WO2016137164A2 - 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 포함하는 임신관련 질환 치료용 조성물 - Google Patents

바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 포함하는 임신관련 질환 치료용 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the treatment of pregnancy-related diseases, and more particularly to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of preterm or breast cancer comprising extracellular vesicles derived from bacteria of the genus Bacillus as an active ingredient, and diagnosing premature birth It is about a method.
  • Extracellular vesicles or outer membrane vesicles (OMVs), derived from gram-negative bacteria, are spherical bimembrane protein lipids, often called nanovesicles, and are toxic as well as endotoxins. It also contains DNA and RNA, proteins and bacterial nucleic acids. In addition to toxic proteins and nucleic acids, gram-positive bacteria-derived extracellular vesicles contain peptidoglycan and lipoteichoic acid, the cell wall components of bacteria. Recent studies have reported that these bacterial-derived extracellular vesicles play an important role in the development of inflammatory diseases previously believed to be noninfectious.
  • Women's breast cancer is the second most common cancer among women in Korea, and breast cancer accounted for about 15% of the average annual cancer in 1999-2002, ranking second. Globally, the incidence of Westerners in the United States, Europe, and Australia is much higher than that of Asians. Women's breast cancer in Korea is much lower than Westerners, but the incidence of women living in the so-called westernized environment of large cities is high, and the epidemiological phenomenon that the incidence of breast cancer is on the rise is increasing. It can be said that it is accelerating the occurrence of cancer while the factors that cause the occurrence of breast cancer in the population continue to exist. It is known that the higher the age at menarche or the late age at menopause, the higher the risk of breast cancer because blood estrogen levels are maintained according to regular menstrual cycles.
  • breast cancer In addition, the risk of breast cancer is reduced from 10 years after delivery for women who are at first full term of delivery, and women with high fertility have a lower risk of breast cancer. On the other hand, women who have never had a chance to give birth are known to have the highest risk of breast cancer, but the exact mechanism of breast cancer prevention effects of pregnancy is unknown.
  • Primary prevention to prevent the occurrence of breast cancer itself includes the suppression of the carcinogenic environment, changes in the individual's health behaviors and habits. For example, a method of suppressing obesity to delay the age at which menarche starts, or active prophylaxis by drugs such as hormones may be considered.
  • Metagenomics also called environmental genomics, is an analysis of metagenomic data obtained from samples taken from the environment. Recently, a method based on 16s ribosomal RNA (16s rRNA) sequences has been possible to list the bacterial composition of the human microflora, and 16s ribosomal RNA is sequenced using the 454FLX titanium platform.
  • 16s rRNA 16s ribosomal RNA
  • the present inventors conducted a metagenome analysis using extracellular vesicle DNA from urine of pregnant women and pregnant women.
  • the present invention was completed by confirming that the extracellular vesicles were significantly increased.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of pregnancy-related diseases, such as premature birth or breast cancer comprising a Bacillus bacteria-derived extracellular vesicles as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of pregnancy-related diseases comprising a bacterium-derived extracellular vesicles as an active ingredient.
  • the extracellular vesicles can be isolated from culture or fermented food of bacteria of the genus Bacillus.
  • the extracellular vesicles are characterized by being secreted naturally or artificially from bacteria of the genus Bacillus.
  • the extracellular vesicles are characterized in that the average diameter of 20 ⁇ 300 nm.
  • the pregnancy-related disease may be premature birth.
  • the pregnancy-related disease may be breast cancer.
  • the present invention provides a composition for inducing normal pregnancy, comprising the extracellular vesicles derived from Bacillus bacteria as an active ingredient.
  • the extracellular vesicles can be isolated from the culture medium or fermented food of Bacillus bacteria.
  • the extracellular vesicles are characterized by being secreted naturally or artificially from bacteria of the genus Bacillus.
  • the extracellular vesicles are characterized in that the average diameter of 20 ⁇ 300 nm.
  • the present invention also provides a method for diagnosing premature birth, comprising the following steps.
  • the extracellular vesicle separation in step (A) may comprise the following steps.
  • the extracellular vesicles are characterized in that the average diameter of 20 ⁇ 300 nm.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a pregnancy-related disease, comprising administering to a subject a composition comprising a Bacillus bacteria-derived extracellular vesicles as an active ingredient.
  • the present invention provides a preventive or therapeutic use of pregnancy-related diseases of Bacillus bacteria-derived extracellular vesicles.
  • the present invention provides a diagnostic for the premature birth of Bacillus bacteria-derived extracellular vesicles.
  • the pharmaceutical composition comprising the bacterium-derived extracellular vesicles of the bacterium of the present invention as an active ingredient can induce pregnancy or prevent premature birth of a pregnant woman, can be used to prevent or treat pregnancy-related diseases such as breast cancer, and Bacillus in pregnant women. By measuring the amount of extracellular vesicles derived from the genus bacteria, it can be usefully used to diagnose the risk of premature birth.
  • FIG. 1A and 1B are Escherichia coli, a gram-negative bacterium. coli ) and Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus- derived extracellular vesicles injected into the mouse after intramuscular injection to determine whether it is excreted in the urine,
  • Figure 1a is a whole body fluorescence image
  • Figure 1b is a vesicle administration 21 hours Afterwards, the extracted mouse organ specific body fluorescent images were taken.
  • Figure 2 shows the results of various taxonomy of bacteria-derived extracellular vesicles isolated from the urine of pregnant women (left) and non-pregnant women (right) as a normal control group.
  • Figures 3a to 3d is a result of analyzing the components of the bacteria-derived extracellular vesicles isolated from the urine of the non-pregnant women (blue underlined, right) and pregnant women (red underlined. 3a), class (Fig. 3b), order (Fig. 3c), and family (Fig. 3d).
  • Figure 4 is a result showing the distribution of bacteria-derived extracellular vesicles isolated from the urine of normal delivery and preterm delivery group pregnant women.
  • Figure 5 is a summary of the distribution of bacteria-derived extracellular vesicles isolated from the urine of pregnant women of normal and preterm delivery group.
  • Figures 6a to 6d is a result of analyzing the distribution of bacteria-derived extracellular vesicles isolated from the urine of preterm delivery group (green underlined, left) and normal delivery group (purple underlined, right) pregnant women, (phylum) ), Class (FIG. 6B), order (FIG. 6C), and family (FIG. 6D) levels.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of pregnancy-related diseases comprising a Bacillus bacteria-derived extracellular vesicles as an active ingredient.
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of pregnancy-related diseases by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action that improves or advantageously changes the symptoms caused by pregnancy-related diseases by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • the Bacillus bacteria-derived extracellular vesicles of the present invention are naturally secreted or artificially secreted extracellular vesicles, isolated from the culture medium of Bacillus bacteria, or from foods fermented with Bacillus bacteria. Can be.
  • the method for separating extracellular vesicles from the bacterial culture solution or the fermented food product containing bacteria is not particularly limited as long as it contains extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles can be separated using methods such as chromatography, pre-flow electrophoresis, capillary electrophoresis, and combinations thereof. In addition, it may further include a process for washing to remove impurities, concentration of the obtained extracellular vesicles and the like.
  • the extracellular vesicles separated by the method may have an average diameter of 20 to 300 nm, preferably 50 to 200 nm, but is not limited thereto.
  • the pregnancy-related diseases of the present invention collectively refer to diseases associated with pregnancy, which occur during or after pregnancy or are suppressed as a result of pregnancy.
  • a representative example that occurs during pregnancy is premature birth, breast cancer is a disease that is suppressed by pregnancy, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a composition for inducing normal pregnancy comprising Bacillus bacteria-derived extracellular vesicles as an active ingredient.
  • the general characteristics were investigated and statistical significance was analyzed using the pregnant women who gave birth, the pregnant women who gave birth prematurely, and the non-pregnant women who were normal controls.
  • the characteristics of the study group showed a significant difference in gestational age between the normal and preterm delivery group, it was confirmed that the apgar score (apgar score) is significantly lower in the preterm group. (See Example 1).
  • the term “apgar score” is designed by an anesthesiologist Virginia Afghanistan in 1952 and refers to a scoring system designed to quickly assess the health status of a newborn baby just born. In other words, this is a score to determine the effects of anesthesia on delivery in newborns. It is generally 1 minute and 5 minutes after delivery and scores are based on five criteria: skin color, pulse, reflex and irritability, muscle tone, and breathing. Number. If a low score is obtained at 1 minute after birth, the newborn needs medical help but does not mean a long-term problem.
  • Gram-negative bacteria Escherichia coli to determine whether the bacteria-derived extracellular vesicles are excreted in the urine coli
  • extracellular vesicles isolated from Gram-positive Staphylococcus aureus were injected into mice by intramuscular injection. After 3 and 6 hours of injection, the extracellular vesicles were excreted through the urine of the mouse, and the organs were extracted and analyzed to confirm that two bacterial-derived extracellular vesicles existed in the liver and kidney (see Example 2). .
  • Example 2 based on the results of Example 2, the urine of the pregnant and non-pregnant delivery group and non-pregnant women were collected to extract DNA from the extracellular vesicles in the urine and then subjected to metagenomic analysis (See Example 3).
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes a bacterium-derived extracellular vesicles as an active ingredient and may include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers are conventionally used in the preparation, and include, but are not limited to, saline solution, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposomes, and the like. If necessary, other conventional additives such as antioxidants and buffers may be further included.
  • diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants and the like may be additionally added to formulate injectable formulations, pills, capsules, granules or tablets such as aqueous solutions, suspensions, emulsions and the like.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations may be preferably formulated according to each component using the methods disclosed in Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in formulation, but may be formulated as an injection, inhalant, or external skin preparation.
  • compositions of the present invention can be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically) according to the desired method, and the dosage is determined by the condition and weight of the patient, Depending on the extent, drug form, route of administration, and time, it may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • composition according to the invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and an effective dose level refers to the type, severity, and activity of the patient's disease. , Sensitivity to the drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of the drug, and other factors well known in the medical arts.
  • the composition according to the present invention may be administered as a separate therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the effective amount of the composition according to the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and generally 0.001 to 150 mg, preferably 0.01 to 100 mg per kg of body weight is administered daily or every other day or 1 It can be administered in 1 to 3 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of obesity, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a pregnancy-related disease comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising an extracellular vesicle derived from Bacillus bacteria as an active ingredient.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, cow, etc. Mean mammal.
  • the present invention comprises the steps of extracting 16s rDNA from extracellular vesicles isolated from the urine of pregnant women; Performing PCR using the primer pairs of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 for the 16s rDNA; And it provides a diagnostic method of premature birth comprising the step of determining the risk of premature birth when the distribution of the Bacillus bacteria-derived extracellular endoplasmic reticulum is more than two times lower than the normal pregnant women by sequencing the PCR product.
  • a method for extracting DNA from the extracellular vesicles isolated from the urine of the pregnant woman comprises the steps of boiling after cooling the urine for 10 to 30 minutes; Centrifuging the cooled product to obtain a supernatant; And filtering the supernatant sequentially into a 0.45 ⁇ m filter and a 0.22 ⁇ m filter, but are not limited thereto.
  • Weight, height and blood were collected according to standardized guidelines and body mass index was calculated by dividing weight by the square of height (kg / m2).
  • the blood is drawn from the middle palpal vein at night fasting state and placed in EDTA tube or serum tube, and then analyzed by cholesterol, white blood cell, hemoglobin, aspartate using an automatic analyzer (Model7180; Hitachi, Tokyo, Japan). Aminotransferase, alanine aminotransferase, high density lipoprotein, fasting blood glucose and creatinine were measured.
  • Urine samples were used in clean medium urine and stored in sterile urine. Pregnancy age in pregnant women was based on the first ultrasound measurement when the last menstrual cycle or the last menstrual cycle was unclear.
  • Table 1 below shows the general characteristics of non-pregnant women and pregnant women.
  • the apgar score was significantly lower in the preterm group than the normal control group (p ⁇ 0.05).
  • there was no significant difference in the age of pregnant women between the two groups (p> 0.05).
  • Escherichia a Gram-negative bacterium, to determine whether bacteria-derived extracellular vesicles are excreted in the urine coli ), and extracellular vesicles derived from Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus were injected into mice by intramuscular injection and images were taken every hour.
  • Escherichia coli and Staphylococcus aureus were first incubated at 30 ° C. on Luria-Bertani medium. The culture was then centrifuged at 5,000 g for 30 minutes, the supernatant was filtered using a 0.45 ⁇ m filter and concentrated with QuixStand TM (GE Healthcare Bio-Sciences AB). The concentrated sample was once again filtered with a 0.22 ⁇ m filter to separate the extracellular vesicles and the protein concentration of the extracellular vesicles was measured by BCA assay (Thermo Scientific). E.
  • mice were labeled with cy7 (GE Healthcare) at room temperature for 1 hour and then injected into mice at 20 ⁇ g / mouse. At defined times, mice were screened at 780-800 nm wavelength using IVIS CTc spectrum CT (SelectScience ⁇ c). Organs were extracted and measured for fluorescence using IVIS ⁇ c spectrum CT.
  • DNA was isolated from extracellular vesicles in the urine of normal, preterm, and non-pregnant women.
  • Metagenome analysis was performed on the DNA of extracellular vesicles isolated from the urine of Example 3-1.
  • each clone was subjected to a polymerase chain reaction (PCR) for DNA analysis using a 16s rDNA fusion primer for amplifying the V1-V3 region and a FastStart High Fidelity PCR System (Roche, Basel, Switzerland). It was.
  • the sequence of the 16s rDNA fusion primer is shown in Table 2 below.
  • the amplification reaction by PCR proceeded in the emulsion state (mixed oil and amplicon), and Tissue Lyser II (Qiagen) using the GS-FLX plus emPCR Kit (454 Life Sciences), the micro-reactor containing the amplification mixture and single particles (“Micro-reactors”) to make it.
  • the emulsion was divided into 96-well plates and subjected to PCR according to the manufacturer's protocol (3 min at 94 ° C, then 35 cycles at 94 ° C for 15 seconds, 45 seconds at 55 ° C, and 1 minute at 72 ° C, the last step). 8 min at 72 ° C). 20 ng of each DNA sample was used for a 50 ⁇ l PCR reaction.
  • amplicon was purified using an AMpure Bead kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), and the Picogreen method (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used. Quantification using Then, the amplicon was diluted and analyzed using GS-FLX Titanium sequencer (Roche, Basel, Switzerland). After PCR amplification, the emulsion was chemically degraded and the beads with amplified DNA library were washed through filtration. Positive beads were purified using biotinylated primer A (complementary to adapter A) and adhered to streptavidin-coated magnetic beads.
  • the DNA library beads attached to the magnetic beads were then separated from the magnetic beads by melting the double helix structure and single-stranded DNA was allowed to flow.
  • the sequencing primer was made from single stranded DNA amplified again.
  • beads containing amplified single-stranded DNA were counted using a Particle Counter (Beckman Coulter). Sequencing was performed on Genome Sequencer FLX titanium (454 Life Sciences) and each sample was loaded on each of a 70 mm-75 mm PicoTiter plate (454 Life Sciences).
  • the bacterial composition of the genus phase was plotted with heatmaps when more than two-fold significant differences were found between pregnant women and normal controls. Hierarchical clustering was performed in the genus stage when there was more than two-fold significant differences between the pregnant and normal controls or an average of more than 1%.
  • Metagenome analysis was performed by separating DNA from extracellular vesicles from the urine of the non-pregnant women, the normal control group, and the preterm delivery group, the pregnant group.
  • the samples could be divided into two groups, the first group was the urine sample group (left) of the pregnant woman, the second group was mostly the urine sample group (right) of the normal control group.
  • the right side of the figure is a taxon with more than 2 times difference between pregnant women and normal control group, with an average composition of 1% or more.
  • family (f) or order (o) names are used for classification without genus names.
  • o order (o) names are used.
  • 13 classification differences were observed in the bacterial composition.
  • the first group pregnant women
  • the second group normal control
  • the first group consisted mainly of the Bacillus (Bacillus) bacteria and their extracellular vesicles.
  • 3A-3D show bacterial-derived extracellular vesicles isolated from urine of pregnant women (red underlined) and normal controls (blue underlined) at the phylum, class, order, and family levels. The distribution analysis of is shown.
  • Example 5 Metagenome Normal through analysis Delivery and premature birth Delivery Bacterial Origin in Pregnant Urine Extracellular Analysis of distribution differences of endoplasmic reticulum
  • Example 3-1 metagenome analysis was performed on the bacterial-derived extracellular vesicle DNA isolated from urine of the normal and preterm delivery group pregnant women.
  • Figure 4 shows the distribution of bacteria-derived extracellular vesicles isolated from the urine of normal and preterm delivery group pregnant women
  • Figure 5 summarizes the distribution of the extracellular vesicles.
  • 6A to 6D also show the distribution of bacteria-derived extracellular vesicles isolated from urine of preterm delivery (green underlined, left) and normal delivery (violet underlined, right) pregnant women. Analyzes are shown at the ,, and family levels.

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Abstract

본 발명은 임신관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 바실러스 속 세균에서 유래한 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조산 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 조산을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임신을 유도하거나 임산부의 조산을 예방할 수 있고, 유방암과 같은 임신관련 질환을 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있으며, 임산부에서 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 양을 측정함으로써 조산의 위험성을 진단하는데 유용하게 이용할 수 있다.

Description

바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 포함하는 임신관련 질환 치료용 조성물
본 발명은 임신관련 질환의 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 바실러스 속 세균에서 유래한 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조산 또는 유방암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 및 조산을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다.
세균은 세포간 정보교환을 위해 나노미터 크기의 세포밖 소포체(extracellular vesicles; EVs)를 세포 밖 환경으로 분비한다. 그람음성균(gram-negative bacteria) 유래 세포밖 소포체, 또는 외막 소포체(outer membrane vesicles; OMVs)는 구형의 이중막 구조의 단백질지질로 흔히 나노소포체(nanovesicles)라고도 불리며, 내독소(lipopolysaccharide) 뿐만 아니라 독성 단백질과 세균의 핵산인 DNA와 RNA도 가지고 있다. 그람양성균(gram-positive bacteria) 유래 세포밖 소포체는 독성 단백질과 핵산 이외에도 세균의 세포벽 구성성분인 펩티도글리칸(peptidoglycan) 및 리포테이코산(lipoteichoic acid)도 함유하고 있다. 최근 연구에 의하면 이러한 세균 유래 세포밖 소포체가 이전의 비감염성이라고 믿었던 염증 질환 발생에 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다.
한편, 전 세계적으로 매년 천오백만의 신생아가 조숙아로 태어나며, 이는 전 세계 신생아의 1/10 이상을 차지하는 것으로 알려져 있다. 이러한 조산은 감염(요로감염, 질 감염), 자궁과 자궁경부의 기형, 체외수정, 산모의 영양, 유전학적 인자들이 원인으로 알려져 있다. 또한, 많은 연구자들은 자궁 내 감염이 조산의 25~40%를 설명하는 중요한 기전이라고 제시하고 있다. 임산부는 호르몬과 물리적 변화로 인한 엄청난 해부학적, 생리학적, 생화학적 변화를 겪게 된다. 예를 들어, 유산균(Lactobacillus acidophilus)이 증가한 결과로 질 분비물이 증가하고 질 pH가 감소하게 된다. 따라서 임신관련 미생물 연구를 통해, 임산부와 비임산부의 질과 양수의 사이토카인 정도, pH의 변화, 감염에의 취약성의 차이 등에 대한 정보를 얻을 수 있다.
여성 유방암은 우리나라 여성에게 두 번째로 많이 발생하는 암으로, 1999-2002년 연평균 암 발생 중 유방암이 약 15%로 2위를 차지하였다. 전 세계적으로는 미국, 유럽, 호주를 중심으로 한 서양인에서의 발생이 동양인에 비해 매우 높은 특징을 보이고 있다. 우리나라 여성 유방암은 서양인에 비해서는 훨씬 낮은 수준에 있지만 대도시의 소위 서구화된 환경 속에서 거주하고 있는 여성의 발생률이 높다는 사실과 유방암의 발생이 과거에 비해 계속 증가하는 추세에 있다는 역학적 현상은 우리나라 여성 인구집단 내에 유방암의 발생을 유발하는 요인이 지속적으로 내재하고 있으면서 암 발생을 가속화시키고 있음을 의미한다고 볼 수 있다. 초경 연령(age at menarche)이 이르거나 폐경 연령(age at menopause)이 늦으면 늦을수록 규칙적 월경주기에 따른 혈중 에스트로겐 농도가 높게 유지되기 때문에 유방암의 위험성이 높다고 알려져 있다. 또한, 첫 만삭분만 연령이 이른 여성의 경우 분만 10년 이후부터 유방암 발생위험은 감소되는 것으로 알려져 있고, 출산력이 높은 여성도 유방암 위험이 낮아진다. 반면 출산의 기회를 한 번도 가지지 못한 여성의 경우 유방암 위험이 가장 높다고 알려져 있으나, 임신의 유방암 예방효과에 대한 정확한 기전은 알려져 있지 않다. 유방암의 발생 자체를 방지하기 위한 일차 예방은 발암 환경의 억제, 개인의 건강행태 및 습관의 변화를 포함한다. 예를 들어, 비만을 억제하여 초경이 시작하는 연령을 가능한 한 늦추게 하는 방안이나 호르몬 등 약물에 의한 적극적인 예방법도 고려될 수 있다.
환경 유전체학이라고도 불리는 메타게놈학은 환경에서 채취한 샘플에서 얻은 메타게놈 자료에 대한 분석학이라고 할 수 있다. 최근 16s 리보솜 RNA(16s rRNA) 염기서열을 기반으로 한 방법으로 인간의 미생물총의 세균 구성을 목록화하는 것이 가능해졌으며, 16s 리보솜 RNA는 454FLX titanium platform을 이용하여 서열을 분석한다. 그동안 임산부에서 대변, 질 분비물, 양수에서 분석한 메타게놈에 대한 연구가 있었으나, 소변은 무균이라고 여겨져 왔기 때문에 소변에서는 임신 중 세균 메타게놈 분석 연구가 없었다.
또한, 아직까지 세균 유래 세포밖 소포체를 이용하여 임신 유도 혹은 조산 예방을 목적으로 이용하는 경우, 또한 유방암의 예방 또는 치료를 위해 이용한 경우는 전무한 실정이다.
본 발명자들은, 상기와 같은 종래의 문제점 해결을 위하여 임신하지 않은 여성과 임산부 여성의 소변으로부터 세포밖 소포체의 DNA를 이용하여 메타게놈 분석을 수행한 결과 임산부 여성 특히 정상적으로 분만한 여성에서 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체가 확연히 증가되어 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조산 또는 유방암과 같은 임신관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 조산 진단방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 임신관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로. 상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균의 배양액 또는 발효식품에서 분리될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20~300 nm인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 임신관련 질환은 조산일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 임신관련 질환은 유방암일 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 정상 임신 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균의 배양액 또는 발효식품에서 분리될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20~300 nm인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 조산의 진단방법을 제공한다.
(A) 임산부의 소변에서 분리한 세포밖 소포체로부터 16s rDNA를 추출하는 단계;
(B) 상기 16s rDNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
(C) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정상임산부에 비하여 2배 이상 낮을 경우 조산의 위험성이 높을 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 일 구현예로, 상기 (A) 단계에서 세포밖 소포체 분리는 하기의 단계를 포함할 수 있다.
(a) 소변을 10분 내지 30분 동안 끓인 후 냉각하는 단계;
(b) 상기 냉각한 산물을 원심분리하여 상층액을 얻는 단계; 및
(c) 상기 상층액을 0.45 ㎛ 필터와 0.22 ㎛ 필터에 차례로 거르는 단계.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20~300 nm인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 임신관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 임신관련 질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 조산 진단용도를 제공한다.
본 발명의 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 임신을 유도하거나 임산부의 조산을 예방할 수 있고, 유방암과 같은 임신관련 질환을 예방 또는 치료하는데 이용할 수 있으며, 임산부에서 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 양을 측정함으로써 조산의 위험성을 진단하는데 유용하게 이용할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 그람음성균인 대장균(Escherichia coli)과 그람양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) 유래 세포밖 소포체를 마우스에 근육주사로 주입한 후 소변으로 배설되는지 확인하기 위한 것으로서, 도 1a는 전신 체내 형광이미지, 도 1b는 소포체 투여 21시간 이후 적출한 마우스 장기 특이적 체내 형광 이미지를 촬영한 사진이다.
도 2는 임산부(좌측)와 정상대조군인 비임산부(우측)의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 다양한 분류군을 나타낸 결과이다.
도 3a 내지 도 3d는 정상대조군인 비임산부(파란 밑줄, 우측)와 임산부(빨간 밑줄. 좌측)의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 구성성분을 분석한 결과로서, 문(phylum)(도 3a), 강(class)(도 3b), 목(order)(도 3c), 및 과(family)(도 3d) 수준에서 분석한 결과이다.
도 4는 정상 분만군과 조산 분만군 임산부들의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖소포체 분포를 나타내는 결과이다.
도 5는 정상 분만군과 조산 분만군의 임산부들의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체 분포를 요약한 결과이다.
도 6a 내지 도 6d는 조산 분만군(녹색 밑줄, 좌측)과 정상 분만군(보라색 밑줄, 우측) 임산부들의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체 분포를 분석한 결과로서, 문(phylum)(도 6a), 강(class)(도 6b), 목(order)(도 6c), 및 과(family)(도 6d) 수준에서 분석한 결과이다.
본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 임신관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 임신관련 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 임신관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체는 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 세포밖 소포체를 포함하며, 바실러스 속 세균의 배양액에서 분리되거나, 또는 바실러스 속 세균으로 발효시킨 식품에서 분리될 수 있다. 상기 세균 배양액 또는 상기 세균 첨가 발효식품에서 세포밖 소포체를 분리하는 방법은 세포밖 소포체를 포함한다면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 배양액이나 발효식품에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 세포밖 소포체를 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 세포밖 소포체의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법에 의하여 분리된 세포밖 소포체는 평균 직경이 20~300 nm일 수 있으며, 바람직하게는 50~200 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 임신관련 질환은 임신과 관련되어 임신 중 혹은 임신 이후에 발생하거나 혹은 임신의 결과로 억제되는 질환을 총칭한다. 임신 중에 발생하는 대표적인 예로는 조산이 있고, 임신에 의해 발생이 억제되는 질환으로 유방암을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 정상 임신 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 정산분만을 한 임산부와 조산을 한 임산부, 및 정상대조군인 비임산부들을 연구 대상군으로 하여 일반적인 특징을 조사하고 통계적인 유의성을 분석하였다. 본 발명의 일 실시예에서는, 연구 대상군의 특징 조사 결과 정상 분만군과 조산 분만군에서 임신 나이가 유의한 차이를 나타내었고, 조산군에서 아프가 점수(apgar score)가 유의하게 낮음을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명에서 사용된 용어, “아프가 점수(apgar score)”란 1952년 마취과 의사 버지니아 아프가에 의해 고안된 것으로, 방금 출생한 신생아의 건강 상태를 빠르게 평가하기 위해 만든 점수 시스템을 의미한다. 즉, 분만시 마취가 신생아에게 어떤 영향이 있는지 알아보기 위한 점수로서 일반적으로 출산 1분 후와 5분 후에 이루어지며, 피부색, 맥박, 반사와 과민성, 근긴장도, 및 호흡의 5가지 기준을 가지고 점수를 매긴다. 출생 1분 후 검사시 낮은 점수를 받을 경우 신생아는 의학적 도움이 필요하지만 장기적인 문제가 생길 것을 뜻하지는 않는다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 소변으로 세균 유래 세포밖 소포체가 배설되는지 확인하기 위해 그람음성균인 대장균(Escherichia coli)과 그람 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 분리한 세포밖 소포체를 마우스에 근육주사로 주입하였다. 주입 3, 6시간 후 마우스의 소변을 통해 세포밖 소포체가 배설되는 것을 확인하였고, 장기를 적출하여 분석한 결과 두 가지 세균 유래 세포밖 소포체가 간과 신장에 존재함을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 실시예 2의 결과를 바탕으로 상기 정상 분만군 및 조산 분만군 임산부와 비임산부들의 소변을 채취하여 소변 내 세포밖 소포체로부터 DNA를 추출한 후 메타게놈 분석을 수행하였다(실시예 3 참조).
그 결과, 비임산부로 이루어진 정상대조군과 임산부의 소변에서 분리한 세포밖 소포체의 분포차이를 분석한 경우, 정상대조군에는 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균 유래 세포밖 소포체가 많이 분포하였고, 바실러스(Bacillus) 속 세균 유래 소포체는 정상대조군에 비해 임산부에 매우 높게 분포하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는. 임산부 중에서 정상 분만군과 조산 분만군의 소변에서 분리한 세포밖 소포체의 분포차이를 분석하였다. 그 결과, 조산을 한 임산부의 소변에서 메틸로박테리움(Methylobacterium), 유레아플라즈마(Ureaplasma), 및 베일로넬라(Veillonella) 균에서 유래한 세포밖 소포체가 증가되어 있는 반면, 정상 분만을 한 임산부의 소변에는 바실러스(Bacillus) 속 세균 유래 세포밖 소포체가 다량 분포하는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 임신관련 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 임산부의 소변에서 분리한 세포밖 소포체로부터 16s rDNA를 추출하는 단계; 상기 16s rDNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정상임산부에 비하여 2배 이상 낮을 경우 조산의 위험성이 높을 것으로 판정하는 단계를 포함하는 조산의 진단방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 임산부의 소변에서 분리한 세포밖 소포체로부터 DNA를 추출하는 방법은 소변을 10분 내지 30분 동안 끓인 후 냉각하는 단계; 상기 냉각한 산물을 원심분리하여 상층액을 얻는 단계; 및 상기 상층액을 0.45 ㎛ 필터와 0.22 ㎛ 필터에 차례로 거르는 단계를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 연구대상군의 일반적 특징
본 발명의 실시예에서는 2006년부터 2008년까지 단국대학교와 이화여자대학교 이화의료원에 등록된 73명의 비임산부와 74명의 임산부(정상 분만 39명, 조산 분만 35명)를 대상으로 연구를 수행하였다. 단국대학교 병원에서 건강검진을 받은 비임산부들을 정상대조군으로 설정하였고, 실험군인 74명의 임산부 중 정상 분만과 조산 분만은 37주를 기준으로 분류하였다. 병원에서 분만한 37주 미만의 조산 임산부를 모으고, 정상 분만은 병원에서 산전 검진을 받은 37주 이상의 임신기간을 거쳐 분만한 산모들을 대상으로 하였다. 임산부 등록 기준은 단생아이면서, 임신 나이가 25주 이상 42주 미만인 경우로 하였고, 등록 제외 기준은 다생아, 사산아, 선천적 기형, 만성고혈압, 전치태반, 태반조기박리인 경우로 하였다.
상기 비임산부 및 임산부들은 연구에 참여 전 동의서에 서명하였으며, 숙련된 조사자들이 참여자들의 역학적, 임상적 정보를 수집하였다. 몸무게, 키, 혈액은 표준화된 지침에 따라 수집하였고, 체질량지수는 몸무게를 키의 제곱으로 나누어서 계산하였다(kg/m2). 또한, 혈액은 야간 공복 상태에서 팔오금중간정맥에서 뽑아 EDTA 튜브나 혈청튜브(serum tube)에 담아 자동분석기(automatic analyzer, Model7180; Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 콜레스테롤, 백혈구, 혈색소, 아스파르테이트 아미노전달효소, 알라닌 아미노전달효소, 고밀도 지질단백질, 공복혈당, 크레아티닌을 측정하였다. 소변샘플은 깨끗한 중간뇨를 이용하였으며, 무균 소변통에 담아 보관하였다. 임산부에서 임신 나이 측정은 마지막 월경 주기 또는 마지막 월경 주기가 불분명한 경우, 첫 번째 초음파 측정을 기준으로 하였으며, 출산 정보는 의무기록을 분석하였다.
하기 표 1에 연구대상자인 비임산부 및 임산부들의 일반적인 특징을 나타내었다. 임산부에서 정상 분만군과 조산 분만군을 비교하면, 임신 나이에서 유의하게 차이를 보였고(39.73 vs. 33.57 weeks, p = 0.000), 신생아의 출생시 체중도 조산군에서 유의하게 낮았다(3342.13 g vs. 2179.17 g, p = 0.000). 또한 조산군에서 정상대조군보다 아프가 점수(apgar score)가 유의하게 낮음을 확인하였다(p< 0.05). 하지만 두 군 간의 임산부의 나이는 유의한 차이를 보이지 않았다(p> 0.05).
정상대조군(n=72) 임산부 p value†
정상 분만 (n=47) 조산 분만(n=36)
임산부 특징
나이(세) 32.2 (12.3) 31.96(3.99) 33.11(3.75) 0.797*
임신나이 39.73(1.88) 33.57(2.76) 0.000
미분만부 (n, %) 28(59.57) 15(41.67) 0.106**
출산 결과
출생 체중 (g) 3342.13(314.80) 2179.17(624.21) 0.000
아프가 점수, 1분 9.66(0.700) 7.67(2.12) 0.000
아프가 점수, 5분 9.98(0.15) 8.86(1.57) 0.000
자궁내 성장지연 (n, %) 0(0.00) 4(2.78) -
실시예 2. 세균 유래 세포밖 소포체 배설 확인
소변으로 세균 유래 세포밖 소포체가 배설되는지 확인하기 위해 그람음성균인 대장균(Escherichia coli), 그람 양성균인 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)에서 유래한 세포밖 소포체를 마우스에 근육주사로 주입하고 매시간 마다 영상을 촬영하였다.
상기 세균의 배양액에서 세포밖 소포체를 분리하기 위하여, 우선 대장균(Escherichia coli)과 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)을 Luria-Bertani 배지 상에 30℃에서 배양하였다. 이후, 배양액을 30분 동안 5,000 g로 원심분리하였고, 상층액은 0.45 ㎛ 필터를 이용하여 거르고, QuixStand™(GE Healthcare Bio-Sciences AB)으로 농축하였다. 농축된 샘플은 0.22 ㎛ 필터로 다시 한 번 걸러서 세포밖 소포체를 분리한 후 세포밖 소포체의 단백질 농도를 BCA assay(Thermo Scientific) 방법으로 측정하였다. 대장균과 황색포도상구균 유래 세포밖 소포체는 cy7(GE Healthcare)으로 1시간 동안 실온에서 표시한 뒤, 20 ㎍/mouse로 쥐에 근육주사로 주입하였다. 정해진 시간에 IVIS￠c spectrum CT(SelectScience￠c)를 이용하여 780-800 nm 파장에서 쥐를 스크리닝하였다. 장기들은 적출하여 IVIS￠c spectrum CT를 이용하여 형광을 측정하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 상기 두 가지 세균 유래 세포밖 소포체 모두 주입 3, 6시간 이후 소변으로 배설되었다. 또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 주입 12시간 후 장기를 적출했을 때, 대장균과 황색포도상구균 유래 두 가지 세포밖 소포체 모두 간과 신장에 존재함을 확인하였다. 결론적으로, 상기 결과들을 통해 세균 유래 세포밖 소포체가 부분적으로는 소변으로 배설된다는 것을 알 수 있다.
실시예 3. 소변 샘플내 세포밖 소포체에서 DNA 메타게놈 분석
3-1. 소변으로부터 DNA 분리
정상 분만 임산부와 조산 분만 임산부, 비임산부 여성의 소변 내에 존재하는 세포밖 소포체에서 DNA를 분리하였다.
각 정상대조군 및 실험군 여성의 소변 1㎖을 채취하여 100℃에서 15분간 끓였다. 끓인 소변 샘플을 얼음에 5분간 두었다가 10,000 g로 4℃에서 20분 동안 원심분리하였다. 상층액은 4℃에 보관하였고, 분리한 DNA는 메타게놈 분석 수행 전 nano-drop으로 분리된 DNA의 양과 질을 측정하였다.
3-2. 소변 내 소포체에서 분리한 DNA 메타게놈 분석
실시예 3-1의 소변으로부터 분리한 세포밖 소포체의 DNA로 메타게놈 분석을 실시하였다.
먼저, 각각의 클론을 V1-V3 region 증폭을 위한 16s rDNA fusion primer와 FastStart High Fidelity PCR System(Roche, Basel, Switzerland)을 이용하여 DNA분석을 위해 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하였다. 상기 16s rDNA fusion primer의 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
프라이머 서열 서열번호
27F Forward 5’-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’ 1
518R Reverse 5’-WTTACCGCGGCTGCTGG-3’ 2
* M: A 또는 C
* W: A 또는 T
PCR을 통한 증폭 반응은 에멀젼 상태(오일과 amplicon이 혼합된 상태)로 진행되었고, GS-FLX plus emPCR Kit(454 Life Sciences)을 이용한 Tissue Lyser II(Qiagen)로 증폭 혼합물과 단독 입자를 포함한 미세 반응자(“micro-reactors”)를 만들기 위해 시행하였다. 에멀젼은 96-well 플레이트에 나누어 담고 제조사에서 제안한 프로토콜대로 PCR을 수행하였다(94℃에서 3분간, 다음에 94℃에서 15초간 35 사이클, 55℃에서 45초간, 그리고 72℃에서 1분간, 마지막 단계는 72℃에서 8분간 시행). 각각 DNA 샘플 20 ng을 50 ㎕ PCR 반응에 사용하였다. 에멀젼 PCR(emulsion PCR; emPCR)을 수행하여 각 DNA를 증폭 후, amplicon은 AMpure Bead kit(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)를 이용하여 정제하고, Picogreen method(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 정량화하였다. 그 다음, amplicon을 희석하여 GS-FLX Titanium sequencer(Roche, Basel, Switzerland)를 이용하여 분석하였다. PCR 증폭 후, 에멀젼은 화학적으로 분해되고 amplified DNA library를 가진 비드(bead)는 여과를 통해 세척하였다. 양성인 비드(beads)는 biotinylated primer A(complementary to adaptor A)를 이용하여 정제하였고 streptavidin-coated magnetic beads에 붙게 하였다. 이후 magnetic beads에 붙은 DNA library beads를 이중나선 구조를 녹여서 magnetic beads에서 분리하고 단일가닥 DNA들은 흘러가게 하였다. 염기서열 primer는 다시 증폭된 단일가닥 DNA로 만들었다. 마지막으로, 증폭된 단일가닥 DNA를 갖고 있는 비드들을 Particle Counter(Beckman Coulter)를 이용하여 개수를 세었다. 염기서열 분석은 Genome Sequencer FLX titanium(454 Life Sciences)에서 하였고, 각각의 샘플들은 70 mm-75 mm PicoTiter plate(454 Life Sciences)의 각각에 로딩하였다.
생물정보학을 통한 메타게놈 분석을 위해 품질점수(평균 Phred점수 > 20)와 read length(> 300 bp)를 체크하여 고품질의 서열들을 모았다. UCLUST와 USEARCH(Edgar, 2010)를 이용하여 Operational Taxonomy Unit(OUT)을 분석하였고, 계통학적 분류는 QIIME(Lozupone, et al., 2006)을 이용하여 분석하였다. 유사성에 기초하여, 모든 16s RNA 서열들은 다음의 계통학적 단계에 따라 분류하였다: 종(species) > 97% 유사성; 속(genus) > 94% 유사성; 과(family) > 90% 유사성; 목(order) > 85% 유사성; 강(class) > 80% 유사성; 문(phylum) > 75% 유사성. 속(genus) 단계의 세균 구성은 임산부와 정상대조군 사이에 2배 이상의 유의한 구성 차이가 보일 경우 heatmap으로 그렸다. 계층적 클러스터링은 속(genus) 단계에서 임산부와 정상대조군 사이에 2배 이상의 유의한 구성 차이가 보이거나 1% 이상의 평균 구성을 보이는 경우 시행하였다.
실시예 4. 메타게놈 분석을 통한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포 차이 분석
실시예 3-2의 방법으로 정상대조군인 비임산부 및 실험군인 정상 분만군과 조산 분만군 임산부의 소변으로부터 세포밖 소포체에서 DNA를 분리하여 메타게놈 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 샘플들은 두 군으로 분류할 수 있었는데, 첫 번째 군은 임산부의 소변 샘플 군(좌측)이었고, 두 번째 군은 대부분 정상대조군의 소변 샘플군(우측)이었다. 그림 우측에는 임산부와 정상대조군에서 2배 이상의 차이를 보인 분류군이며, 1% 이상의 평균 구성을 보인 군이다. 또한, 속 이름이 없는 분류의 경우 과(family, f) 또는 목(order, o) 이름을 사용하였다. 또한 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 세균 구성에서 13개의 분류 차이가 관찰되었다. 첫 번째 군(임산부)은 2개의 클러스터를, 두 번째 군(정상대조군)은 3개의 클러스터를 만들었다. 첫 번째 군은 주로 바실러스(Bacillus) 세균과 그 세포밖 소포체로 구성되었다.
Taxon mean of control mean of pregnancy fold change p-value
Bacillus 0.1218% 45.6146% 374.3878 1.21E-36
Erythrobacteraceae(f) 0.9847% 2.8276% 2.8716 8.47E-05
Acinetobacter 2.8650% 1.1649% 0.4066 1.05E-04
Sphingomonas 1.5396% 0.6007% 0.3902 1.57E-03
Pseudomonas 14.2252% 4.0889% 0.2874 1.21E-16
Bradyrhizobiaceae(f) 1.5951% 0.4560% 0.2859 4.14E-03
Methylobacterium 7.2819% 1.5022% 0.2063 6.79E-11
Lactobacillus 8.4385% 1.6068% 0.1904 3.11E-03
Herbaspirillum 1.9899% 0.1409% 0.0708 1.77E-07
Pseudomonadaceae(f) 15.4593% 0.6549% 0.0424 9.58E-10
Atopobium 3.8597% 0.1017% 0.0264 4.39E-03
Alicyclobacillus 3.1655% 0.0325% 0.0103 7.55E-11
Alteromonadales(o) 5.4748% 0.0022% 0.0004 1.16E-08
상기 표 3의 결과를 통해 바실러스 속 세균 유래 소포체는 정상대조군(평균 구성= 0.12%)에 비해 임산부(평균 구성= 45.61%)에서 가장 흔한 세균 유래 세포밖 소포체였고, 반대로 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균 유래 세포밖 소포체는 임산부(평균 구성= 4.09%)에 비해 비임산부(평균 구성= 14.23%)에서 가장 흔한 세균 유래 세포밖 소포체임을 확인하였다.
도 3a 내지 도 3d에는 문(phylum), 강(class), 목(order), 및 과(family) 수준에서 임산부(빨간 밑줄)와 정상 대조군(파란 밑줄)의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포 분석결과를 나타내었다.
실시예 5. 메타게놈 분석을 통한 정상 분만군과 조산 분만군 임산부 소변에서의 세균 유래 세포밖 소포체의 분포 차이 분석
실시예 3-1에서 정상 분만군과 조산 분만군 임산부의 소변으로부터 분리한 세균 유래 세포밖 소포체 DNA를 실시예 3-2의 방법으로 메타게놈 분석을 수행하였다. 도 4에 정상 분만군과 조산 분만군 임산부들의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 나타내었고, 도 5에 상기 세포밖 소포체의 분포를 요약하여 나타내었다. 또한, 도 6a 내지 도 6d에 조산 분만군(녹색 밑줄, 좌측)과 정상 분만군(보라색 밑줄, 우측) 임산부들의 소변에서 분리한 세균 유래 세포밖 소포체의 분포를 문(phylum), 강(class), 목(order), 및 과(family) 수준에서 분석하여 나타내었다.
도 4 내지 도 6의 결과를 종합하여 분석한 결과, 다양한 세균 유래 세포밖 소포체가 정상 분만군과 조산 분만군 소변에 존재함을 알 수 있었다. 메틸로박테리움(Methylobacterium) 속 유래 세포밖 소포체는 비임산부와 조산을 한 임산부 소변에서 많았고 대신 바실러스(Bacillus) 속 세균 유래 세포밖 소포체가 줄어들었다. 반면, 정상 분만을 한 임산부에서는 메틸로박테리움 속 유래 세포밖 소포체가 거의 발견되지 않았다. 또한, 유레아플라즈마(Ureaplasma)와 베일로넬라(Veillonella) 유래 세포밖 소포체인 경우도 정상 분만 산모에서보다 조산 분만 산모에서 흔히 발견되었다.
상기 결과를 통해, 조산 분만을 한 임산부보다 정상 분만을 한 임산부에서 다른 세균들 유래 세포밖 소포체와 달리 바실러스 유래 세포밖 소포체가 많음을 알 수 있었다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for 16s rDNA
<400> 1
gagtttgatc mtggctcag 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for 16s rDNA
<400> 2
wttaccgcgg ctgctgg 17

Claims (16)

  1. 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 임신관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균의 배양액 또는 발효식품에서 분리되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20~300 nm인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 임신관련 질환은 조산인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 임신관련 질환은 유방암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  7. 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는, 정상 임신 유도용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균의 배양액 또는 발효식품에서 분리되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 바실러스 속 세균에서 자연적으로 또는 인공적으로 분비되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20~300 nm인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 하기의 단계를 포함하는, 조산의 진단방법:
    (A) 임산부의 소변에서 분리한 세포밖 소포체로부터 16s rDNA를 추출하는 단계;
    (B) 상기 16s rDNA에 대하여 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    (C) 상기 PCR 산물의 서열분석을 통하여 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 분포가 정상임산부에 비하여 2배 이상 낮을 경우 조산의 위험성이 높을 것으로 판정하는 단계.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 (A) 단계에서 세포밖 소포체의 분리는 하기의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 진단방법.
    (a) 소변을 10분 내지 30분 동안 끓인 후 냉각하는 단계;
    (b) 상기 냉각한 산물을 원심분리하여 상층액을 얻는 단계; 및
    (c) 상기 상층액을 0.45 ㎛ 필터와 0.22 ㎛ 필터에 차례로 거르는 단계.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 평균 직경이 20~300 nm인 것을 특징으로 하는, 진단방법.
  14. 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 임신관련 질환의 예방 또는 치료방법.
  15. 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 임신관련 질환의 예방 또는 치료용도.
  16. 바실러스 속 세균 유래 세포밖 소포체의 조산 진단용도.
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