CN109182230A - 一种防治红豆杉叶枯病的植物内生枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种防治红豆杉叶枯病的植物内生枯草芽孢杆菌及其应用，属于农作物病害防治技术领域。所述植物内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BS193，已于2017年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13936。本发明所述的枯草芽孢杆菌菌株BS193是从番茄植株体内分离获得，能够有效抑制红豆杉叶枯病菌的生长，抑菌谱广，对番石榴焦腐病菌、花生黄曲霉、香蕉枯萎病菌、大豆腐霉、番茄早疫病菌、辣椒疫霉、荸荠枯萎病菌、芦笋茎枯病菌、辣椒炭疽病菌等多种病原菌都有拮抗作用，与环境相容性好，具有良好的开发应用前景。

Description

一种防治红豆杉叶枯病的植物内生枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种防治红豆杉叶枯病的植物内生枯草芽孢杆菌及其应用，属于农作物病害防治技术领域。

背景技术

红豆杉属于裸子植物，能产生可合成抗癌药物的紫杉醇，具备很好的药用价值，是世界上公认濒临灭绝的自然珍稀抗癌植物，红豆杉叶枯病是红豆杉上的严重病害，由拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）引起，该病主要危害红豆杉叶片部分，使叶片枯黄逐渐坏死，最终导致红豆杉死亡。目前该病的流行频率及危害程度逐渐加重，严重影响红豆杉的生长。

目前为止，红豆彬叶枯病的防治主要还是依靠化学农药大量使用。化学农药对农业的发展虽然起着重要的作用，但长期不合理使用会带来许多负面影响。化学农药的高毒、高残留不仅对人、畜的健康造成危害，而且对土壤、水体、大气造成严重污染，破坏生态平衡。许多国家和地区已经相继禁止了一些高毒、高残留化学农药的生产和使用。在当今人们越来越关注自己的生存环境，以及越来越提倡绿色生活的时代，探索病害的生物防治已引起国内外学者的普遍重视。迄今,国内对红豆杉叶枯病尚无生物防治的报道。

土壤是各种微生物良好的栖息环境，生存着许多具有相互拮抗作用的微生物。利用植株上附生的或根际土壤中的拮抗细菌及其代谢产物调控根围有害微生物的平衡以达到控病保产的目的是病害防治的重要途径，筛选高效和活性稳定的拮抗菌株则是保证生物防治获得成功的先决条件。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌的一种，不仅可以在土壤、植物根际体表等外界环境中广泛存在，而且是植物体内常见内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。枯草芽孢杆菌在自然界中广泛存在，并具有繁殖快、适应性强，对环境友好、对作物安全、对人畜无害、抗菌谱广等优点，因而在多种植物上都显示出很好的病害防治效果。

据报道，目前具有抗病作用的枯草芽孢杆菌多为植物根际微生物，而从植物组织内分离获得的防病内生性枯草芽孢杆菌则很少，从茄子组织中分离获得能防治中草药病害的枯草芽孢杆菌尚未见报道。本发明的目的是针对目前红豆彬叶枯病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种高效防治红豆彬叶枯病的生防枯草芽孢杆菌及其应用方法，从而开发出新型的生防菌剂，满足无公害农产品生产的要求。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前红豆彬叶枯病严重发生，且面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的问题，提供一种防治红豆杉叶枯病的植物内生枯草芽孢杆菌及其应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种防治红豆彬叶枯病的植物内生枯草芽孢杆菌菌株BS193，经形态观察、培养特征观察和分子生物学研究鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，已于2017年3月27月保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路l号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 13936。

所述的植物内生枯草芽孢杆菌BS193菌剂的制备过程如下：

将所述的菌株接种于LB液体培养基中，30℃，180 r/min，培养24 h，制成种子液。取10mL种子液接种于发酵培养基中。经优化后得到的发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g 酵母粉、10 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1000 mL，溶解并调pH值为7.0-7.2。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量5% v/v、装瓶量100mL /250mL，发酵培养基pH值7.0-7.2、30℃，180 r/min，培养48 h，制成浓度为10⁸ CFU/ml的BS193菌株发酵液。将发酵液经4 ℃, 6000 r/min离心20 min后，用0.22 µm细菌过滤器过滤得无菌滤液。

所述的植物内生枯草芽孢杆菌在防治红豆杉叶枯病的应用。

所述的植物内生枯草芽孢杆菌BS193菌剂抑制红豆彬叶枯病菌菌丝生长的方法如下：

菌株BS193对红豆杉叶枯病菌菌丝生长的抑制作用：采用平板对峙培养法，在PDA与LB等比例混合培养皿正中央接种菌龄一致、直径7 mm的拟盘多毛孢菌丝块，在距离菌块相对两侧2.5 cm处用接种环蘸取等量BS193菌液划线，以未接BS193的拟盘多毛孢菌为对照，重复3次，放置在28℃恒温培养箱中培养4 d后，测量抑菌带大小。

菌株BS193发酵液对红豆杉叶枯病菌菌丝生长的抑制作用：将菌龄一致、直径为7mm的红豆彬叶枯病菌菌丝块置于PDA平板中央，在菌丝块上下左右各相距2.5 cm处放置直径为7 mm的灭菌滤纸片，其中2片分别滴加2 mL菌株BS193发酵液，另2片分别加同体积无菌水和LB培养液作对照，重复3次，置于28℃恒温箱中培养，待对照组生长至平板边缘时观察菌落生长情况。

菌株BS193无菌滤液对红豆杉叶枯病菌菌丝生长的抑制作用：将菌株BS193无菌滤液与冷却至45 ℃左右的PDA培养基按体积比1:10混匀倒平板，制成BS193无菌滤液的抑菌平板，以同比例加入无菌水的PDA培养基为对照。取菌龄一致、直径7 mm红豆彬叶枯病菌丝块置于PDA平板中央，重复3次，置于28℃的恒温箱中培养，5-7 d后观察菌落生长情况。

所述的植物内生枯草芽孢杆菌在防治番石榴焦腐病、花生黄曲霉病、香蕉枯萎病、大豆腐霉根腐病、番茄早疫病、辣椒疫霉病、荸荠枯萎病、芦笋茎枯病、辣椒炭疽病中的应用。

本发明有益效果：

1、本发明筛选出的植物内生枯草芽孢杆菌BS193抑制作用强，能够明显抑制红豆彬叶枯病菌的生长。由于该菌株分离自番茄植株体内，属于内生菌，是生物制剂，因此没有化学农药使用带来的一系列问题，可减少农业污染，且能有效防治红豆彬叶枯病。

2、本发明筛选出的植物内生枯草芽孢杆菌BS193抑菌谱广，对多种病原菌具有抑制作用，如番石榴焦腐病菌、花生黄曲霉、香蕉枯萎病菌、大豆腐霉、番茄早疫病菌、辣椒疫霉、荸荠枯萎病菌、芦笋茎枯病菌、辣椒炭疽病菌等，具有良好的开发应用前景。

3、本发明植物内生枯草芽孢杆菌分离自植株体内，容易在体内定植，有利于充分发挥菌株的优势。本发明植物内生枯草芽孢杆菌菌株培养条件简单，容易保存，易于工业化生产，是一种理想的生防细菌。

附图说明

图1菌株BS193和其他菌株的系统发育树。

图2菌株BS193对红豆彬叶枯病菌菌丝生长的抑制作用。

图3菌株BS193发酵液对红豆彬叶枯病菌菌丝生长的抑制作用。

图4菌株BS193无菌滤液对红豆彬叶枯病菌菌丝生长的抑制作用。

图5菌株BS193无菌滤液处理红豆杉叶枯病菌后菌丝形态的电镜图。

图6菌株BS193对多种病原菌菌丝生长的抑制作用。其中A：番石榴焦腐病菌；B：花生黄曲霉； C：香蕉枯萎病菌；D:大豆腐霉；E：番茄早疫病菌； F：辣椒疫霉；G：荸荠枯萎病菌；H：芦笋茎枯病菌；J：辣椒炭疽病菌 。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明做进一步阐述，但并不是对本发明的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例一：菌株BS193的鉴定

l、菌株来源

植物内生枯草芽孢杆菌菌株BS193从健康的番茄叶片上分离获得。将番茄叶片用自来水洗净晾干后，选取适量叶片组织，再用蒸馏水清洗3次、75%乙醇消毒3 min，用无菌水清洗3次，升汞处理10 min，再用无菌水清洗3次。在无菌研钵内加入10 mL无菌水和灭菌石英砂，研磨成匀浆，加盖静止30 min后，用移液枪吸50 ul上清液于LB培养基上涂板，48 h后长出菌落进行纯化保藏。

2、形态特征观察

将菌株BS193划线接种于LB培养基(l0 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1000 mL，溶解并调pH值为7.0-7.2，高压灭菌备用) 。30℃培养48 h后进行菌落特征和形态特征观察。菌落特征：该菌株在LB培养基上生长良好，菌落呈不规则状，乳白色，粗糙，不透明，扁平微隆起，表面有皱褶，边缘裂叶状。形态特征：菌株BS193革兰氏阳性，杆状，末端圆，(0.6～0.8)×(1.5～3.0)微米，无荚膜，不成链，周生鞭毛，能运动；芽孢椭圆形至柱状，中生或次端生，(0.6～0.9)×(1.0～1.5)微米。

3、序列分析与分子鉴定

基因组提取试剂盒提取菌株BS193基因组DNA后，采用细菌通用引物（ L1:5’-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3’和L2:5’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’）对16S rDNA进行PCR 扩增。回收PCR扩增产物，经连接、转化、鉴定后，阳性克隆送生工生物工程（上海）有限公司测序，序列全长为1509 bp(SEQ ID No.l)。将所得序列提交到GenBank数据库进行BLAST 分析比对，发现其与枯草芽孢杆菌有99%的序列同源性，在系统发育树（进化树）中也与枯草芽孢杆菌处于同一分枝上（图1）。

结合形态学特征及16S rDNA序列同源性分析结果，最终将菌株BS193鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)。

实施例二：菌株BS193对红豆杉叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

采用平板对峙培养法，在PDA与LB培养基等比例混合培养皿正中央接种菌龄一致、直径7 mm的拟盘多毛孢菌丝块，在距离菌块相对两侧2.5 cm处用接种环蘸取等量BS193菌液划线，以未接BS193的拟盘多毛孢菌为对照，重复3次，放置在28 ℃恒温培养箱中培养4天后，测量抑菌带大小，结果表明菌株BS193对红豆杉叶枯病菌具有较好的拮抗作用（图2）。

实施例三：菌株BS193发酵液对红豆杉叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

1、菌株BS193发酵液的制备

将所述的菌株接种于LB液体培养基中，30℃，180 r/min，培养24 h，制成种

子液，取10ml种子液接种于发酵培养基中。经优化后得到的发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g 酵母粉、10 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1000 mL，溶解并调pH值为7.0-7.2。通过对培养条件的摸索，得到最佳发酵条件为：接种量5% v/v、装瓶量100mL /250mL，发酵培养基pH值7.0-7.2，30℃，180 r/min，培养48 h，制成浓度为10⁸ CFU/ml的BS193菌株发酵液。

2、菌株BS193发酵液对红豆杉叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

取菌龄一致、直径7mm的红豆彬叶枯病菌菌丝块置于PDA平板中央，在菌丝块上下左右各相距2.5 cm处放置直径为7 mm的灭菌滤纸片，其中2片分别滴加2 mL菌株BS193发酵液，另2片分别同无菌水和LB培养液作对照，重复3次，置于28℃条件下恒温培养，待对照组生长至平板边缘时观察菌落生长情况。结果表明，枯草芽孢杆菌BS193发酵液能明显抑制拟盘多毛孢菌丝生长（图3）。

实施例四：菌株BS193无菌滤液对红豆杉叶枯病菌菌丝生长的抑制作用

1、菌株BS193无菌滤液的制备

将实施例三制备的发酵液经4℃, 6000 r/min离心20 min后，用0.22 µm细菌

过滤器过滤得无菌滤液。

2、 BS193无菌滤液对红豆杉叶枯病病原菌菌丝生长的抑制作用

将菌株BS193无菌滤液与冷却至45℃左右的PDA培养基按体积比1:10混匀倒平板，制成BS193无菌滤液的抑菌平板，以同比例加入无菌水的PDA培养基为对照。取菌龄一致、直径7mm红豆彬叶枯病菌丝块置于PDA平板中央，重复3次，置于28℃的恒温箱中培养，5-7 d后观察菌落生长情况。结果表明，枯草芽孢杆菌BS193无菌滤液对拟盘多毛孢菌丝生长具有明显的抑制作用（图4）。

实施例五：菌株BS193无菌滤液处理红豆杉叶枯病菌后的电镜观察

依照实施例四的方法对拟盘多毛孢菌进行处理后，在实验组中分别挑取少量受抑制菌落边缘的菌丝，在对照组中挑取菌落边缘的菌丝，在电子显微镜下观察BS193 无菌滤液对拟盘多毛孢菌丝生长形态的影响。结果发现，对照组拟盘多毛孢菌丝生长旺盛，菌丝纤长，均匀，饱满；但经BS193无菌滤液处理后的菌丝生长量减少，分枝增多，畸形，菌丝干瘪，皱缩（图5）。

实施例六：菌株BS193对多种病原菌菌丝生长的抑制作用

取菌龄一致、直径7 mm供试病原菌菌丝块置于PDA与LB培养基等比例混合平板中央，在菌丝块上下左右各相距2.5 cm处放置直径为7 mm的灭菌滤纸片，其中3片分别滴加2 mL已活化BS193菌液，另1片加同体积LB培养液作对照，置于28 ℃条件下恒温培养，待对照组生长至平板边缘时观察菌落生长情况。结果表明，植物内生枯草芽孢杆菌BS193对番石榴焦腐病菌、花生黄曲霉、香蕉枯萎病菌、大豆腐霉、番茄早疫病菌、辣椒疫霉、荸荠枯萎病菌、芦笋茎枯病菌、辣椒炭疽病菌等9种不同病原菌均表现出明显的抑制作用，具有较广的抑菌谱（图6）。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一种防治红豆杉叶枯病的植物内生枯草芽孢杆菌及其应用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1505

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatga agtcgagcgg 60

acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 120

tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac 180

cgcatggttc aaacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca 240

ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg 300

tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga 360

atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg 420

gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga 480

cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 540

ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga 600

tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga 660

agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 720

tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa 780

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt 840

tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa 900

gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 960

cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga 1020

cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg 1140

ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1200

catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa ggcagcgaaa 1260

ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg 1320

actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggga atacgttccc 1380

gggccttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagttcgt aacacccaag ccggtgaggt 1440

aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg gacagatgat tggggtaagt cgtaacaagg 1500

taacc 1505

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agtcgtaaca acgtagccgt 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgccaaggc atccacc 17

Claims (5)

1.一种植物内生枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述的菌株为植物内生枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) BS193，已于2017年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 13936。

2.如权利要求l所述的植物内生枯草芽孢杆菌制备的生防菌剂。

3.根据权利要求2所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：将所述的植物内生枯草芽孢杆菌接种于LB液体培养基中30℃，180 r/min，培养24 h，制成种子液，取10 mL种子液接种于发酵培养基中；发酵培养基配方为：10 g胰蛋白胨、5 g酵母粉、10 g氯化钠和15 g琼脂粉加蒸馏水定容至1000 mL，溶解并调pH值为7.0-7.2；发酵条件为：接种量5% v/v、装瓶量100mL /250mL，发酵培养基pH值7.0-7.2，30℃，180 r/min，培养48 h，制成浓度为10⁸ CFU/ml的BS193菌株发酵液；将发酵液经4℃,6000 r/min离心20 min后，用0.22 µm细菌过滤器过滤得无菌滤液，即为生防菌剂。

4.如权利要求1所述的植物内生枯草芽孢杆菌在防治红豆杉叶枯病的应用。

5.如权利要求1所述的植物内生枯草芽孢杆菌在防治番石榴焦腐病、花生黄曲霉病、香蕉枯萎病、大豆腐霉根腐病、番茄早疫病、辣椒疫霉病、荸荠枯萎病、芦笋茎枯病、辣椒炭疽病中的应用。