C和VmYZU10474(专利CN 112063593A中致病性弧菌噬菌体VmYZU10474)悬液至10⁹PFU/mL，阴性对照组中加入等体积SM缓冲液(0PFU/mL)，经处理的接种物分别放置在37℃培养箱中恒温培养，每隔2h取样1mL，用涂布法测量其菌落总数，每组设置3个平行，取平均值用于分析。

实施结果如图4所示，随着培养时间延长，阴性对照组的菌落总数快速增长，12h时达到10⁸CFU/mL，而添加噬菌体组的菌落总数低于对照组，其中YZU.V.F.P-21612C处理组的菌落总数在培养至12h时仍能保持在最初的菌落数水平，比对照组低约10⁵CFU/mL，比噬菌体VmYZU10474处理组低约10²CFU/mL，表明本发明中YZU.V.F.P-21612C噬菌体在培养基中对河流弧菌生长起到显著抑制作用，且效果明显优于VmYZU10474，并且从特征上看，尤其是基因组特征上看是不同与噬菌体VmYZU10474，是一个新种。

实施例3

噬菌体YZU.V.F.P-21612C对河流弧菌生物被膜的抑制作用

取对数生长期的河流弧菌培养物(河流弧菌CICC21612菌液)，用LBS培养基稀释，调节最终浓度为1×10⁷CFU/mL。试验分成YZU.V.F.P-21612C处理组，阴性对照组，空白组。YZU.V.F.P-21612C处理组：在96孔板中每孔加入150μL浓度为10⁷CFU/mL河流弧菌(CICC21612)菌液和150μL噬菌体YZU.V.F.P-21612C悬液(A处理为噬菌体10⁵PFU/mL、B处理为10⁶PFU/mL、C处理为10⁷PFU/mL、D处理为10⁸PFU/mL、E处理为10⁹PFU/mL)；阴性对照组：在无菌96孔板中每孔加入菌液(10⁷CFU/mL)和SM缓冲液各150μL；空白组：每孔加300μL LBS培养基；37℃培养24h，取出96孔板，吸出悬浮菌液，用无菌PBS洗涤3次，充分除去浮游菌体；每孔加入200μL浓度为0.2％的结晶紫染色液，染色30min；吸出染色液，用PBS清洗96孔板至洗出液呈无色，室温吹干；每孔加入200μL的33％醋酸脱色剂，振荡溶解，利用酶标仪测定600nm处的OD值，每组平行测定5次，取平均值用于分析。

实施结果如图5所示，加入10⁵PFU/mL、10⁶PFU/mL、10⁷PFU/mL、10⁸PFU/mL、10⁹PFU/mLYZU.V.F.P-21612C悬液的试验组(A、B、C、D、E处理组)的OD_600nm均显著低于阴性对照组(p<0.001)，表明YZU.V.F.P-21612C显著抑制了河流弧菌生物膜形成。

实施例4

噬菌体YZU.V.F.P-21612C对河流弧菌生物被膜的去除作用

取河流弧菌(CICC21612)菌液(10⁷CFU/mL)1mL于无菌24孔板中，并置入灭菌圆形玻璃爬片后在37℃培养箱静置24h，用无菌PBS清洗去除浮游菌，实验组加入1mL噬菌体YZU.V.F.P-21612C悬液(10⁸PFU/mL)；对照组加入1mL LBS液体培养基；37℃处理4h；取出爬片，PBS清洗3次，加入2.5％的戊二醛溶液固定过夜，再用PBS洗涤爬片，然后依次用30％、50％、70&、80％、90％、100％乙醇(两次)逐级梯度脱水；完成后将爬片浸入含有无水硫酸钠的无水乙醇中，等待干燥；取出爬片，采用二氧化碳临界点干燥器对爬片进行干燥，粘台、喷金，用扫描电镜观察爬片上膜的生长情况并拍照。

实施结果如图6所示，河流弧菌(CICC21612)生物膜形成情况如图6(A)所示，细菌吸附在玻璃爬片表面生长24h后，爬片表面单菌落聚合，生物膜形成，生物膜表面附着细胞碎片及各种代谢物，经噬菌体作用4h后生物膜情况如图6(B)所示，爬片上只见少量零星的生物膜或细胞碎片，由此可见，噬菌体YZU.V.F.P-21612C能显著清除河流弧菌(CICC21612)的生物被膜。

上述试验结果表明本发明噬菌体能够有效控制河流弧菌的生长，同时可以高效抑制河流弧菌菌膜的形成。对水产品及其环境、加工器具中的河流弧菌进行清除，减少该菌的污染；用于制备河流弧菌抑菌剂或者生物抗菌剂中的应用。

Claims (8)

1.一种河流弧菌噬菌体（Vibiro fluvialis phage）YZU.V.F.P-21612C，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年12月7日，保藏编号为CCTCC NO：M 2020867。

2.权利要求1所述的河流弧菌噬菌体（Vibiro fluvialis phage）YZU.V.F.P-21612C在抑制水产品暂养水体或加工环境、器具环境中河流弧菌中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述河流弧菌噬菌体（Vibiro fluvialis phage）YZU.V.F.P-21612C在抑制水产品暂养水体或加工环境、器具环境中河流弧菌的繁殖与代谢中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述河流弧菌噬菌体（Vibiro fluvialis phage）YZU.V.F.P-21612C在抑制或者清除水产品暂养水体或加工环境、器具环境中河流弧菌所产生的生物被膜中的应用。

5.权利要求1所述的河流弧菌噬菌体（Vibiro fluvialis phage）YZU.V.F.P-21612C在制备河流弧菌抑菌剂或者生物抗菌剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述河流弧菌噬菌体（Vibiro fluvialis phage）YZU.V.F.P-21612C的分离物或培养物作为抑菌剂成分。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抑菌剂制备为：将河流弧菌噬菌体（Vibiro fluvialis phage）YZU.V.F.P-21612C与对数生长期的河流弧菌菌液混合，室温放置，然后加到LB液体培养基，恒温振荡过夜培养；将培养物离心收集上清液，过滤，收集噬菌体增殖液，加PEG 8000和NaCl，摇匀至溶解，过夜；离心去上清液；加SM缓冲液，室温反应；使用氯仿抽提；离心回收含YZU.V.F.P-21612C颗粒的亲水相，将获得的YZU.V.F.P-21612C颗粒与SM缓冲液混合，制成噬菌体抑菌剂母液。

8.一种权利要求5所述河流弧菌抑菌剂或者生物抗菌剂的使用过程，其特征在于，包括如下步骤：

将河流弧菌噬菌体抑菌剂母液用水稀释并制成喷洒液或淋洗液，对生产环境、生产器具的喷洒或洗涤，减少水产品及其环境、加工器具表面的河流弧菌载量或降低和抑制生物被膜的形成。

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