CN111454869B - 一株海洋链霉菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株海洋链霉菌及其应用。该海洋链霉菌于2020年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所述海洋链霉菌可作为抗菌剂；利用该菌株发酵还可进一步获得化学式为C19H16O6、结构式如式一的新化合物Kiamycin E，该方法具有高效环保的特点。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体的说是一株海洋链霉菌及其作为抗菌剂的应用。
背景技术
霜霉病俗称白霉病、霜霉病等，是作物上的一种常见病害，可发生于黄瓜、玉米、白菜、葡萄等多种作物上。此病害在作物的生长过程中有很大的危害，会对农业生产造成不可挽回的巨大损失。在连阴雨天气，空气湿度大，或结露持续时间长时易流行。平均最低气温较高的年份发病重。早播、脱肥或病毒病重等条件下发病重。
霜霉病主要危害叶片，发病初期叶正面出现灰白色、淡黄色或黄绿色周缘不明显的病斑，后扩大为黄褐色病斑，病斑因受叶脉限制而呈多角形或不规则形，叶背密生白色霜状霉。病斑多时相互连接，使病叶局部或整叶枯死。病株往往由外向内层层干枯，严重时仅剩小小的心叶球。
发明内容
本发明目的在于提供一株海洋链霉菌及其作为抗菌剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一株海洋链霉菌KCB-132，分类命名为Streptomyces pratensis ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19782，保藏时间为2020年5月7日，保藏单位地址：中国北京。
一种海洋链霉菌的应用，所述海洋链霉菌在作为抗菌剂中的应用。
所述海洋链霉菌在作为抗真菌菌剂中的应用。
所述抗菌剂为该菌株的发酵液、菌悬液、浓缩物、分离液中的一种或几种。
所述发酵物为将海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养直至长出白色的孢子，取孢子体接种到液体培养基，28℃，150-220rpm/min，摇床培养8-12 d 收获发酵物；
所述浓缩物为将上述所得发酵液经大孔吸附树脂洗脱，而后减压浓缩得总浸膏；总浸膏经硅胶柱层析，以体积比为0:100-100:0的甲醇/二氯甲烷为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液体积比2:98的甲醇/二氯甲烷的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS反相柱层析，收集含50%有机醇的洗脱液的洗脱部分，浓缩。
一种海洋链霉菌的应用，所述菌株在制备Kiamycin E化合物中的应用。
一种Kiamycin E化合物，化合物的化学式为C19H16O6，其结构式为
将活化后的海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132于ISP2培养基中发酵培养，纯化后即得Kiamycin E。
化合物得Kiamycin E的制备方法：
1）将海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养直至长出白色的孢子，取孢子体接种到液体培养基，28℃，150-220 rpm/min，摇床培养8-12 d 收获发酵物。将发酵液经大孔吸附树脂洗脱，而后减压浓缩得总浸膏；
2）总浸膏经硅胶柱层析，以体积比为0:100-100:0的甲醇/二氯甲烷为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液体积比2:98的甲醇/二氯甲烷的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS反相柱层析，收集含50%有机醇的洗脱液的洗脱部分，浓缩，进行HPLC制备得到化合物Kiamycin E。
所述步骤1）中萃取是采用的有机溶剂为乙酸乙酯和/或正丁醇；
所述大孔吸附树脂洗脱采用的洗脱液为有机醇。
所述步骤1）中萃取是采用的有机溶剂为乙酸乙酯和/或正丁醇，优选为乙酸乙酯；
所述大孔吸附树脂洗脱采用的洗脱液为有机醇；其中，有机醇为甲醇、乙醇中的一种，优选为乙醇。
所述ODS反相柱层析的洗脱液为有机醇和水；其中，有机醇和水的体积比为0:100-100:0，所述有机剂为甲醇、乙醇或乙腈，优选为甲醇。
所述培养基为ISP2固体或液体培养基。
所述大孔吸附树脂柱，为弱极性或非极性的大孔吸附树脂，优选弱极性。
一种化合物的应用，所述化合物在作为抗菌剂中的应用。
所述化合物在作为抗植物或环境中的真菌剂的应用。
所述化合物在作为抗霜霉病菌的抗菌剂中的应用。
本发明所具有的优点：
1.本发明制备所得的Kiamycin E类化合物来源于海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132的发酵产物，采用微生物发酵的方法制备该化合物具有高效环保的特点；
2.本发明制备所得的Kiamycin E类化合物具有显著抗霜霉病菌活性，且该化合物为尚未被报道的新化合物，对霜霉病菌的MIC值为5.1 μg/mL，可进一步探索其作用机制，以期开发为新型抗植物病害真菌剂或其先导化合物。
附图说明
图1为本发明实施例提供的Kiamycin E 正离子质谱图(HR-ESI-MS)。
图2为本发明实施例提供的Kiamycin E 1H NMR谱(溶剂：DMSO-d 6 )。
图3为本发明实施例提供的Kiamycin E 13C NMR谱(溶剂：DMSO-d 6 )。
图4为本发明实施例提供的Kiamycin E DEPT-135谱（溶剂：DMSO-d 6 ）。
图5为本发明实施例提供的Kiamycin E 1H-1H COSY谱(溶剂：DMSO-d 6 )。
图6为本发明实施例提供的Kiamycin E HMBC谱(溶剂：DMSO-d 6 )。
图7为本发明实施例提供的Kiamycin E NOESY谱(溶剂：DMSO-d 6 )。
图8为本发明实施例提供的Kiamycin E HSQC谱(溶剂：DMSO-d 6 )。
图9为本发明实施例提供的Kiamycin E X单晶衍射图。
具体实施方式
下面的实施例用以解释本发明，但是并非对本发明实质内容的限制。
实施例1. 海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132的获取。
分离培养基为高氏一号培养基，加入50mg/L放线菌酮、50mg/L制霉菌素和20 mg/L萘啶酮酸作为抑制剂，灭菌条件为121℃、20 min。采用稀释涂布法对海洋沉积物样品中的放线菌进行分离，分离平板于28℃培养21天，经纯化得到链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132。
形态生长特征：
将菌株Streptomyces pratensis KCB-132接种于固体ISP2培养基上，培养7天。菌体可产生丰富的白色气生菌丝，基内菌丝成淡黄色。菌落干燥，周别不规则。
将菌株接种在ISP2培养基上，分别在4℃、10℃、15℃、20℃、28℃、32℃、37℃、42℃、45℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2 次；
再将菌株接种在含有不同浓度NaCl（不同浓度的NaCl依次为0%，3%，5%，8%，10%，15%）的ISP2培养基内，37℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2 次；
另，再将菌株接种在含有不同缓冲液（不同缓冲液为：pH Buffer：pH 5.0-5.5：0.1M 柠檬酸-0.1M 柠檬酸钠；pH 6.0-8.0：10mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸-0.5 M NaOH；pH8.5-11.5：0.5M NaHCO3-0.5M Na2CO3）的ISP2培养基中，并以空白培养基作阴性对照，37℃培养，每周观察一次，四周结束，重复2次。
结果表明：菌株生长温度范围为10-37℃，最适生长温度为28℃，pH生长范围为6.0-11.0，最适pH为7.5，盐浓度（NaCl）生长范围为0-5%。
实施例2 Kiamycin E的制备
1）发酵培养
将上述获得海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养3-4 d，直至长出白色的孢子，将孢子体10%的接种量接种到ISP2液体培养基中，28℃，150-220 rpm/min，摇床培养8-12 d 收获发酵物。过滤发酵物获得发酵液和菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂柱（12nm，50μm），100%乙醇洗脱，用旋转蒸发仪减压浓缩（真空度100mbar，转速100rpm）得总浸膏。
所述ISP2液体培养基为葡萄糖0.4%，酵母粉0.4%，麦芽浸粉1%。固体培养基在此基础上添加2%的琼脂。
2）粗提物分离纯化
总浸膏经正相硅胶（200-300目，54-75μm）柱层析，以二氯甲烷：甲醇进行梯度洗脱，流速5ml/min，以体积比为100:0至0：100（二氯甲烷：甲醇（v/v））。收集洗脱液体积比98:2（二氯甲烷：甲醇）的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS（C-18，50μm）反相柱层析，以水：甲醇（v/v）体积比100:0至0:100进行梯度洗脱，流速2ml/min，收集50：50（水：甲醇）洗脱部分，浓缩，进行HPLC制备，以甲醇：水作为流动相，洗脱速率为1ml/min，收集保留时间tR为20.5-22.7min的组分，得到化合物Kiamycin E。
实施例3. Kiamycin E的结构确证
1. 仪器与材料
Jasco P-1020 数字式旋光仪，Agilent TOF/6500高分辨率质谱，岛津UV-2401型可见-紫外分光光度计，核磁为Bruke Avance III 500 NMR spectrometer，为按上述实施例1步骤制备。
2. 化合物结构鉴定
Kiamycin E：白色粉末，易溶于二甲亚砜、甲醇，丙酮、氯仿，微溶于水，[α]25D+38.7 (MeOH, c 0.2); UV (Acetonitrile) λmax (log ε) 203 (3.6), 262 (2.8), 336(2.5) nm; HRESIMS [M + H]+, m/z325.10740 (calcd for C19H17O5, 325.10760).
Kiamycin E的核磁数据见表一，图1是Kiamycin E正离子质谱图(HR-ESI-MS)。图2是Kiamycin E 1H NMR谱图(溶剂：DMSO-d 6 )。图3是Kiamycin E 13C NMR谱(溶剂：DMSO-d 6 )。图4是 Kiamycin E DEPT-135谱（溶剂：DMSO-d 6 ）。图5是 Kiamycin E 1H-1H COSY谱(溶剂：DMSO-d 6 )。图6是Kiamycin E HMBC谱(溶剂：DMSO-d 6 )。图7是Kiamycin E NOESY谱(溶剂：DMSO-d 6 )。图8是Kiamycin E HSQC谱(溶剂：DMSO-d 6 )。图9是Kiamycin E X单晶衍射图。
表1：Kiamycin E的核磁数据（1H NMR 500 MHz，13C NMR 125 MHz）。
据此确定该化合物结构。
实施例4. Streptomyces pratensis KCB-132发酵液抗菌活性初步测评
将上述生长良好的链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132接种于含有100mLISP2培养基的500 mL三角瓶中，180 rpm旋转摇床，28℃培养7 d；将上述获得发酵液在4500rpm离心20min，将菌丝体与发酵液分开，以1:1体积比将发酵液经乙酸乙酯萃取，合并后蒸干；将蒸干后的粗提物用甲醇溶解在5mL的螺口瓶中，低温保存备用。
霜霉病菌在YPD斜面培养基（酵母膏1%，蛋白胨2%）上37℃生长3-5天，直到至菌丝覆盖整个斜面。从上述各真菌的斜面上刮取尽量多的菌体，使用磨菌器将菌丝分别磨碎，而后于5ml无菌水中得到不同待检定菌的菌悬液。将菌悬液分别以1%的量加入融化并冷却至40 ℃左右的BHI培养基中，摇匀后迅速倒入已经含有相应固体培养基作为底层的9cm培养皿中。
吸取甲醇溶解的粗提物60μL，分2次加到直径为5mm的圆形无菌滤纸片上，待甲醇挥干后，贴于含有指示菌的检定平板上，同时以甲醇为阴性对照，以双抗（1000 unit/mL青霉素和1000 mg/mL链霉素）作为阳性对照，细菌于37℃培养12h、真菌37℃培养48h，观察并记录抑菌圈的大小。
结果表明，链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132对霜霉病菌有较好的抑菌活性，抑菌圈达到了21mm，表明该菌在生物农药、微生物制剂及其他抗菌相关领域具有较好的开发应用前景。
实施例5. Kiamycin E抗菌活性初步测评
1、将待测化合物（上述实施例制备获得化合物）和阳性对照分别用甲醇配制成浓为1.28 mg/mL的样品。
2、根据OD值测定数值，将霜霉病菌株用无菌水稀释成2×105。
3、铺板（10×5）：培养基为空白对照，甲醇为阴性对照，制霉菌素为阳性对照，第一行加入50 μL培养基，最后一行加入10 μL甲醇和90 μL培养基的混合液，弃去50 μL，左边第一列加入90 μL培养基，其它加50 μL培养基。
所述培养基为YPD培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%。
4、加药：第一列加入10 μL药物（除该列的第一个孔和最后一个孔），用排枪混匀，从第一列中吸取50 μL加入到第二列，重复至到从第五列孔中吸取50 μL弃去。用排枪吸取50 μL稀释后的菌液加入到孔中，培养16-20 h，观察结果。
5、结论：
Kiamycin E对霜霉病菌有较好抑制活性，其MIC为5.1μg/mL。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株海洋链霉菌KCB-132，其分类命名为Streptomyces pratensis ，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19782，保藏时间为2020年5月7日，保藏单位地址为中国北京。
2.一种权利要求1所述的海洋链霉菌KCB-132在作为抗菌剂中的应用。
3.按权利要求2所述的海洋链霉菌的应用，其特征在于：所述抗菌剂为该菌株的发酵液、菌悬液、浓缩物、分离液中的一种或几种。
4.按权利要求3所述的海洋链霉菌的应用，其特征在于：所述发酵液为将海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养直至长出白色的孢子，取孢子体接种到液体培养基，28℃，150-220 rpm/min，摇床培养8-12 d 收获发酵液；
所述浓缩物为将上述所得发酵液经大孔吸附树脂洗脱，而后减压浓缩得总浸膏；总浸膏经硅胶柱层析，以体积比为0:100-100:0的甲醇/二氯甲烷为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱液体积比2:98的甲醇/二氯甲烷的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS反相柱层析，收集含50%有机醇的洗脱液的洗脱部分，浓缩。
5.一种权利要求1所述的海洋链霉菌KCB-132在制备Kiamycin E化合物中的应用，该化合物具有抗菌剂的应用；
Kiamycin E化合物的化学式为C19H16O6，其结构式为
6.权利要求5所述的应用，其特征在于：
1）将权利要求1所述的海洋链霉菌Streptomyces pratensis KCB-132划线接种于ISP2固体培养基上，28℃培养直至长出白色的孢子，取孢子体接种到液体培养基，28℃，150-220rpm/min，摇床培养8-12 d 收获发酵物，过滤发酵物获得发酵液和菌丝体，发酵液经大孔吸附树脂柱12nm，50μm，100%乙醇洗脱，用旋转蒸发仪减压浓缩，真空度100mbar，转速100rpm，得总浸膏；
2）总浸膏经正相硅胶 200-300目，54-75μm柱层析，以体积比为0:100-100:0的甲醇/二氯甲烷为洗脱液进行梯度洗脱，流速5ml/min，收集洗脱液体积比2:98的甲醇/二氯甲烷的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行ODS C-18，50μm 反相柱层析，以体积比100:0至0:100的水/甲醇为洗脱液进行梯度洗脱，流速2ml/min，收集含50%有机醇的洗脱液，浓缩，进行HPLC制备，以甲醇/水作为流动相，洗脱速率为1ml/min，收集保留时间tR为20.5-22.7min的洗脱部分，得到化合物Kiamycin E。
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A marine Streptomyces and its application Effective date of registration: 20211214 Granted publication date: 20201009 Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: BINZHOU MEDICAL University Registration number: Y2021980014859 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Granted publication date: 20201009 Pledgee: Yantai financing guarantee Group Co.,Ltd. Pledgor: BINZHOU MEDICAL University Registration number: Y2021980014859 |