CN110382720A - 通过细菌宏基因组分析来诊断结肠癌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及经对来源于人体的物质中存在的来源于细菌的囊泡进行宏基因组分析来预测如结肠息肉、结肠癌等结肠肿瘤的发病和致病因子的方法，更具体说，经对在粪便或尿液中存在的来源于细菌的囊泡中的宏基因组测序来诊断结肠肿瘤的致病因子和其发病风险的方法。肠道中存在数万亿个细菌，这些细菌在细胞外分泌囊泡进行信息交换。虽然细菌不被吸收到结肠上皮细胞中，但细菌分泌的囊泡通过粘膜并被吸收到结肠上皮细胞中，然后通过血液系统分布，然后通过肝脏和肾脏分泌。来源于细菌的囊泡可增加或减少炎症和癌症的发作，且本发明可有效用作通过对来源于人体的物质中存在的来源于细菌的囊泡的基因宏基因组进行测序来诊断结肠肿瘤的发病风险和其致病因子的方法。此外，甚至在结肠肿瘤或结肠癌发作后仍可实施早期诊断，从而减少结肠癌的发作并增加治疗效果。
Description
技术领域
本公开涉及用于通过细菌的宏基因组分析来诊断结肠肿瘤的方法，更具体地，涉及经由使用来源于受试者的样品的细菌的宏基因组分析，通过分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少来诊断结肠肿瘤，如结肠息肉、结肠癌等的方法。
背景技术
结肠癌或结肠直肠癌是发生在阑尾、结肠和直肠中的恶性肿瘤，并且发生在粘膜中，该粘膜是大肠的最内表面。根据2006年的公告，结肠癌是继韩国胃癌之后的第二大常见癌症，其发病频率随着近期饮食习惯的西化而急剧增加，并且在过去十年中，结肠癌的死亡率增加大约80％，增长率不断增加。结肠癌最常发生在60多岁的人群中，并且就发生部位而言，结肠癌在直肠中比在结肠中更频繁地发生。虽然结肠癌可能在任何年龄发生，但90％或更多的结肠癌患者年龄在40岁或以上，并且发病率每10年翻一番。
已知所有结肠癌都以结肠息肉或结肠腺瘤开始，而息肉是指肠内膜上皮最初异常生长所致的突起，是15％至20％的成人中常见的疾病。除结肠息肉外，如果您有患结肠癌的家庭成员或您是患有溃疡性结肠炎的个体很长一段时间，则结肠癌的风险会增加。此外，结肠癌是已知与食物相关的典型癌症，并且作为结肠癌的致病因素，由于饮食生活的西化而导致的纤维素摄入量低、动物脂肪的高摄入量、精制糖的过量摄入等是众所周知的。
在早期结肠癌的情况下，没有特定的症状，但即使没有症状，也会发生未被注意的肠出血，因此血液流失，导致贫血的发生，有时，食欲不振和体重减轻可能发生。当癌症发展时，可能发生胃痛或肠道习惯改变，例如腹泻，便秘等，或者可能存在来自肛门的直肠出血症状，并且血液可能具有鲜艳的猩红色或黑色。当结肠癌发展时，可能感觉到在腹部通常未被识别的肿块。最显著的症状是排便习惯的变化、血便、疼痛和贫血，特别是，有必要彻底调查40岁或以上成年人的这种变化。
当利用结肠镜检查通过活组织检查检测到癌细胞时，可以明确诊断结肠癌。在大多数结肠癌病例中，没有早期症状，因此诊断非常困难，并且目前没有使用非侵入性方法预测结肠癌的方法。在癌症发展后使用现有的诊断方法检测结肠癌等实体癌症的情况很多，因此为了降低医疗费用和防止结肠癌引起的死亡，提供一种在高风险组中通过预测结肠肿瘤和致病因素的发生，来预防发生结肠癌癌症的方法是有效的。
同时，众所周知，在人体内共生的微生物数量为100万亿，是人类细胞数的10倍，微生物的基因数超过人类基因数的100倍。微生物群(microbiota)或微生物组(microbiome)是一个微生物群落，其中包括在给定栖息地中存在的细菌、古细菌和真核生物。已知肠道微生物群在人类的生理现象中起着至关重要的作用，并通过与人类细胞的相互作用对人体健康和疾病产生重大影响。共生地生活在人体内的细菌分泌纳米级的囊泡，以便与其他细胞交换关于基因、蛋白质等的信息。粘膜形成不允许尺寸为200nm或以上的粒子通过的物理屏障，因此共生在粘膜中的细菌不能通过，但来源于细菌的细胞外囊泡具有大约为100nm或以下的尺寸，因此相对自由地通过粘膜并被吸收到人体内。
宏基因组学(也称为环境基因组学)可以是针对从自环境中收集的样品获得的宏基因组数据的分析学(韩国专利公开No.2011-0073049)。最近，使用基于16s核糖体RNA(16srRNA)碱基序列的方法列出了人类微生物群的细菌组成，并且使用下一代测序(NGS)平台分析了16s rDNA碱基序列，其是16s核糖体RNA的基因。然而，在结肠肿瘤发病时，没有关于通过从来源于人的物质(如粪便)中分离细菌和来源于细菌的囊泡以及通过分析存在于来源于细菌的囊泡中的宏基因组来鉴定结肠肿瘤如结肠息肉、结肠癌等的致病因素来诊断结肠肿瘤的方法的报道。
发明内容
为了诊断结肠肿瘤，例如结肠息肉、结肠癌等等，本发明的发明人使用尿液和粪便(其是来源于受试者的样品)从来源于细菌的细胞外囊泡中提取DNA，并且对提取的DNA进行宏基因组分析，结果，鉴定出能够作为结肠肿瘤，例如结肠息肉、结肠癌等等的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡，从而基于这些发现完成了本发明。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过对来源于细菌的细胞外囊泡中存在的基因的宏基因组分析来提供结肠肿瘤诊断信息的方法。
然而，本公开的技术目标不限于上述目标，本领域普通技术人员根据下面的描述将清楚地了解其它未提及的技术目标。
[技术方案]
为了实现本发明的上述目标，本发明提供了一种为结肠肿瘤诊断提供信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种诊断结肠肿瘤的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本发明还提供了一种预测结肠肿瘤的风险的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一种实施方案中，在过程(c)中，可以经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠癌。
在本发明的一种实施方案中，在过程(c)中，所述比较可以包括比较：
来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、柔膜菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、4C0d-2纲、芽孢杆菌纲(Bacilli)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、腐生螺旋体菌纲(Saprospirae)、Fimbriimonadia菌纲、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、索利氏菌纲(Solibacteres)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、和甲烷杆菌纲(Methanobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由RF32目、YS2目、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、RF39目、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、腐生螺旋体菌目(Saprospirales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、Fimbriimonadales菌目、iii1-15目、索利氏菌目(Solibacterales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、色球藻目(Chroococcales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、蛭弧菌目(Bdellovibrionales)、脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由消化球菌科(Peptococcaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、巴尔通体科(Bartonellaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Fimbriimonadaceae菌科、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由rc4-4属、变形菌属(Proteus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、Mucispirillum菌属、真杆菌属(Eubacterium)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、差异球菌属(Alloiococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、小杆菌属(Dialister)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、SMB53属、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、碳酸噬胞菌属(Capnocytophaga)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、Fimbriimonas菌属、皮生球菌属(Dermacoccus)、无色杆菌属(Achromobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、纤毛菌属(Sneathia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽单胞菌属(Blastomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、沙特尔沃思菌属(Shuttleworthia)、根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、戈登氏菌属(Gordonia)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、史雷克氏菌属(Slackia)、埃希氏菌属(Escherichia)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、埃格特菌属(Eggerthella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、沙雷菌属(Serratia)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)和嗜胆菌属(Bilophila)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一种实施方案中，在过程(c)中，可以经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠癌。
在本发明的一种实施方案中，在过程(c)中，所述比较可以包括比较：
来源于属于螺旋体门(Spirochaetes)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体纲(Spirochaetes)和酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体目(Spirochaetales)和粘球菌目(Myxococcales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体科(Spirochaetaceae)和S24-7科组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者来源于选自由密螺旋体属(Treponema)、小杆菌属(Dialister)、颤螺旋菌属(Oscillospira)和真杆菌属(Eubacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一种实施方案中，在过程(c)中，可以经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠息肉。
在本发明的一种实施方案中，在过程(c)中，所述比较可以包括比较：
来源于选自由放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由β变形菌纲(Betaproteobacteria)、索利氏菌纲(Solibacteres)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和4C0d-2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、索利氏菌目(Solibacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、变形菌属(Proteus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、SMB53属、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、臭杆菌属(Odoribacter)、梭菌属(Clostridium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、史雷克氏菌属(Slackia)、小杆菌属(Dialister)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
在本发明的一种实施方案中，在过程(c)中，所述受试者样品可以是粪便或者尿。
[有利益处]
从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被吸收到人体内，因此可能直接影响炎症和癌症的发生，并且在症状出现之前很难早期诊断结肠息肉和结肠癌，因此对其有效治疗是困难的。因而，根据本发明，通过使用来源于人体的样品，通过对细菌或来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，可以预测发生结肠肿瘤，如结肠息肉、结肠癌等的风险，因此通过对结肠肿瘤的风险组的早期诊断和预测进行适当管理，可以延迟结肠肿瘤的发作或可以预防结肠肿瘤，并且甚至在结肠肿瘤发生后，可以实施结肠肿瘤的早期诊断，从而降低结肠肿瘤的发病率以及增加治疗效果。另外，被诊断患有结肠息肉或结肠癌的患者可以避免暴露于通过宏基因组学分析预测的致病因素，由此可以改善结肠息肉和结肠癌的进展，或者可以防止其复发。
附图说明
图1A和1B是用于体内评估来源于细菌的细胞外囊泡(EV)的分布模式的视图。图1A示出了肠细菌和来源于细菌的EV在口服施用于小鼠后每个时间(0小时、5分钟、3小时、6小时和12小时)的分布模式的图像。图1B示出了肠细菌和来源于细菌的EV在口服施用于小鼠之后在12小时后，提取的小鼠的血液和各种器官(心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉)中显示的分布模式的图像。
图2示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图3示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图4示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图5示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图6示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图7示出了在对从来源于结肠癌患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图8示出了在对从来源于结肠癌患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图9示出了在对从来源于结肠癌患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图10示出了在对从来源于结肠癌患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图11示出了在对从来源于结肠癌患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图12示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于结肠息肉患者的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图13示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于结肠息肉患者的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图14示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于结肠息肉患者的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图15示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于结肠息肉患者的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图16示出了在对从来源于结肠癌患者的粪便和来源于结肠息肉患者的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图17示出了在对从来源于结肠癌患者的尿和来源于结肠息肉患者的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图18示出了在对从来源于结肠癌患者的尿和来源于结肠息肉患者的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图19示出了在对从来源于结肠息肉患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图20示出了在对从来源于结肠息肉患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图21示出了在对从来源于结肠息肉患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图22示出了在对从来源于结肠息肉患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图23示出了在对从来源于结肠息肉患者的粪便和来源于正常个体的粪便中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图24示出了在对从来源于结肠息肉患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在门级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图25示出了在对从来源于结肠息肉患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在纲级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图26示出了在对从来源于结肠息肉患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在目级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图27示出了在对从来源于结肠息肉患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在科级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
图28示出了在对从来源于结肠息肉患者的尿和来源于正常个体的尿中分离的来源于细菌的EV进行宏基因组分析之后，在属级上表现出显著诊断性能的来源于细菌的EV的分布结果。
具体实施方式
本发明涉及通过细菌宏基因组分析来诊断结肠肿瘤，例如结肠息肉、结肠癌等等的方法。本发明的发明人从存在于来源于受试者的样品中的来源于细菌的细胞外囊泡中提取基因，对其进行宏基因组分析，并鉴定能够充当结肠肿瘤，例如结肠息肉、结肠癌等等的致病因子的来源于细菌的细胞外囊泡。
因此，本发明提供了一种提供关于结肠肿瘤诊断的信息的方法，所述方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
本文所用的术语“结肠癌诊断”是指确定患者是否有患结肠癌的风险，患结肠癌的风险是否相对较高，或者是否已经出现结肠癌。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟结肠癌发作(所述特定患者是具有高的患结肠癌的风险的患者)或预防结肠癌发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断结肠息肉经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本文所用的术语“结肠息肉诊断”是指确定患者是否有患结肠息肉的风险，患结肠息肉的风险是否相对较高，或者是否已经出现结肠息肉。本发明的方法可以用于通过对特定患者的特殊和适当的护理来延迟结肠息肉发作(所述特定患者是具有高的患结肠息肉的风险的患者)或预防结肠息肉发作。此外，该方法可以临床上用于通过早期诊断结肠息肉经由选择最合适的治疗方法来确定治疗。
本文所用的术语“宏基因组”("metagenome")涉及包括在诸如土壤、动物肠等分离的区域中的所有病毒、细菌、真菌等的全部基因组，并且主要用作基因组的概念，其解释了使用测序仪一次鉴定许多微生物以分析非培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一种物种的基因组，而是指基因组的混合物，包括环境单位的所有物种的基因组。这个术语源于这样一种观点：当在生物学发展到组学(omics)的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上相互作用以形成完整的物种。在技术上，它是使用快速测序以识别一个环境中的所有物种并验证相互作用和代谢来分析所有DNA和RNA的技术的主题，无论物种如何都如此。在本发明中，使用从血清分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行细菌宏基因组分析。
在本发明的一实施方式中，对正常个体、结肠息肉患者和结肠癌患者的粪便和尿样品中的来源于细菌的细胞外囊泡中存在的基因进行宏基因组分析，并且实际上通过在门级、纲级、目级、科级和属级的分析，鉴定能够充当结肠癌和结肠息肉发作的原因的来源于细菌的细胞外囊泡。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于脱铁杆菌门(Deferribacteres)、柔膜菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、4C0d-2纲、芽孢杆菌纲(Bacilli)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、腐生螺旋体菌纲(Saprospirae)、Fimbriimonadia菌纲、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、索利氏菌纲(Solibacteres)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)和梭杆菌纲(Fusobacteriia)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于RF32目、YS2目、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、RF39目、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、腐生螺旋体菌目(Saprospirales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、Fimbriimonadales菌目、iii1-15目、索利氏菌目(Solibacterales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、色球藻目(Chroococcales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和蛭弧菌目(Bdellovibrionales)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于消化球菌科(Peptococcaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、巴尔通体科(Bartonellaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Fimbriimonadaceae菌科、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)和蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于rc4-4属、变形菌属(Proteus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、Mucispirillum菌属、真杆菌属(Eubacterium)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、差异球菌属(Alloiococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、小杆菌属(Dialister)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、SMB53属、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、碳酸噬胞菌属(Capnocytophaga)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、Fimbriimonas菌属、皮生球菌属(Dermacoccus)、无色杆菌属(Achromobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、纤毛菌属(Sneathia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽单胞菌属(Blastomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)和沙特尔沃思菌属(Shuttleworthia)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例4)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)和甲烷杆菌纲(Methanobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于根瘤菌属(Rhizobium)、变形菌属(Proteus)、摩根氏菌属(Morganella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、SMB53属、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、粪球菌属(Coprococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、戈登氏菌属(Gordonia)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、小杆菌属(Dialister)、史雷克氏菌属(Slackia)、埃希氏菌属(Escherichia)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、埃格特菌属(Eggerthella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、差异球菌属(Alloiococcus)、沙雷菌属(Serratia)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)和嗜胆菌属(Bilophila)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和正常个体之间显著不同(参见实施例5)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于螺旋体门(Spirochaetes)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和结肠息肉患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于螺旋体纲(Spirochaetes)和酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和结肠息肉患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于螺旋体目(Spirochaetales)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和结肠息肉患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于螺旋体科(Spirochaetaceae)和S24-7科的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和结肠息肉患者之间显著不同(参见实施例6)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于密螺旋体属(Treponema)、小杆菌属(Dialister)和颤螺旋菌属(Oscillospira)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和结肠息肉患者之间显著不同(参见实施例6)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于粘球菌目(Myxococcales)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和结肠息肉患者之间显著不同(参见实施例7)。
具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于真杆菌属(Eubacterium)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠癌患者和结肠息肉患者之间显著不同(参见实施例7)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于放线菌门(Actinobacteria)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例8)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于β变形菌纲(Betaproteobacteria)和索利氏菌纲(Solibacteres)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例8)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)和索利氏菌目(Solibacterales)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例8)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)和鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例8)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于粪便中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges菌属和玫瑰色半光合菌属(Roseateles)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例8)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在门级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例9)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在纲级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和4C0d-2纲的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例9)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在目级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例9)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在科级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例9)。
更具体地说，在本发明的一实施方式中，通过在属级对存在于尿中的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析得出，来源于属于根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、变形菌属(Proteus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、SMB53属、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、臭杆菌属(Odoribacter)、梭菌属(Clostridium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、史雷克氏菌属(Slackia)、小杆菌属(Dialister)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)的细菌的细胞外囊泡的含量在结肠息肉患者和正常个体之间显著不同(参见实施例9)。
根据上述实施例结果，证实通过对从粪便和尿中分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，鉴定出与正常个体和结肠息肉患者相比，来源于细菌的细胞外囊泡的在结肠癌患者中的含量表现出显著的变化，并且通过宏基因组分析，经由分析每个级上的来源于细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少，可以诊断结肠癌。
根据上述实施例结果，还证实通过对从粪便和尿中分离的来源于细菌的细胞外囊泡进行宏基因组分析，鉴定出与正常个体相比，来源于细菌的细胞外囊泡在结肠息肉患者中的含量表现出显著的变化，并且通过宏基因组分析，经由分析每个级上的来源于细菌的细胞外囊泡的含量的增加或减少，可以诊断结肠息肉。
在下文中，将参照示例性实施例来描述本发明以帮助理解本发明。然而，这些实施例仅为了说明的目的而提供，且并不意图限制本发明的范围。
[实施例]
实施例1.肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡的体内吸收、分布和排泄模式的分析
[1]为了评估肠细菌和来源于细菌的细胞外囊泡是否通过胃肠道系统地吸收，使用以下方法进行实验。更具体地，将由荧光标记的肠细菌和来源于该细菌的细胞外囊泡(EV)各50μg口服给药至小鼠的胃肠道，并在0小时，以及在5分钟、3小时、6小时和12小时后测量荧光。作为观察小鼠整体图像的结果，如图1A所示，细菌在施用时不被系统吸收，而来源于细菌的EV在给药后5分钟，被系统吸收，并且在给药后3小时，在膀胱中观察到强的荧光，从中确认EV经由泌尿系统排出，并且在给药后12小时存在于身体中。
[2]在肠细菌和来源于肠细菌的细胞外囊泡被系统吸收后，为了评价肠细菌和来源于细菌的EV在被系统吸收后在侵入人体内的各种器官的模式，将用荧光标记的细菌和来源于细菌的EV各50μg使用与上述相同的方法给药，然后在给药后12小时，从每只小鼠中提取血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉。作为在提取的组织中观察荧光的结果，如图1 B所示，证实肠细菌未被吸收到各器官中，而来源于细菌的EV分布在血液、心脏、肺、肝、肾、脾、脂肪组织和肌肉中。
[3]实施例2.从粪便和尿中进行囊泡分离和DNA提取
[4]为了从粪便和尿中分离细胞外囊泡并且提取DNA，首先将粪便和尿加入到10ml管中，以3500×g和在4℃下离心10分钟，沉淀悬浮液，且仅收集上清液，将上清液置于新的10ml管中。用0.22μm过滤器过滤所收集的上清液以除去细菌和杂质，然后置于中心离心过滤器(50kD)中，并以1500×g和在4℃下离心15分钟以丢弃尺寸小于50kD的物质，然后浓缩至10ml。再次使用0.22μm的过滤器除去细菌和杂质，然后通过使用90ti型转子将所得浓缩物以150,000×g和在4℃下进行超高速离心3小时，以除去上清液，并将聚集的沉淀物用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，由此获得囊泡。
将根据上述方法从粪便和尿分离的100μl细胞外泡囊在100℃下煮沸，使内部DNA能从脂质中脱出，然后在冰上冷却。接下来，将所得的囊泡以10,000×g和在4℃下离心30分钟以除去剩余的悬浮液，仅收集上清液，然后使用NanoDrop分光光度计定量所提取的DNA的量。此外，为了验证所提取的DNA中是否存在来源于细菌的DNA，使用下表1所示的16s rDNA引物进行PCR。
[表1]
实施例3.使用从粪便和尿中的囊泡提取的DNA进行宏基因组分析
使用与实施例2相同的方法提取DNA，然后使用如表1中所示的16S rDNA引物对其进行PCR，以扩增DNA，随后测序(Illumina MiSeq测序仪)。将结果作为标准流程图(SFF)文件输出，并将SFF文件使用GS FLX软件(v2.9)转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量得分文件，然后确定用于阅读的信用评级，并且除去具有小于99％(Phred评分<20)的窗口(20bps)平均碱基响应(base call)准确度的部分。在删除低质量部分之后，仅使用长度为300bps或更大的阅读(Sickle版本1.33)，并且为了进行操作分类单元(OTU)分析，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类。特别地，基于对于属的94％的序列相似性，对于科的90％的序列相似性，对于目的85％的序列相似性值，对于纲的80％的序列相似性值，以及对于门的75％的序列相似性值进行聚类，并且对每个OTU的门级、纲级、目级、科级和属级进行分类，并使用BLASTN和GreenGenes的16S DNA序列数据库(108,453个序列)分析具有97％或97％以上序列相似性的细菌(QIIME)。
实施例4.基于对从来源于正常个体和结肠癌患者的粪便中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的结肠癌诊断模型
从29例结肠癌患者和358例正常个体的粪便样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自脱铁杆菌门(Deferribacteres)、柔膜菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表2和图2)。
[表2]
通过在纲级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、4C0d-2纲、芽孢杆菌纲(Bacilli)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、腐生螺旋体菌纲(Saprospirae)、Fimbriimonadia菌纲、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、索利氏菌纲(Solibacteres)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)和梭杆菌纲(Fusobacteriia)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表3和图3)。
[表3]
通过在目级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自RF32目、YS2目、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、RF39目、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、腐生螺旋体菌目(Saprospirales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、Fimbriimonadales菌目、iii1-15目、索利氏菌目(Solibacterales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、色球藻目(Chroococcales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)和蛭弧菌目(Bdellovibrionales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表4和图4)。
[表4]
通过在科级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自消化球菌科(Peptococcaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、巴尔通体科(Bartonellaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Fimbriimonadaceae菌科、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)和蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表5和图5)。
[表5]
通过在属级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自属于rc4-4属、变形菌属(Proteus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、Mucispirillum菌属、真杆菌属(Eubacterium)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、差异球菌属(Alloiococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、小杆菌属(Dialister)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、SMB53属、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、碳酸噬胞菌属(Capnocytophaga)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、Fimbriimonas菌属、皮生球菌属(Dermacoccus)、无色杆菌属(Achromobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、纤毛菌属(Sneathia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽单胞菌属(Blastomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)和沙特尔沃思菌属(Shuttleworthia)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表6和图6)。
[表6]
实施例5.基于对从来源于正常个体和结肠癌患者的尿中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的结肠癌诊断模型
从38例结肠癌患者和38例正常个体的尿样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表7和图7)。
[表7]
通过在纲级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)和甲烷杆菌纲(Methanobacteria)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表8和图8)。
[表8]
通过在目级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自脱硫杆菌纲(Desulfobacterales)、不等鞭毛纲(Stramenopiles)、假单胞菌纲(Pseudomonadales)、梭菌纲(Clostridiales)、苏黎世杆菌纲(Turicibacterales)、脱硫弧菌纲(Desulfovibrionales)、海洋螺菌纲(Oceanospirillales)和甲烷杆菌纲(Methanobacteriales)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表9和图9)。
[表9]
通过在科级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表10和图10)。
[表10]
通过在属级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用来自根瘤菌属(Rhizobium)、变形菌属(Proteus)、摩根氏菌属(Morganella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、SMB53属、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、粪球菌属(Coprococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、戈登氏菌属(Gordonia)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、小杆菌属(Dialister)、史雷克氏菌属(Slackia)、埃希氏菌属(Escherichia)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、埃格特菌属(Eggerthella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、差异球菌属(Alloiococcus)、沙雷菌属(Serratia)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)和嗜胆菌属(Bilophila)中的一种或多种细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表11和图11)。
[表11]
实施例6.基于对从来源于结肠息肉患者和结肠癌患者的粪便中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的结肠癌诊断模型
从29例结肠癌患者和27例结肠息肉患者的粪便样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于螺旋体门(Spirochaetes)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表12和图12)。
[表12]
通过在纲级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于螺旋体纲(Spirochaetes)和酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表13和图13)。
[表13]
通过在目级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于螺旋体目(Spirochaetales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表14和图14)。
[表14]
通过在科级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于螺旋体科(Spirochaetaceae)和S24-7科的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表15和图15)。
[表15]
通过在属级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于密螺旋体属(Treponema)、小杆菌属(Dialister)和颤螺旋菌属(Oscillospira)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表16和图16)。
[表16]
实施例7.基于对从来源于结肠息肉患者和结肠癌患者的尿中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的结肠癌诊断模型
从26例结肠癌患者和38例结肠息肉患者的尿样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在目级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于粘球菌目(Myxococcales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表17和图17)。
[表17]
通过在属级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于真杆菌属(Eubacterium)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠癌表现出显著的诊断性能(参见表18和图18)。
[表18]
实施例8.基于对从来源于正常个体和结肠息肉患者的粪便中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的结肠息肉诊断模型
从27例结肠癌患者和358例正常个体的粪便样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于放线菌门(Actinobacteria)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表19和图19)。
[表19]
通过在纲级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于β变形菌纲(Betaproteobacteria)和索利氏菌纲(Solibacteres)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表20和图20)。
[表20]
通过在目级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)和索利氏菌目(Solibacterales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表21和图21)。
[表21]
通过在科级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于根瘤菌科(Rhizobiaceae)和鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表22和图22)。
[表22]
通过在属级分析粪便中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges菌属和玫瑰色半光合菌属(Roseateles)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表23和图23)。
[表23]
实施例9.基于对从来源于正常个体和结肠息肉患者的尿中分离的来源于细菌的EV的宏基因组分析的结肠息肉诊断模型
从38例结肠癌患者和38例正常个体的尿样品中分离细胞外囊泡，然后使用实施例3的方法对其进行宏基因组测序。为了开发诊断模型，首先，选择在t检验中显示两组间p值小于0.05，两组之间的差显示为两倍或更多的菌株，然后通过逻辑回归分析计算属于诊断性能指标的曲线下面积(AUC)、灵敏度和特异性。
通过在门级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表24和图24)。
[表24]
通过在纲级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和4C0d-2纲的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表25和图25)。
[表25]
通过在目级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表26和图26)。
[表26]
通过在科级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表27和图27)。
[表27]
通过在属级分析尿中来源于细菌的细胞外囊泡得出，使用属于根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、变形菌属(Proteus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、SMB53属、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、臭杆菌属(Odoribacter)、梭菌属(Clostridium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、史雷克氏菌属(Slackia)、小杆菌属(Dialister)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)的细菌作为生物标志物开发的诊断模型对于结肠息肉表现出显著的诊断性能(参见表28和图28)。
[表28]
提供本发明的前述描述仅用于说明性目的，并且本发明所属技术领域的普通技术人员应理解，本公开涉及，本发明可以以各种修改形式实施，而不脱离本发明的精神或必要的特点。因此，本文描述的实施方式应仅在说明性意义上被考虑，而不是用于限制的目的。
[工业实用性]
根据本发明，通过细菌宏基因组分析诊断结肠肿瘤的方法可用于：使用源自受试者的样品通过细菌宏基因组分析，分析来源于特定细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，从而预测结肠肿瘤(例如结肠息肉、结肠癌等)的风险，并诊断结肠肿瘤。从环境中存在的细菌分泌的细胞外囊泡被人体吸收，因此可能直接影响炎症和癌症的发生，并且在症状出现之前很难早期诊断结肠息肉和结肠癌，从而对其有效治疗很难。因此，根据本发明，通过使用源自人体的样品对细菌或来源于细菌的细胞外囊泡的宏基因组分析，可以预测结肠肿瘤，如结肠息肉，结肠癌等的风险，因此可以通过早期诊断和预测结肠肿瘤的风险组，经由适当的管理来延迟结肠肿瘤的发作或预防结肠肿瘤，甚至在结肠肿瘤发生后，可以实施结肠肿瘤的早期诊断，从而降低结肠肿瘤的发病率并增加治疗效果。另外，被诊断患有结肠息肉或结肠癌的患者能够避免暴露于根据本发明的细菌宏基因组分析预测的致病因子，由此可以改善结肠息肉和结肠癌的进展，或者可以防止其复发。
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<120> 通过细菌宏基因组分析来诊断结肠癌的方法
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<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55
Claims (16)
1.一种为结肠肿瘤诊断提供信息的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠癌。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述比较包括比较：
来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、柔膜菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、4C0d-2纲、芽孢杆菌纲(Bacilli)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、腐生螺旋体菌纲(Saprospirae)、Fimbriimonadia菌纲、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、索利氏菌纲(Solibacteres)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、和甲烷杆菌纲(Methanobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由RF32目、YS2目、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、RF39目、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、腐生螺旋体菌目(Saprospirales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、Fimbriimonadales菌目、iii1-15目、索利氏菌目(Solibacterales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、色球藻目(Chroococcales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、蛭弧菌目(Bdellovibrionales)、脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由消化球菌科(Peptococcaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、巴尔通体科(Bartonellaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Fimbriimonadaceae菌科、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由rc4-4属、变形菌属(Proteus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、Mucispirillum菌属、真杆菌属(Eubacterium)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、差异球菌属(Alloiococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、小杆菌属(Dialister)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、SMB53属、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、碳酸噬胞菌属(Capnocytophaga)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、Fimbriimonas菌属、皮生球菌属(Dermacoccus)、无色杆菌属(Achromobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、纤毛菌属(Sneathia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽单胞菌属(Blastomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、沙特尔沃思菌属(Shuttleworthia)、根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、戈登氏菌属(Gordonia)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、史雷克氏菌属(Slackia)、埃希氏菌属(Escherichia)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、埃格特菌属(Eggerthella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、沙雷菌属(Serratia)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)和嗜胆菌属(Bilophila)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠癌。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述比较包括比较：
来源于属于螺旋体门(Spirochaetes)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体纲(Spirochaetes)和酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体目(Spirochaetales)和粘球菌目(Myxococcales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体科(Spirochaetaceae)和S24-7科组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由密螺旋体属(Treponema)、小杆菌属(Dialister)、颤螺旋菌属(Oscillospira)和真杆菌属(Eubacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠息肉。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述比较包括比较：
来源于选自由放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由β变形菌纲(Betaproteobacteria)、索利氏菌纲(Solibacteres)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和4C0d-2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、索利氏菌目(Solibacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、变形菌属(Proteus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、SMB53属、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、臭杆菌属(Odoribacter)、梭菌属(Clostridium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、史雷克氏菌属(Slackia)、小杆菌属(Dialister)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者样品是粪便或者尿。
9.一种诊断结肠肿瘤的方法，该方法包括以下过程：
(a)从分离自受试者样品的细胞外囊泡中提取DNA；
(b)使用具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的成对的引物对所提取的所述DNA进行聚合酶链式反应(PCR)；以及
(c)通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少，或者
通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠癌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述比较包括比较：
来源于选自由脱铁杆菌门(Deferribacteres)、柔膜菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、装甲菌门(Armatimonadetes)、浮霉菌门(Planctomycetes)、梭杆菌门(Fusobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由脱铁杆菌纲(Deferribacteres)、柔膜细菌纲(Mollicutes)、4C0d-2纲、芽孢杆菌纲(Bacilli)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、腐生螺旋体菌纲(Saprospirae)、Fimbriimonadia菌纲、酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)、索利氏菌纲(Solibacteres)、红蝽菌纲(Coriobacteriia)、颤藻亚纲(Oscillatoriophycideae)、梭杆菌纲(Fusobacteriia)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、和甲烷杆菌纲(Methanobacteria)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由RF32目、YS2目、脱铁杆菌目(Deferribacterales)、苏黎世杆菌目(Turicibacterales)、RF39目、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、乳杆菌目(Lactobacillales)、红杆菌目(Rhodobacterales)、腐生螺旋体菌属(Saprospirales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、Fimbriimonadales菌目、iii1-15目、索利氏菌目(Solibacterales)、红蝽菌目(Coriobacteriales)、色球藻目(Chroococcales)、梭杆菌目(Fusobacteriales)、蛭弧菌目(Bdellovibrionales)、脱硫杆菌目(Desulfobacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由消化球菌科(Peptococcaceae)、脱铁杆菌科(Deferribacteraceae)、苏黎世杆菌科(Turicibacteraceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、梭菌科(Clostridiaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、类诺卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、巴尔通体科(Bartonellaceae)、纤维素单胞菌科(Cellulomonadaceae)、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、Fimbriimonadaceae菌科、皮生球菌科(Dermacoccaceae)、纤毛菌科(Leptotrichiaceae)、红蝽菌科(Coriobacteriaceae)、异球藻科(Xenococcaceae)、气单胞菌科(Aeromonadaceae)、地嗜皮菌科(Geodermatophilaceae)、蛭弧菌科(Bdellovibrionaceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、气球菌科(Aerococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、戈登氏菌科(Gordoniaceae)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由rc4-4属、变形菌属(Proteus)、链型杆菌属(Catenibacterium)、Mucispirillum菌属、真杆菌属(Eubacterium)、苏黎世杆菌属(Turicibacter)、差异球菌属(Alloiococcus)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、普雷沃菌属(Prevotella)、小杆菌属(Dialister)、厌氧棒状菌属(Anaerostipes)、SMB53属、粪便杆菌属(Faecalibacterium)、布劳特氏菌属(Blautia)、碳酸噬胞菌属(Capnocytophaga)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、Fimbriimonas菌属、皮生球菌属(Dermacoccus)、无色杆菌属(Achromobacter)、新鞘氨醇杆菌属(Novosphingobium)、纤毛菌属(Sneathia)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、芽单胞菌属(Blastomonas)、蛭弧菌属(Bdellovibrio)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、沙特尔沃思菌属(Shuttleworthia)、根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、肠球菌属(Enterococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、多尔氏菌属(Dorea)、链球菌属(Streptococcus)、毛螺旋菌属(Lachnospira)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、戈登氏菌属(Gordonia)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、罗斯氏菌属(Roseburia)、史雷克氏菌属(Slackia)、埃希氏菌属(Escherichia)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、埃格特菌属(Eggerthella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)、沙雷菌属(Serratia)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)和嗜胆菌属(Bilophila)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于结肠息肉患者的样品和来源于结肠癌患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠癌。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述比较包括比较：
来源于属于螺旋体门(Spirochaetes)的细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体纲(Spirochaetes)和酸杆菌-6纲(Acidobacteria-6)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体目(Spirochaetales)和粘球菌目(Myxococcales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由螺旋体科(Spirochaetaceae)和S24-7科组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由密螺旋体属(Treponema)、小杆菌属(Dialister)、颤螺旋菌属(Oscillospira)和真杆菌属(Eubacterium)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
14.根据权利要求9所述的方法，其中，在过程(c)中，经由通过对所述PCR的产物进行测序，比较来源于正常个体的样品和来源于结肠息肉患者的样品之间的来源于细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少来诊断结肠息肉。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述比较包括比较：
来源于选自由放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和广古菌门(Euryarchaeota)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由β变形菌纲(Betaproteobacteria)、索利氏菌纲(Solibacteres)、γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、梭菌纲(Clostridia)、甲烷杆菌纲(Methanobacteria)和4C0d-2纲组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)、索利氏菌目(Solibacterales)、不等鞭毛目(Stramenopiles)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、梭菌目(Clostridiales)、海洋螺菌目(Oceanospirillales)、脱硫弧菌目(Desulfovibrionales)和甲烷杆菌目(Methanobacteriales)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；
来源于选自由根瘤菌科(Rhizobiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)、渺小杆菌科(Exiguobacteraceae)、莫拉菌科(Moraxellaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、链球菌科(Streptococcaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、韦荣氏球菌科(Veillonellaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、帕拉普氏菌科(Paraprevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、臭杆菌科(Odoribacteraceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、产碱杆菌科(Alcaligenaceae)、巴恩斯氏菌科(Barnesiellaceae)、甲烷杆菌科(Methanobacteriaceae)和理研菌科(Rikenellaceae)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少；或者
来源于选自由鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Alkanindiges菌属、玫瑰色半光合菌属(Roseateles)、根瘤菌属(Rhizobium)、摩根氏菌属(Morganella)、变形菌属(Proteus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、SMB53属、乳球菌属(Lactococcus)、粪球菌属(Coprococcus)、链球菌属(Streptococcus)、拟杆菌属(Bacteroides)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、臭杆菌属(Odoribacter)、梭菌属(Clostridium)、丛毛单胞菌属(Comamonas)、帕拉普氏菌属(Paraprevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、枝芽孢菌属(Virgibacillus)、史雷克氏菌属(Slackia)、小杆菌属(Dialister)、考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)、萨特氏菌属(Sutterella)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、玫瑰单胞菌属(Roseomonas)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)组成的群组中的一种或多种细菌的细胞外囊泡的含量增加或减少。
16.根据权利要求9所述的方法，其中，所述受试者样品是粪便或者尿。
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Application publication date: 20191025 |