JP2020503864A - 細菌メタゲノム分析を通した大腸腫瘍の診断方法 - Google Patents

細菌メタゲノム分析を通した大腸腫瘍の診断方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、人体由来物に存在する細菌由来小胞メタゲノム分析を通して大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍の発生および原因因子を予測する方法に関し、より具体的には、糞便、あるいは尿に存在する細菌由来小胞に存在するメタゲノム塩基配列を分析して、大腸腫瘍の原因因子および発生危険度を診断するための方法に関する。腸内には、数兆個の細菌が存在し、情報交換のために細胞外に小胞を分泌する。細菌である場合には、大腸上皮細胞に吸収されないが、細菌から分泌された小胞は、粘膜を通過して大腸上皮細胞に吸収された後、血液を介して全身的に分布した後、肝と腎臓を介して排泄される。細菌由来小胞は、炎症、癌の発生を増加あるいは減少させることができるが、本発明は、人体由来物に存在する細菌由来小胞の遺伝子メタゲノム塩基配列分析を通して大腸腫瘍の発生危険度および原因因子を診断するための方法に有用に利用することができる。また、大腸ポリープあるいは大腸癌の発病後にも早期診断することができるので、大腸癌の発病を低下させ、治療効果を高めることができる。【選択図】図７

Description

本発明は、細菌メタゲノム分析を通して大腸腫瘍を診断する方法に関し、より具体的には、被検体由来サンプルを利用して細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することによって、大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍を診断する方法に関する。
大腸癌（ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ）あるいは大腸直腸腫瘍（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）は、盲腸、結腸と直腸にできる悪性腫瘍であって、大腸の最内側の表面である粘膜で発生した癌である。２００６年の発表によれば、韓国では、胃癌に次いで２番目に多い癌であって、近年、食生活の様相が西欧化されるに伴い、その発生頻度が急に増加しており、最近１０年間大腸癌による死亡率は、約８０％程度増加して、その上昇速度がずっと高まっている傾向にある。好発年齢は、６０代に最も頻繁に発生し、部位別に見れば、直腸に発生する場合が、結腸に発生する場合より若干さらに多い。すべての年齢で大腸癌が発生し得るが、大腸癌患者の９０％以上の場合、年齢が４０才以上であり、毎１０年ごとにその発生率が２倍ずつ増加する。
すべての大腸癌は、大腸ポリープ（ｃｏｌｏｎ ｐｏｌｙｐ）あるいは大腸腺腫（ｃｏｌｏｎ ａｄｅｎｏｍａ）から始まると知られており、ポリープは、初めに大腸内壁で上皮が異常な成長をして突出することを言い、成人の１５〜２０％に現れる非常にありふれている病気である。大腸ポリープの以外にも、家族の中で大腸癌にかかったヒトがいる場合、長期間潰瘍性大腸炎に苦しめられた場合にも、大腸癌の危険が増加する。また、大腸癌は、食べ物と関連していると知られている代表的な癌であって、食生活の西欧化に伴って繊維素の摂取が少かったり、動物性脂肪の摂取が多かったり、あるいは精製された糖分（砂糖）の過多摂取などが誘発要素と知られている。
初期大腸癌の場合には、特別な症状が現れないが、症状がない場合にも、目につかない腸出血により血液が失われて、貧血が生じることがあり、時々食欲不振と体重減少が現れることがある。癌が進行された場合には、腹が痛かったり、下痢または便秘ができるなど排便習慣の変化が現れたり、肛門から血が出る直腸出血の症状が現れることがあり、血液は、明るい鮮紅色を示したり、黒い色を示すことがある。大腸癌が進行された場合には、腹で平素には触られなかった塊りが触られることがある。最も注意すべき症状としては、排便習慣の変化、血便、疼痛および貧血であり、特に４０才以上の成人においてこのような変化があるときには、徹底的に調査する必要がある。
大腸癌の確診は、大腸内視鏡検査を通した組織検査を通して癌細胞を発見する場合に可能である。大概に大腸癌は、早期には症状がないので、診断が非常に難しく、現在非侵襲的な方法で大腸癌を予測する方法はない。既存の診断方法としては、大腸癌などの固形癌が進行された場合に発見される場合が多いので、大腸癌による医療費用と死亡を予防するためには、大腸腫瘍の発生および原因因子をあらかじめ予測して、高危険群において大腸癌の発生を予防する方法を提供することが効率的な方法である。
一方、人体に共生する微生物は、１００兆に達してヒト細胞より１０倍多く、微生物の遺伝子数は、ヒトの遺伝子数の１００倍を超えると知られている。微生物叢（ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａあるいはｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）は、与えられた居住地に存在する細菌（ｂａｃｔｅｒｉａ）、古細菌（ａｒｃｈａｅａ）、真核生物（ｅｕｋａｒｙａ）を含む微生物群集（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）を言い、腸内微生物叢は、ヒトの生理現象に重要な役割をし、人体細胞と相互作用を通じてヒトの健康と病気に大きい影響を及ぼすものと知られている。人体に共生する細菌は、他の細胞への遺伝子、タンパク質などの情報を交換するためにナノメートルサイズの小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を分泌する。粘膜は、２００ナノメートル（ｎｍ）サイズ以上の粒子は通過できない物理的な防御膜を形成して、粘膜に共生する細菌である場合には粘膜を通過しないが、細菌由来小胞は、サイズが大概１００ナノメートルサイズ以下であるので、比較的自由に粘膜を通過して人体に吸収される。
環境ゲノミクスとも呼ばれるメタゲノム学は、環境で採取したサンプルから得られたメタゲノム資料に対する分析学と言える（韓国特許公開第２０１１−００７３０４９号）。最近、１６ｓリボソームＲＮＡ（１６ｓ ｒＲＮＡ）塩基配列を基盤とした方法でヒトの微生物叢の細菌構成をリスト化することが可能になり、１６ｓリボソームＲＮＡの遺伝子である１６ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を次世代塩基配列分析（ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ） ｐｌａｔｆｏｒｍを利用して分析する。しかし、大腸腫瘍の発病において、糞便のような人体由来物から細菌および細菌由来小胞を分離して、細菌由来小胞に存在するメタゲノム分析を通して大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍の原因因子を同定して、大腸腫瘍を診断する方法については報告されたことがない。
本発明者らは、大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍を診断するために、被検体由来サンプルである尿および糞便を利用して細菌由来小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、その結果、大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定したところ、これに基づいて本発明を完成した。
これより、本発明は、細菌由来細胞外小胞に存在する遺伝子に対するメタゲノム分析を通して大腸腫瘍を診断するための情報提供方法を提供することを目的とする。
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、下記の段階を含む、大腸腫瘍診断のための情報提供方法を提供する：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
そして、本発明は、下記の段階を含む、大腸腫瘍の診断方法を提供する：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
また、本発明は、下記の段階を含む、大腸腫瘍の発病危険度の予測方法を提供する：
（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）で前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸癌を診断することができる。
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）でＤｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、４Ｃ０ｄ−２、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉｏｐｈｙｃｉｄｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
ＲＦ３２、ＹＳ２、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、ｉｉｉ１−１５、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
ｒｃ４−４、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、ＳＭＢ５３、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｄｏｒｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、およびＢｉｌｏｐｈｉｌａよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することができる。
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸癌を診断することができる。
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）でＳｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、およびＭｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、およびＳ２４−７よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、およびＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することができる。
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸ポリープを診断することができる。
本発明の一具現例において、前記段階（ｃ）でＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、および４Ｃ０ｄ−２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳＭＢ５３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することができる。
本発明の一具現例において、前記被検体サンプルは、糞便または尿であってもよい。
環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて、炎症および癌の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、大腸ポリープおよび大腸癌は、症状が現れる前に早期診断が難しいため、効率的な治療が難しいのが現状であるから、本発明による人体由来サンプルを利用した細菌または細菌由来細胞外小胞のメタゲノム分析を通して大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍発病の危険度をあらかじめ予測することによって、大腸腫瘍の危険群を早期に診断および予測して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができるので、大腸腫瘍の発病率を低下させ、治療効果を高めることができる。また、大腸ポリープあるいは大腸癌と診断された患者においてメタゲノム分析を通して原因因子を予測して、原因因子に対する露出を避けることによって、大腸ポリープおよび大腸癌の経過を良くしたり、再発を防止することができる。
図１は、体内で細菌由来細胞外小胞の分布様相を評価するためのものであって、図１ａは、マウスに腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および細菌由来小胞（ＥＶ）を口腔で投与した後、時間別（０、５ｍｉｎ、３ｈ、６ｈ、および１２ｈ）にこれらの分布様相を撮影した写真であり、図１ｂは、マウスに腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）および細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）を口腔で投与し、１２時間後に尿および多様な臓器（心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、脂肪組織、および筋肉）を摘出して前記細菌および細胞外小胞の分布様相を撮影した写真である。 図２は、大腸癌患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図３は、大腸癌患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図４は、大腸癌患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図５は、大腸癌患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図６は、大腸癌患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図７は、大腸癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図８は、大腸癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図９は、大腸癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１０は、大腸癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１１は、大腸癌患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１２は、大腸癌患者および大腸ポリープ患者の糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１３は、大腸癌患者および大腸ポリープ患者の糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１４は、大腸癌患者および大腸ポリープ患者の糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１５は、大腸癌患者および大腸ポリープ患者の糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１６は、大腸癌患者および大腸ポリープ患者の糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１７は、大腸癌患者および大腸ポリープ患者の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１８は、大腸癌患者および大腸ポリープ患者の尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図１９は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２０は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２１は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２２は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２３は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの糞便から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２４は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２５は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、綱（ｃｌａｓｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２６は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、目（ｏｒｄｅｒ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２７は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。 図２８は、大腸ポリープ患者および正常ヒトの尿から細菌由来小胞を分離した後、メタゲノム分析を行って、属（ｇｅｎｕｓ）レベルで診断的性能が有意な細菌由来小胞（ＥＶｓ）の分布を示した結果である。
本発明は、細菌メタゲノム分析を通して大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍を診断する方法に関し、本発明者らは、被検体由来サンプルを利用して細菌由来細胞外小胞から遺伝子を抽出し、これに対してメタゲノム分析を行い、大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍の原因因子として作用できる細菌由来細胞外小胞を同定した。
これより、本発明は、（ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
（ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
（ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を含む大腸腫瘍診断のための情報提供方法を提供する。
本発明において使用される用語「大腸癌診断」とは、患者に対して大腸癌が発病する可能性があるか、大腸癌が発病する可能性が相対的に高いか、または大腸癌がすでに発病したかどうかを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する大腸癌の発病危険度が高い患者によって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするのに使用することができる。また、本発明の方法は、大腸癌を早期に診断して、最も適切な治療方式を選択することによって、治療を決定するために臨床的に使用することができる。
本発明において使用される用語「大腸ポリープ診断」とは、患者に対して大腸ポリープが発病する可能性があるか、大腸ポリープが発病する可能性が相対的に高いか、または大腸ポリープがすでに発病したかどうかを判別することを意味する。本発明の方法は、任意の特定患者に対する大腸ポリープの発病危険度が高い患者によって特別かつ適切な管理を通じて発病時期を遅らせたり発病しないようにするのに使用することができる。また、本発明の方法は、大腸ポリープを早期に診断して最も適切な治療方式を選択することによって、治療を決定するために臨床的に使用することができる。
本発明において使用される用語「メタゲノム（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅ）」とは、「群遺伝体」とも言い、土、動物の腸など孤立した地域内のすべてのウイルス、細菌、かびなどを含む遺伝体の総和を意味するものであって、主に培養にならない微生物を分析するために、配列分析器を使用して一度に多くの微生物を同定することを説明する遺伝体の概念に使用される。特に、メタゲノムは、一種のゲノムまたは遺伝体を言うものではなく、一つの環境単位のすべての種の遺伝体であって、一種の混合遺伝体を言う。これは、オミックス的に生物学が発展する過程で一種を定義するとき、機能的に既存の一種だけでなく、多様な種が互いに相互作用して完全な種を作るという観点から出た用語である。技術的には、速い配列分析法を利用して、種に関係なく、すべてのＤＮＡ、ＲＮＡを分析して、一つの環境内でのすべての種を同定し、相互作用、代謝作用を糾明する技法の対象である。本発明では、好ましくは血清から分離した細菌由来細胞外小胞を利用してメタゲノム分析を実施した。
本発明の実施例では、正常ヒト、大腸ポリープ患者、および大腸癌患者の糞便および尿内細菌由来細胞外小胞に存在する遺伝子に対するメタゲノム分析を実施し、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、科（ｆａｍｉｌｙ）、および属（ｇｅｎｕｓ）レベルでそれぞれ分析して、実際に大腸癌および大腸ポリープの発生原因として作用できる細菌由来小胞を同定した。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、４Ｃ０ｄ−２、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉｏｐｈｙｃｉｄｅａｅ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ綱細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを目レベルで分析した結果、ＲＦ３２、ＹＳ２、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、ｉｉｉ１−１５、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＢｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ目細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、およびＢｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを属レベルで分析した結果、ｒｃ４−４、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、ＳＭＢ５３、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、およびＳｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ属細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例４参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ門細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ科細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳＭＢ５３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｄｏｒｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、およびＢｉｌｏｐｈｉｌａ属細菌由来小胞が大腸癌患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例５参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門細菌由来小胞が大腸癌患者と大腸ポリープ患者との間に有意な差異があった（実施例６参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６綱細菌由来小胞が大腸癌患者と大腸ポリープ患者との間に有意な差異があった（実施例６参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ目細菌由来小胞が大腸癌患者と大腸ポリープ患者との間に有意な差異があった（実施例６参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、およびＳ２４−７科細菌由来小胞が大腸癌患者と大腸ポリープ患者との間に有意な差異があった（実施例６参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、およびＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ属細菌由来小胞が大腸癌患者と大腸ポリープ患者との間に有意な差異があった（実施例６参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ目細菌由来小胞が大腸癌患者と大腸ポリープ患者との間に有意な差異があった（実施例７参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ目細菌由来小胞が大腸癌患者と大腸ポリープ患者との間に有意な差異があった（実施例７参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例８参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＳｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ綱細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例８参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、およびＳｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ目細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例８参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、およびＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例８参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、糞便に存在する細菌由来小胞メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、およびＲｏｓｅａｔｅｌｅｓ属細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例８参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを門レベルで分析した結果、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ門細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例９参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを綱レベルで分析した結果、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、および４Ｃ０ｄ−２綱細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例９参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを目レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例９参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを科レベルで分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ科細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例９参照）。
より具体的に、本発明の一実施例では、尿に存在する細菌由来小胞メタゲノムを属レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳＭＢ５３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ属細菌由来小胞が大腸ポリープ患者と正常ヒトとの間に有意な差異があった（実施例９参照）。
本発明は、上記のような実施例結果を通じて、糞便および尿から分離した細菌由来細胞外小胞に対してメタゲノム分析を実施することによって、正常ヒトおよび大腸ポリープ患者と比較して大腸癌患者において含量が有意に変化した細菌由来小胞を同定し、メタゲノム分析を通して前記各レベルで細菌由来小胞の含量増減を分析することによって、大腸癌を診断することができることを確認した。
また、本発明は、上記のような実施例結果を通じて、糞便および尿から分離した細菌由来細胞外小胞に対してメタゲノム分析を実施することによって、正常ヒトと比較して大腸ポリープ患者において含量が有意に変化した細菌由来小胞を同定し、メタゲノム分析を通して前記各レベルで細菌由来小胞の含量増減を分析することによって、大腸ポリープを診断することができることを確認した。
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
［実施例］
実施例１．腸内細菌および細菌由来小胞の体内吸収、分布、および排泄様相の分析
腸内細菌と細菌由来小胞が胃腸管を介して全身的に吸収されるかを評価するために、次のような方法で実験を行った。マウスの胃腸に蛍光で標識した腸内細菌と腸内細菌由来小胞をそれぞれ５０μｇの用量で胃腸管で投与し、０分、５分、３時間、６時間、１２時間後に蛍光を測定した。マウス全体イメージを観察した結果、図１ａに示したように、前記細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）の場合には、全身的に吸収されないが、細菌由来小胞（ＥＶ）の場合には、投与後に５分に全身的に吸収され、投与３時間後には、膀胱に蛍光が濃く観察されて、小胞が泌尿器系に排泄されることが分かった。また、小胞は、投与１２時間まで体内に存在することが分かった。
腸内細菌と腸内細菌由来小胞が全身的に吸収された後、様々な臓器に浸潤された様相を評価するために、蛍光で標識した５０μｇの細菌と細菌由来小胞を前記の方法のように投与した後、１２時間目にマウスから血液（Ｂｌｏｏｄ）、心臓（Ｈｅａｒｔ）、肺（Ｌｕｎｇ）、肝（Ｌｉｖｅｒ）、腎臓（Ｋｉｄｎｅｙ）、脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）、脂肪組織（Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）、および筋肉（Ｍｕｓｃｌｅ）を摘出した。前記摘出した組織で蛍光を観察した結果、図１ｂに示したように、前記腸内細菌（Ｂａｃｔｅｒｉａ）は、各臓器に吸収されない反面、前記腸内細菌由来細胞外小胞（ＥＶ）は、血液、心臓、肺、肝、腎臓、脾臓、脂肪組織、および筋肉に分布することを確認した。
実施例２．糞便および尿から小胞分離およびＤＮＡ抽出
糞便および尿から小胞を分離し、ＤＮＡを抽出するために、まず、１０ｍｌチューブに糞便および尿を入れ、遠心分離（３，５００×ｇ、１０ｍｉｎ、４℃）を実施して浮遊物を沈めて上澄み液だけを回収した後、新しい１０ｍｌチューブに移した。０．２２μｍフィルターを使用して前記回収した上澄み液から細菌および異物を除去した後、セントリプレップチューブ（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒｓ ５０ｋＤ）に移し、１，５００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して５０ｋＤより小さい物質は捨て、１０ｍｌまで濃縮させた。再び０．２２μｍフィルターを使用してバクテリアおよび異物を除去した後、Ｔｙｐｅ ９０ｔｉローターで１５０，０００×ｇ、４℃で３時間の間超高速遠心分離方法を使用して上澄み液を捨て、固まったペレット（ｐｅｌｌｅｔ）を生理食塩水（ＰＢＳ）で溶かして小胞を収得した。
前記方法によって糞便および尿から分離した小胞１００μｌを１００℃で沸かして内部のＤＮＡを脂質外に出るようにした後、氷に５分間冷ました。次に、残った浮遊物を除去するために、１０，０００×ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄み液だけを集めた後、Ｎａｎｏｄｒｏｐを利用してＤＮＡ量を定量した。以後、前記抽出されたＤＮＡに細菌由来ＤＮＡが存在するかを確認するために、下記表１に示した１６ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｉｍｅｒでＰＣＲを行うことによって、前記抽出された遺伝子に細菌由来遺伝子が存在することを確認した。
実施例３．糞便および尿内小胞から抽出したＤＮＡを利用したメタゲノム分析
前記実施例２の方法で遺伝子を抽出した後、前記表１に示した１６Ｓ ｒＤＮＡプライマーを使用してＰＣＲを実施して遺伝子を増幅させ、シーケンシング（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）を行った。結果をＳｔａｎｄａｒｄ Ｆｌｏｗｇｒａｍ Ｆｏｒｍａｔ（ＳＦＦ）ファイルで出力し、ＧＳ ＦＬＸ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖ２．９）を利用してＳＦＦファイルをｓｅｑｕｅｎｃｅファイル（．ｆａｓｔａ）とｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｓｃｏｒｅファイルに変換した後、リードの信用度評価を確認し、ｗｉｎｄｏｗ（２０ｂｐｓ）平均ｂａｓｅ ｃａｌｌ ａｃｃｕｒａｃｙが９９％未満（Ｐｈｒｅｄ ｓｃｏｒｅ＜２０）である部分を除去した。質が低い部分を除去した後、リードの長さが３００ｂｐｓ以上であるものだけを利用し（Ｓｉｃｋｌｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．３３）、結果分析のために、Ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ Ｕｎｉｔ（ＯＴＵ）は、ＵＣＬＵＳＴとＵＳＥＡＲＣＨを利用してシークエンス類似度によってクラスタリングを行った。具体的に、属（ｇｅｎｕｓ）は９４％、科（ｆａｍｉｌｙ）は９０％、目（ｏｒｄｅｒ）は８５％、綱（ｃｌａｓｓ）は８０％、門（ｐｈｙｌｕｍ）は７５％シークエンス類似度を基準としてクラスタリングをし、各ＯＴＵの門、綱、目、科、属レベルの分類を行い、ＢＬＡＳＴＮとＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓの１６Ｓ ＤＮＡシークエンスデータベース（１０８、４５３シークエンス）を利用して９７％以上のシークエンス類似度を有するバクテリアを分析した（ＱＩＩＭＥ）。
実施例４．正常ヒトと大腸癌患者の糞便から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤大腸癌診断模型
前記実施例３の方法で、大腸癌患者２９人と正常ヒト３５８人の糞便から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ−ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
糞便内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表２および図２参照）。
糞便内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、４Ｃ０ｄ−２、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉｏｐｈｙｃｉｄｅａｅ、およびＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ綱細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表３および図３参照）。
糞便内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、ＲＦ３２、ＹＳ２、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、ｉｉｉ１−１５、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、およびＢｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ目細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表４および図４参照）。
糞便内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、およびＢｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表５および図５参照）。
糞便内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、ｒｃ４−４、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、ＳＭＢ５３、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、およびＳｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ属細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表６および図６参照）。
実施例５．正常ヒトと大腸癌患者の尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤大腸癌診断模型
前記実施例３の方法で、大腸癌患者３８人と正常ヒト３８人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ−ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
尿内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ門細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表７および図７参照）。
尿内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ綱細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表８および図８参照）。
尿内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表９および図９参照）。
尿内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ科細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１０および図１０参照）。
尿内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳＭＢ５３、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｄｏｒｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、およびＢｉｌｏｐｈｉｌａ属細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１１および図１１参照）。
実施例６．大腸ポリープ患者と大腸癌患者の糞便から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤大腸癌診断模型
前記実施例３の方法で、大腸癌患者２９人と大腸ポリープ患者２７人の糞便から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ−ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
糞便内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門細菌をバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１２および図１２参照）。
糞便内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６綱細菌をバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１３および図１３参照）。
糞便内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ目細菌をバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（チケット１４および図１４参照）。
糞便内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、およびＳ２４−７科細菌をバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（チケット１５および図１５参照）。
糞便内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、およびＯｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ属細菌をバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１６および図１６参照）。
実施例７．大腸ポリープ患者と大腸癌患者の尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤大腸癌診断模型
前記実施例３の方法で、大腸癌患者２６人と大腸ポリープ患者３８人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ−ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
尿内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ目細菌で診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１７および図１７参照）。
尿内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌で診断模型を開発したとき、大腸癌に対する診断的性能が有意に現れた（表１８および図１８参照）。
実施例８．正常ヒトと大腸ポリープの糞便から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤大腸ポリープ診断模型
前記実施例３の方法で、大腸癌患者２７人と正常ヒト３５８人の糞便から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、まず、ｔ−ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
糞便内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ門細菌で診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表１９および図１９参照）。
糞便内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＳｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ綱細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２０および図２０参照）。
糞便内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、およびＳｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ目細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２１および図２１参照）。
糞便内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、およびＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２２および図２２参照）。
糞便内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、およびＲｏｓｅａｔｅｌｅｓ属細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２３および図２３参照）。
実施例９．正常ヒトと大腸ポリープの尿から分離した細菌由来小胞メタゲノム分析基盤大腸ポリープ診断模型
前記実施例３の方法で、大腸癌患者３８人と正常ヒト３８人の尿から小胞を分離した後、メタゲノムシーケンシングを行った。診断模型の開発は、先にｔ−ｔｅｓｔで二つの群間のｐ値が０．０５以下であり、二つの群間に２倍以上違いが生じる菌株を選定した後、ｌｏｇｉｓｔｉｃ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ方法で診断的性能指標であるＡＵＣ（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｃｕｒｖｅ）、敏感度、および特異度を算出した。
尿内細菌由来小胞を門（ｐｈｙｌｕｍ）レベルで分析した結果、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａ門細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２４および図２４参照）。
尿内細菌由来小胞を綱（ｃｌａｓｓ）レベルで分析した結果、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、および４Ｃ０ｄ−２綱細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２５および図２５参照）。
尿内細菌由来小胞を目（ｏｒｄｅｒ）レベルで分析した結果、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ目細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２６および図２６参照）。
尿内細菌由来小胞を科（ｆａｍｉｌｙ）レベルで分析した結果、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ科細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２７および図２７参照）。
尿内細菌由来小胞を属（ｇｅｎｕｓ）レベルで分析した結果、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳＭＢ５３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ属細菌で一つ以上のバイオマーカーで診断模型を開発したとき、大腸ポリープに対する診断的性能が有意に現れた（表２８および図２８参照）。
上記に記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
本発明による細菌メタゲノム分析を通して大腸腫瘍を診断する方法は、被検体由来サンプルを利用して細菌メタゲノム分析を行って、特定細菌由来細胞外小胞の含量増減を分析することによって、大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍の発病危険度を予測し診断するのに利用することができる。環境に存在する細菌から分泌される細胞外小胞は、体内に吸収されて、炎症および癌の発生に直接的な影響を及ぼすことができ、大腸ポリープおよび大腸癌は、症状が現れる前に早期診断が難しいため、効率的な治療が難しいのが現状であるから、本発明による人体由来サンプルを利用した細菌または細菌由来細胞外小胞のメタゲノム分析を通して大腸ポリープおよび大腸癌などの大腸腫瘍発病の危険度をあらかじめ予測することによって、大腸腫瘍の危険群を早期に診断および予測して、適切な管理により発病時期を遅らせたり発病を予防することができ、発病後にも早期診断することができるので、大腸腫瘍の発病率を低下させ、治療効果を高めることができる。また、大腸ポリープあるいは大腸癌と診断された患者において本発明による細菌メタゲノム分析は、原因因子を予測して原因因子に対する露出を避けることによって、大腸ポリープおよび大腸癌の経過を良くしたり、再発を防止するのに利用することができる。

Claims (16)

  1. 下記の段階を含む、大腸腫瘍診断のための情報提供方法：
    （ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
    （ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
    前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
    前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
  2. 前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸癌を診断することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
  3. 前記段階（ｃ）でＤｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、４Ｃ０ｄ−２、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉｏｐｈｙｃｉｄｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
    ＲＦ３２、ＹＳ２、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、ｉｉｉ１−１５、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
    ｒｃ４−４、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、ＳＭＢ５３、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｄｏｒｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、およびＢｉｌｏｐｈｉｌａよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項２に記載の情報提供方法。
  4. 前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸癌を診断することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
  5. 前記段階（ｃ）でＳｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、およびＭｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、およびＳ２４−７よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
    Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、およびＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項４に記載の情報提供方法。
  6. 前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸ポリープを診断することを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
  7. 前記段階（ｃ）でＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、および４Ｃ０ｄ−２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
    Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳＭＢ５３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項６に記載の情報提供方法。
  8. 前記被検体サンプルは、糞便または尿であることを特徴とする請求項１に記載の情報提供方法。
  9. 下記の段階を含む、大腸腫瘍の診断方法：
    （ａ）被検体サンプルから分離した細胞外小胞からＤＮＡを抽出する段階；
    （ｂ）前記抽出したＤＮＡに対して配列番号１および配列番号２のプライマーペアを利用してＰＣＲを行う段階；および
    （ｃ）前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
    前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階；または
    前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階。
  10. 前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸癌を診断することを特徴とする請求項９に記載の大腸腫瘍の診断方法。
  11. 前記段階（ｃ）でＤｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、４Ｃ０ｄ−２、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉｏｐｈｙｃｉｄｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａよりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
    ＲＦ３２、ＹＳ２、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、ＲＦ３９、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、ｉｉｉ１−１５、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｘｅｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
    ｒｃ４−４、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒ、Ａｌｌｏｉｏｃｏｃｃｕｓ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ、ＳＭＢ５３、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｕｔｉａ、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｓ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃｕｓ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ、Ｎｏｖｏｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ、Ｓｎｅａｔｈｉａ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｓｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈｉａ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｄｏｒｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｇｏｒｄｏｎｉａ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ、およびＢｉｌｏｐｈｉｌａよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１０に記載の大腸腫瘍の診断方法。
  12. 前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して大腸ポリープ患者と大腸癌患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸癌を診断することを特徴とする請求項９に記載の大腸腫瘍の診断方法。
  13. 前記段階（ｃ）でＳｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、およびＡｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ−６よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、およびＭｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、およびＳ２４−７よりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
    Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ、およびＥｕｂａｃｔｅｒｉｕｍよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１２に記載の大腸腫瘍の診断方法。
  14. 前記段階（ｃ）で、前記ＰＣＲ産物の配列分析を通して正常ヒトと大腸ポリープ患者由来サンプルで細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較する段階を通じて大腸ポリープを診断することを特徴とする請求項９に記載の大腸腫瘍の診断方法。
  15. 前記段階（ｃ）でＡｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａよりなる群から選ばれる１種以上の門（ｐｈｙｌｕｍ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、および４Ｃ０ｄ−２よりなる群から選ばれる１種以上の綱（ｃｌａｓｓ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｔｒａｍｅｎｏｐｉｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓよりなる群から選ばれる１種以上の目（ｏｒｄｅｒ）細菌由来細胞外小胞、
    Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ｂａｒｎｅｓｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、およびＲｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅよりなる群から選ばれる１種以上の科（ｆａｍｉｌｙ）細菌由来細胞外小胞、または
    Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ、Ａｌｋａｎｉｎｄｉｇｅｓ、Ｒｏｓｅａｔｅｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ＳＭＢ５３、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｏｄｏｒｉｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｍａｍｏｎａｓ、Ｐａｒａｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｌａｃｋｉａ、Ｄｉａｌｉｓｔｅｒ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｏｍｏｎａｓ、およびＭｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒよりなる群から選ばれる１種以上の属（ｇｅｎｕｓ）細菌由来細胞外小胞の含量増減を比較することを特徴とする請求項１４に記載の大腸腫瘍の診断方法。
  16. 前記被検体サンプルは、糞便または尿であることを特徴とする請求項９に記載の大腸腫瘍の診断方法。
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