CN103981126A - 微生物菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物农药技术领域，具体公开了一种微生物菌剂及其制备方法与应用。该微生物菌剂由微黄白链霉菌SY-FX-14得到；所述的微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14，保藏日期为2013年12月25日，保藏编号为CGMCC No.8613。本发明将首次从牛粪土中分离得到微黄白链霉菌SY-FX-14作为活性成分制备微生物菌剂，实验结果表明，微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黄瓜炭疽、棉花黄萎、黄瓜灰霉、水稻恶苗、番茄青枯、水稻纹枯、烟草黑胫、小麦根腐、水稻稻瘟、小麦赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黄瓜褐斑、黄瓜霜霉病原菌均具有明显的抑制生长作用。该微生物菌剂制备工艺简单、发酵周期短、并能够快速在土壤和植物体定殖，具有较好的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于生物农药技术领域，特别涉及一种微生物菌剂及其制备方法与应用。
【背景技术】
微生物农药由于其绿色环保，不易产生抗药性的特性，在防治作物病虫害方面得到越来越广泛的重视和应用。微生物农药的推广和应用技术正逐渐趋于成熟，国家在生物防治领域的政策支持力度逐年加大，微生物农药的使用能克服化学农药对生态环境的污染并减少在农副产品中农药的残留，提升农副产品的品质和价格，既具有环境效益又具有经济效益。
目前，市场上推广的主要微生物农药品种集中在芽孢杆菌属和假单胞菌属。链霉菌属是一类能产生抗生素的微生物菌属，作为农用杀真菌类在美国和欧洲登记的种为Streptomyces griseoviridis和Streptomyces lydicus，链霉菌属有望成为继芽孢杆菌属和假单胞菌属后另一类在生物防治领域广泛应用的微生物农药。
【发明内容】
本发明的首要目的在于提供一种微生物菌剂。
本发明的另一目的在于提供所述的微生物菌剂的制备方法。
本发明的再一目的在于提供所述的微生物菌剂的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现：一种微生物菌剂，由微黄白链霉菌SY-FX-14得到；所述的微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14，保藏日期为2013年12月25日，保藏编号为CGMCC No.8613，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）；保藏单位地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号（100101）。
所述的微黄白链霉菌SY-FX-14，分离自辽宁铁岭地区牛粪土，其具有以下生物学特性：（1）在保藏培养基生长，菌丝乳黄色，随着培养时间延长，菌丝颜色加深变灰；（2）在种子培养基生长，菌丝乳白色，菌落与培养基结合处出 现茶色色素；（3）在发酵培养基生长菌丝浅灰色，后逐渐变为土黄色，在液体培养中后期呈较大的浅黄色菌丝团。
所述的微黄白链霉菌SY-FX-14采用以下方法进行培养：将微黄白链霉菌置于保藏培养基中，于25-33℃活化12-24h后置于种子培养基中，于25-33℃、100-150r/min培养1-2天，得到种子液；将所述种子液以体积比4-8%接种于发酵培养基中，于25-33℃、100-150r/min振荡培养2-4天，得到微黄白链霉菌SY-FX-14。
所述的保藏培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，水1L，pH7.4-7.6。
所述的种子培养基：蔗糖30g，蛋白胨5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，K2HPO41g，水1L。
所述的发酵培养基：玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaCl2g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO31g，水1L。
所述的微生物菌剂通过如下方法制备得到：将微黄白链霉菌置于保藏培养基中，于25-33℃活化12-24h后置于种子培养基中，于25-33℃、100-150r/min培养1-2天，得到种子液；将所述种子液以体积比4-8%接种于发酵培养基中，于25-33℃、100-150r/min振荡培养2-4天，得到微黄白链霉菌SY-FX-14；将得到的微黄白链霉菌SY-FX-14与基质混合，得到微生物菌剂。
所述的保藏培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，水1L，pH7.4-7.6。
所述的种子培养基：蔗糖30g，蛋白胨5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，K2HPO41g，水1L。
所述的发酵培养基：玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaCl2g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO31g，水1L。
所述的基质为草炭土、膨润土或微粉碳酸钙。
所述的微生物菌剂的有效活菌数可为5*109cfu/g，pH值为6.0-8.0。
所述的微生物菌剂具有广谱杀菌活性，可用于防治植物病害；
所述的植物病害为白香瓜瓜腐(Choanephora cucurhtarum)、辣椒枯萎(Fusariumoxysporum f.sp.vasinfectum(Atk.)Synder et Hansen)、番茄早疫(Alternariasolani.)、黄瓜炭疽(Colletotrichum orbiculare)、棉花黄萎(Verticillium dahliae)、黄瓜灰霉(bocrytis Cinerea Pers.)、水稻恶苗(Fusarium moniliforme Sheld.)、番茄青枯(Pseudomanas solanacearumSmith)、水稻纹枯(Thanatephorus cucumeris(Frank)Donk)、烟草黑胫(Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker)、小麦根腐(Cochliobolus sati-vu(Ito et Kurib.)Drechsl.)、水稻稻瘟(hyricularia grisea(Cooke)Sacc.)、小麦赤霉(Fusarium graminearum Schw.)、油菜菌核(Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary)、大豆根腐(Fusarium orthoceras Appel.Et Wollenweber)、番茄灰霉(Botrytis cinerea)、黄瓜褐斑(Corynespora cassiicola)和黄瓜霜霉(Pseudoperonospora cubensis(Berk.Et Curt.)Rostov)中的至少一种。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
本发明将首次从牛粪土中分离得到微黄白链霉菌SY-FX-14作为活性成分制备微生物菌剂，实验结果表明，微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黄瓜炭疽、棉花黄萎、黄瓜灰霉、水稻恶苗、番茄青枯、水稻纹枯、烟草黑胫、小麦根腐、水稻稻瘟、小麦赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黄瓜褐斑、黄瓜霜霉病原菌均具有明显的抑制生长作用。该微生物菌剂制备工艺简单、发酵周期短、并能够快速在土壤和植物体定殖，具有较好的应用前景。
【具体实施方式】
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14的分离和鉴定：
（1）微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14的分离
从辽宁铁岭地区牛粪土采集土壤10g，加入内装100mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于120r/min摇床上振荡30min，振荡结束后静置1h，取上清0.5mL加入4.5mL无菌水中，涡旋混合，依次稀释10-2、10-3、10-4倍，分别取150μL稀释液涂布于高氏一号培养基平板上，每个梯度涂布3个平行，在28℃培养3d，挑取培养基上的单菌落进行平板划线纯化，获得微黄白链霉菌菌株。
（2）微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14的鉴定
16S rRNA基因序列测序结果表明SY-FX-14菌株的16S rRNA基因序列为序列表1中核苷酸序列。根据测序结果与Genbank中链霉菌16S rRNA基因序列进行同源性比较，结果表明SY-FX-14菌属于链霉菌属（Streptomyces）中的微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）。
实施例2
含有微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14活性成分菌剂的制备：
（1）培养基的配制
保藏培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，水1L，pH7.4-7.6；
种子培养基：蔗糖30g，蛋白胨5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，K2HPO41g，水1L；
发酵培养基：玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaCl2g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO31g，水1L。
将上述培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。
（2）菌种活化
将微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14转接种子斜面培养基，置于恒温培养箱中，28℃培养24h。
（3）种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤（1）中制得的种子培养基三角瓶（250mL三角瓶内装100mL培养基）中，于28℃、120r/min振荡培养48h。
（4）发酵培养
将步骤（1）的发酵培养基置于发酵罐中，在121℃条件下灭菌20min，灭菌完成后待冷却至室温时接入4%预先活化好的种子菌液。此时控制发酵罐转速为120r/min，通气量为1:1-1:1.2，温度为28℃，培养72h，培养过程中自动添加0.05%有机硅油消泡剂。将发酵液用草炭吸附成可湿性粉剂菌剂。通过显微观察，平板计数检测菌剂中的有效活菌数为5*109cfu/g；测定pH值为7.1。
实施例3
含有微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14活性成分菌剂的制备：
（1）培养基的配制
保藏培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，水1L，pH7.4-7.6；
种子培养基：蔗糖30g，蛋白胨5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，K2HPO41g，水1L；
发酵培养基：玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaCl2g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO31g，水1L。
将上述培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。
（2）菌种活化
将微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14转接种子斜面培养基，置于恒温培养箱中，25℃培养18h。
（3）种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤（1）中制得的种子培养基三角瓶（250mL三角瓶内装100mL培养基）中，于25℃、130r/min振荡培养48h。
（4）发酵培养
将步骤（1）的发酵培养基置于发酵罐中，在121℃条件下灭菌20min，灭菌完成后待冷却至室温时接入6%预先活化好的种子菌液。此时控制发酵罐转速为130r/min，通气量为1:1-1:1.2，温度为25℃，培养96h，培养过程中自动添加0.05%有机硅油消泡剂。将发酵液用草炭吸附成可湿性粉剂菌剂。通过显微观察，平板计数检测菌剂中的有效活菌数为5*109cfu/g；测定pH值为7.1。
实施例4
含有微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14活性成分菌剂的制备：
（1）培养基的配制
保藏培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，水1L，pH7.4-7.6；
种子培养基：蔗糖30g，蛋白胨5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，K2HPO41g，水1L；
发酵培养基：玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaCl 2g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO31g，水1L。
将上述培养基于121℃高压蒸汽灭菌20min，待用。
（2）菌种活化
将微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14转接种子斜面培养基，置于恒温培养箱中，33℃培养12h。
（3）种子培养
选择生长良好的活化斜面菌种接种于装有步骤（1）中制得的种子培养基三角瓶（250mL三角瓶内装100mL培养基）中，于33℃、110r/min振荡培养36h。
（4）发酵培养
将步骤（1）的发酵培养基置于发酵罐中，在121℃条件下灭菌20min，灭菌完成后待冷却至室温时接入8%预先活化好的种子菌液。此时控制发酵罐转速为110r/min，通气量为1:1-1:1.2，温度为33℃，培养48h，培养过程中自动添加0.05%有机硅油消泡剂。将发酵液用草炭吸附成可湿性粉剂菌剂。通过显微观察，平板计数检测菌剂中的有效活菌数为5*109cfu/g；测定pH值为7.1。
实施例5
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14菌剂对病原真菌的抑菌活性的检测：
采用平板对峙生长法，微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14菌剂用无菌水充分溶解后，使菌体浓度达到108-109CFU/mL，在平板直径两端距离平板边缘1.0-1.5cm处点接于PDA培养基上。供试真菌在PDA平板活化培养形成菌落，用打孔器（5mm）制取菌饼，将菌丝面朝下接菌于PDA平板中央。将接种好的平板置于28℃生化培养箱中培养至微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14与病原菌间形成明显的抑菌带。拮抗作用强弱以“+”，表示。“+++”：拮抗活性很强，抑菌带宽度大于8.0mm；“++”：拮抗活性中等强度，抑菌带宽度在3.0mm和8.0mm之间；“+”：拮抗活性弱或无活性，抑菌带宽度小于3.0mm或者无抑菌带，病菌正常生长，而且可覆盖微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14。
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14菌剂对供试病原真菌的抑制作用结果如表1所示。
表1微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14菌剂对供试病原真菌的抑制作用
从表1可以看出，微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14菌 剂对辣椒枯萎、黄瓜炭疽、黄瓜灰霉、小麦赤霉、小麦根腐、油菜菌核、大豆根腐病原菌的抑制效果很强，为“+++”；对白香瓜瓜腐、番茄灰霉、番茄早疫、棉花黄萎、水稻恶苗、水稻纹枯、番茄青枯、烟草黑胫、水稻稻瘟、黄瓜褐斑、黄瓜霜霉病原菌的抑制效果较强，为“++”。
实施例6
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对黄瓜霜霉病的室内生物活性的测定：
（1）供试药剂
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14可湿性粉剂（制备方法见实施例2），枯草芽孢杆菌（武汉天惠生物工程有限公司，2*1010cfu/g可湿性粉剂）。
（2）试验设计
试验共设5个处理，其中微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14可湿性粉剂设置3个浓度，分别为500倍、800倍、1000倍，对照药剂稀释1000倍，清水对照，每个处理3次重复。
（3）试验方法
选择生长整齐一致的盆栽黄瓜幼苗（1叶1心期），按上面所设浓度在作物喷雾机上进行喷雾处理，盆栽幼苗经药剂处理后自然晾干。24h后接种黄瓜霜霉病菌孢子悬浮液置于人工气候室24h（温度：23℃，湿度：90%）后移至温室中正常管理。温室条件：温度22-30℃，湿度40-60%。
（4）调查及计算方法
在温室中培养7d调查防治效果，分级标准执行中华人民共和国国家标准《农药田间药效试验准则（一）》，以病情指数计算防治效果。
药效计算方法：
（5）试验结果
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对黄瓜霜霉病的室内生物活性的测定结果如表2所示。
从表2可以看出，本发明的微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14可湿性粉剂对黄瓜霜霉病具有较好的防治效果，同商品化枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防治效果相当，无明显差异。
表2微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对黄瓜霜霉病的温室防治效果
实施例7
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对大豆锈病的室内生物活性的测定：
（1）供试药剂
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14可湿性粉剂（制备方法见实施例2），枯草芽孢杆菌（武汉天惠生物工程有限公司，2*1010cfu/g可湿性粉剂）。
（2）试验设计
试验共设5个处理，其中微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14可湿性粉剂设置3个浓度，分别为500倍、800倍、1000倍，对照药剂稀释1000倍，清水对照，每个处理3次重复。
（3）试验方法
选择生长整齐一致的盆栽大豆幼苗（2叶期），按上面所设浓度在作物喷雾机上进行喷雾处理，另喷施清水作对照，盆栽幼苗经药剂处理后自然晾干。24h后接种大豆锈病病菌孢子悬浮液置于人工气候室24h（温度：23℃，湿度：90%）后移至温室中正常管理。温室条件：温度22-30℃，湿度40-60%。
（4）调查及计算方法
在温室中培养10d调查防治效果，分级标准执行中华人民共和国国家标准《农药田间药效试验准则（一）》，以病情指数计算防治效果。
药效计算方法：
（5）试验结果
微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对大豆锈病的室内生 物活性的测定结果如表3所示。
从表3可以看出，本发明的微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14可湿性粉剂对大豆锈病具有较好的防治效果，同商品化枯草芽孢杆菌可湿性粉剂的防治效果相当，无明显差异。
表3微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14对黄瓜霜霉病的温室防治效果
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种微生物菌剂，其特征在于，由微黄白链霉菌SY-FX-14得到；所述的微黄白链霉菌（Streptomyces albidoflavus）SY-FX-14，保藏日期为2013年12月25日，保藏编号为CGMCC No.8613。
2.根据权利要求1所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的微黄白链霉菌SY-FX-14采用以下方法进行培养：将微黄白链霉菌置于保藏培养基中，于25-33℃活化12-24h后置于种子培养基中，于25-33℃、100-150r/min培养1-2天，得到种子液；将所述种子液以体积比4-8%接种于发酵培养基中，于25-33℃、100-150r/min振荡培养2-4天，得到微黄白链霉菌SY-FX-14。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的保藏培养基的成分如下：可溶性淀粉20g，KNO31g，NaCl0.5g，K2HPO4·3H2O0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，水1L，pH7.4-7.6。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的种子培养基的成分如下：蔗糖30g，蛋白胨5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，KCl0.5g，K2HPO41g，水1L。
5.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述的发酵培养基的成分如下：玉米粉20g，蔗糖10g，蛋白胨2g，淀粉5g，酵母膏2g，NaCl2g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，CaCO31g，水1L。
6.权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述的微生物菌剂通过如下方法制备得到：将微黄白链霉菌置于保藏培养基中，于25-33℃活化12-24h后置于种子培养基中，于25-33℃、100-150r/min培养1-2天，得到种子液；将所述种子液以体积比4-8%接种于发酵培养基中，于25-33℃、100-150r/min振荡培养2-4天，得到微黄白链霉菌SY-FX-14；将得到的微黄白链霉菌SY-FX-14与基质混合，得到微生物菌剂。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述的基质为草炭土、膨润土或微粉碳酸钙。
8.权利要求1所述的微生物菌剂应用于防治植物病害。
9.权利要求1所述的微生物菌剂的有效活菌数为5*109cfu/g，pH值为6.0-8.0。
10.根据权利要求8所述的微生物菌剂的应用，其特征在于，所述的植物病害为白香瓜瓜腐、辣椒枯萎、番茄早疫、黄瓜炭疽、棉花黄萎、黄瓜灰霉、水稻恶苗、番茄青枯、水稻纹枯、烟草黑胫、小麦根腐、水稻稻瘟、小麦赤霉、油菜菌核、大豆根腐、番茄灰霉、黄瓜褐斑和黄瓜霜霉中的至少一种。
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