CN106754563B

CN106754563B - 一种防治烟草青枯病的微生物组合物及用途

Info

Publication number: CN106754563B
Application number: CN201710080626.1A
Authority: CN
Inventors: 吴翔; 甘炳成; 彭卫红; 谢丽源; 黄忠乾; 谭昊; 周洁
Original assignee: Soil and Fertilizer Research Institute SAAS
Current assignee: Sichuan Edible Fungi Research Institute
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2017-02-15
Publication date: 2020-01-03
Anticipated expiration: 2037-02-15
Also published as: CN106754563A

Abstract

本发明属于微生物领域，具体提供了一种防治烟草青枯病的微生物组合物；该微生物组合物由3株放线菌属细菌：细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)CGMCC 12841、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC 12842、链霉菌(Streptomyces pratensis)CGMCC 12843和1株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)组合而成。该微生物组合物能有效防治烟草青枯病，并改善烟草农艺性状、调整土壤中的有益微生物比例、提高烟草产量和上等烟的比例。此外，本发明还提供了该微生物组合物的培养方法。

Description

一种防治烟草青枯病的微生物组合物及用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种微生物组合物及其对烟草的青枯病的防治应用。

技术背景：

烟草作为我国重要的经济作物之一，截止2010年，烟草种植面积为135万公顷，占耕地总播种面积的0.86％。我国烟草种植区域广泛，而就主要烟草栽培分布区而言，烟叶生产地集中在云南、贵州、四川、重庆、湖南等地的经济欠发达地区，烤烟给农民带来的经济收益远大于其它作物，因此，烟叶成为烟草种植区重要的经济作物，烟叶生产成为这些种植地区的支柱种植产业和农民的支柱收益方式，对这些地区的经济增长具有举足轻重的作用。据统计，仅2015年上半年，烟草行业实现工商税利6242.4亿元，上缴财政总额4850.6亿元，预计全年上缴财政将超1万亿元。可见烟草对国家财政收入和国民经济的促进作用的贡献大，其独特的重要地位不容忽视。

但烟草种植受多种病害影响，其中烟草青枯病是我国最严重的土传细菌性病害。该病害一旦发病，其发病率可达到50％以上，如果遇到适宜烟草青枯病原菌生长的持续高温高湿天气，可引起大范围的病害爆发，甚至造成整个种植地区绝收的巨大损失。烟草青枯病在我国长江以南的烟区普遍发生，且以重庆、四川、江西、湖南、福建等省市地区的烟区最为严重，近年来，该病的发生有向北方烟区扩散的趋势。为了防治烟草青枯病，提高烟草产量，研发和应用了大量的化学药品和肥料，结合其它防治和管理措施，这类药品和肥料尽管能暂时控制病害，但烟草青枯病原菌却很难彻底消除，而且化学投入品会增加对环境的负面影响。微生物菌剂具有环境友好性，能减少或替代化学投入品的使用，在防治烟草病害的同时可以减少化学肥料给环境带来的负面影响，具有很大的应用价值。

发明内容

本发明目的包括：

提供一种微生物组合物，以及该微生物组合物的用途；

提供该微生物组合物的培养方法；

提供该微生物组合物的施用方法，等。

本发明公开了一株从土壤分离得到的细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)，该菌株已于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 12841，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明实验中简称为SC-105-B-10。

本发明公开了一株从土壤分离得到的微白黄链霉菌(Streptomycesalbidoflavus)该菌株已于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 12842，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明实验中简称为L2-003-A-5。

本发明公开了一株从土壤分离得到的链霉菌(Streptomyces pratensis)；该菌株已于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 12843，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明实验中简称为SC-168-A-2。

本发明公开了一株从土壤分离得到的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；该菌株已于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC 12844，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株在本发明实验中简称为MT-002-B-7。

本发明微生物组合物由上述3株放线菌：细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)CGMCC 12841、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC 12842、链霉菌(Streptomyces pratensis)CGMCC 12843，和1株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CGMCC 12844组成。该4株菌从土壤中分离筛选所得，具有一定防治烟草青枯病的能力。

本发明提供了一种微生物组合物的具体实施方式，由CGMCC 12841、CGMCC 12842、CGMCC 12843和CGMCC 12844三种放线菌和一种细菌CGMCC 12844组成；

所述CGMCC 12841、CGMCC 12842、CGMCC 12843和CGMCC 12844的活菌数的比例为(1～5):(1～5):(1～5):(1～5)；

优选的，活菌数的比例为1:1:1:1。

本发明还提供了上述微生物组合物防治烟草青枯病，改善农艺性状和调节土壤微生物比例的用途；以及上述微生物组合物作为生物肥料的用途，如防治烟草青枯病、改善烟草植株农艺性状、提高烟草产量和提高上等烟出产量的用途；所述烟草植株农艺性状，包括烟草的株高、茎围、最大叶长、最大叶宽和有效叶数等。

本发明的另一种实施方式是，提供一种复合液体发酵液；由上述微生物组合物和任选的培养液制备而成；

优选的，所述复合菌剂为液体制剂，其中辅料可以为水等。

进一步优选的，所述液体发酵物的活菌数为1.0×10⁸～1.0×10⁹个/ml。

对于上述微生物、微生物组合物的培养方法，可以将四种微生物在培养基中分别培养后，按比例复合而成；也可以将四种微生物按比例复合后，同时在培养基中培养得到；所述培养液为LB培养液，由重量比为2:1:2的胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠组成，该培养液的PH值为7～8；优选的，该培养液由胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g和NaCl 10.0g组成，pH值为7.4；

上述微生物、微生物组合物的培养方法，也可以参照本领域常规方法进行培养。

有益效果

本发明微生物组合物具有以下有益效果：

1、通过本发明的构建，该微生物组合物中的4株菌实现了协同增效的效果。

4株菌按特定比例组成的组合物拮抗烟草青枯病的效果优于单株菌和由单株菌组成的其他组合。

2、盆栽和小区试验证明该组合物对烟草青枯病具有100％防治效果；

3、本发明组合物对烟草农艺性状株高、茎围、最大叶长、最大叶宽和有效叶数都有显著或极显著的改善作用；

4、能改善植株根际土壤中的微生物区系，极显著提高细菌、真菌和放线菌数量，调整土壤中的各类微生物比例；

4、能较对照提高烟草产量18.09％，提高上等烟比例21.8％。

微生物材料保藏

2016年8月15日，细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)CGMCC 12841保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

2016年8月15日，微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC 12842保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

2016年8月15日，链霉菌(Streptomyces pratensis)CGMCC 12843保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

2016年8月15日，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CGMCC 12844保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。

具体实施方式

实施例一、最优微生物组合物的筛选获得

一.拮抗菌的筛选

1.培养基

TM培养基：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，酪素水解物(Trypticase)1.0g，琼脂粉18.0g

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.2

2.拮抗能力的测定方法

烟草青枯病病原菌，由云南省烟草科学研究院惠赠。

将病原菌接种于液体TM培养基，30℃、170r/min振荡培养36h，离心收集菌体并用无菌水重悬，放置于经70％酒精和10％双氧水消毒的无菌喷瓶里，然后均匀地喷洒在TM平板上，每皿喷雾约0.2mL，制成含病原菌的平板，在离平板中心距离相等的3个方向分别用6mm无菌打孔器打孔备用。将筛选所得菌株于液体牛肉膏蛋白胨培养基中30℃、170r/min振荡培养24h，每孔中注入30μL发酵液，于30℃正置培养36h后，记录孔周围的抑菌圈直径，抑菌圈直径大小代表各菌株对病原菌抑制能力的大小。

二.构建拮抗组合物

从土壤中分离筛选获得3株放线菌和1株细菌有较强拮抗烟草青枯病原菌的能力，它们分别是：1.L2-003-A-5；2.SC-105-B-10；3.SC-168-A-2；4.MT-002-B-7。对4株菌进行复合构建。菌株编号与组合物编号方式如表1-1所示。

将4株拮抗菌株进行单个菌株、两两组合、3个组合以及4个菌株全部接入，共有15个组合，如表1-2所示。组合内菌株均从试管中挑取一环接入同一个装有无菌LB培养液的三角瓶中，30℃、180r/min发酵培养48～60h，检测各个组合发酵液对烟草青枯病的抑制效果，以不接菌的LB培养液为对照，每个组合重复3次。

表1-1菌株编号、菌株组合的名称

表1-2拮抗菌系配伍效果

注：以上数据为3个重复的平均值±标准差，a,b,c…指在5％水平上具有差异

构建15个复合菌系组合对烟草青枯病的拮抗效果如表1-2所示，从表中可以看出，单个菌株中，菌株MT-002-B-7的抑菌圈直径最大；两两组合中菌株L2-003-A-5和菌株MT-002-B-7的组合效果最好；而无菌株L2-003-A-5参与的三个菌株组合效果最佳；总的来说，4株菌都参与的″1234″组合对烟草青枯病的拮抗圈直径最大，平均直径达到30.00mm，其次是“234”组合，平均直径为27.33mm，这两个组合的抑菌圈直径都显著优于其它组合(P<0.05)。为了选出最优的组合，对两个组合(“1234”组合、“234”组合)进行了稳定性检测试验，分别将发酵好的两个组合的菌液于室温保存，于保存后第5天、第15天、第30天和第50天检测其拮抗能力，检测结果如表1-3所示。

表1-3两个组合稳定性检测

从表1-3的检测结果可知，两个组合在检测的4个时间内，和刚培养好的菌液相比(如表1-2中234和1234两个组合的抑菌圈直径)，拮抗能力均有所下将。其中组合234的拮抗能力降低的更快，在第50天，其拮抗能力就相对刚培养好的菌液的降低了25.61％，而组合1234的拮抗能力稳定性相对较好，在第50天的降低率仅为3.53％，因此结合组合物效果的稳定性，最终选择“1234”组合为目的拮抗菌系。

实施例二.以下为盆栽试验例

1.处理设置：

对照(CK):不施菌液

处理:组合物(L2-003-A-5+SC-105-B-10+SC-168-A-2+MT-002-B-7)发酵液，即实施例1所述的“1234”组合。

土壤:盆栽土为121.3℃灭菌3h的水稻土。

2.培养液

TM培养液：蛋白胨10.0g，葡萄糖5.0g，酪素水解物(Trypticase)1.0g LB培养液:胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，pH值为7.4

3.制作组合物发酵液和施用方法

将烟草青枯病病原菌接入TM培养液，30℃、170r/min振荡培养24h，用无菌水将其浓度调至10⁹cfu/mL备用。处理和CK两个处理的青枯病原菌的接入方法采用茎基部穿刺接种法，每个植株注入1mL病原菌菌悬液即可。

将各处理所含的供试菌株在LB培养液中共同发酵，28℃、180r/min发酵培养24～56h，获得浓度为10⁸cfu/mL的菌液。施用时采取灌根的方法，吸取5mL原液，将其用水稀释至100mL，每个处理5个重复。分别在移栽期施用1次，第25d施用1次，第40d施用1次，盆栽试验共进行65d。

4.指标检测

4.1病情调查：

⑴烟草青枯病病情调查方法

根据病情分级判定病害级别，并根据公式计算发病率、病情指数和防治效果。

病情分级

0级:无症状；

1级:茎部有褪绿病斑或条斑，一侧有少数叶片凋萎；

2级:茎部黑色病斑，但未达到顶部(病斑长度<全茎的1/2)，或病侧半数以上的叶片凋萎；

3级:茎部黑色病斑达到植株顶部(病斑长度>全茎1/2)，或病侧三分之二叶片凋萎；

4级:病株茎部枯死(黑斑环绕整个植株)。

⑵调查结果

表2-1各处理菌液施用后对烟草青枯病的防治效果

单位:％

在盆栽试验期间，共进行3次病情调查，调查结果如表2-1所示。处理在盆栽的整个试验期都无烟草青枯病的发病现象，而CK在第25d的发病率达到100％，在3次病情调查中其病情指数逐渐升高。此外，CK的植株长势一直不如用了菌液的处理。

4.2土壤微生物区系分析

⑴分析方法

采集时间为每次菌剂施用前，采集剥离表层土后的根际土，分析样品中细菌、真菌、放线菌3个微生物种类的数量。分离方法为稀释平板法，培养基分别是牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和PDA培养基。

①培养基：

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL，pH 6.8～7.2。

高氏一号：KNO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，可溶性淀粉20.0g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4。

PDA培养基：土豆200.0g，葡萄糖20.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH自然。

②倒平板

将121℃灭菌30min后的培养基放入无菌操作台，待其冷却至50℃～60℃时倒入培养皿中。每皿20mL，冷却凝固备用。

③系列稀释

称取土壤样品10.00g，加入带玻璃珠(15个左右)的100mL无菌水中(250mL锥形瓶)，在旋转式摇床上180r/min充分震荡30min即成母液菌悬液(10^-1梯度)。从10^-1稀释液中移取1mL液体加入9mL水中作为10^-2稀释液，再从10^-2稀释液中移取1mL液体加入9mL水中，作为10^-3稀释液…每次吸取悬液，注意把悬液震荡均匀，反复吹吸3次再取样。

④涂布分离

吸取100μL稀释液接到培养基上，用无菌玻璃棒同时涂布，将稀释液均匀地涂开。同一个土壤样品做4个连续梯度，每个梯度3个重复，从低浓度到高浓度进行涂布。细菌培养选取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，放线菌和真菌选取浓度10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。

⑤培养观察

将涂布后的牛肉膏蛋白胨培养基平板、高氏一号培养基平板和PDA培养基平板放于30℃恒温培养箱倒置培养，细菌培养28～36h，放线菌培养4～5d，真菌培养3～5d后取出观察生长情况。

⑥菌落计数

细菌和放线菌以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，真菌以出现10～150个菌落数的稀释度的平板为计数标准，分别统计活菌数目。当只有一个稀释度的平均菌落数在20～300个之间时，则以该平均菌落数计算。若有两个稀释度，其平均菌落数均在20～300个之间时，应按两者菌落总数之比值决定。若其比值小于等于2应计算两者的平均数；若大于2则以稀释度小的菌落平均数计算。

式中：

n_m—质量有效活菌数，单位：个/g；

—菌落平均数，单位：个；

k—稀释倍数；

v₁—基础液体积，单位：mL；

v₂—菌悬液加入量，单位：mL；

m₀—样品量，单位：g。

⑵试验结果

各处理各种微生物计数结果见表2-2。由于盆栽土壤经过了高温高压灭菌，因此土壤中没有土著微生物，检测出的微生物主要是定殖的功能菌株，以及其它部分来自空气、常规管理中水和肥料等土壤接触的介质带入的微生物。3次检测的各处理的各类微生物数量都有逐渐增加的趋势，其中处理的细菌和放线菌的数量都比对照显著提高，第65d时，处理的放线菌数量达到7.88×10⁵cfu/g，原因可能是处理中所含的功能菌株中细菌和放线菌各占优势，在没有土著微生物影响的灭菌土壤中，功能菌株大量的定殖成为优势菌株，并且处理中功能菌株种类的多少也决定了检出的各类微生物的多少。而对照中真菌的数量多于处理，原因可能为对照中无功能菌株接入，其无菌土壤更容易受环境和接触介质中的真菌侵染。

表2-2不同处理土壤微生物区系的影响

微生物数量单位：个/g

4.3农艺性状调查

⑴调查方法

测定在盆栽结束的第65d株高、鲜重、最大叶长和最大叶宽4种农艺性状。

株高指的是自地表茎基处至茎部顶端高度，在打顶后茎顶端生长定型时测量；

鲜重指植株采集后去除上面泥土等杂质，立刻测出包括它完整的根、茎、叶的重量；

最大叶长指的是长度自莲叶连接处至叶尖的直线长度；

最大叶宽指的以叶面最宽处的长度。

⑵基本农艺性状调查分析

表2-3盆栽试验中各处理农艺性状检测结果

盆栽试验农艺性状检测结果如表2-3所示，在调查的4项农艺性状中，处理对植株株高、鲜重、最大叶长和最大叶宽较对照增加效果明显，能促进烟株生长。

实例三.以下为田间试验例

1.微生物组合物发酵液制作方法

按照实施例一中，组合“1234”中的4株菌，配置复合菌系。将4株菌各接种一环于装有250ml LB培养液的500ml三角瓶中，于摇床中30℃、180r/min发酵培养48h，既成种子液。利用发酵罐对种子液进行放大培养，发酵条件是发酵时间为36h，通气量0.5V/V.M，转速250r/h，温度30℃，既成组合物发酵液。

2.试验方法：

2.1处理设置：

对照(CK):不施菌液

处理:组合物(L2-003-A-5+SC-105-B-10+SC-168-A-2+MT-002-B-7)发酵液

2.2施用方法

施用时采取灌根的方法，将发酵好的菌液浓度调至10⁸cfu/mL，每株5mL原液，为了灌根均匀，将其用水稀释至100mL。每个重复3行，每行30株，每个处理3个重复。分别在移栽期施用1次，团棵期施用1次，第二次施用后15d，共施用3次。

3.指标检测

3.1病情调查：

⑴烟草青枯病病情调查方法如实例二

⑵调查结果

在田间试验期间，共进行6次病情调查，从烟草青枯病发病初期开始，每10d一次。从表3-1的青枯病病害调查结果可以看出，在整个田间小区试验期间，对照从第一次调查烟草青枯病发病率为0.27％到最后一次的11.33％，发病率和病情指数都在随着时间持续升高。而处理在6次病情调查中均无烟草青枯病发生，对烟草青枯病的防效都达到了100％，说明这处理中的拮抗菌分泌的拮抗物质在整个试验过程中对青枯病原菌的生长都起到了抑制作用。

表3-1各处理菌液施用后对烟草青枯病的防治效果

单位:％

3.2土壤微生物区系分析

⑴分析方法如实例二

⑵试验结果

如表3-2，根据3次对土壤微生物区系的分析结果可知，在整个试验阶段，对照的细菌、真菌和放线菌数量均在同一个级别，第1次土样中处理和对照各微生物数量之间差异不显著，说明整个试验地中的微生物分布较为均匀。第2次和第3次的样品中处理则因为施用菌液，细菌、真菌和放线菌数量的变化都较大，较对照均达到极显著差异(P<0.01)。从结果可知，处理中的微生物在根际的定殖能力好，繁殖能力强，也促进了根际相关微生物数量的增加。

表3-2不同处理对烟草根际土壤中微生物区系的影响

微生物数量单位：个/g

3.3农艺指标调查

⑴试验方法

对所检测的农艺指标每个处理的各个重复随机取样5株来测定，调查结果通过SPSS13.0软件进行单因素方差分析。株高、鲜重、最大叶长、最大叶宽检测方法如实例二，茎围、节距和有效叶数，各指标检测方法如下：

茎围指第一青果期在烟株高约1/3处测得的茎的圆周长度；

节距指的是第一青果期在株高1/3处测量上下5个叶位，每个叶位测量2个节距(共测量10个节距)的平均长度；

有效叶数指所采收的实际有效叶片数。

⑵试验结果

表3-3各处理农艺性状调查结果

调查每个处理3个重复各5株烟株的农艺性状，并进行方差分析。由表3-3可知，在6个被调查的农艺性状项目中，与对照相比，处理的株高、茎围、最大叶长、最大叶宽和有效叶数有极显著或显著的提高效果。处充分验证了处理的组合物发酵液对烟草具有改善农艺性状、促进生长效果。

3.4产量、上等烟统计

烟叶属于持续采收，每次采收的烟叶由专业的烟草分级工按照各个重复的各个级别分别累计计重，并根据国家发改委、烟草专卖局关于烟草等级的划分标准，对其进行分级。

各处理各等级烟的分别产量和总产量结果如3-4，本次田间小区试验地所采收的烟叶被分为6个级别，分别为4个中等级别X3F、B3F、X2F、C4F，2个上等级别B2F和C3F，处理相对对照上等烟提高比例21.8％，产量提高18.09％，上等烟重量和产量较对照都形成极显著性差异。

表3-4各处理各等级烟的分别产量和总产量

单位：KG

Claims

1.一种微生物组合物，由细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)CGMCC 12841、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC 12842、草地链霉菌(Streptomycespratensis)CGMCC 12843和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CGMCC 12844组成。

2.根据权利要求1所述的微生物组合物，其特征在于，细黄链霉菌(Streptomycesmicroflavus)CGMCC 12841、微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus)CGMCC 12842、草地链霉菌(Streptomyces pratensis)CGMCC 12843和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CGMCC 12844的活菌数的比例为(1～5):(1～5):(1～5):(1～5)。

3.根据权利要求2所述的微生物组合物，其特征在于，所述活菌数的比例为1:1:1:1。

4.权利要求1-3任一项所述的微生物组合物在调节土壤微生物比例中的用途。

5.权利要求1-3任一项所述的微生物组合物在防治烟草青枯病、改善烟草植株农艺性状、提高烟草产量和/或提高上等烟出产量中的用途。

6.一种微生物组合物，含有权利要求1-3任一项所述的微生物组合物，所述组合物为液体发酵物。

7.根据权利要求6所述的微生物组合物，其特征在于，所述液体发酵物的活菌数为1.0×10⁸～1.0×10⁹个/ml。

8.权利要求1-3任一项所述微生物组合物的培养方法，其特征在于，四种细菌在培养液中分别培养后，按比例复合而成；或者四种微生物按比例复合后，同时在培养液中培养得到；所述培养液为LB培养液，由重量比为2:1:2的胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠组成，该培养液的pH值为7～8。