CN114480164B - 一种土壤溶杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种土壤溶杆菌及其应用，涉及微生物技术领域。本发明提供的土壤溶杆菌为土壤溶杆菌(Lysobacter soli)FTB‑N1，于2021年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23348。该菌具有固氮及钝化重金属的作用，可将空气中的游离氮转化为可被作物吸收的氮，提高作物对氮素的利用；可有效将镉污染土壤中的可交换态镉钝化，降低其有效性，减小镉对作物生长胁迫作用的同时，避免了镉向作物植株体内转移，降低了作物的镉含量，提升食品安全性。

Description

一种土壤溶杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种能够固氮及钝化土壤重金属 的土壤溶杆菌及其应用。

背景技术

随着我国工业化进程的加快，大量有毒重金属离子未经处理直接排放到 土壤和水体中，造成了严重的重金属污染土壤问题，这不但导致土壤的生产 力下降造成作物减产，而且通过生物富集作用危害人类健康。我国的土壤重 金属污染的情形体现了广泛和持久的典型特质，修复和再生重金属污染土壤 的问题刻不容缓。

重金属污染土壤的修复方法主要有两类：一是将污染物清除，即将污染 物从一个地方转移至另一个地方；二是将污染物钝化，即从可溶态或可交换 态转变为难溶态，有效减少污染物在土壤中的迁移性和生物可利用性。现有 的土壤修复技术包括换士法、化学修复、生物钝化、电修复和热修复等方法。 其中生物钝化技术将土壤中的细菌及真菌通过生物吸附固定、溶解、氧化还原等降低重金属的可交换态，具有不存在二次污染，对土壤破坏小等优点。 因此对重金属污染土壤进行生物钝化修复，降低其中的重金属的含量，从而 减少其在农作物中的累积，无论对于改善土壤本身种植能力，还是提高人类 自身健康均具有重大的科学研究意义和实用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种土壤溶杆菌，该菌能够起到土壤 固氮和钝化土壤重金属的作用，固氮作用促进作物生长，钝化土壤中重金属 减少重金属胁迫，从两方面提升作物产量，并能够避免重金属向作物体内迁 移，减少了重金属在作物体内的积累。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种土壤溶杆菌，名称为土壤溶杆菌(Lysobacter soli)FTB-N1，于2021 年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 编号为CGMCCNo.23348；该土壤溶杆菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述土壤溶杆菌生理、形态特征为：革兰氏阴性菌，好氧型；菌体呈杆 状，两端钝圆；单生，大小为(0.2-0.5)μm×(2-70)μm，无鞭毛，但具 有滑行能力，无芽孢；菌落黄色。

本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂中添加有上述土壤溶杆 菌。

优选的是，所述微生物菌剂中土壤溶杆菌有效菌数为3.0-7.0×10⁹cfu/g。

优选的是，所述微生物菌剂制备方法包括：将所述土壤溶杆菌活化后， 接种于发酵培养基中，28-32℃培养48h-96h。

更优选的是，所述发酵培养基包括如下重量份组分：蛋白胨8-12份， 牛肉膏粉4-6份，氯化钠4-6份，琼脂9-15份，蒸馏水800-1200份，pH＝7.2-7.4。

本发明还提供了上述土壤溶杆菌或上述微生物菌剂在土壤固氮和/或土 壤重金属修复中的应用；所述土壤重金属修复指钝化土壤重金属。

优选的是，所述重金属为镉。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种土壤溶杆菌FTB-N1及其应用，该菌具有固氮及钝化 重金属的作用。以菌剂的形式将本发明的土壤溶杆菌FTB-N1施用于农田， 将空气中的游离氮转化为可被作物吸收的氮，提高作物对氮素的利用；将本发明的土壤溶杆菌FTB-N1施用于镉污染土壤，可有效将污染土壤中的可交 换态镉钝化，降低其有效性，减小镉对作物生长胁迫作用的同时，避免了镉 向作物植株体内转移，降低了作物的镉含量，提升了食品安全性。

附图说明

图1为FTB-N1的菌落形态图；

图2为显微镜下FTB-N1菌体图。

具体实施方式

本发明提供了一种土壤溶杆菌，菌株号为FTB-N1，于2021年09月02 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.23348。

本发明土壤溶杆菌FTB-N1是从河北省唐山市玉田县玉田镇纪家庄村农 田土壤中筛选获得的。对筛选获得的FTB-N1菌株经形态鉴定和16S rDNA测序分析，确定为土壤溶杆菌(Lysobactersoli)FTB-N1。在营养琼脂培养 基上30℃有氧培养72h，菌体可以大量生长，菌落形态结果如图1所示，菌 体呈杆状，两端钝圆。单生，菌落黄色。显微镜观察发现菌体大小一般为 (0.2～0.50)μm×(2～70)μm，无鞭毛，但具有滑行能力，无芽孢，如图 2所示。采用细菌16s rDNA通用引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3 所示：

27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)

1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，其中M代表简并碱基， M＝A/C，即表明M为A或C，对菌株FTB-N1进行扩增和正向测序，得到 的序列长度为1446bp，具体序列如SEQ IDNO.1所示。

将测序结果在NCBI数据库中进行比对，最终鉴定筛选获得的样品为土 壤溶杆菌(Lysobactersoli)FTB-N1。

本发明的另一目的在于提供一种添加有上述土壤溶杆菌的微生物菌剂， 优选所述微生物菌剂中土壤溶杆菌有效菌数为3.0-7.0×10⁹cfu/g，该微生物 菌剂同样具备上述土壤溶杆菌(Lysobactersoli)FTB-N1的生物活性功能； 进一步优选有效菌数为5.0-7.0×10⁹cfu/g。优选上述微生物菌剂制备方法包 括：将所述土壤溶杆菌(Lysobactersoli)FTB-N1活化后，接种于发酵培养 基中，28-32℃培养48h-96h；进一步优选接种于发酵培养基中，30℃培养72h。

优选上述发酵培养基包括如下重量份组分：蛋白胨8-12份，牛肉膏粉 4-6份，氯化钠4-6份，琼脂9-15份，蒸馏水800-1200份，pH＝7.2-7.4；进 一步优选蛋白胨10份，牛肉膏粉5份，氯化钠5份，琼脂12份，蒸馏水1000 份，pH＝7.2-7.4。本发明对上述培养基原料没有特殊限定，采用本领域常规 市售产品即可。

本发明还提供了上述土壤溶杆菌(Lysobactersoli)FTB-N1或由该菌制 备的微生物菌剂在土壤固氮和/或修复重金属污染土壤中的应用。进一步优选 微生物菌剂的施用量为土壤质量的3-10‰，更优选施用量为土壤质量的5‰。 本发明中修复重金属污染土壤指通过土壤溶杆菌(Lysobactersoli)FTB-N1 钝化土壤中重金属，进一步优选所述重金属为重金属镉。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将土壤溶杆菌FTB-N1接种于蛋白胨10份，牛肉膏粉5份，氯化钠5份， 琼脂12份，蒸馏水1000份，调节pH＝7.3，30℃下培养72h。获得土壤溶杆菌 FTB-N1发酵液。

实施例2

将土壤溶杆菌FTB-N1接种于蛋白胨8份，牛肉膏粉4份，氯化钠4份，琼脂9份，蒸馏水800份，调节pH＝7.2，28℃下培养96h。获得土壤溶杆菌FTB-N1 发酵液。

实施例3

将土壤溶杆菌FTB-N1接种于蛋白胨12份，牛肉膏粉6份，氯化钠6份， 琼脂15份，蒸馏水1200份，调节pH＝7.4，32℃下培养48h。获得土壤溶杆菌 FTB-N1发酵液。

实施例4

通过乙炔还原法测定土壤溶杆菌FTB-N1的固氮能力

将土壤溶杆菌FTB-N1接种于含有15mL半固体NFB的25ml小瓶中，置于 30℃培养箱中培养48h，将小瓶瓶盖换成橡胶塞，用无菌注射器抽出10％的 气体，每瓶注入10％乙炔，再置于30℃培养箱中培养36h。用无菌注射器中 瓶中抽取混合气体0.2mL注入气相色谱仪(Trace GC2000，Chrom-cord，Italy) 进样柱中，测定乙炔含量。其中，以不接种菌注有乙炔的小瓶为对照，重复 3次。从显示屏上乙炔、乙烯峰值判断有无乙烯的产生并确定其固氮活性。

试验结果表明，30℃下，菌株土壤溶杆菌FTB-N1可以以112nmol/小时 /10⁸个细胞的平均速度将乙炔还原为乙烯，具有固氮能力。

实施例5

将土壤溶杆菌FTB-N1接种于10g蛋白胨，5g牛肉膏粉，5g氯化钠，12g 琼脂，1000ml蒸馏水，调节pH＝7.3，30℃下培养72h。以沸石作为多孔微生 物载体，接种培养好的土壤溶杆菌FTB-N1，设置CK(沸石)，微生物菌剂 1-3(沸石接种土壤溶杆菌FTB-N1有效菌数3.0×10⁹cfu/g、5.0×10⁹cfu/g和7.0 ×10⁹cfu/g)。

于小麦种植盆中，按栽培基质(草炭V：蛭石V：沙子V＝1:1:3，测定氮 素含量1.03g/kg)质量5‰施用沸石CK及微生物菌剂1-3，播种以经过催芽的 小麦种子，并进行相同管理措施，重复3次。在小麦成熟期检测小麦产量等 各指标，求平均值，结果如表1所示。

表1土壤溶杆菌FTB-N1微生物菌剂对小麦产量的影响

根据表1可以看出，在相同氮素含量的栽培基质中，通过施用含有土壤 溶杆菌FTB-N1的微生物菌剂，该微生物菌剂能够起到良好的固氮作用，将 空气中的游离氮转化为可被作物吸收的氮，相较于CK，明显促进小麦高产， 增产率达到69.9-77.0％。

实施例6

将土壤溶杆菌FTB-N1接种于10g蛋白胨，5g牛肉膏粉，5g氯化钠，12g 琼脂，1000ml蒸馏水，调节pH＝7.3，30℃下培养72h。以沸石作为多孔微生 物载体，接种培养好的土壤溶杆菌FTB-N1，设置CK(沸石)，微生物菌剂 1-3(沸石接种土壤溶杆菌FTB-N1有效菌数3.0×10⁹cfu/g、5.0×10⁹cfu/g和7.0 ×10⁹cfu/g)。

准备圆柱形塑料桶。取玉田县后湖工业聚集区某耕地镉污染壤土，风干 过5mm筛，测定可交换态镉含量为1.66mg/kg。将镉污染壤土分别装入准备 好的圆柱形塑料桶中，每桶1kg，分别按土壤质量5‰施用沸石CK及微生物 菌剂1-3，喷施去离子水保持土壤含水量在60％，室温下培养45d，测定微生 物菌剂1-3对镉污染土壤中镉的钝化能力。

表2土壤溶杆菌FTB-N1微生物菌剂对土壤镉形态的影响

处理	可交换态Cd(mg/kg)	钝化率(％)
			CK	1.66	0
微生物菌剂1	0.212	87.2
			微生物菌剂2	0.198	88.1
微生物菌剂3	0.157	90.5

根据表2可以看出，本发明添加有土壤溶杆菌FTB-N1的微生物菌剂可大 幅降低土壤中可交换态镉含量，可交换态镉的钝化率达到87.2-90.5％。

实施例7

将土壤溶杆菌FTB-N1接种于10g蛋白胨，5g牛肉膏粉，5g氯化钠，12g 琼脂，1000ml蒸馏水，调节pH＝7.3，30℃下培养72h。以沸石作为多孔微生 物载体，接种培养好的土壤溶杆菌FTB-N1，设置CK(沸石)，微生物菌剂 1-3(沸石接种土壤溶杆菌FTB-N1有效菌数3.0×10⁹cfu/g、5.0×10⁹cfu/g和7.0 ×10⁹cfu/g)。

取玉田县后湖工业聚集区某耕地镉污染壤土，风干过5mm筛，测定可交 换态镉含量为1.82mg/kg。将镉污染壤土填入小麦种植盆中，按基质质量5‰ 分别施用沸石CK及微生物菌剂1-3，播种已经过催芽的小麦种子，并进行相 同管理措施，重复3次。在小麦成熟期检测小麦产量等各指标，求平均值， 结果如表3所示。

表3土壤溶杆菌FTB-N1微生物菌剂对小麦产量及籽粒镉含量的影响

处理	产量(kg/亩)	籽粒Cd含量(mg/kg)
			CK	573.8	0.532
微生物菌剂1	992.7	0.042
			微生物菌剂2	1044.3	0.038
微生物菌剂3	1078.7	0.030

根据表3可以看出，本发明添加有土壤溶杆菌FTB-N1的微生物菌剂通过 固氮作用，将空气中的游离氮转化为可被作物吸收的氮；通过钝化镉污染土 壤中的可交换态镉，减小了镉对小麦生长的胁迫作用，从两方面提升了小麦 产量，并能够降低土壤中镉向小麦植株中的迁移，降低了小麦籽粒镉含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 沣田宝农业科技有限公司

<120> 一种土壤溶杆菌及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1446

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcgccctcc cgaaggttaa gctacctgct tctggtgcaa aaactcccat ggtgtgacgg 60

gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcagcaa tgctgatctg cgattactag 120

cgattccgac ttcatggagt cgagttgcag actccaatcc ggactgagat ggggtttctg 180

ggattggctt gccctcgcgg gttcgcagcc ctctgtcccc accattgtag tacgtgtgta 240

gccctggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 300

cggcggtctc cttagagttc ccaccattac gtgctggcaa ctaaggacaa gggttgcgct 360

cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcagcacctg 420

tgtcacggtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tccgtgcatg tcaaggccag 480

gtaaggttct tcgcgttgca tcgaattaaa ccacatactc caccgcttgt gcgggccccc 540

gtcaattcct ttgagtttca gtcttgcgac cgtacttccc aggcggcgaa cttaacgcgt 600

tagcttcgat actgagtgcc tagttgcacc caacatccag ttcgcatcgt ttagggcgtg 660

gactaccagg gtatctaatc ctgtttgctc cccacgcttt cgtgcctcag tgtcagtgct 720

ggtccaggta gccgccttcg ccacggatgt tcctcccgat atctacgcat ttcactgcta 780

caccgggaat tccgctaccc tctaccgcac tctagtaagc cagtatccaa tgcagttccc 840

aggttgagcc cagggctttc acatcagact taacaaacca cctacgcacg ctttacgccc 900

agtaattccg agtaacgctt gcacccttcg tattaccgcg gctgctggca cgaagttagc 960

cggtgcttat tcttccggta ccgtcataac acccgagtat taatcgagcg cttttctttc 1020

cggacaaaag tgctttacaa cccgaaggcc ttcttcacac acgcggcatg gctggatcag 1080

gcttgcgccc attgtccaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct ggaccgtgtc 1140

tcagttccag tgtggctgat catcctctca gaccagctac ggatcgtcgc cttggtgggc 1200

ctttaccccg ccaactagct aatccggcat cggctcatct atctgcgtga ggcccgaagg 1260

tcccccactt tctcccgtag gacgtatgcg gtattagcgt aagtttccct acgttatccc 1320

ccacaaatag gcagattccg atgcattcct cacccgtccg ccactcgcca cccaaggagc 1380

aagctcctct gtgctgccgt tcgacttgca tgtgttaggc ctgccgccag cgttcactct 1440

gagcca 1446

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> mutation

<222> (12)..(12)

<223> m=A/C

<400> 2

agtttgatcm tggctcag 18

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

1.一种土壤溶杆菌，其特征在于，名称为土壤溶杆菌(Lysobactersoli)FTB-N1，于2021年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.23348。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，添加有权利要求1所述的土壤溶杆菌。

3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中土壤溶杆菌有效菌数为3.0-7.0×10⁹cfu/g。

4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂的制备方法包括：将所述土壤溶杆菌活化后，接种于发酵培养基中，28-32℃培养48h-96h。

5.根据权利要求4所述的微生物菌剂，其特征在于，所述发酵培养基包括如下重量份组分：蛋白胨8-12份，牛肉膏粉4-6份，氯化钠4-6份，琼脂9-15份，蒸馏水800-1200份，pH＝7.2-7.4。

6.权利要求1所述土壤溶杆菌或权利要求2-5任意一项所述微生物菌剂在土壤固氮和/或土壤重金属修复中的应用；所述土壤重金属修复为钝化土壤重金属；所述重金属为镉。