CN112143709A - 一株嗜水气单胞菌噬菌体及其应用 - Google Patents

一株嗜水气单胞菌噬菌体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株嗜水气单胞菌噬菌体及其应用，该菌株已于2020年8月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2020456。本发明提供的嗜水气单胞菌噬菌体的最佳感染复数为0.0001，噬菌体感染宿主菌的潜伏期为20min左右，爆发时间为120min左右，爆发量为1000PFU/cell，在使用剂量为104PFU/mL就能达到显著的抑菌效果，是一株可以用于治疗我国淡水鱼类嗜水气单胞菌感染的强效噬菌体，在水产养殖中具有广泛的应用前景。

Description

一株嗜水气单胞菌噬菌体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株嗜水气单胞菌噬菌体及其应用。
背景技术
嗜水气单胞菌为革兰氏阴性菌，属于气单胞菌科、气单胞菌属，广泛分布于水体环境，是引起鱼类运动性气单胞菌败血症的主要病原体。该菌被认为是我国淡水养殖鱼类暴发性传染病的主要病原菌，嗜水气单胞菌目前已经发现存在2种溶血性毒素，分别是溶血素和气溶素。嗜水气单胞菌中溶血性毒素会导致细胞内容物泄漏，最终引发寄主细胞死亡。除鱼类，嗜水气单胞菌还可引起软体动物、两栖类、爬行类、鸟类及哺乳类等多种动物的全身性败血症或局部感染，常导致动物大量死亡，亦可引起人类急性胃肠炎、食物中毒。我国每年因嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症已经给淡水鱼类养殖户带来了巨大的经济损失。
目前对嗜水气单胞菌的防控主要依靠使用抗生素和化学药物，但抗生素大量、不合理的使用，致使多重耐药嗜水气单胞菌的出现越来越频繁，导致抗生素治疗的失败，更可能导致鱼类产品的食品安全问题；化学药物则普遍存在有效时间短、对水产动物刺激性大、副产物具有毒性、增加心血管病患病率、易造成水体缺氧等缺点，并可在生物体内富集和放大，进而给生态系统和环境安全带来风险。
噬菌体是一种以细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物作为宿主的病毒，它能够特异性的杀死宿主菌，达到预防和治疗的目的。噬菌体疗法作为细菌性病害控制的方法之一，具有特异性强、裂解效率高、无残留等特点，因此，研究嗜水气单胞菌噬菌体来防控该类疾病具有重要意义。
目前已有一些关于噬菌体治疗嗜水气单胞菌的报道，例如专利CN110699330A、CN110093321A、CN110484513A，以及硕士学位论文“嗜水气单胞菌噬菌体的分离纯化及生物学特性分析”等。但上述报道的噬菌体普遍存在毒力不强、使用浓度过高等问题，因此，需要进一步开发新的用于治疗嗜水气单胞菌的强效噬菌体。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，从淡水鱼内脏中分离得到一株嗜水气单胞菌噬菌体，该噬菌体的最佳感染复数为0.0001，噬菌体感染宿主菌的潜伏期为20min左右，爆发时间为120min左右，爆发量为1000PFU/cell，在使用剂量为104PFU/mL就能达到显著的抑菌效果，是一株可以用于治疗我国淡水鱼类嗜水气单胞菌感染的强效噬菌体。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一株嗜水气单胞菌噬菌体(Aeromonas hydrophilaphage)BLCC16-001，该噬菌体已于2020年8月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉，武汉大学)，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2020456。
所述嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001分离自淡水鱼内脏，具有如下特征：
噬菌体具有呈正多面体的头部结构，有尾部，头部直径约60nm，尾长约140nm，应属于肌尾噬菌体科。
噬菌体菌株在固体培养基上可以形成较大空斑，周围有晕环，边缘清晰规则，直径为0.5～1mm。液体培养噬菌体时，菌液中接入噬菌体2～3h后菌液变澄清，出现细胞碎片沉淀，判定其为短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、装配、裂解这五个阶段而实现其繁殖的烈性噬菌体。
本发明的第二方面，提供上述嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001在如下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)杀灭嗜水气单胞菌或抑制嗜水气单胞菌的生长；
(2)制备杀灭嗜水气单胞菌的产品；
(3)制备抑制嗜水气单胞菌生长的产品；
(4)制备预防和/或治疗嗜水气单胞菌所致鱼类疾病的产品；
(5)制备预防和/或治疗由嗜水气单胞菌引起的炎症反应的产品。
上述应用中，优选的，所述鱼类为淡水鱼类。
本发明的第三方面，提供一种噬菌体制剂，所述噬菌体制剂以上述嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001为活性成分。
优选的，所述噬菌体制剂中，嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001的剂量大于或等于104PFU/mL。
上述噬菌体制剂可以以本发明的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001作为唯一活性成分；还可以含有除本发明的噬菌体以外的其他噬菌体，其与本发明的噬菌体复配使用可以得到与之相当或者更好的防治嗜水气单胞菌的效果。
上述噬菌体制剂还可以包括载体，所述载体可以为固体载体或液体载体；其中，固体载体可以选自矿物材料、植物材料或高分子化合物；液体载体可以选自有机溶剂、植物油、矿物油和水。
上述噬菌体制剂可以被制备成各种使用形式，如液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂等，经喷雾、注射或口服等方式用于防治嗜水气单胞菌。
本发明的第四方面，提供上述噬菌体制剂在如下(1)或(2)中的用途：
(1)制备预防和/或治疗嗜水气单胞菌所致鱼类疾病的产品；
(2)制备预防和/或治疗由嗜水气单胞菌引起的炎症反应的产品。
本发明的第五方面，提供包含上述嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001作为有效成分的饲料添加剂、饮用水添加剂或杀菌剂。
本发明的第六方面，提供一种治疗由嗜水气单胞菌引起的疾病的方法，该方法包括给予面临嗜水气单胞菌引起的疾病风险或经诊断患有由嗜水气单胞菌引起的疾病的受试者治疗有效量的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001。
本发明的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001在相当宽的剂量范围内是有效的。实际使用本发明嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001的剂量可根据有关的情况来决定。这些情况包括：受试者的生理状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。
本发明的有益效果：
(1)本发明的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001的最佳感染复数低，为0.0001；噬菌体感染宿主菌的潜伏期为20min左右，爆发时间为120min左右，爆发量为1000PFU/cell；其潜伏期短、裂解量高，是治疗嗜水气单胞菌的强效噬菌体。
(2)本发明的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001具有宽宿主谱，对嗜水气单胞菌属(Aeromonas hydrophila)中的多株不同菌株均有裂解效果，在水产养殖中具有广泛的应用前景。
(3)本发明的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001在30-60℃之间能够保持较好的稳定性和活性，在0-40℃条件下能保持有效的杀菌活性，并且在酸碱环境中表现出较好的适应性；而水产养殖水体的一般温度在20-40℃之间，呈弱碱性；因此，本发明的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001可以很好的适应水产养殖环境，在水产养殖中应用具有极大的可能性。
附图说明
图1：嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001的电镜图。
图2：嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001在固体培养基上的生长情况。
图3：温度对嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001稳定性的影响。
图4：pH对嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001稳定性的影响。
图5：嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001的一步生长曲线图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语说明：
本文使用的术语“预防”是指通过给受试者施用噬菌体作为有效成分的产品来抑制相应疾病或者延缓相应疾病发生的所有措施。
本文使用的术语“治疗”是指通过给受试者施用噬菌体作为有效成分的产品来改善或减轻感染性疾病的症状的所有措施。
本文使用的术语“治疗有效量”表示，治疗、改善靶向的疾病或病症或者表现出可检测的治疗效果所需的治疗剂的量。
正如背景技术部分所介绍的，现有报道的治疗嗜水气单胞菌噬菌体普遍存在毒力不强、使用浓度过高等问题。基于此，本发明的目的在于开发新的用于治疗嗜水气单胞菌的强效噬菌体。
目前虽有很多关于噬菌体筛选分离的报道，但开发新的用于治疗嗜水气单胞菌的强效噬菌体仍存在诸多的技术难点，具体来说：
用于治疗细菌性疾病的噬菌体必须仔细核查，以确保它们是烈性噬菌体。溶原性噬菌体已被证明可以提高病原体的毒性，如果溶原性噬菌体被应用在噬菌体的治疗中，可能存在噬菌体的基因水平传播到病原菌上的风险。因此，在开发用于治疗嗜水气单胞菌的噬菌体时，首先需要确保所分离的噬菌体为烈性噬菌体，此为难点之一。
噬菌体剂量是噬菌体有效治疗的一个主要因素，感染复数是研究病毒感染和产出之间量效关系的一个重要的生物学指标。不同的噬菌体最佳感染复数一般不同，而最佳感染复数在一定程度上也决定了噬菌体疗法的最终效果。本发明对噬菌体的最佳感染复数与抑菌活性的相关性进行了研究，结果发现，同一致病菌噬菌体，最佳感染复数越小，毒性越强，杀灭同一浓度病原菌所需用量越小。而现有报道的嗜水气单胞菌噬菌体的最佳感染复数最优为0.001，其抑菌活性仍有待进一步改进。
本发明从淡水鱼内脏中分离得到一株嗜水气单胞菌噬菌体，该噬菌体具有呈正多面体的头部结构，有尾部，头部直径约60nm，尾长约140nm，应属于肌尾噬菌体科。液体培养噬菌体时，菌液中接入噬菌体2～3h后菌液变澄清，出现细胞碎片沉淀，判定其为短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、装配、裂解这五个阶段而实现其繁殖的烈性噬菌体。
进一步研究发现，该噬菌体的最佳感染复数为0.0001，噬菌体感染宿主菌的潜伏期为20min左右，爆发时间为120min左右，爆发量为1000PFU/cell，在使用剂量为104PFU/mL就能达到显著的抑菌效果；以上性能表明：本发明的嗜水气单胞菌噬菌体与现有报道的用于治疗嗜水气单胞菌的噬菌体相比，在菌株毒性上有了显著的提高，并极大减少了噬菌体的剂量，相应的也降低了抑菌成本。
经安全性试验考察，本发明的噬菌体能够在短时间内排出体外，不会引起残留，安全性高。
综上，本发明的嗜水气单胞菌噬菌体与现有报道的噬菌体相比，其毒力强、使用浓度低，而且耐高、低温、pH的能力更高，能够更好的适应水产养殖环境，在水产养殖中应用具有极大的可能性，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：噬菌体的分离制备
本发明中的淡水鱼内脏样品采自山东省泰安市五马市场；
宿主菌为嗜水气单胞菌CVCC4002，购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
在50mL离心管中装入20mL Tris-HCl缓冲液，然后加入少量淡水鱼内脏样品，4℃静置过夜。将样品以8000r/min离心10min去除杂质，上清液4000r/min离心10min并以0.22μm微孔滤器过滤得到滤液并保存。
取上述20mL滤液加入20mL TSB培养基中，再加入1mL处于对数生长期的宿主菌(嗜水气单胞菌CVCC4002)悬液，混匀30℃振荡培养过夜。次日8000r/min离心30min，取上清9mL加10mL TSB培养基及宿主菌悬液0.3mL，室温放1h，30℃振荡(180r/min)3h，取出后再次离心(12000r/min，30min)，将上清液0.3mL和0.3mL宿主菌悬液一并加入3mL45℃半固体培养基(青岛海博TSB培养基+0.75％琼脂)中，充分混匀后，倾倒于固体琼脂培养(基青岛海博TSA培养基)上制成双层平板，放置30℃温箱中孵育4-6h，观察噬菌斑生长。
实施例2：噬菌体的扩增培养和纯化
用枪头挑取直径较大的噬菌斑，置于缓冲液(Tris-HCl缓冲液)中，4℃放置3h，用缓冲液作10倍梯度稀释，双层平板(底层TSA固体，上层TSB+0.75％琼脂半固)法作单斑培养。从其中挑直径较大的单个噬菌斑于含宿主菌液(菌量约为108CFU/mL)的液体TSB培养基内培养6h作少量增殖，再用双层平板法观察噬菌斑的形态，重复操作3～5次后，即可得形状和大小一致的噬菌斑。挑取单个噬菌斑置于Tris-HCl缓冲液中，并将其转接入3～5mL TSB培养基中，加入噬菌体宿主菌液0.1mL，混匀，室温作用15min，30℃培养10～14h，12000rpm，4℃，离心10min，取上清，加入0.3％氯仿。
取1mL新鲜培养的宿主菌，加0.1mL噬菌体裂解液(以单个噬菌体培养物与宿主菌分别按照1∶1、1∶10和1∶100的比例)，30℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于宿主菌；加入100mL TSB液体培养基，再加入CaCl2母液至终浓度1mM，30℃摇振培养12～16h，12000rpm，4℃，离心10min，取上清，得到噬菌体裂解液。
在裂解液中分别加入RNaseA、DNaseⅠ至1μg/mL，30℃温育30min；加9.3g PEG8000，5.8gNaCl，摇匀至溶解，冰浴1h或4℃过夜；4℃离心10000rpm10min，去上清液；加2mLTris-HCl缓冲液，充分洗涤管壁及沉淀，室温作用1h；通过加入等体积的氯仿抽提，温和振荡30s；4℃，5000rpm离心10min以分离有机相和亲水相，回收含有噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的噬菌体，该噬菌体命名为BLCC16-001，双层平板检测纯化噬菌体见图2。
挑选纯化的噬菌体BLCC16-001在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNO：M 2020456，保藏日期为2020年8月28日，保藏单位地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072。
该保藏的噬菌体具有以下微生物学特征：
1.形态学特性
在透射电子显微镜下观察噬菌体颗粒(见图1)，该噬菌体具有呈正多面体的头部结构，有尾部，头部直径约60nm，尾长约140nm，应属于肌尾噬菌体科。
2.培养学特性
噬菌体菌株在双层平板(底层TSA固体，上层TSB+0.75％琼脂半固)上可以形成较大空斑，周围有晕环，边缘清晰规则，直径为0.5～1mm(见图2)。液体培养噬菌体时，菌液中接入噬菌体2～3h后菌液变澄清，出现细胞碎片沉淀，判定其为短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、装配、裂解这五个阶段而实现其繁殖的烈性噬菌体。
实施例3：温度及pH对噬菌体BLCC16-001稳定性的影响
参照专利CN107099511A中记载的方法对温度及pH对噬菌体的稳定性进行考察，具体如下：
各取0.5mL109 PFU/mL的噬菌体液于无菌EP管中，分别于30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，80℃，90℃的水浴中作用60min，待作用时间结束后取样，并立即将样品置于水浴中冷却，经过稀释后测定噬菌体的效价，结果见图3。由图3可知，嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001经30℃、40℃、50℃、60℃处理1h后效价基本不变，70℃处理1h后效价下降了1个数量级，80℃处理1h后效价下降了2个数量级，90℃处理1h后全部失活。
取无菌EP管加入不同pH值(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11)的液体TSB900μL，然后将上述EP管置于30℃的水浴中，待温度平衡后加入100μL 109PFU/mL的噬菌体液混匀，30℃作用2h。每管各取样测定噬菌体的效价，结果见图4。由图4可知，嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001在pH值为2-10的范围内存活率较高，在pH值为1和11时全部失活，总体上来看嗜水气单胞菌噬菌体对pH值的耐受范围比较宽。
实施例4：噬菌体BLCC16-001最佳感染复数试验
培养宿主菌(嗜水气单胞菌CVCC4002)至对数生长期，按照感染复数分别为1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001的比例，加噬菌体液和宿主菌至液体TSB中，30℃振荡培养3.0h，4000rpm离心30min去除菌体，测定上清液中噬菌体的滴度，以产生最高滴度的感染复数为最佳感染复数。结果见表1。噬菌体BLCC16-001在感染复数为0.0001时所产生子代噬菌体的滴度最高，为2.4×1010PFU/mL，表明噬菌体BLCC16-001最佳感染复数为0.0001。
表1：BLCC16-001最佳感染复数试验
Figure BDA0002701169230000071
实施例5：噬菌体BLCC16-001一步生长曲线测定
一步生长曲线的测定采用Lur等改进的方法。将TSB液体培养基中初始宿主菌浓度调整至2.0×107CFU/mL，噬菌体浓度调整至2.0×103PFU/mL，30℃孵育10min，迅速置于30℃、180rpm振荡培养，同时开始计时，在0时刻和每隔20min取样，测定噬菌体的滴度。以感染时间为横坐标，噬菌体滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，结果见图5。由图5可知，噬菌体BLCC16-001感染宿主菌的潜伏期为20min左右，爆发时间为120min左右，爆发量为1000PFU/cell。爆发量＝爆发末期噬菌体滴度(2.0×1010PFU/mL)/初期宿主菌浓度(2.0×107CFU/mL)。潜伏期较短、裂解量高的噬菌体，视为毒力较高的噬菌体。
实施例6：噬菌体BLCC16-001宽宿主谱检测
试验选择8株细菌，包括嗜水气单胞菌6株、维氏气单胞菌1株、溶藻弧菌1株对噬菌体BLCC16-001的宿主谱进行分析，其中6株嗜水气单胞菌及1株维氏气单胞菌来自吉林农业大学(分离自不同地区不同养殖品种)，1株溶藻弧菌分离自泰安市东湖公园水体。具体操作如下：分别取8株细菌的过夜培养物100μL，1.5％TSB平板中央，用涂棒分别将它们涂制成均匀的菌苔。然后将每个平板平均分成两个区域，其中一个区域，取10μL噬菌体BLCC16-001滴加在菌苔表面，另一个区域滴加10μL生理盐水作对照，待液滴干燥后倒置于30℃培养12～16h，观察结果。
结果见表2，结果表明：试验选择的细菌菌液在平板上均生长良好。滴加噬菌体BLCC16-001后出现不长细菌的透明区域，并且对所收集的8株细菌中的4株有裂解作用，其中对嗜水气单胞菌裂解率为66.7％。说明分离到的噬菌体BLCC16-001是一种针对嗜水气单胞菌的宽宿主谱噬菌体。
表2：噬菌体BLCC16-001噬菌谱检测
菌株编号 属 BLCC16-001
C8-0083 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) －
C8-0084 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) +
C8-0085 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) +
C8-0086 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) +
C8-0087 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) +
C8-0088 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) －
C8-0095 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii) －
C8-0109 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) －
注：“+”表示裂解，“－”表示不裂解。
实施例7：噬菌体BLCC16-001杀菌活性试验
将制备好的嗜水气单胞菌CVCC4002菌液进行活菌计数，然后用0.05M的Tris-HCL缓冲液稀释成含菌105～106CFU/mL的试验菌液；制备好的噬菌体液进行效价计数，然后用0.05M的Tris-HCL缓冲液稀释成含噬菌体104、105、106、107PFU/mL不同浓度梯度的试验噬菌体液；吸取0.5mL试验菌液于不同浓度噬菌体溶液4.5mL内，置30℃水浴5min或其他特定的作用时间后，立即吸取上述菌-噬菌体混合液1.0mL，加入9.0mLTris-HCL缓冲液。另外以0.05M的Tris-HCL缓冲液代替噬菌体溶液，同时进行上述各步骤，作为阴性对照组；以Tris-HCL缓冲液代替稀释后的菌液及噬菌体液的作为空白对照，以排除实验用品及缓冲液对本实验可能造成的影响。采用平板菌落计数法进行活菌计数，计算杀菌率及杀灭指数。
活菌培养计数时，细菌繁殖体在适宜的温度下培养18～24h，观察最终结果。
结果判断：
消毒t时的杀菌率(Pt)＝〔(n0-nt)/n0〕×100％
杀灭指数(KI)＝n0/nt
以上两式中：n0为阴性对照组活菌数，nt为试验组活菌数。
结果见表3，当病原菌浓度为105CFU/mL时，噬菌体BLCC16-001在浓度为106PFU/mL～107PFU/mL，5min内对病源菌的杀灭指数达3个数量级以上，效果较好；较低浓度，噬菌体BLCC16-001在浓度为105PFU/mL时，3h杀菌率达到99.2％，杀灭指数2个数量级；噬菌体BLCC16-001在浓度为104PFU/mL时，3h杀菌率达到91.0％。
表3：噬菌体BLCC16-001杀菌活性试验
Figure BDA0002701169230000091
注：CK表示空白对照，CK-表示阴性对照；表中的“活菌数”是由平板菌落计数法得到，活菌数的计数组成中，“×”之前的数字表示平均菌落数，“10n”表示稀释的倍数。
实施例8：最佳感染复数与抑菌活性相关性研究
噬菌体感染复数(MOI)为初始感染时投入噬菌体与细菌间的比值，是衡量噬菌体投入与产出的重要生物学指标。同时，在进行细菌病治疗时，许多研究者将这个指标作为确定噬菌体治疗剂量的参考(《宽噬菌谱肠炎沙门氏菌噬菌体的生物学特性》)。本实验选取四株噬菌体进行，分别为BLCC16-001、3-4002、5-4002、X-1。其中3-4002为本实验室分离自凤台鱼市垃圾污水，最佳感染复数0.001；5-4002为本实验室分离自泰安市梳洗河泥样，最佳感染复数为0.01；X-1分离纯化自市场某款嗜水气单胞菌噬菌体产品，已通过实验得知其最佳感染复数为0.01。先将制备好的菌液活菌计数，然后用Tri-HCl缓冲液稀释成含菌106CFU/mL的试验菌液，制备好的4种噬菌体液效价计数，用Tris-HCL缓冲液分别稀释成含噬菌体105～108PFU/mL的试验噬菌体液；分别吸取0.5mL试验菌液和4.5mL的不同种类及浓度的噬菌体溶液组成菌-噬菌体混合液，置30℃水浴反应3h，分别吸取上述菌-噬菌体混合液1.0mL，加入9.0mLTri-HCl缓冲液混匀。采用平板菌落计数法进行活菌计数，验证对106CFU/mL的试验菌液杀菌率超过90％的各噬菌体浓度。本实验室研究结果表明，同一致病菌噬菌体，最佳感染复数越小，毒性越强，杀灭同一浓度病原菌所需用量越小。结果见表4，最佳感染复数为0.01的噬菌体，杀菌率达90％时使用浓度为10MOI，最佳感染复数为0.0001～0.001时，杀菌率达90％时使用浓度为0.1～1MOI。
表4：最佳感染复数与杀菌活性相关性试验
Figure BDA0002701169230000101
实施例9：温度对噬菌体BLCC16-001抑菌活性的影响
本实验旨在研究养殖水体温度变化范围内，噬菌体侵染活性是否受到影响。先将制备好的菌液活菌计数，然后用Tri-HCl缓冲液稀释成含菌106CFU/mL的试验菌液，制备好的噬菌体液效价计数，用Tris-HCL缓冲液稀释成含噬菌体105PFU/mL的试验噬菌体液；分别吸取0.5mL试验菌液和4.5mL的噬菌体溶液组成菌-噬菌体混合液，置0℃/10℃/20℃/30℃/40℃水浴不同时间，分别吸取上述菌-噬菌体混合液1.0mL，加入9.0mLTri-HCl缓冲液混匀。另外以Tri-HCl缓冲液代替噬菌体溶液，同时进行上述各步骤，作为阴性对照组；以不做任何处理的作为空白对照。吸取1mL用平板菌落计数法进行活菌计数。结果见表5，结果表明：温度对噬菌体BLCC16-001杀菌活性影响较小，0～40℃，6h时杀菌率均能达到96.0％以上，温度较高时，噬菌体杀菌效率更高，3h时杀菌率即可达到90.0％以上。噬菌体BLCC16-001较适杀菌温度为0～40℃。
表5：温度对嗜水气单胞菌BLCC16-001杀菌活性的影响
Figure BDA0002701169230000111
注：CK表示空白对照，CK-表示阴性对照。
实施例10：pH对噬菌体BLCC16-001杀菌活性的影响
本实验旨在研究养殖水体pH变化范围内，噬菌体侵染活性是否受到影响。先将制备好的菌液活菌计数，然后用pH4～9的Tri-HCl缓冲液稀释成含菌106CFU/mL不同pH的试验菌液；制备好的噬菌体液效价计数，用pH4～9的Tris-HCL缓冲液稀释成含噬菌体105PFU/mL不同pH的试验噬菌体液；分别吸取同pH的0.5mL试验菌液和4.5mL的噬菌体溶液组成菌-噬菌体混合液，30℃水浴不同时间分别吸取上述菌-噬菌体混合液1.0mL，加入9.0mLTri-HCl缓冲液混匀。另外以Tri-HCl缓冲液代替噬菌体溶液，同时进行上述各步骤，作为阴性对照组；以不做任何处理的作为空白对照。吸取1mL用平板菌落计数法进行活菌计数。结果表明，当混合液pH值为4时，会导致噬菌体杀菌率下降至76.7％(见表6)，较pH较高时低20％。噬菌体BLCC16-001最佳使用范围为pH5～9。
表6：pH对BLCC16-001杀菌活性的影响
Figure BDA0002701169230000121
注：CK表示空白对照，CK-表示阴性对照。
实施例11：噬菌体BLCC16-001在小鼠上的安全性实验
参照专利CN107099511A中记载的安全性试验方法进行，具体为：选用雌性BALB/c小鼠(20～22克)20只，预饲两天后随机分为2组(噬菌体组、对照组)，每组10只。噬菌体组采用腹腔注射的方式接种0.3mL噬菌体BLCC16-001，剂量为2.25×109PFU/kg；对照组接种0.3mL生理盐水；连续观察15d，分别在处理后第1天和第15天检测小鼠盲肠内噬菌体含量及内脏情况。
观察结果显示，此剂量的噬菌体BLCC16-001对小鼠日常行为没有影响，处理后第一天各组小鼠盲肠pH值相差不大(见表7)，噬菌体组盲肠内容物噬菌体效价为2.8×102PFU/g；处理后第十五天噬菌体组盲肠内容物已检测不到噬菌体的效价；说明噬菌体BLCC16-001进入小鼠体内后会逐渐排出体外，不会引起残留。各组小鼠解剖检查未见异常。
表7：各组小鼠盲肠内容物检测结果
Figure BDA0002701169230000131
实施例12：噬菌体BLCC16-001治疗气单胞菌效果评价
一、嗜水气单胞菌感染鱼模型的构建
选取试验鱼(鲤鱼，体重5克±1克)50尾，随机分为5组，即养殖水体中嗜水气单胞菌CVCC4002浓度为5.0×103CFU/mL试验组、5.0×104CFU/mL试验组、5.0×105CFU/mL试验组、5.0×106CFU/mL试验组和0CFU/mL对照组，每组10尾，试验鱼背鳍下去等数鳞片，采用浸泡的方式攻毒，在随后的7d内观察鱼的体征和存活情况，确定能够引起试验鱼死亡的最小浓度。
经试验确定，嗜水气单胞菌CVCC4002引发体表受创试验鱼死亡的最小浓度为105CFU/mL(见表8)。
表8：嗜水气单胞菌最小致死浓度
Figure BDA0002701169230000132
二、噬菌体杀菌及治疗效果评价
选取试验鱼(鲤鱼，5克±1克)30尾，随机分为3组，即噬菌体治疗组、攻毒对照组和Tris-HCl对照组，每组10尾。试验鱼背鳍下去等数鳞片，采用浸泡的方式对噬菌体治疗组、攻毒对照组进行攻毒，嗜水气单胞菌CVCC-4002浓度为5.0×105CFU/mL。在嗜水气单胞菌感染后1h内，噬菌体治疗组采用泼洒方式使水体噬菌体BLCC16-001浓度达5.0×104PFU/mL，另外两组撒入等体积Tris-HCl缓冲液。随后的7d内观察鱼的体征和存活情况，并采集水样，以选择培养基(青岛海博RS培养基)计嗜水气单胞菌活菌数，及双层平板法计噬菌体BLCC16-001效价。
由表9可知，实验过程中，攻毒对照组嗜水气单胞菌CVCC-4002活菌数保持在105CFU/mL，并略有上升；噬菌体治疗组嗜水气单胞菌活菌数维持在103～104CFU/mL，较攻毒对照组下降1～2个数量级，噬菌体BLCC16-001的杀菌率在90％左右；噬菌体效价维持在104PFU/mL。攻毒对照组试验鱼分别于2d死亡1尾，3d死亡2尾，4d死亡1尾，共计死亡4尾；噬菌体治疗组试验鱼在实验过程中未出现死亡，说明本发明的噬菌体对养殖水体中嗜水气单胞菌具有显著的杀菌效果，可有效的保护试验鱼免受养殖水体中嗜水气单胞菌的侵害。
表9：噬菌体BLCC16-001杀菌及治疗效果
Figure BDA0002701169230000141
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株嗜水气单胞菌噬菌体(Aeromonas hydrophila phage)BLCC16-001，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2020456。
2.权利要求1所述的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001在如下(1)-(5)至少一项中的应用：
(1)杀灭嗜水气单胞菌或抑制嗜水气单胞菌的生长；
(2)制备杀灭嗜水气单胞菌的产品；
(3)制备抑制嗜水气单胞菌生长的产品；
(4)制备预防和/或治疗嗜水气单胞菌所致鱼类疾病的产品；
(5)制备预防和/或治疗由嗜水气单胞菌引起的炎症反应的产品。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鱼类为淡水鱼类。
4.一种噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂以权利要求1所述的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001为活性成分。
5.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂中，嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001的剂量大于或等于104PFU/mL。
6.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂还包括载体，所述载体为固体载体或液体载体。
7.根据权利要求4所述的噬菌体制剂，其特征在于，所述噬菌体制剂的剂型为液体制剂、冻干制剂或口服固体制剂。
8.权利要求4-7任一项所述的噬菌体制剂在如下(1)或(2)中的用途：
(1)制备预防和/或治疗嗜水气单胞菌所致鱼类疾病的产品；
(2)制备预防和/或治疗由嗜水气单胞菌引起的炎症反应的产品。
9.包含权利要求1所述的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001作为有效成分的饲料添加剂或者饮用水添加剂。
10.一种杀菌剂，其以权利要求1所述的嗜水气单胞菌噬菌体BLCC16-001作为有效成分。
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