CN113215114A - 一种ndm-1大肠杆菌噬菌体及其分离方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NDM‑1大肠杆菌噬菌体及其分离方法和应用，属于污水处理技术中的卫生防治技术领域。本噬菌体采用如下方法制得：首先从活性污泥环境中提取出野生型噬菌体；针对含NDM‑1耐药基因大肠杆菌对该噬菌体进行驯化侵染，接着依次侵染耐药细菌E.coilK12和E.coilNDM‑1分离得到高效裂解泛耐药大肠杆菌E.coilNDM‑1的多价噬菌体。该多价噬菌体能够在10h内显著抑制泛耐药细菌E.coilNDM‑1增殖且能够耐受多种不利环境因素，且能耦合产生菌E.coilK12在34h内显著抑制泛耐药大肠杆菌E.coilNDM‑1的繁殖，为噬菌体技术在耐药细菌的基础防控和实际推广奠定一定的技术基础。

Description

一种NDM-1大肠杆菌噬菌体及其分离方法和应用
技术领域
本发明属于污水处理技术卫生防治技术领域，具体而言，涉及一种NDM-1大肠杆菌噬菌体及其分离方法和应用。
背景技术
抗生素自问世以来被认为是对抗疾病的最有力武器之一，被广泛地应用到人类、禽畜的疾病预防与治疗、农业病害防治以及水产养殖等途径。由于抗生素的广泛使用，使得耐药细菌的污染走进大众的视野，其在环境中被频繁检出引起了人们的担忧。E.coil NDM-1携带有blaNDM-1的基因，它能够中和β-内酰胺类抗生素，使细菌对绝大多数临床上常用的抗生素产生耐药性，被认为是“超级细菌”。携带blaNDM-1抗性基因的菌株表现出对多种抗生素的抗性，如β-内酰胺类、头孢菌素类抗生素，强大的耐药性大大增加了由其引起的感染性疾病的治疗难度；且携带blaNDM-1细菌的耐药性具有比一般耐药细菌更强的“传染性”。blaNDM-1耐药基因在环境中长期存在，具有强稳定性、处理难度大的特点，能够在不同细菌间转移并传递抗性，使原本不具备耐药能力的细菌产生耐药性。由于缺乏针对blaNDM-1的常规标准化表型检测方法和有效的抗生素等药剂来治疗具有能力的含blaNDM-1抗性基因的细菌感染，最终导致感染患者出现高死亡率，极大的威胁了生态和人体的健康。
医院废水和抗生素制药废水大部分都是排入当地的城市污水处理厂，使得污水处理厂的各个处理单元中均含有一定浓度的抗生素，而污水处理厂的生物处理阶段存在大量的细菌，这些细菌在抗生素的长期选择压力下易产生变异，获得对抗生素的抗性。并且，这些获得了耐药性的细菌能够再通过多种媒介将自身的抗性基因转移到其他细菌上，可能造成细菌耐药性的蔓延并破坏了污水生物处理单元的微生物群落结构影响污水处理效果，并使得污水处理厂被认为是耐药细菌和耐药基因的产生源、储存库及排放源，带来严重的生态安全风险和健康隐患。
污水处理厂的传统处理单元无法有效地去除污水中大部分的抗性细菌特别是抗性基因，并可能会在污水处理厂的生物处理过程中造成抗性基因的传播，而使得抗性细菌和抗性基因可能会随着污水处理厂的出水或剩余污泥排放到环境中。抗性细菌进入自然环境后可能通过食道、接触、空气传播等方式侵染人体，对人类健康和生命安全直接构成威胁。所以需要寻找一种高效的新型制剂来实现污水中耐药细菌的有效去除，以预防耐药细菌造成的感染。
噬菌体是一类能够“捕食”细菌的病毒，其构造简单为蛋白质外壳和遗传物质。其中，烈性噬菌体感染细菌后可以使得细菌裂解并快速增殖，是自然界天然存在的强有力的用来对抗细菌的良好制剂，具有特异性强、自我增殖速度快、来源广泛等其他化学抑菌剂没有的良好特性。噬菌体的良好特异性能做到精准杀菌，在去除耐药细菌的同时不破坏污水处理系统中其他功能微生物的群落结构，从而保证污水处理厂的污水处理效果。噬菌体通过侵染细菌从而达到阻断和减少耐药基因复制和传播，从而达到抑制耐药细菌和耐药基因传播的目的。能够准确灭杀耐药细菌的噬菌体制剂是一种纯天然的，对人体无害不会造成二次污染的，低成本的新型高效杀菌产品，基于噬菌体的治理技术技术可能是一种治理耐药细菌及耐药基因基因的高效、长期可用的处理方法。
但是由于污水环境比较复杂，容易导致噬菌体在污水环境中失活，此外，噬菌体可能在污水环境中脱靶吸附，导致噬菌体的浓度下降使其有效侵染目标细菌的效率下降。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种NDM-1大肠杆菌噬菌体，该噬菌体能够承受不同的环境冲击，具有较好的效价，具体提供的技术方案如下：
一种NDM-1大肠杆菌噬菌体，其壳体由头部和尾部组成，头部和尾部通过颈部相连；头部形状呈二十面体对称结构，尾部呈螺旋对称，核酸组成均为双链DNA；头部直径约为120nm；而尾长约135nm，直径约为4nm，属于长尾、肌病毒科。
本发明的又一目的是提供一种NDM-1大肠杆菌噬菌体的噬菌体的分离方法，用于从污水或污泥中分离出上述噬菌体，其包括以下步骤：
S1、在污水或活性污泥中提取噬菌体；
S2、采用循序多宿主分离方法对S1提取的的噬菌体进行分离、训化、纯化，得到具有侵染含NDM-1耐药基因大肠杆菌的多价噬菌体；所述宿主依次为E.coli NDM-1、E.coliK12、 E.coli NDM-1、E.coli K12；扩大培养使多价噬菌体滴度达到109PFU/ml以上。
本发明的再一目的是提供一种上述NDM-1大肠杆菌噬菌体的使用方式，将上述噬菌体耦合产生菌E.coil K12后再用于抑制NDM-1大肠杆菌，这能够明显提高其效价。
本发明的优点在于：
本发明的NDM-1大肠杆菌噬菌体能够承受不同的环境冲击、具有较好的效价，可以为阻断复杂的污水环境中的耐药细菌及耐药基因传播提供一种新的治理策略。此外，当该噬菌体与E.coli K12耦合还后可以进一步提高效价。
附图说明
图1为噬菌体对不同宿主菌生长繁殖抑制效果图；
图2为噬菌体耦合产生菌E.coil K12对E.coil NDM-1的抑制效果图；
图3为噬菌斑及PE1扫描电镜形态图；
图4为噬菌体对不同环境因子的耐受能力图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，结合实施例作进一步描述。实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整也属于本发明保护的范围。
实施例
生物材料：
下述实施例中所采用的目标菌为大肠杆菌(E.coil NDM-1)购于北纳生物-菌种/细胞库；所用的噬菌体则也是由污水环境中所分离获得的能高效杀灭这株致病菌的多价噬菌体，命名为PE1。
为了客观的考察本申请所提供的多价噬菌体分离方法抑制大肠杆菌E.coil NDM-1的客观性、准确性和可行性，发明人以无菌培养基为操作环境，以考察具体操作的可行性，具体过程简要介绍如下。
实施例
一种控制大肠杆菌E.coil NDM-1的多价噬菌体，采用如下步骤分离得到：
S1、从自然环境中分离噬菌体：按照Yu.P等人描述的方法，从四川省成都市金海污水处理厂的污水中分离噬菌体，获得富含噬菌体溶液。
S2、多价噬菌体的驯化：按照《Control of antibiotic resistant bacteria inactivated sludge using polyvalent phages in conjunction with a productionhost》文章所描述采用循序多宿主分离方法对从污水中分离得到的噬菌体进一步分离、驯化、纯化，得到具有侵染目的细菌能力的多价噬菌体。采用的宿主顺序依次是：E.coli NDM-1、E.coli K12、E.coliNDM-1、E.coli K12。最后，在E.coli NDM-1的菌苔上挑取一个噬菌斑，并进一步纯化三次，将最终纯化后的噬菌体命名为PE1。
性能测试
(1)多价噬菌体PE1对宿主菌繁殖生长抑制能力
分别将多价噬菌体PE1与不同的宿主菌(E.coli NDM-1、E.coli K12)按照感染复数为 1(MOI＝1)加入LB培养基中,在37℃、120rpm震荡条件共同培养，测量光密度值为600nm 时的吸光度(OD600)，以考察噬菌体PE1抑制不同宿主菌生长繁殖的能力。测试结果见图1。
由图1可知，多价噬菌体PE1能在10h内显著抑制E.coli NDM-1的繁殖。
(2)多价噬菌体PE1耦合产生菌E.coil K12对E.coil NDM-1的抑制作用
活化E.coli NDM-1和E.coli K12至对数生长期(150rpm，35℃)，然后于150mL LB培养基中分别加入E.coli NDM-1、E.coli NDM-1和E.coli K12细菌，(E.coli NDM-1菌液至终浓度为106CFU/mL)并加入噬菌体PE1，振荡摇匀；于35℃、150rpm恒温气浴摇床中培养，测定OD600；设置只加E.coli NDM-1作为对照组，分析噬菌体PE1耦合产生菌E.coli K12对E.coli NDM-1的控制能力。测试结果见图2。
由图2可知，噬菌体PE1耦合产生菌E.coli K12抑制E.coli NDM-1在反应开始后的34h 内，其溶液的OD600基本无变化，与E.coli NDM-1+PE1组相比澄清时间更长，结果表明耦合产生菌E.coli K12可以有效提高PE1对E.coli NDM-1的去除能力。
一步生长曲线表明该多价噬菌体PE1对E.coli NDM-1的裂解量为57±5PFU/cell，对E. coli K12的裂解量为86±8PFU/cell，噬菌体PE1分别对E.coli NDM-1和E.coli K12的爆发期为60min和50min，都能在较短时间内迅速增殖。
(3)多价噬菌体PE1的一步生长曲线及扫描电镜观察
按照最佳感染复数(MOI＝1)于37℃条件下将噬菌体PE1和细菌(OD600＝0.1)混合，吸附5min；取0.1mL混合液加入到已预冷的9.9mL TSB培养基中，涡旋振荡混匀，再取1mL至2mL离心管中；使用冷冻离心机4℃下7000g离心2min去除未与细菌吸附结合的噬菌体PE1，并用1mL TSB重悬；取500μL重悬液加入至50mL TSB培养基中，并于摇床37℃环境下150rpm振荡培养；每10min取样1mL培养液，并取100μL利用双层平板法迅速测定其中噬菌体PE1滴度。
使用日本电子JEOL 2010型TEM在110KV电压下对样品进行成像，观察噬菌体PE1的形貌特征。取少量噬菌体PE1，将其滴加至有碳膜的铜网上(浓度约为4×108PFU/mL)；利用pH值为4.5的2％乙酸双氧铀负染色；使用滤纸吸干多余染料，并将样品于室温环境下干燥30min。观察结果见图3
根据图3可知，所分离的多价噬菌体PE1是一种有尾噬菌体PE1，其壳体由头部和尾部组成，头部和尾部通过颈部相连。头部形状呈二十面体对称结果，尾部呈螺旋对称，核酸组成均为双链DNA。通过测量，噬菌体PE1的头部直径约为120nm；而尾长约135nm，直径约为4nm。其属于长尾、肌病毒科。
(4)多价噬菌体PE1抗环境冲击能力
取100μL噬菌体PE1(109PFU/mL)加入至不同环境因子溶液中处理1h后，10倍梯度稀释样品，并确定处理后样品中噬菌体PE1效价，分析不同环境因子对噬菌体PE1活性的影响。
配制pH范围为3～11缓冲液；配制盐浓度分别为10、50、200和350g/L的溶液；配制浓度分别为0.005mM、0.05mM、0.5mM、5mM的CuCl2溶液；配制0.05mM的不同重金属CrCl3、CuCl2、CoCl2、CdCl2溶液。测试结果如图4。
由图4可知，噬菌体PE1在60℃及以下条件时，可保持良好活性，当温度升至70℃时，噬菌体PE1才完全丧失活性。试验表明噬菌体PE1具有良好的热稳定性，在大部分环境中均能适用；发现噬菌体PE1具有较宽的pH适应范围，为5～10。其在pH为4、11时，测得噬菌体PE1仍保持一定活性，具有良好的pH耐受性，且对碱性环境的耐受力相对酸性更强，表明该方法的噬菌体PE1能适应不同pH环境；NaCl盐浓度不是噬菌体PE1的显著性影响因子，即使在饱和盐溶液(350g/L)中仍能保持很高活性；E.coli NDM-1为宿主时，重金属对多价噬菌体PE1的抑制作用依次为Cr3+>Cd2+＝Co2+>Cu2+，重金属离子对噬菌体PE1 的抑制作用较小；噬菌体PE1受抑制程度随不同浓度Cu2+增加而增强，在低于0.5mM的低浓度Cu2+溶液时，可以保持相对较高的稳定性。
通过上述测试发现，实施例1获得的多价噬菌体PE1能够高效裂解泛耐药大肠杆菌E.coil NDM-1、能够耐受不同环境冲击。
对分离得到的多价噬菌体进行测试，确定其宿主谱如下：
表1为分离得到的多价噬菌体宿主谱
Figure RE-GDA0003139876020000051
以上对本发明的有关内容进行了说明，本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。基于本发明的上述内容，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (3)

1.一种NDM-1泛耐药大肠杆菌噬菌体，其壳体由头部和尾部组成，头部和尾部通过颈部相连；头部形状呈二十面体对称结构，尾部呈螺旋对称，核酸组成均为双链DNA；头部直径约为120nm；而尾长约135nm，直径约为4nm，属于长尾、肌病毒科。
2.一种NDM-1泛耐药大肠杆菌噬菌体的噬菌体的分离方法，用于从污水或污泥中分离出如权利要求1所述的噬菌体，其特征在于，包括以下步骤：
S1、在污水或活性污泥中提取噬菌体；
S2、采用循序多宿主分离方法对S1提取的的噬菌体进行分离、训化、纯化，得到具有侵染含NDM-1耐药基因大肠杆菌的多价噬菌体；所述宿主依次为E.coli NDM-1、E.coli K12、E.coli NDM-1、E.coli K12；扩大培养使多价噬菌体滴度达到109PFU/ml以上。
3.一种权利要求1所述的NDM-1泛耐药大肠杆菌噬菌体在抑制NDM-1泛耐药大肠杆菌上的应用，其特征在于，将所述的噬菌体耦合产生菌E.coil K12后再用于抑制NDM-1泛耐药大肠杆菌。
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