CN112625989B - 一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE‑311菌株及其应用，本发明提供了一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE‑311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019733，分类学命名Escherichia coli。该菌株具有高转化效率，是作为改造、表达的良好宿主，且自身能表达K99黏附素。

Description

一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌Escherichia coli ETECBE-311菌株及其应用。

背景技术

肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli)是引起新生仔猪和断奶仔猪黄痢、白痢、水肿等腹泻疾病的主要病原菌之一，给我国乃至全世界养猪业带来了巨大经济损失。ETEC的主要致病因子有两种：黏附素(又称定居因子抗原)和肠毒素。在感染初生仔畜后，ETEC通过黏附素在宿主肠道内迅速定植、繁殖，进而产生肠毒素使动物水和电解质失衡，出现腹泻甚至脱水死亡的情况，发病率和死亡率均很高。定植过程是毒素积累的前提条件，ETEC的致病性很大程度上取决于其定植、增殖的能力。

不同的ETEC菌株的菌毛抗原类型不同，主要有K88、K99、F41、987P，引起仔猪腹泻的主要肠毒性大肠杆菌菌株的抗原类型主要是K88和K99。近年来，为了解决由ETEC引起的仔猪腹泻等一系列疾病，国内外学者致力于具有抗体菌株的疫苗研发工作。

传统的多黏附素菌株的构建都是扩增多重菌毛基因串联表达，且以常见工程菌作为宿主，常见工程菌自身都不具备K99黏附素基因片段也不能表达K99黏附素，而本发明提供了筛选出的一种具有高转化效率的菌株作为改造、表达宿主，且该菌株自身具有K99黏附素并能大量表达外源质粒的基因。

本发明利用筛选出的菌株所制备重组菌株能够实现肠毒性大肠杆菌特异性菌毛的双重表达，使重组菌株能够同时具备多重黏附蛋白抗原，为多联黏附蛋白抗体提供菌株基础。同时，表达有双黏附素的大肠杆菌细胞壁具有更强的与肠道细胞受体结合的能力，可以对多重致病性大肠杆菌的侵袭提供更多的占位保护能力，重组菌株本身黏附能力的有效加强使其在与有害菌竞争肠道定植位点时处于优势地位，能有效保障动物体内肠道健康。

发明内容

为了解决上述问题，本发明以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因，转化至不同肠毒素性大肠杆菌中，筛选出一株具有高转化效率的菌株作为改造、表达宿主。

本发明提供了一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019733，分类学命名Escherichia coli。

以及，所述的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311，其16SrDNA序列如SEQ IDNO.1所示。

以及，所述的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株具有K99黏附素的应用。

以及，所述的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株制备成大肠杆菌与重组质粒pQE30-GFP相配合进行转化的应用。

以及，所述的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株作为宿主的应用。

本发明提供的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株具有高转化效率，是作为改造、表达的良好宿主。同时大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株自身能表达K99黏附素，还能够大量表达外源质粒上的faeG基因，减少了基因重组所需的成本。本发明提供的菌株还能进一步重组为Escherichia coli ETEC BE-311-faeG菌株，且该重组菌株具有保护肠道的作用。

附图说明

图1为ETEC BE-311的革兰氏染色镜检图；

图2为ETEC BE-311的16SrRNA扩增电泳图；

图3为ETEC BE-311的肠毒素类型检测电泳图；

图4为ETEC BE-311的黏附素类型检测电泳图；

图5为pQE30-GFP转化至各菌株荧光表达量对比图；

图6为pQE30-GFP转化至不同菌株的日光平板图；

图7为pQE30-GFP转化至不同菌株在蓝光激发下的荧光平板图；

图8为双砷-四半胱氨酸系统特异性检测的荧光显微镜检测结果；

图9为IPEC-J2细胞黏附实验的显微镜观察结果；

图10为ETEC BE-311-faeG在大鼠胃肠道中阻碍ETEC定植的作用探究的动物实验设计方案示意图。

具体实施方式

本发明提供如下技术方案：

本发明从湖北省武汉市江夏区某养猪场腹泻仔猪粪便样品中分离、纯培养，经过革兰氏染色鉴定、16SrRNA扩增比对、肠毒素基因扩增后，得到多株肠毒性大肠杆菌；根据现有的大肠杆菌黏附蛋白基因序列设计引物，以多种肠毒素性大肠杆菌的DNA为模板，通过PCR扩增并确定不同菌株的黏附蛋白类型；以绿色荧光蛋白GFP作为报告基因，转化至不同肠毒素性大肠杆菌中，筛选出一株具有高转化效率的菌株(命名为Escherichia coli ETECBE-311)作为改造、表达宿主。

一、细菌的分离纯化：用灭菌的磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.2)将湖北省武汉市江夏区某养猪场腹泻仔猪粪粪便样品稀释100倍。将50μL稀释液加入含有普通营养琼脂培养基的培养皿中，并用“L”型一次性涂布棒涂匀。将接种后的培养皿置于37℃培养箱中培养12～16h。挑取可疑菌落在新培养基上进行划线接种。如此操作，分离和传代，革兰氏染色后，用光学显微镜观察分离细菌形态，判断细菌纯度。图1为ETEC BE-311的革兰氏染色镜检图。其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

16SrRNAPCR扩增与测序：按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取分离菌株的DNA，作为PCR扩增的模板。采用细菌的通用引物27F和1492R扩增分离菌株的16SrRNA，预计片段大小为1453bp。引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成。反应体系(50μL)：2×HieffTM PCR Master Mix 25μL、上下游引物各1μL、Template DNA 1μL、Rnase-free H2O22μL。PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸44s，35个循环；72℃延伸10min；维持4℃。图2为ETEC BE-311的16S rRNA扩增电泳图。

二、肠毒素、黏附素基因检测：根据NCBI上已发表的序列信息，设计如表1菌株筛选鉴定所用引物表中所示的特异性引物，对分离得到的大肠杆菌进行肠毒素(LTa、LTb、ST1、ST2)和黏附素(K88、K99、987P、F41)基因检测，PCR反应体系及程序参照16S rRNA扩增步骤。

图3为ETEC BE-311的肠毒素类型检测电泳图，其中M：DL 2000bp DNA Marker；泳道1：ST₁；泳道2：ST₁阳性对照；泳道3：ST₂；泳道4：ST₂阳性对照；泳道5：LTb；泳道6：LTb阳性对照；泳道7：LTa；泳道8：LTa阳性对照。图4为ETEC BE-311的黏附素类型检测电泳图，M：DL2000bp DNA Marker；泳道1：BE-311菌毛类型检测；泳道2：标准菌株菌毛阳性对照。从图4中能看出ETEC BE-311自身具有类型为K99的黏附素。

表1：菌株筛选鉴定所用引物表

三、表达宿主的筛选：利用绿色荧光蛋白GFP(激发波长：488nm；发射波长：507nm)作为报告基因，连入pQE30质粒，转化至筛选得到的肠毒性大肠杆菌BE263、BE209、BE-311、BE314、BE327及对照工程菌TOP10中，利用荧光分光光度计测定菌液的荧光强度，来反映菌株的转化效率，即外源蛋白的表达能力，最终得到良好的表达宿主ETEC BE-311。图5为pQE30-GFP转化至各菌株荧光表达量对比图，显然ETEC BE-311最优。图5中K99、K88ab是标准菌株，BE263、BE209、BE-311、BE314、BE327是筛选出的菌株。

四、转化效果对比：图6为pQE30-GFP转化至不同菌株的日光平板图，其中A：K99-GFP；B：K88ab-GFP；C：Top10-GFP；D：BE209-GFP；E：BE263-GFP；F：BE-311-GFP；G：BE314-GFP；H：BE327-GFP。

图7为pQE30-GFP转化至不同菌株在蓝光激发下的荧光平板图，其中A：K99-GFP；B：K88ab-GFP；C：Top10-GFP；D：BE209-GFP；E：BE263-GFP；F：BE-311-GFP；G：BE314-GFP；H：BE327-GFP。

重组质粒pQE30-GFP转化至ETEC标准菌株K99、K88ab、K88ac、987P，大肠杆菌工程菌TOP10，及分离菌株BE209、BE263、BE-311、BE314、BE327后，涂布在含有Amp的LB平板上，放置37℃的培养箱16h。在转化次日，转化TOP10的菌落颜色呈现出绿色；转化至K99的菌落同样呈现绿色，转化至K88ab的菌落呈白色，转化至K88ac、987P的平板未长出菌落；转化至BE-311的菌落呈绿色，其余分离菌株均呈白色。

用蓝光激发光源照射平板特异性观察菌落表达GFP绿色荧光的情况发现荧光强度基本与日光菌落颜色一致，且在E.coli K88ab及分离菌株BE209、BE314中存在质粒丢失的情况，出现假阳性结果。

绿色荧光蛋白GFP能在E.coli BE-311中高效表达，于培养次日整个平板的菌落基本全部变绿，荧光值与工程菌E.coli TOP10相当。以上实验说明筛选出的BE-311菌株具有高转化效率、能大量表达外源质粒的基因。

利用上述筛选出的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株，本发明还提供了其重组菌株大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311-faeG的制备方法及其应用。

所述重组菌株大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311-faeG的制备方法及重组菌株鉴定思路为：

1、大肠杆菌表面展示表达载体的构建：根据NCBI上已发表的基因序列，选取Lpp前29个氨基酸(包含信号肽)序列设计引物并进行生物合成；根据OmpA的基因序列，设计引物，并以肠杆菌DH5α基因组DNA为模板进行扩增，将两段基因通过重叠延伸PCR的方式进行融合表达，构成pQE30-Lpp’OmpA质粒；经查阅相关文献后，选择K88菌毛的主要蛋白亚基faeG为目的基因进行黏附素的扩增，并与pQE30-Lpp’OmpA质粒进行连接，完成pQE30-Lpp’OmpA-faeG重组表达载体的构建。

2、ETEC BE-311的外源黏附素表达：用CaCl₂法将ETEC BE-311制备成大肠杆菌感受态；将构建好的pQE30-Lpp’OmpA-faeG质粒转化至感受态中，涂布于Amp+抗性平板上，37℃培养12h。

3、重组菌的特性鉴定：挑取上述抗性平板上的阳性克隆于试管培养基中，培养过夜后，进行双酶切验证和测序比对；进一步将重组菌株加诱导剂培养过夜，经SDS-PAGE电泳检测目的黏附蛋白的表达情况。为了检验faeG是否成功展示在了宿主ETEC BE-311细胞壁表面，本发明设计了特异性扩增引物，在目的片段后面加上了一段包含6个氨基酸的半胱氨酸标签—TC短肽，该短肽在与双砷染料ReAsH特异性共价结合后，经一定波长的光激发(最大激发波长593nm)，即可发出红色荧光，可以直接用荧光显微镜检测。以IPEC-J2猪小肠上皮细胞作为材料设计细胞黏附实验对重组菌的黏附特性进行鉴定。

以下是具体实施例：

一、大肠杆菌表面展示菌株的构建

经查阅相关文献及NCBI搜索后选择K88菌毛的主要蛋白亚基faeG为目的基因进行黏附素的扩增，黏附素蛋白faeG的序列如SEQ ID NO.2所示。TC短肽在与双砷染料ReAsH特异性共价结合后，经一定波长的光激发(最大激发波长593nm)，即可发出红色荧光，可以直接用荧光显微镜检测，用于检验faeG是否成功展示在了宿主ETEC BE-311细胞壁表面。

利用引物设计软件primer5.0，利用同源重组的原理针对待整合的基因设计引物，通过PCR的方法分别扩增出Lpp、OmpA、faeG及faeG-TC后，再进行重叠PCR制备重组片段，与Kpn I和BamH I双酶切线性化载体pQE30进行连接，将重组质粒转化至Top10，在含有氨苄抗性的LB平板上挑取单克隆进行菌落PCR，双酶切验证以及测序鉴定阳性重组子，成功构建pLpp’OmpA-faeG及pLpp’OmpA-faeG-TC。便于之后再进一步将质粒提取后转化至ETEC BE-311感受态中，筛选鉴定得到具有双重黏附素抗原的重组菌株。相关引物及反应体系如表2至表7所示。

表2菌株构建过程中所需要的引物

表3 PCR反应体系

PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸60s(Lpp：72℃延伸9s；OmpA：72℃延伸21s；faeG/faeG-TC：72℃延伸52s)，35个循环；72℃延伸10min；维持4℃。

表4重叠延伸PCR反应体系

PCR反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸29s，35个循环；72℃延伸10min；维持4℃。

表5 pQE-30双酶切体系

表6酶连体系

表7菌落PCR反应体系

二、大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311感受态细胞的制备

1)从过夜培养12-16h的新鲜平板上挑取单菌落接种于装有100mL LB培养基的锥形瓶中，在37℃，200rpm条件下震荡培养2-3h，直至OD₆₀₀nm达到0.3-0.4；

2)将100mL的菌液平均分装到两个50mL预冷的离心管(无菌)中，放冰上静置30min，在高速冷冻离心机中于4℃4000rpm条件下离心10min，收集菌体细胞；

3)弃上清，用10mL预冷的0.1M氯化钙溶液重悬，冰上静置10min，然后在高速冷冻离心机中于4℃4000rpm条件下离心10min，收集菌体细胞，重复一次；

4)弃上清，每管菌体沉淀用2mL含有15％甘油的氯化钙溶液重悬，取出预冷且预先写好标记的1.5mL的EP管迅速分装，每管分装100μL，-80℃保存备用；

5)从-80℃超低温冰箱取出感受态细胞放置于冰上冻融，将连接产物全部加入到感受态细胞中，轻弹管壁混匀，放冰上静置30min；

6)将离心管置于42℃水浴锅中严格90s，取出后冰上静置5min；

7)在离心管中添加600μL灭菌的LB液体培养基，37℃120rpm温育40min；

8)低速离心浓缩取上清，取适量的菌悬液均匀涂布于抗性平板上，在恒温培养箱中37℃倒置培养12-16h。

三、双砷-四半胱氨酸系统的特异性检测，用于检验faeG是否成功展示在了宿主ETEC BE-311细胞壁表面

1)转接新鲜菌液于新的5mL LB培养基中，在37℃，200rpm条件下震荡培养2h，直至OD₆₀₀nm达到0.6-0.8时，加入5μL IPTG继续诱导培养4h；

2)取400μL摇好的菌液于2mL离心管，8500rpm离心2min；

3)用400μLECB缓冲液(配置方法：135mM NaCl，5mM KCl，10mM HEPES，2mM MgCl₂，2mM CaCl₂，pH 7.4)洗涤菌体，重复两次，最后一次重悬混匀。加入400μL 2μM ReAsH-EDT₂染料，混匀后用锡纸包裹离心管，避光处理；

4)将离心管置于37℃，50rpm条件的培养箱中，菌和染料孵育2h；

5)取出离心管，9000rpm离心2min，用ECB重复洗涤3次，最后用400μLECB重悬菌体；

取10μL样品在载玻片上涂开，盖上盖玻片，做好标记，于荧光显微镜下观察(激发波长：593nm/发射波长：608nm)。

荧光显微镜检测结果如图8所示，其中A为大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株；B为重组菌株大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311。图8的B中灰色的点就是在荧光显微镜检测发出红色荧光的点。

四、IPEC-J2细胞黏附实验

细胞的培养：

将IPEC-J2细胞于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。将1mL细胞接种于24孔板(孔中已铺好灭菌处理过的盖玻片)中，每孔细胞约2.5×10⁵个，置于细胞培养箱中过夜。随机分为对照组(野生K88、野生ETEC BE-311、空孔)及实验组(ETEC BE-311-faeG)，每组设置3个复孔。

细菌的处理

用接种环从LB培养基上挑取单菌落并接种于5mL LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床振荡过夜；取50μL菌液加入5mL LB液体培养基中继续摇床培养9h(对照组直接培养，实验组先培养2h，超净操作加入5μL IPTG进行诱导，再培养至9h)，测OD₆₀₀(约为2.3；菌浓为2×10⁸CFU/mL)。取5mL菌液于离心管中，12000rpm离心3min，弃去上清，收集细菌，加入1mLPBS重悬，得到最后菌悬液的浓度约为1×10⁹CFU/mL。

细菌与细胞黏附：

取菌悬液30μL于新的无菌EP管中，12000rpm离心8min。用100μL IPEC细胞培养基进行重悬，振荡混匀，备用；将各组细胞用适量体积的预温无菌PBS清洗5次，随后将重悬后的菌液接种到24孔板内，置于37℃孵箱中孵育2h，使细菌感染细胞；用预温无菌PBS清洗孔板，洗去未黏附的细菌5次，加入4％戊二醛室温固定15min，用PBS室温漂洗三次，每次10min。在孔板中加入150μL的0.1％的结晶紫溶液染色3min，通过移液枪反复吸取和注入无菌水对样品进行染料的去除，待清洗液至无色时，取出玻片，用显微镜观察并记录。

观察结果如图9所示，可见重组菌株ETEC BE-311-faeG具有良好的黏附性，如果用IPTG诱导蛋白表达则黏附性更优，其中A为ETEC BE-311菌株；B为野生K88菌株；C为未诱导的重组菌株ETEC BE-311-faeG；D为用IPTG诱导蛋白表达的重组菌株ETEC BE-311-faeG。

五、重组菌株大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311-faeG在大鼠体内对攻毒菌株侵染的肠道保护作用研究实验

1菌株准备

按1％的接种量将Escherichia coli ETEC BE-311野生菌及Escherichia coliETEC BE-311-faeG重组菌接种到LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养12-16h。测新鲜菌液的OD₆₀₀nm，根据该值估算菌浓，利用灭菌生理盐水作为介质，对菌液进行浓缩，使得最终的菌浓为109CFU/mL，于灭菌的50mL离心管密封保存于-20℃冰箱。将浓缩菌液送至湖北省农业科学院辐照加工研究所进行灭活处理，选择辐照剂量为8kGy。取回样品，于超净工作台中用接种环蘸取少许菌液在LB平板上划线，检查其是否已全部灭活。用1.5mL的离心管分装样品，每管1mL，最后冷藏于-4℃冰箱中。

2动物实验方法

BE-311-faeG在大鼠胃肠道中阻碍ETEC定植的作用探究的动物实验设计方案如图10所示。42只初断奶的SD雄性大鼠购自湖北省疾病防控中心，并根据实验需求随机分成4组：PC(Positive Control，PC)阳性对照组、NC(Negative Control，NC)阴性对照组、单黏附素FanC组(即Escherichia coli ETEC BE-311)及双黏附素FanC-FaeG组(即Escherichiacoli ETEC BE-311-faeG)。其中表达K99菌毛的主要基因为FanC，表达K88菌毛的主要基因为FaeG。鼠房温度控制在25℃左右，日照时间为7:00至18:00。SD大鼠每笼2只，位置摆放在相同环境下。前2天为适应期，在此期间内，供应充足的饲料及饮用水，让大鼠自由采食饮水。从第3天开始进入预防期，给大鼠称重，清空之前未吃完的饲料和饮用水，给每笼添加500g混合饲料，100mL饮水。对照组饮用生理盐水，实验组分别在生理盐水中加入1mL浓度为1×10⁹CFU/mL的BE-311和BE-311-FaeG菌液。每日换水，并记录其饮水量。第7天进行攻毒，将ETEC标记菌株K99-mCherry和K88ab-GFP的菌液按1：1混合离心，12000rpm，3min，用含0.3％NaHCO₃的生理盐水重悬，使得终浓度为1×10⁹CFU/mL。用灭菌的灌胃针吸取1mL给阳性对照组及实验组的每只大鼠灌胃。攻毒后12h，将阳性对照组及实验组，每组随机取6只，用颈椎脱臼法处死后解剖，剥离其全肠置于平板中，迅速保藏于-4℃冰箱中，并于第二天分段处理分析。粪便样品的采集时间点为攻毒后12h、24h、48h和72h。到第12天，将全部4组的大鼠(4×6＝24只)进行称重并解剖，取其肝脏、脾脏样品，也存于-4℃冰箱中，并迅速分析。

3肠道和粪便的取样处理方法

肠道样品：按照10倍稀释法，将已处理过的样品稀释成一系列梯度的菌液，然后采用平板计数法，吸取0.1mL稀释液涂布于带Amp抗性的乳糖LB平板上，每个样品涂3个平行，置于37℃恒温培养箱过夜培养。挑选培养好的、适宜浓度的平板进行计数，利用激发光源装置的蓝光来特异性识别平板上的K88ab-GFP绿色菌落，绿光用以识别K99-mCherry红色菌落。

粪便样品：于攻毒后12h、24h、48h和72h采取，取样时，固定小鼠，将其尾部提起，用手指轻轻按压小鼠下腹部，收集新鲜粪便于对应编号的已称重的10mL离心管中，每管分装2-3颗，再次称重。根据样品的重量，加入适量的灭菌生理盐水进行10倍稀释，并与玻璃珠混合，使其充分匀浆。静止2-5min后即可吸取上清涂板于带Amp的乳糖LB平板上，不能及时分析的样品可放在-4℃保存，分析前先振荡混匀再静止后取样。将处理好的样品进行系列梯度稀释，然后涂布于带Amp抗性的LB平板上，利用激发光源照射计数。

4数据处理与统计分析

本试验实验数据采用JMP 11.0统计软件进行处理分析。利用Tukey HSD(可靠显著差异)成对检验分析实验动物的生长性能方面的结果，同列角标字母不同表明差异显著；利用Dunnett检验分析菌落回收数据，控制组为阳性对照组，P<0.05被认为处理间差异显著。每个试验最终结果以6个平行结果的平均值±标准差来表示。

5实验结果与讨论

5.1攻毒后对大鼠生长性能的影响

对42只SD雄性大鼠整个实验期间(包括适应期、预防期和攻毒期)的增重、饮水及采食情况进行统计，结果如表8所示。在为期12天的实验中，任何一组老鼠的活动都没有明显的变化。所有大鼠均健康，无死亡情况。阴性对照组的日增重水平远高于阳性对照组(P<0.05)，说明在用ETEC标记菌株K88ab-GFP和K99-mCherry攻毒后，对SD大鼠具有显著的毒害作用，保持了菌株自身的肠毒素特性。经灭活ETEC处理的实验组(FanC组与FanC-FaeG组)与阴性对照组的平均日增重处于同一个水平，且FanC-FaeG组高于FanC组(P<0.05)，证明两种灭活ETEC的预处理均能有效缓解SD大鼠受到的毒害情况，保证其生长不受影响，双黏附素FanC-FaeG组的效果还优于单黏附素FanC组；在日均采食量的统计上，各组结果基本与日增重结果一致，实验组与阴性对照组无显著差异，阳性对照组采食量显著降低，恰好进一步证明了攻毒后SD大鼠所受到的毒害作用以及预处理对毒害作用的缓解；各组在饲料转化率及日均饮水量上无统计学差异，说明在饮水中加入一定量的ETEC灭活菌株不会影响水质口感，从而导致大鼠饮水量下降。

表8不同黏附素灭活菌株对攻毒大鼠生长性能的影响

注：最后的结果表示为平均值±标准差的方式(N＝6)。同列角标字母不同表明差异显著(P<0.05)5.2攻毒后大鼠的脾脏、肝脏变化

攻毒后5天，全部四组SD大鼠(N＝6)采用颈椎脱臼法处死后，用手术剪解剖，取其脾脏、肝脏进行称重，最终数据表示为器官质量占大鼠总质量的百分比，结果见表9。由表9可知，对照组及实验组的脾脏重量十分接近，并无显著差异。而在肝脏称重的结果中，阴性对照组明显低于阳性对照组及两个实验组(P<0.05)，具有统计学意义；同时，阳性对照组又远远高于单黏附素FanC组及双黏附素FanC-FaeG组(P<0.05)，表明攻毒菌株的侵入会引起大鼠肝脏肿大，但ETEC灭活菌的预处理能够起到一定程度的缓解作用。

表9不同黏附素灭活菌株对攻毒大鼠相对脾脏和肝脏重量的影响

注：最后的结果表示为平均值±标准差的方式(N＝6)。同列角标字母不同表明差异显著(P<0.05)5.3攻毒后大鼠粪便中标记菌株的回收统计

用K99-mCherry和K88ab-GFP混合菌液对大鼠灌胃处理，分别在攻毒后12h、24h、48h和72h取粪便样品进行标记菌株的回收检测，结果见表10。从数据来看，12h时，阳性对照组及实验组内检测到K99-mCherry的量无统计学差异，而双黏附素FanC-FaeG组回收到的K88ab-GFP的量显著高于单黏附素FanC组和阳性对照组(P<0.10)；24h时，FanC-FaeG组检测到K99-mCherry的量明显高于阳性对照组(P<0.10)，FanC组与阳性对照无统计学差异。在K88ab-GFP的回收结果中，FanC-FaeG组和FanC组都显著低于阳性对照组，且FanC-FaeG组相差更大；到了48h时，K88ab-GFP在各组中均未能被检测到，而实验组FanC和FanC-FaeG两组都远远低于阳性对照组(P<0.05)；攻毒后72h，粪便中以无法回收到ETEC特异性标记菌株。

在12h时，实验组中回收到的攻毒菌株与阳性对照无明显差异，甚至高于阳性对照，是由于预处理喂服的灭活ETEC菌株(包含FanC与FanC-FaeG)已经优先在肠道内占据了部分结合位点，导致攻毒菌株定植过程受到阻碍，大部分都随着肠道的蠕动，被排出体外。加上攻毒时间太短，已黏附的病原菌无法迅速增殖，使得粪便中回收的数量显著增多。攻毒24h后，预处理带来的影响效力逐渐弱化，已定植的病原菌在肠道内生长繁殖，成为影响病原菌菌浓的主要因素。相较于对照组，实验组定植的病原菌少，肠道排空能力强，故粪便中的回收数量远远少于阳性对照组。

表10不同黏附素灭活菌株对攻毒大鼠粪便中特异性标记菌株细菌总量的影响

注：最后的结果表示为平均值±标准差的方式(N＝6)。*标字母表明试验组与阳性对照组相比差异显著，其中*代表P<0.10，**代表P<0.05，***代表P<0.01。

5.4攻毒后大鼠各肠段中标记菌株的回收统计

按照丈量法将SD大鼠肠道分为5段，处理样品，稀释涂板并计算各肠段内不同ETEC特异性标记菌株的绝对量，结果统计如表11所示。在十二指肠、空肠和回肠内，双黏附素FanC-FaeG组检测到的K99-mCherry和K88ab-GFP均显著低于阳性对照组，说明双黏附素重组菌能够通过自身黏附特性的增强，有效减少ETECK88及K99在肠道内的黏附和定植，起到占位保护的作用。单黏附素FanC组与阳性对照无统计学差异，说明单黏附素的菌株在与同等黏附能力的ETEC处于一个肠道内环境时，无法明显的影响对方与特异性受体的结合，从而抑制病原菌的定植。ETEC标记菌株在盲肠和结肠中回收的量均很大，但各组之间无显著性差异。这一现象可能是因为由ETEC菌毛黏附素导致的特异性定植只针对小肠进行，而与大肠无关，且其定植的具体部位根据受体的分布和小肠内控制菌毛表达的特定的环境信号共同决定。而小肠并不包括结肠和盲肠，因而各组间无差异。

表11不同黏附素灭活菌株对攻毒大鼠各肠段特异性标记菌株细菌总数的影响

注：最后的结果表示为平均值±标准差的方式(N＝6)。*标字母表明试验组与阳性对照组相比差异显著，其中*代表P<0.10，**代表P<0.05，***代表P<0.01。

6结果分析

试验前后FanC-FaeG组(即Escherichia coli ETEC BE-311-faeG)与阴性对照组的大鼠生长性能方面无显著性差异(P<0.05)；攻毒后12h，测不同肠段内各组的标记菌回收数量，在十二指肠、空肠及回肠中E.coli数量：FanC-FaeG组<FanC组<阳性对照，盲肠与结肠段各组无显著性差异；攻毒后12h、24h、48h和72h，分别取粪便样品进行检测，12h时，FanC-FaeG组>FanC组≈阳性对照，24h时，FanC-FaeG组<FanC组<阳性对照，24h后无法回收到标记菌株。证实重组菌株Escherichia coli ETEC BE-311-faeG的双黏附特性能够显著减少致病菌在小肠内的特异性黏附，有效缓解攻毒后大鼠受到的毒害作用，保证其正常生长。因此重组菌株大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311-faeG菌株具有保护肠道的作用，也能应用于制备为保护肠道的药物中。

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1435

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

tgggaaggct agaatgcagt cgaacggtaa caggaagcag cttgctgctt cgctgacgag 60

tggcggacgg gtgagtaatg tctgggaaac tgcctgatgg agggggataa ctactggaaa 120

cggtagctaa taccgcataa cgtcgcaaga ccaaagaggg ggaccttcgg gcctcttgcc 180

atcggatgtg cccagatggg attagctagt aggtggggta acggctcacc taggcgacga 240

tccctagctg gtctgagagg atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 300

tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agccatgccg 360

cgtgtatgaa gaaggccttc gggttgtaaa gtactttcag cggggaggaa gggagtaaag 420

ttaatacctt tgctcattga cgttacccgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc 480

agccgcggta atacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcacgc 540

aggcggtttg ttaagtcaga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcatctgata 600

ctggcaagct tgagtctcgt agaggggggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta 660

gagatctgga ggaataccgg tggcgaaggc ggccccctgg acgaagactg acgctcaggt 720

gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780

cgacttggag gttgtgccct tgaggcgtgg cttccggagc taacgcgtta agtcgaccgc 840

ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900

tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctggtctt gacatccacg 960

gaagttttca gagatgagaa tgtgccttcg ggaaccgtga gacaggtgct gcatggctgt 1020

cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt 1080

tgttgccagc ggtccggccg ggaactcaaa ggagactgcc agtgataaac tggaggaagg 1140

tggggatgac gtcaagtcat catggccctt acgaccaggg ctacacacgt gctacaatgg 1200

cgcatacaaa gagaagcgac ctcgcgagag caagcggacc tcataaagtg cgtcgtagtc 1260

cggattggag tctgcaactc gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtggatcaga 1320

atgccacggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg 1380

gttgcaaaag aagtaggtag cttaaccttc gggagggcgc taccacttgg ataac 1435

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaaaga ctctgattgc actggcaatt gctgcatctg ctgcatctgg tatggcacat 60

gcctggatga ctggtgattt caatggttcg gtcgatatcg gtggtagtat cactgcagat 120

gattatcgtc agaaatggga atggaaagtt ggtacaggtc ttaatggatt tggtaatgta 180

ttgaatgacc tgaccaatgg tggaaccaaa ctgaccatta ctgttactgg taataagcca 240

attttgttag gccgaaccaa agaagcattt gctacgccag taactggtgg tgtagatgga 300

attcctcata ttgcatttac tgactatgaa ggagcttctg tagtactcag aaaccctgat 360

ggtgaaacta ataaaaaagg tttagcatat tttgttctgc cgatgaaaaa tgcagagggc 420

actaaagttg gttcagtgaa agtgaatgca tcttatgccg gtgtgttagg gagaggtggg 480

gttacttctg cggacgggga gctgctttcg ctttttgccg acgggttgag ctctatcttt 540

tatggtggtt tgccgagggg ttctgaactc tcggctggga gtgccgcagc ggagcgcaca 600

aagttgtttg gaagtctatc aagaaatgat attctcggac agattcaaag agtaaacgca 660

aatattactt ctcttgttga cgtcgcaggt tcttacaggg aaaacatgga gtacactgat 720

ggaactgttg tttctgctgc ctatgcactg ggtattgcaa acggtcagac tattgaggca 780

acttttaatc aggctgtaac taccagcact cagtggagcg ctccgctgaa cgtagcaatt 840

acttattact aa 852

Claims (3)

1.一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编 430072，保藏日期为2019年9月18日，保藏编号为：CCTCC NO：M2019733，分类学命名Escherichia coli。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311，其16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株作为宿主的应用。

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