CN117343860B - 一种链霉菌sn0246及其制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种链霉菌SN0246及其制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法。本发明提供了一种链霉菌SN0246，并从本发明所述链霉菌SN0246的发酵液中提取到的聚酮类化合物卡纳四环酮。本发明制备的卡纳四环酮对水稻稻瘟病病原菌灰梨孢(Pyricularia oryzae)具有显著的抑制作用，EC50为14.8μg/mL卡纳四环酮对水稻稻瘟病具有防治作用。本发明制备卡纳四环酮可作为一种新型农药先导化合物，开发具有新型抗菌作用机理的农用抗生素，可有效降低传统化学农药对水稻稻瘟病防治所引发的抗药性问题，且减少生态环境污染引发的生态环境问题。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种链霉菌SN0246及其制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法。
背景技术
水稻(Oryza sativa L.)是全球重要粮食作物。稻瘟病严重影响了水稻的产量，严重时可导致水稻减产60-65％。
目前稻瘟病的防治手段主要是选用抗病品种和喷洒化学农药。长期频繁、单一使用化学农药，导致病原菌抗药性增加，有效药剂减少，给稻瘟病的防治带来很大困难。
聚酮类化合物具有抗菌性能，但是传统聚酮类化合物是采用化学合成技术制备而成。
天然产物是农药先导化合物的重要来源，具有活性作用范围广、结构多样性高的特点。微生物则是获取天然产物的一种重要资源，在天然产物开发过程中具有很大的优势。发现结构新颖且具有高生物活性的次生代谢产物，已成为环境友好型新农药研发的一个主要方向。
发明内容
基于此，本发明提供了一种链霉菌SN0246及其制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法。
本发明是从土壤中分离纯化的链霉菌Streptomyces canarius SN0246，然在链霉菌SN0246的发酵液中提取到新型的聚酮类化合物卡纳四环酮，其可作为一种新型农药先导化合物，开发具有新型抗菌作用机理的农用抗生素，并可以利用对微生物发酵实现短时间大量制备，制备周期短、成本低、对环境影响小，同时明确卡纳四环酮对灰梨孢(Pyricularia oryzae)的抑制作用以及对稻瘟病的防治作用。
本发明链霉菌SN0246菌种保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20360，保藏日期为2020年07月14日；分类命名为Streptomyces canarius。
本发明还提供了一种制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法，包括以下步骤：
(1)菌株培养：将所述链霉菌SN0246接种至固体培养基中，在28℃环境中培养7d，加入无菌水制成孢子悬浮液；所述孢子悬浮液的浓度为1～6×105个/mL；
(2)一级种子培养：将所述孢子悬浮液采用ISP2液体培养基进行培养，所述孢子悬浮液与ISP2液体培养基的添加体积比为1:10～1:100，180r/min，28℃振荡培养2d，获得一级种子液；
(3)二级种子培养：将所述一级种子液采用ISP2液体培养基进行二级培养，所述一级种子液和ISP2液体培养基的添加体积比为1:1～1:20，180r/min，28℃振荡培养2d，获得二级种子液；
(4)发酵培养：将所述二级种子液接种至加有Amberlite XAD 16大孔吸附树脂的液体培养基中，在28℃、180rpm条件下培养发酵7d；所述二级种子液与液体培养基添加体积比为1:1～1:20；所述大孔吸附树脂体积为发酵液的2％-10％；
(5)取出步骤(4)处理后液体培养基中的大孔吸附树脂，水洗并烘干后使用甲醇浸泡树脂4次，每次浸泡3h，收集浸提液，浓缩得到甲醇浸膏Fr.1；
(6)用水、甲醇和二氯甲烷混合液对所述甲醇浸膏Fr.1萃取4次，收集二氯甲烷萃取液并浓缩得到二氯甲烷浸膏Fr.2；
(7)将所述浸膏Fr.2进行硅胶柱层析，经梯度洗脱后收集洗脱液，浓缩后得到组分Fr.3；所述梯度洗脱所采用的洗脱剂依次为4倍柱体积的二氯甲烷、体积比为100:2的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:4的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:8的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:16的二氯甲烷和甲醇、体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇；
(8)对所述组分Fr.3进行硅胶柱层析，经梯度洗脱后收集洗脱液，浓缩后得到组分Fr.4；
所述梯度洗脱所采用的洗脱剂依次为3～7倍柱体积的二氯甲烷、体积比为100:0.3的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:0.5的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:2的二氯甲烷和甲醇；
(9)对所述组分Fr.4进行硅胶柱层析，用正己烷:丙酮＝9:1溶剂进行等梯度洗脱，纯化得到聚酮类化合物卡纳四环酮。
优选的，步骤(1)中所述固体培养基为：NaCl 0.5g，KNO3 1g，可溶性淀粉20g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.4。
优选的，步骤(2)中所述ISP2液体培养基为：麦芽浸膏粉10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，蒸馏水1L，pH 7.3，121℃，30min灭菌。
优选的，步骤(4)所述液体培养基为：NaCl 0.5g，KNO3 1g，可溶性淀粉20g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.4。
优选的，步骤(5)水、甲醇和二氯甲烷的体积比为2:1:1。
优选的，所述聚酮类化合物卡纳四环酮的结构式如下：
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种链霉菌SN0246并从链霉菌SN0246的发酵液中提取到的聚酮类化合物卡纳四环酮。本发明制备的聚酮类化合物卡纳四环酮可作为一种新型农药先导化合物，开发具有新型抗菌作用机理的农用抗生素。本发明微生物发酵时间段，缩短了聚酮类化合物卡纳四环酮制备周期，还具有成本低以及对环境友好等特点。本发明制备的聚酮类化合物卡纳四环酮对灰梨孢(Pyricularia oryzae)具有显著的抑制作用，能够对稻瘟病进行防治使用。
附图说明
图1为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的1H-NMR谱图；
图2为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的13C-NMR谱图；
图3为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的HSQC谱图；
图4为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的HMBC谱图；
图5为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的1H-1H COSY谱图；
图6为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的NOESY谱图；
图7为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的HRESIMS谱图；
图8为本发明实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮的单晶衍射得到的椭球图(ORTEP)；
图9为药剂处理灰梨孢后的扫描电镜图，其中图a、b为灰梨孢的菌丝；图c、d为灰梨孢的分生孢子：图a、c为对照组；图b、d为实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮处理组；
图10为药剂处理灰梨孢菌丝后透射电镜图，其中图a、b为对照组；图c、d为实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮处理组；
图11为药剂处理灰梨孢分生孢子后透射电镜图，其中，图a、b为对照组；图c、d为实施例1聚酮类化合物卡纳四环酮处理组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：链霉菌菌株的分离与纯化
本发明所用的链霉菌是从土壤中分离得到的雀黄链霉菌(Streptomycescanarius)，菌株编号为SN0246。现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20360，保藏日期为2020年07月14日。
将采集到的土样分别用无菌水浸泡，得到浸提液，再用无菌水对其进行10倍梯度稀释，将10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6梯度稀释液分别涂布在固体培养基上，28℃培养，观察并挑取长出的单菌落纯化培养，于10-3浓度溶液中得到目标菌株链霉菌SN0246。其中固体培养基为：NaCl 0.5g，KNO3 1g，可溶性淀粉20g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.3。
实施例2：链霉菌SN0246的液体发酵
将上述链霉菌SN0246菌株接种于固体培养基上，28℃下培养7d后，加入无菌水刮取表面孢子制成孢子悬浮液；所述孢子悬浮液的浓度为1～6×105个/mL。其中固体培养基为：NaCl 0.5g，KNO3 1g，可溶性淀粉20g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O0.01g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.3。
一级种子培养基采用ISP2液体培养基，将上述孢子悬浮液接种于含有5mL ISP2液体培养基的试管中，180r/min，28℃振荡培养2d，获得一级种子液。其中ISP2液体培养基为：麦芽浸膏粉10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，蒸馏水1L，pH 7.3，121℃，30min灭菌。
二级种子培养基采用ISP2液体培养基，将上述一级种子液接种于含有50mL ISP2液体培养基的250mL三角瓶中，180r/min，28℃振荡培养2d，获得二级种子液。
将上述二级种子液接种于含有400mL液体培养基的2L三角瓶中(含Amberlite XAD16大孔吸附树脂)，28℃、180rpm条件下培养7d。其中液体培养基为：NaCl 0.5g，KNO3 1g，可溶性淀粉20g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1L，pH 7.3。
实施例3：化合物卡纳四环酮的提取与分离
收集实施例2所得发酵液中的大孔吸附树脂，水洗、烘干后，用甲醇浸泡树脂4次，每次浸泡3h，收集甲醇相，浓缩得甲醇浸膏Fr.1；用水、甲醇、二氯甲烷体系(V二氯甲烷:V甲醇:V水＝2:1:1)对浸膏Fr.1萃取4次，收集二氯甲烷萃取液并浓缩得到二氯甲烷浸膏Fr.2；对浸膏Fr.2进行硅胶柱层析，依次使用4倍柱体积的纯二氯甲烷、二氯甲烷:甲醇＝100:2(体积比)、二氯甲烷:甲醇＝100:4(体积比)、二氯甲烷:甲醇＝100:8(体积比)、二氯甲烷:甲醇＝100:16(体积比)、二氯甲烷:甲醇＝1:1(体积比)、纯甲醇溶剂进行梯度洗脱，浓缩二氯甲烷：甲醇＝100：2部分洗脱液，得到组分Fr.3；对组分Fr.3进行硅胶柱层析，依次使用5倍柱体积的纯二氯甲烷、二氯甲烷:甲醇＝100:0.2(体积比)、二氯甲烷:甲醇＝100:0.5(体积比)、二氯甲烷:甲醇＝100:2(体积比)溶剂进行梯度洗脱，浓缩二氯甲烷：甲醇＝100：0.2部分洗脱液，得到组分Fr.4；对组分Fr.4进行硅胶柱层析，用正己烷:丙酮＝9:1(体积比)溶剂进行等梯度洗脱，纯化分离得到聚酮类化合物卡纳四环酮。
实施例4：化合物卡纳四环酮的结构鉴定
卡纳四环酮：无色透明晶体,-48.15(c 2.70,MeOH),HRESIMS m/z413.1962[M+H]+(calcd:C24H29O6,413.1964)。1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(151MHz,CDCl3)具体数据见表1。
卡纳四环酮的X-射线晶体学数据:C24H28O6,monoclinic,space group C2 withβ＝108.816(1)°,γ＝90°,/>Z＝4,Dcalc＝1.300g/cm3,R1＝0.0292(I>2σ(I)),wR2＝0.0798(I>2σ(I)),R1＝0.0294(all data),wR2＝0.0800(all data),T＝173(2)K.Crystal size,0.100×0.140×0.160mm3.The goodness of fit on F2 was 1.047.Absolute structureparameter 0.06(3).在剑桥晶体数据中心的存储编号为：CCDC 2121958。
表1.卡纳四环酮的1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)数据(ppm)
(1)卡纳四环酮的1H-NMR谱图见附图1(CDCl3，600MHz)；
(2)卡纳四环酮的13C-NMR谱图见附图2(CDCl3，150MHz)；
(3)卡纳四环酮的HSQC谱图见附图3(溶剂CDCl3)；
(4)卡纳四环酮的HMBC谱图见附图4(溶剂CDCl3)；
(5)卡纳四环酮的1H-1H COSY谱图见附图5(溶剂CDCl3)；
(6)卡纳四环酮的NOESY谱图见附图6(溶剂CDCl3)；
(7)卡纳四环酮的HRESIMS谱图见附图7；
(8)卡纳四环酮单晶衍射得到的椭球图(ORTEP)见附图8。
根据以上核磁共振图谱数据、质谱数据，确定化合物的分子式为C24H28O6及其平面结构，再根据X-射线单晶衍射检测(Cu靶)结果，确定该化合物的绝对构型。利用Scifinder数据库检索，确认该化合物为具有新颖碳骨架结构的新型聚酮类化合物，并命名为卡纳四环酮。
实施例5：化合物卡纳四环酮对灰梨孢的生物活性测定
(1)对灰梨孢菌丝生长的抑制效果
采用菌丝生长速率法，测定化合物卡纳四环酮对灰梨孢菌丝生长的抑制活性。选择合适的五个浓度梯度，测定各个浓度的菌丝生长抑制率，利用SPSS软件计算得EC50值。多菌灵和三环唑作为阳性对照。
结果表明：化合物卡纳四环酮的EC50为14.8μg/mL，多菌灵的EC50为0.5μg/mL，三环唑的EC50为44.2μg/mL。并且，随着卡纳四环酮浓度的增加，灰梨孢的菌落直径变小，菌丝变得稀疏，这表明卡纳四环酮对灰梨孢菌丝的抑制作用存在剂量效应。
(2)对灰梨孢孢子萌发的抑制效果
采用凹玻片法，测定化合物卡纳四环酮对灰梨孢孢子萌发的抑制活性。并选择合适的五个浓度梯度，通过孢子萌发抑制试验测定各个浓度的孢子萌发抑制率，利用SPSS软件计算得EC50值。多菌灵和三环唑作为阳性对照。
结果表明，当药剂浓度为100μg/mL时，化合物卡纳四环酮对灰梨孢孢子萌发的相对抑制率达93.7％，多菌灵对灰梨孢孢子萌发的相对抑制率达93.2％，三环唑对灰梨孢孢子萌发的相对抑制率45.2％。卡纳四环酮对灰梨孢孢子萌发的EC50值为4.5μg/mL，多菌灵EC50值为4.6μg/mL，三环唑EC50值为97.5μg/mL。
(3)对灰梨孢产孢能力的影响
在接种灰梨孢的培养基上，添加不同的药剂处理，并进行孢子诱导，测定各处理对灰梨孢产孢能力的影响。
结果表明：空白对照组分生孢子梗较多，且分生孢子多是丛生；经药剂处理后，分生孢子梗减少，灰梨孢产孢能力减弱。其中，三环唑处理组抑制产孢的能力最强，且分生孢子梗上多是单个生长孢子，其产孢抑制率达65.1％；化合物卡纳四环酮对灰梨孢的产孢抑制率为52.2％，分生孢子在分生孢子梗上仍表现为丛生；多菌灵处理组的产孢抑制率为64.2％。
(4)对灰梨孢菌丝和孢子的亚细胞结构的影响
利用扫描电镜和透射电镜，观察5μg/mL化合物卡纳四环酮处理后的灰梨孢菌丝及分生孢子形态和内部超微结构进行观察。
结果显示：灰梨孢菌丝细胞壁和细胞膜因大量细胞质发生渗漏而发生塌陷，导致菌丝表面发生皱缩，线粒体内嵴消失；灰梨孢分生孢子表面凹凸不平，细胞内部出现中空，细胞器不明显，菌丝体及分生孢子的形态均发生显著改变。观察结果图片见附图9-11。
实施例6：化合物卡纳四环酮对稻瘟病防治效果测定
采用活体盆栽法，测定100μg/mL卡纳四环酮在水稻植株上对稻瘟病的防治效果。观察发病情况，并利用网格法计算病斑面积，算出病情指数及防治效果。稻瘟病分级标准如下：
0级，无病
1级，仅有针尖大小褐点，受害面积占叶片面积的2％以下
3级，病斑面积占叶片面积的3％-10％。
5级，病斑面积占叶片面积的11％-20％。
7级，病斑面积占叶片面积的21％-50％。
9级，病斑面积占叶片面积的51％以上。
结果表明，在接种病原菌前喷施卡纳四环酮、多菌灵及三环唑的水稻植株病情指数远低于对照组，对稻瘟病的防治效果均达到80％以上，分别为83.87％，87.10％和90.32。卡纳四环酮、多菌灵及三环唑对水稻稻瘟病均具有良好的保护作用。在接种病原菌后喷施卡纳四环酮、多菌灵及三环唑的水稻植株病情指数低于对照组，对水稻稻瘟病的防治效果分别为54.84％，83.87％和35.49％，卡纳四环酮和三环唑对水稻稻瘟病的防治效果不及多菌灵。
另外，分别于第1d、第2d、第4d、第6d和第8d喷施药剂，在第8d施药后的24h统一接种灰梨孢孢子悬浮液，测定卡纳四环酮在水稻植株上对稻瘟病防治的持效性。接种后7d后调查发现，卡纳四环酮、多菌灵及三环唑对水稻稻瘟病的防治效果均在50％以上，其中第1d施药防治效果最低，卡纳四环酮防治效果为52.78％，多菌灵防治效果为61.11％，三环唑防治效果为69.45％。试验结果表明：卡纳四环酮对水稻植株上稻瘟病的防治具有良好的持效性。
表2新型聚酮类化合物卡纳四环酮(100μg/mL)的持效性
需要说明的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例，显然本发明不仅仅限于以上实施例，还可以有其他变形。本领域的技术人员从本发明公开内容直接导出或间接引申的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种雀黄链霉菌(Sreptomyces canarius)SN0246，其特征在于，所述雀黄链霉菌SN0246菌种保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20360，保藏日期为2020年07月14日。
2.一种制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌株培养：将权利要求1所述雀黄链霉菌SN0246接种至固体培养基中，在28℃环境中培养7d，加入无菌水制成孢子悬浮液；所述孢子悬浮液的浓度为1～6×105个/mL；
(2)一级种子培养：将所述孢子悬浮液采用ISP2液体培养基进行培养，所述孢子悬浮液与ISP2液体培养基的添加体积比为1:10～1:100，180r/min，28℃振荡培养2d，获得一级种子液；
(3)二级种子培养：将所述一级种子液采用ISP2液体培养基进行二级培养，所述一级种子液和ISP2液体培养基的添加体积比为1:1～1:20，180r/min，28℃振荡培养2d，获得二级种子液；
(4)发酵培养：将所述二级种子液接种至加有Amberlite XAD 16大孔吸附树脂的液体培养基中，在28℃、180rpm条件下培养发酵7d；所述二级种子液与液体培养基添加体积比为1:1～1:20；所述大孔吸附树脂体积为发酵液的2％-10％；
(5)取出步骤(4)处理后液体培养基中的大孔吸附树脂，水洗并烘干后使用甲醇浸泡树脂4次，每次浸泡3h，收集浸提液，浓缩得到甲醇浸膏Fr.1；
(6)用水、甲醇和二氯甲烷混合液对所述甲醇浸膏Fr.1萃取4次，收集二氯甲烷萃取液并浓缩得到二氯甲烷浸膏Fr.2；
(7)将所述浸膏Fr.2进行硅胶柱层析，经梯度洗脱后收集洗脱液，浓缩后得到组分Fr.3；所述梯度洗脱所采用的洗脱剂依次为4倍柱体积的二氯甲烷、体积比为100:2的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:4的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:8的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:16的二氯甲烷和甲醇、体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇；
(8)对所述组分Fr.3进行硅胶柱层析，经梯度洗脱后收集洗脱液，浓缩后得到组分Fr.4；
所述梯度洗脱所采用的洗脱剂依次为3～7倍柱体积的二氯甲烷、体积比为100:0.3的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:0.5的二氯甲烷和甲醇、体积比为100:2的二氯甲烷和甲醇；
(9)对所述组分Fr.4进行硅胶柱层析，用正己烷:丙酮＝9:1溶剂进行等梯度洗脱，纯化得到聚酮类化合物卡纳四环酮；
所述聚酮类化合物卡纳四环酮的结构式如下：
3.根据权利要求2所述制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法，其特征在于，步骤(1)中所述固体培养基为：NaCl 0.5g，KNO3 1g，可溶性淀粉20g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.4。
4.根据权利要求2所述制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法，其特征在于，步骤(2)中所述ISP2液体培养基为：麦芽浸膏粉10g，葡萄糖4g，酵母粉4g，蒸馏水1L，pH 7.3，121℃，30min灭菌。
5.根据权利要求2所述制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法，其特征在于，步骤(4)所述液体培养基为：NaCl 0.5g，KNO3 1g，可溶性淀粉20g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水1L，pH 7.2-7.4。
6.根据权利要求2所述制备聚酮类化合物卡纳四环酮的方法，其特征在于，步骤(5)水、甲醇和二氯甲烷的体积比为2:1:1。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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