CN104472550B

CN104472550B - 一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂及其应用

Info

Publication number: CN104472550B
Application number: CN201410717164.6A
Authority: CN
Inventors: 包红朵; 王冉; 张辉; 周艳; 张莉莉
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-12-02
Filing date: 2014-12-02
Publication date: 2017-12-29
Anticipated expiration: 2034-12-02
Also published as: CN104472550A

Abstract

本发明公开一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂及其应用，所述生物杀菌剂包括沙门氏菌噬菌体和辅剂，沙门氏菌噬菌体至少包括沙门氏菌噬菌体PSA‑6、鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu‑4‑116以及保藏号为CCTCC NO:M2014429的肠炎沙门氏菌噬菌体、保藏号为CCTCC NO:M2014433的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体、保藏号为CCTCC NO:M2014431的德尔卑沙门氏菌噬菌体或保藏号为CCTCC NO:M2014432的伦敦沙门氏菌噬菌体中三种以上的噬菌体；该生物杀菌剂通过多种裂解性沙门氏菌噬菌体的复配作为有效杀菌成分，大大拓宽了杀菌范围，增加杀菌活性。

Description

一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂及其应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体为一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂及其应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是畜禽养殖中危害严重的致病菌，也是引起食物中毒的重要人畜共患病原菌，在全球范围内，沙门氏菌感染及污染问题已引起养禽业、食品安全和公共卫生界的高度重视，其不仅威胁人畜健康，而且严重阻碍了养禽业的发展，成为畜牧生产和食品安全的重要关注点，目前，由于抗生素药物的广泛使用及滥用，整个沙门氏菌属的多重耐药性也从20世纪90年代的20％-30％增加到了本世纪初的70％，随着抗生素耐药性的进一步加剧，沙门氏菌在长期的进化过程中产生了严重的多重耐药现象，目前，对防治其危害和传播，尚无有效且安全的措施。

裂解性噬菌体作为一种新型的“生物杀菌剂”，正受到国内外专家的广泛关注和高度认可，裂解性噬菌体是细菌的天然“杀手”，在杀灭其特异性细菌时非常快速、对人体和哺乳动物无害、不易产生耐药和残留，在应对多重耐药菌株、食品加工卫生及建立新型畜牧业等方面有着无限的应用潜力，早在2006年8月，美国食品药品监督局(FDA)首次批准了噬菌体（LISTEXTM P100）产品作为食品添加剂，用于防控即食性食品及家禽类制品中李斯特菌(Lisiteria)污染，2010年3月，韩国希杰饲料公司又首次使用裂解性沙门氏菌噬菌体作为饲料添加剂用于杀灭饲料中的鸡沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌，这两个实例已充分证实噬菌体作为有效的天然杀菌剂有着极大的应用价值及广阔的应用前景。专利号为“ZL201010508259.9”的中国专利公开了一种保藏号为CCTCC M2010226的沙门氏菌噬菌体PSA-6，专利号为“ZL 201110053518.8”的中国专利同样公开了一种保藏号为CCTCC M 2011042的鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu-4-116，其均对沙门氏菌有一定的杀灭作用。但在目前的实际应用中，由于沙门氏菌血清型众多，单一噬菌体由于其裂解特异性限制了其杀菌范围，研制一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂，拓宽噬菌体杀菌范围、增加杀菌活性一直是本领域亟待解决的技术难题。

发明内容

针对上述问题，提供一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂，以多种裂解性沙门氏菌噬菌体为主要成分，全面、快速、无残留的杀灭沙门氏菌，有效控制养殖和食品加工过程中的沙门氏菌的污染和传播，本发明是这样实现的：

一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂，包括沙门氏菌噬菌体和辅剂，其特征在于，所述沙门氏菌噬菌体至少包括沙门氏菌噬菌体PSA-6、鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu-4-116以及保藏号为CCTCC NO:M2014429的肠炎沙门氏菌噬菌体（Salmonella enterica serovar Enteritidis phage）、保藏号为CCTCC NO:M2014433的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella enterica serovar Typhimurium phage)、保藏号为CCTCC NO:M2014431的德尔卑沙门氏菌噬菌体(Salmonella enterica serovar Derby phage)或保藏号为CCTCCNO:M2014432的伦敦沙门氏菌噬菌体(Salmonella enterica serovar London phage)中三种以上的噬菌体。

本发明中，所述沙门氏菌噬菌体的含量≥10⁵pfu/mL。

本发明所述沙门氏菌噬菌体的含量中，各组分的沙门氏菌噬菌体活噬菌体数量相同。

本发明中，所述辅剂为SM缓冲液。

一种如本发明所述广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂在杀灭沙门氏菌的应用。

本发明中，所述杀灭沙门氏菌中的应用是指：将广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂作为消杀剂，在屠宰场、畜禽产品加工车间及器具、养殖环境中喷洒，防止沙门氏菌污染。

本发明中，所述杀灭沙门氏菌中的应用是指：将广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂作为添加剂添加到畜禽产品中，防止畜禽产品中沙门氏菌的污染。

本发明所述在杀灭沙门氏菌中的应用是指：将广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂作为药物添加到畜禽饲料中，或对畜禽体表喷雾，或给畜禽灌服，或给畜禽肌肉注射，预防畜禽被沙门氏菌感染。本发明的有益效果在于：

（1）该广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂是通过多种裂解性沙门氏菌噬菌体的复配作为有效杀菌成分，与单一裂解性沙门氏菌噬菌体相比，大大拓宽了其杀菌范围，增加其杀菌活性。

（2）由于自然界中裂解性沙门氏菌噬菌体的数量庞大，来源广，容易分离获得，因此，以多种裂解性沙门氏菌噬菌体为主要成分的生物杀菌剂成本低、绿色型、无刺激性气味、无环境污染问题。

（3）该生物杀菌剂完全为水溶液，容易配置成喷洒液或制剂，可进行快速、彻底、安全、无残留的杀灭沙门氏菌乃至耐药性沙门氏菌。

附图说明：

图1为肠炎沙门氏菌噬菌体JN54KDE电镜照片；

图2为鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178电镜照片；

图3为德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067-2电镜照片；

图4为伦敦沙门氏菌噬菌体JSD9电镜照片；

图5为实施例噬菌体生物杀菌剂的OD值检测结果。

具体实施方式

实施例中过夜培养是指：挑取TSB平板上的单个菌落，将其接种于5mL LB培养基中，37℃，150rpm震荡过夜。

实施例中SM缓冲液的配制方法为：NaCl 5.8 g，MgSO₄·7H₂O 2 g ，1 mol/L的Tris·HCl 50ML（pH=7.0），5 mL 2% gelatin，加入ddH₂O补足至1000ML。

实施例1 沙门氏菌噬菌体的分离、扩增纯化

本实施例中养鸡场的粪尿污水样品来自于江苏省南通市某养鸡场；宿主菌为本实验室保存的肠炎沙门氏菌SM-54-KDE，分离自济南市某鸡场的病鸡。

噬菌体分离：采集养鸡场的粪尿污水样品，将其经双层滤纸过滤，12000×g离心20min，再分别用0.45μm和0.22μm滤膜过滤上清液；取10mL过滤液，加入0.5mL 过夜培养的宿主菌（含菌量为10⁹cfu/mL），再加入20mL 4×LB培养基，放置于37℃培养12～16h，次日，取上述培养物以12000×g离心10min，取上清并加入占上清体积0.3%的氯仿备用；以点样试验，鉴定该上清是否含有肠炎沙门氏菌噬菌体，再对鉴定后含有肠炎沙门氏菌噬菌体的水样进行双层平板法检测噬菌体噬菌斑数目。

扩增：将获得的肠炎沙门氏菌噬菌体与宿主菌按数量比1:1混合，加入100mL LB液体培养基，再加入CaCl₂母液至终浓度1mM，37℃摇振培养12-16h，12000rpm，4℃，离心10min，取上清，扩增得到肠炎沙门氏菌噬菌体裂解液。

纯化：在获得的100mL肠炎沙门氏菌噬菌体裂解液中加入RNase A至1μg/mL、加入DNaseⅠ至1μg/mL， 37℃温育30min后，加10.0g PEG 8000，5.84g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1h（实际操作中，也可以4℃过夜），再于4℃离心10000rpm 10min，去上清液；加2mL SM缓冲液，充分洗涤管壁及沉淀，室温反应1h；再加入等体积的氯仿抽提，温和振荡 30s，再于4℃，5000rpm离心10min，分离有机相和亲水相，回收含有肠炎沙门氏菌噬菌体颗粒的亲水相，获得纯化的肠炎沙门氏菌噬菌体，双层平板检测纯化噬菌体，纯化的肠炎沙门氏菌噬菌体的效价为≥10⁸pfu/mL。

申请人将该肠炎沙门氏菌噬菌体自命名为JN54KDE，其微生物学特征为：如图1所示，该噬菌体具有呈多面体的头部结构和可伸缩性的尾部，应属于肌尾病毒科，该噬菌体属于裂解性噬菌体。

申请人将该纯化的肠炎沙门氏菌噬菌体JN54KDE保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO:M2014429,保藏日期为：2014年9月19日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072 。

实施例2 鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的分离、扩增及纯化

本实施例中鸡场的粪尿污水样品来自于江苏省南通市某养鸡场；宿主菌为鼠伤寒沙门氏菌HNER178，分离自江西省某养殖场的病死鸡体内，本实验室保存。

鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的分离、扩增和纯化，除宿主菌为鼠伤寒沙门氏菌HNER178外，其余步骤与实施例1相同，纯化的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的效价为≥10⁸pfu/mL。

申请人将该鼠伤寒沙门氏菌噬菌体自命名为JX178，其微生物学特征为：如图2所示，该噬菌体具有呈多面体的头部结构和长尾，应属于长尾病毒科，该噬菌体属于裂解性噬菌体。

将纯化的裂解性鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO: M2014433，保藏日期为2014年9月19日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072 。

实施例3 德尔卑沙门氏菌噬菌体的分离、扩增及纯化

本实施例中污水样品来自于江苏省某农贸市场；宿主菌为德尔卑沙门氏菌HNER067-2，分离自江西某农贸市场，本实验室保存。

德尔卑沙门氏菌噬菌体的分离、扩增及纯化，除宿主菌为德尔卑沙门氏菌外，其余操作步骤与实施例1相同，纯化的德尔卑沙门氏菌噬菌体的效价为≥10⁸pfu/mL。申请人将德尔卑沙门氏菌噬菌体自命名为JX067-2，其微生物学特征为：如图3所示，该噬菌体具有呈多面体的头部结构和长尾，应属于长尾病毒科，该噬菌体属于裂解性噬菌体。

申请人将纯化的德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067-2保存于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏号为CCTCC NO: M2014431，保藏日期为：2014年9月19日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072 。

实施例4 伦敦沙门氏菌噬菌体的分离、扩增纯化

本实施例中污水样品来自于江苏省某鸡场；宿主菌为伦敦沙门氏菌D9，分离自江苏省某鸡场病鸡体内，本实验室保存。

伦敦沙门氏菌噬菌体的分离、扩增及纯化，除宿主菌为伦敦沙门氏菌外，其余操作步骤与实施例1相同，纯化的伦敦沙门氏菌噬菌体的效价为≥10⁸pfu/mL。申请人将该伦敦沙门氏菌噬菌体自命名为JSD9，其微生物学特征为：如图4所示，该噬菌体具有呈多面体的头部结构和可收缩性的尾，应属于肌尾病毒科，该噬菌体属于裂解性噬菌体。

将纯化的伦敦沙门氏菌噬菌体的JSD9在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏号为CCTCC NO: M2014432，保藏日期为：2014年9月19日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072 。

实施例5 制备广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂

分别取实施例1-4获得的肠炎沙门氏菌噬菌体JN54KDE、鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178、德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067-2、伦敦沙门氏菌噬菌体JSD9，以及沙门氏菌噬菌体PSA-6（由ZL 201010508259.9公开，下同）和鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu-4-116（由ZL201110053518.8公开，下同），上述6种噬菌体的效价均≥10⁸pfu/mL，将上述6种噬菌体按照噬菌体数量等比例进行充分混合，加入适量SM缓冲液，即获得广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂，其中沙门氏菌噬菌体数量≥10⁵pfu/mL。

实施例6 广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂杀菌效果测试

过夜培养的肠炎沙门氏菌SM-54-KDE菌液1.0mL（含菌量为2×10⁹cfu/mL）用LB将其OD_600nm值调整为1.0（约为1×10⁹cfu/mL），分别加入实施例5获得的广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂（效价为1×10⁵pfu/mL）和实施例1获得肠炎沙门氏菌噬菌体JN54KDE，最后分别用LB调整其OD_600nm为0.5左右，于37℃静置培养，同时以不加噬菌体作为对照组，在培养的0、1、2、3、4、5、6、7h检测OD_600nm值的变化。

结果如图5所示，与不加噬菌体的对照组相比，广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂（生物杀菌剂）和肠炎沙门氏菌噬菌体JN54KDE (单株噬菌体)组，1h后沙门氏菌数量均增长缓慢，而且2h后，沙门氏菌数量均急剧下降，7小时后沙门氏菌数量将到最低值。从图5上可以看出，生物杀菌剂与单株噬菌体杀菌效果一样迅速和彻底。

实施例7 广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂的裂菌作用范围实验

本实施例中所涉及的311株沙门氏菌菌株：其中肠炎沙门氏菌120株，占67.52%；鸡白痢沙门氏菌27株，占8.68%；鼠伤寒沙门氏菌25株，占8.04%；印第安纳沙门氏菌23株，占7.40%；德尔卑沙门氏菌15株，占4.82%；其余沙门氏菌共11株，占15.75%。

实验分为对照组与实验组，其中：

对照组1为实施例1获得的沙门氏菌噬菌体JN54KDE，效价≥10⁵pfu/mL。

对照组2为实施例2获得的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178，效价≥10⁵pfu/mL。

对照组3为实施例3获得的德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067-2，效价≥10⁵pfu/mL。

对照组4为实施例4获得的伦敦沙门氏菌噬菌体JSD9，效价≥10⁵pfu/mL。

对照组5为沙门氏菌噬菌体PSA-6，效价≥10⁵pfu/mL。

对照组6为鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu-4-116效价≥10⁵pfu/mL。

对照组7为沙门氏菌噬菌体PSA-6、实施例3获得的德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067-2和实施例4获得的伦敦沙门氏菌噬菌体JSD9等量混合后，加入适量SM缓冲液，该三种噬菌体的效价均≥10⁵pfu/mL。

对照组8为实施例1获得的沙门氏菌噬菌体JN54KDE、实施例2获得的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178、实施例3获得的德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067-2和鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu-4-116等量混合后，加入适量SM缓冲液，该4种噬菌体的效价均≥10⁵pfu/mL。

对照组9为沙门氏菌噬菌体PSA-6、实施例1获得的沙门氏菌噬菌体JN54KDE、实施例2获得的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178、鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu-4-116和实施例4获得的伦敦沙门氏菌噬菌体JSD9等量混合后，加入适量SM缓冲液，该5种噬菌体的效价均≥10⁵pfu/mL。

实验组为实施例5获得的广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂，效价为1×10⁵pfu/mL。

实验过程：分别取311株沙门氏菌过夜培养的菌液100ul均匀涂布于LB平板，待其干燥后分别取10ul实验组或对照组噬菌体点样于菌苔表面，并以生理盐水点样作对照，每个样品做3个重复，待液滴干燥后倒置于37℃培养箱，培养12~16h于第二天观察效果。

经点样法测定了沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂和六株单独噬菌体的裂菌作用范围，结果见表1，针对311株沙门氏菌流行株，对照组1-6的裂菌作用范围在52.41-66.88%之间，对照组7-9的裂菌作用范围在80.38-88.42之间，而实验组对286株沙门氏菌具有裂解作用，裂菌作用范围为91.96%，结果表明，实验组具有宽裂菌谱的特性，其裂菌作用范围显著高于单株噬菌体（对照组1-6）。

表1 噬菌体的裂菌范围测定结果

表中“+”是指能产生裂菌斑；“-”是指不能产生裂菌斑。

实施例8 生物杀菌剂在鸡脯肉中的杀菌效果实验

在无菌环境下，先将1×10⁵cfu/mL肠炎沙门氏菌 SM-54-KDE 20ul滴于鸡脯肉表面，约5min后，再分成实验组和对照组，其中，将实施例5获得的广谱型沙门氏菌生物杀菌剂（效价为1×10⁵pfu/mL）20ul滴于实验组鸡脯肉表面，对照组则滴加20ul的PBS；将制备好的样品置于4℃，于1h、2h、6h、24h和48h后，将实验组和对照组取出，检测沙门氏菌的数量。

结果如表2所示，与细菌对照组相比较，4℃作用6h后，生物杀菌剂几乎可以完全杀灭肠炎沙门氏菌，且能够对食品提供长久的保护。

表2 广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂在鸡脯肉中的杀菌效果实验

实施例9 广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂控制养殖环境中的沙门氏菌污染实验

将浓度为10⁵cfu/ml的肠炎沙门氏菌SM-54-KDE涂抹在屠宰场料槽表面，然后以实施例5获得的广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂（效价为1×10⁵pfu/mL）对料槽实施喷杀，2h后，开始检测沙门氏菌。

检测结果显示，2h后，料槽表面沙门氏菌的数量降到100 CFU以下，5h后，料槽表面沙门氏菌的数量降到10 CFU以下，说明该广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂可以有效杀灭养殖环境中肠炎沙门氏菌。

实施例10 广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂治疗雏鸡沙门氏菌感染实验

使用60只一周龄雏鸡进行感染实验。首先，用肠炎沙门氏菌SM-54-KDE进行喷洒攻毒实验，第二天攻毒雏鸡全部出现腹泻症状，将感染的60只雏鸡平均分成3组，每组20只，分别采用大腿肌肉注射1mL/只、口腔灌服10mL/只和鸡舍喷雾100mL/舍的方式，使用实施例5获得的广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂（效价为1×10⁵pfu/mL）对感染沙门氏菌的雏鸡进行治疗，连续24h观察并记录。

结果显示：使用生物杀菌剂治疗后，肌肉注射、灌服和喷雾三种方式均可在24h内恢复雏鸡的状态，减轻腹泻症状；其中灌服和肌肉注射组能明显快速(小于24h)的控制腹泻症状；喷雾方式效果较慢，但是24h后，雏鸡也恢复活力。

实施例11、广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂控制饲料中的沙门氏菌污染实验

挑取肠炎沙门氏菌SM-54-KDE单克隆，经过夜培养后，调整浓度为1×10⁵cfu/ml，用小型喷雾器(瓶)将1ml菌液喷在摊开的10g饲料添加剂表面，然后将实施例5获得的广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂1ml （效价为1×10⁵pfu/mL ）的浓度实施喷杀，2h后，检测沙门氏菌。

检测结果显示，在以10⁵pfu/ml浓度实施喷杀2h后，饲料中肠炎沙门氏菌SM-54-KDE的数量降到10 cfu/g以下，说明该生物杀菌剂可以有效杀灭饲料中污染的沙门氏菌。

Claims

1.一种广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂，包括沙门氏菌噬菌体和辅剂，其特征在于，所述沙门氏菌噬菌体包括沙门氏菌噬菌体PSA-6、鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu-4-116以及保藏号为CCTCC NO:M2014429的肠炎沙门氏菌噬菌体（Salmonella enterica serovarEnteritidis phage）、保藏号为CCTCC NO:M2014433的鼠伤寒沙门氏菌噬菌体(Salmonella enterica serovar Typhimurium phage)、保藏号为CCTCC NO:M2014431的德尔卑沙门氏菌噬菌体(Salmonella enterica serovar Derby phage)和保藏号为CCTCC NO:M2014432的伦敦沙门氏菌噬菌体(Salmonella enterica serovar London phage)；

所述沙门氏菌噬菌体的含量≥10⁵pfu/mL；

所述沙门氏菌噬菌体的含量中，各组分的沙门氏菌噬菌体活噬菌体数量相同。

2.根据权利要求1所述广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂，其特征在于，所述辅剂为SM缓冲液。

3.如权利要求1或2所述广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂在杀灭沙门氏菌的应用；

所述杀灭沙门氏菌中的应用是指：将广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂作为消杀剂，在屠宰场、畜禽产品加工车间及器具、养殖环境中喷洒，防止沙门氏菌污染;

或者，所述杀灭沙门氏菌中的应用是指：将广谱型沙门氏菌噬菌体生物杀菌剂作为添加剂添加到畜禽产品中，防止畜禽产品中沙门氏菌的污染。