WO2021010745A2 - 에티오나마이드를 이용한 줄기세포의 효능 강화방법 - Google Patents

에티오나마이드를 이용한 줄기세포의 효능 강화방법 Download PDF

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WO2021010745A2
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ethionamide
disease
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mesenchymal stem
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나덕렬
장종욱
손효진
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention provides a medium composition for enhancing the efficacy of stem cells containing ethionamide, a method for enhancing the efficacy of stem cells including culturing the stem cells in the medium composition, and of stem cells having enhanced efficacy. It relates to a manufacturing method, a stem cell manufactured by the method, and a use thereof.
  • Inflammation is a protective reaction involving immune cells, blood vessels, and molecular biological intermediates as one of the biological responses to harmful stimuli of biological tissues such as pathogens and damaged cells.
  • abnormal inflammation is associated with a number of human diseases, such as allergies, atopy, arthritis, heart disease, brain disease, circulatory disorders, as well as a cause of various diseases such as cancer.
  • the onset of many inflammation-related diseases is associated with activation of macrophages and excessive production of inflammation-related factors.
  • Representative inflammation-related factors include interleukin-1ß (IL-1ß), tumor necrosis- ⁇ (tumor). necrosis factor- ⁇ ; TNF- ⁇ ) and nitrogen monoxide (NO).
  • Degenerative brain disease represented by Alzheimer's disease and Parkinson's disease
  • Alzheimer's disease which was onset every 68 seconds in the United States, is predicted to develop every 33 seconds by 2050. It is the third most expensive disease after heart disease and cancer in the United States. It is the sixth major cause of death for the elderly over 65 years of age. In Korea, the number of dementia patients is estimated to be from 470,000 (8.8% of the 65-year-old population) in 2010 to 750,000 (9.7%) in 2020, and cerebrovascular disease remains the 2nd leading cause of death in Korea over the past decade. Are doing.
  • the brain inflammatory reaction is one of the pathologies seen in most degenerative brain diseases such as Alzheimer's and Parkinson's disease, and nerve cell death is promoted by inflammatory cytokines or inflammatory mediators such as oxides produced from immune cells by the brain inflammatory reaction. . Therefore, studies are being actively conducted to cure degenerative brain diseases by suppressing the encephalopathic reaction.
  • mesenchymal stem cells are known to be cells involved in tissue regeneration, treatment, and immune response, along with multipotency, and use these characteristics to separate mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Efforts to develop as a therapeutic agent for various diseases by cultivation have been steadily continued. For example, mesenchymal stem cells are emerging as a new alternative for the treatment of autoimmune diseases, and their immunosuppressive and anti-inflammatory effects, and T-cell activation and proliferation inhibitory effects have been reported.
  • mesenchymal stem cells are reported to exhibit a neuronal protective effect, which contributes to the survival of nerve cells and regeneration of nerve fibers by secreting various nerve growth factors in the degenerative nervous system environment, and mesenchymal stem cells have immunomodulatory ability. It has a variety of immune responses. It is also known to regulate the degenerative nervous system environment along with nerve regeneration through differentiation or fusion into nerve cells (Hanyang Med Rev 2012; 32:145-153).
  • mesenchymal stem cells only the above general effects of mesenchymal stem cells are known, and the development of mesenchymal stem cells optimized to have more improved therapeutic effects is inadequate. Therefore, it is effective for the treatment of inflammatory diseases and degenerative brain diseases. There is an urgent need to develop enhanced and optimized stem cell treatments.
  • the present inventors studied a method for further enhancing the efficacy of stem cells such as the anti-inflammatory effect and the expression of near-secretory factors.
  • stem cells such as the anti-inflammatory effect and the expression of near-secretory factors.
  • ethionamide which is known as an antibiotic
  • the present invention was completed by confirming that the efficacy of stem cells as described above is improved, and that the stem cells substantially reduce pathologies of brain inflammation and dementia in vivo.
  • an object of the present invention is to provide a medium composition for enhancing the efficacy of stem cells, including ethionamide.
  • Another object of the present invention is to provide a method for enhancing the efficacy of stem cells, including the step of culturing the stem cells in the medium composition.
  • the present invention provides a method for producing stem cells with enhanced efficacy, stem cells with enhanced efficacy produced by the method, and uses of the stem cells, including the step of culturing stem cells in the medium composition. It has another purpose.
  • the present invention provides a medium composition for enhancing the efficacy of stem cells, including ethionamide.
  • the ethionamide may be contained in a concentration of 1 to 200 ⁇ M in the medium.
  • the stem cells may be embryonic stem cells or adult stem cells.
  • the adult stem cells may be mesenchymal stem cells derived from at least one tissue selected from the group consisting of umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, skin, amniotic membrane and placenta.
  • the enhancement of the efficacy may be the enhancement of expression of near-secretory factors in stem cells.
  • the near-secretion factor is a brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a vascular endothelial cell growth factor (VEGF), an insulin-like growth factor (insulin- like growth factor-1; IGF-1), hepatocyte growth factor (HGF), heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H: quinone oxidoreductase (NAD) Consist of (P)H:quinone oxidoreductase; NQO1), glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC) and glutamate-cysteine ligase modifier subunit (GCLM) It may be one or more selected from the group.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • HO-1 heme oxygenase-1
  • NAD(P)H quinone oxidoreducta
  • the present invention provides a method for enhancing the efficacy of stem cells, comprising culturing the stem cells in the medium composition.
  • the present invention provides a method for producing stem cells with enhanced efficacy, comprising culturing the stem cells in the medium composition.
  • the present invention provides stem cells with enhanced efficacy prepared by the above method.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases, comprising the stem cells as an active ingredient.
  • the inflammatory disease is dermatitis, allergy, atopy, asthma, conjunctivitis, periodontitis, rhinitis, otitis media, pharyngitis, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastritis, Crohn's disease, colitis, peritonitis, osteomyelitis, cellulitis, meningitis , Encephalitis, pancreatitis, stroke, acute bronchitis, chronic bronchitis, hemorrhoids, gout, ankylosing spondylitis, rheumatoid fever, lupus, fibromyalgia, psoriatic arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, infectious arthritis, peri-scapular joint infection, tendinitis, tendonitis, tendonitis , Myositis, hepatitis, cystitis, nephritis, sjogren's syndrome,
  • the present invention provides a method for preventing or treating an inflammatory disease, comprising treating an individual with a pharmaceutical composition containing the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of the pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases, comprising the stem cells as an active ingredient.
  • the degenerative brain disease is Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease, frontotemporal dementia, Huntington's disease, stroke, cerebral infarction, Pick disease, head trauma, spinal cord injury, cerebral arteriosclerosis, Lou Gehrig's disease, multiple It may be selected from the group consisting of sclerosis, senile depression and Creutzfeldt-Jakob disease.
  • the present invention provides a method for preventing or treating degenerative brain diseases, comprising the step of treating an individual with a pharmaceutical composition containing the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of the pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative brain diseases.
  • the present inventors believe that the anti-inflammatory effect of the mesenchymal stem cells is enhanced when microglia cells in which the inflammatory reaction is induced are co-cultured with the mesenchymal stem cells treated with ethionamide, and the mesenchymal stem cells treated with ethionamide It was experimentally confirmed that the near-field secretion of various growth factors and antioxidant factors was improved in cells, and furthermore, in an animal model of dementia, a substantial reduction effect of amyloid beta, encephalopathy, and phosphorylated tau by administration of the mesenchymal stem cells was confirmed.
  • the present invention it is possible to effectively enhance the anti-inflammatory effect of mesenchymal stem cells and the expression levels of near-secretory factors by a simple process of treating mesenchymal stem cells with ethionamide, and stem cells produced by this method May be usefully used for preventing or treating inflammatory diseases or degenerative brain diseases.
  • 1A is a result of measuring the expression level of iNOS after co-culturing microglial cells (BV2) in which an inflammatory response is induced and mesenchymal stem cells treated or untreated with ethionamide.
  • BV2 microglial cells
  • 1B is a result of measuring the expression level of NO after co-culturing microglia (BV2) in which an inflammatory reaction is induced and mesenchymal stem cells treated or untreated with ethionamide.
  • BV2 co-culturing microglia
  • 1C is a result of measuring the expression level of ROS after co-culturing microglia (BV2) in which an inflammatory response is induced and mesenchymal stem cells treated or untreated with ethionamide.
  • BV2 co-culturing microglia
  • 2A is a result of measuring the mRNA expression level of IL-6, an inflammatory cytokine, after co-culturing microglia (BV2) in which an inflammatory response is induced and mesenchymal stem cells treated or untreated with ethionamide.
  • Figure 2b is a result of measuring the expression level of the mRNA and protein of the inflammatory cytokine TNF- ⁇ after co-culturing microglia (BV2) and ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells. to be.
  • Figure 3 is an inflammatory reaction induced microglia (BV2) and ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells were co-cultured, and then NF- ⁇ B activity was measured through Western blot, and the expression level was quantified. It is the result.
  • BV2 inflammatory reaction induced microglia
  • ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells were co-cultured, and then NF- ⁇ B activity was measured through Western blot, and the expression level was quantified. It is the result.
  • Figure 4a is a result of measuring the expression levels of growth factors BDNF, VEGF, IGF-1 and HGF as near secretion factors after treating mesenchymal stem cells with ethionamide at different concentrations (50, 100 ⁇ M).
  • Figure 4b is a result of measuring the expression levels of antioxidant-related factors such as HO-1, NQO1, GCLC and GCLM as near secretion factors after treatment of mesenchymal stem cells with ethionamide at different concentrations (50, 100 ⁇ M). .
  • FIG. 5A is an immunostaining with amyloid beta antibody (anti-6E10) to the brain tissue sections obtained one week after administration of ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells to the ventricles of the dementia mouse model, respectively. This is the result of quantification.
  • anti-6E10 amyloid beta antibody
  • 5B is a result of measuring the level of amyloid beta by performing ELISA using each soluble fraction and insoluble fraction obtained by homogenizing brain tissue after administration of each mesenchymal stem cell to a dementia mouse model in the same manner as in FIG. 5A. .
  • FIG. 6 shows the results of immunostaining using an encephalopathy-related antibody (GFAP) on the brain tissue section obtained through the same method as in FIG. 5A, and quantifying it.
  • GFAP encephalopathy-related antibody
  • FIG. 7 shows the brain tissue samples obtained 2 weeks after administration of ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells to the ventricles of the dementia mouse model in the same manner as in FIG. 5b, and threonine 181 through ELISA. These are the results of measuring the levels of tau protein in which residue 231 is phosphorylated.
  • the present invention provides a medium composition for enhancing the efficacy of stem cells, including ethionamide.
  • ethionamide (2-ethylpyridine-4-carbothioamide) having the following chemical structure was known to be used for the treatment of infectious diseases caused by bacteria as a thionamide-based antibiotic, but in the present invention, the stem cell efficacy of ethionamide The reinforcement effect was first discovered.
  • the present inventors confirmed the effect of enhancing the efficacy of stem cells treated with ethionamide through specific examples.
  • the levels of iNOS, NO and ROS were measured, and as a result, ethionamide
  • the expression of the above factors was further reduced compared to the control group or the case without ethionamide, and through this, the mesenchymal stem cells were treated with ethionamide. It was confirmed that the anti-inflammatory effect was improved (see Example 3).
  • the expression levels of inflammatory cytokines IL-6 and TNF- ⁇ are measured after co-culturing microglial cells in which the inflammatory response is induced with ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells.
  • ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells As a result, it was confirmed that the effect of inhibiting the expression of inflammatory cytokines was improved when co-cultured with ethionamide-treated mesenchymal stem cells compared to the control or non-treated ethionamide (see Example 4).
  • the near-secretion factor is proportional to the treatment concentration of eionamide. It was confirmed that the expression level of them increased (see Example 6).
  • the effect of stem cells treated with ethionamide at an in vivo level was confirmed.
  • the results of immunostaining or ELISA analysis were performed on the mesenchymal stem cells treated with ethionamide. It was confirmed the significant reduction effect of amyloid beta, encephalopathy and phosphorylated tau protein by (see Examples 7 to 9).
  • concentration of ethionamide contained in the medium there is no limit to the concentration of ethionamide contained in the medium, but preferably, it may be contained in a concentration of 1 to 200 uM, more preferably 50 to 200 uM, and more preferably 50 to 150 uM. Can be included in concentration.
  • stem cell used in the present invention refers to a cell having the ability to differentiate into two or more different types of cells while having self-replicating ability as undifferentiated cells.
  • the stem cells of the present invention may be autologous or allogeneic stem cells, and may be derived from any type of animal including humans and non-human mammals, and whether the stem cells are derived from adults or embryos are not limited thereto. Does not.
  • the adult stem cells derived from the adult may be mesenchymal stem cells, mesenchymal stromal cells derived from human tissue, mesenchymal stem cells derived from human tissue, multipotent stem cells, or amniotic epithelial cells. And, preferably, mesenchymal stem cells, but not limited thereto, and the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from umbilical cord, cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane and placenta, It is not limited to this.
  • the separation and cultivation of mesenchymal stem cells can be performed by a method that is obvious to those skilled in the art, and there is no limitation on the method as long as it is a method capable of proliferating while maintaining stem cell capacity without changing the characteristics of mesenchymal stem cells .
  • enhancing the efficacy of stem cells means improving the therapeutic properties and effects of stem cells against inflammatory diseases or degenerative brain diseases, and more specifically, suppressing the occurrence of nitric oxide, its related factors or reactive oxygen species, inflammatory Antioxidant and anti-inflammatory effects through inhibition of cytokine expression and reduction of NF- ⁇ B activity; And it means that the expression efficiency of near-secretory factors such as growth factor and antioxidant factor is improved.
  • the near-secretion factor is more specifically, brain-derived neurotrophic factor (BDNF), vascular endothelial cell growth factor (VEGF), insulin-like growth factor-1 ; IGF-1), hepatocyte growth factor (HGF), heme oxygenase-1 (HO-1), NAD(P)H: quinone oxidoreductase (NAD(P)H: 1 selected from the group consisting of quinone oxidoreductase; NQO1), glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (GCLC), and glutamate-cysteine ligase modifier subunit (GCLM). It may be more than a species, but is not limited thereto.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • HGF hepatocyte growth factor
  • HO-1 heme oxygenase-1
  • the present invention provides a method for enhancing the efficacy of stem cells comprising culturing the stem cells in the medium composition.
  • the present invention provides a method for producing stem cells with enhanced efficacy, including culturing the stem cells in the medium composition.
  • the present invention provides a stem cell with enhanced efficacy produced by the above method.
  • the present invention provides an anti-inflammatory composition comprising the stem cells as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases or degenerative brain diseases comprising the stem cells as an active ingredient.
  • prevention used in the present invention means any action that suppresses or delays the onset of inflammatory disease or degenerative brain disease by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which symptoms for inflammatory diseases or degenerative brain diseases are improved or advantageously changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • inflammatory disease used in the present invention is a generic term for a disease whose main lesion is inflammation, and more preferably, in the present invention, the inflammatory disease is dermatitis, allergy, atopic, asthma, conjunctivitis, periodontitis, Rhinitis, otitis media, sore throat, tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastritis, Crohn's disease, colitis, peritonitis, osteomyelitis, cellulitis, meningitis, encephalitis, pancreatitis, stroke, acute bronchitis, chronic bronchitis, hemorrhoids, gout, ankylosing spondylitis, rheumatic fever, lupus , Fibromyalgia, psoriatic arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, infectious arthritis, peri-shoulderitis, tendinitis, tendonitis, peritonitis, myositis, hepatitis
  • degenerative brain disease used in the present invention refers to a disease occurring in the brain among degenerative diseases that occur with age, and more preferably in the present invention, Parkinson's disease, dementia, Alzheimer's disease, Selected from the group consisting of frontotemporal dementia, Huntington's disease, stroke, cerebral infarction, Pick's disease, head trauma, spinal cord injury, cerebral arteriosclerosis, Lou Gehrig's disease, multiple sclerosis, senile depression and Creutzfeldt-Jakob disease. It may be, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes stem cells whose efficacy is enhanced by treatment with ethionamide as an active ingredient, and may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is commonly used in preparation, and includes, but is limited to, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, cyclodextrin, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, liposome, and the like. It is not, and other conventional additives such as antioxidants and buffers may be further included if necessary.
  • injectable formulations such as aqueous solutions, suspensions, emulsions, etc., pills, capsules, granules, or tablets.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations it can be preferably formulated according to each component using a method disclosed in Remington's literature.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited in its formulation, but may be formulated as an injection, an inhalant, an external preparation for skin, or the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally (for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally or topically applied) according to a desired method, but preferably may be administered in the brain, and the dosage Is different depending on the condition and weight of the patient, the degree of the disease, the form of the drug, the route and time of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to treat or diagnose a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or diagnosis, and the effective dose level is the type of disease, severity, drug Activity, sensitivity to drugs, time of administration, route of administration and rate of excretion, duration of treatment, factors including drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with a conventional therapeutic agent, and may be administered single or multiple times. It is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect in a minimum amount without side effects in consideration of all the above factors, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, the type of disease, and drugs used in combination.
  • 5 x 10 2 cells to 5 x 10 8 cells per 1 kg of body weight may be administered daily or every other day, or administered once to multiple times.
  • multiple doses can be administered at intervals of 1 week to 1 month.
  • the dosage amount is not limited by any method.
  • the present invention provides a method for preventing or treating inflammatory diseases or degenerative brain diseases comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • “individual” refers to a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle. Means mammal.
  • the present invention provides the use of the pharmaceutical composition to prevent or treat inflammatory diseases or degenerative brain diseases.
  • mesenchymal stem cells For human umbilical mesenchymal stem cells, after securing the umbilical cord according to the standards approved by IRB (IRB# 2015-09-023-003) of Samsung Medical Center, mesenchymal stem cells were isolated by the following method.
  • the following experiment was performed to verify whether the anti-inflammatory effect of the stem cells was improved when the mesenchymal stem cells were treated with ethionamide. Specifically, after inducing an inflammatory model by treating BV2 cells, which are microglial cells, with lipopolysaccharide (LPS), they were co-cultured with mesenchymal stem cells (hMSCs) that were primed or not treated with ethionamide. The expression levels of nitric oxide (NO), nitrogen oxide related factors, and reactive oxygen species were measured.
  • BV2 cells which are microglial cells, with lipopolysaccharide (LPS)
  • LPS lipopolysaccharide
  • hMSCs mesenchymal stem cells
  • the expression levels of nitric oxide (NO), nitrogen oxide related factors, and reactive oxygen species were measured.
  • iNOS inducible nitric oxide synthase
  • ROS reactive oxygen species
  • the expression level was significantly reduced in the case of culturing with the mesenchymal stem cells treated with ethionamide compared to the case of co-culture with the control or non-ethionamide mesenchymal stem cells.
  • the results indicate that the anti-inflammatory effect of the stem cells is enhanced by treating the mesenchymal stem cells with ethionamide.
  • Example 1 Based on the results of Example 1, the present inventors induced the same inflammatory model as in Example 1, and then co-cultured ethionamide with primed or untreated mesenchymal stem cells, and then representative inflammatory cytokines. The expression levels of the kines IL-6 and TNF- ⁇ were measured.
  • NF- ⁇ B Nuclear factor- ⁇ B
  • NF- ⁇ B is known as the most important transcription factor involved in the inflammatory response mechanism in immune cells, and abnormal NF- ⁇ B activation by various causes is a pathogenesis mechanism of various inflammatory diseases including degenerative brain disease. Is reported. Therefore, based on the results of Examples 1 and 2, it was attempted to verify whether or not ethionamide treatment could enhance the inhibitory effect of NF- ⁇ B activity in mesenchymal stem cells. To this end, in the same manner as in Examples 1 and 2, the inflammatory response was induced in BV2, which is microglial cells, and then co-cultured with ethionamide-treated or untreated mesenchymal stem cells, and the activity of NF- ⁇ B was measured.
  • the mesenchymal stem cells were treated with 50 and 100 ⁇ M of ethionamide, respectively, and then used as a near secretion factor.
  • ethionamide Known brain-derived neurotrophic factor (BDNF), vascular endothelial cell growth factor (VEGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), and hepatocyte growth
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • HGF hepatocyte growth factor
  • antioxidant-related factors such as HO-1 (Heme oxygenase-1), NQO1 (NAD(P)H: quinone oxidoreductase), GCLC ( The mRNA expression levels of Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit) and GCLM (Glutamate-cysteine ligase modifier subunit) were measured.
  • HO-1 Heme oxygenase-1
  • NQO1 NAD(P)H: quinone oxidoreductase
  • GCLC The mRNA expression levels of Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit
  • GCLM Glutamate-cysteine ligase modifier subunit
  • Example 7 Confirmation of the effect of reducing amyloid beta by stem cells treated with ethionamide in a dementia mouse model
  • the present inventors used a dementia mouse model to determine whether the mesenchymal stem cells treated with ethionamide have a therapeutic effect on the degenerative brain disease, and the level of amyloid beta according to the administration of the mesenchymal stem cells. Change was measured.
  • mesenchymal stem cells (primed) treated with ethionamide or untreated mesenchymal stem cells (hMSCs) were administered to the dementia mouse model into the ventricle of the mouse, and the brain was excised one week later.
  • the extracted brain was fixed with 4% paraformaldehyde, and then the tissue section obtained by cutting the tissue was treated with anti-6E10, a representative antibody against amyloid beta, for immunostaining, and observed through a fluorescence microscope. .
  • the degree of fluorescence was quantitatively analyzed and shown as a graph.
  • mesenchymal stem cells primed
  • ethionamide or untreated mesenchymal stem cells hMSCs
  • the stem cells treated with ethionamide have an effect of reducing amyloid beta, which means that the stem cells have a therapeutic effect by reducing the pathology of degenerative brain diseases.
  • Example 8 Confirmation of the effect of reducing encephalopathy by stem cells treated with ethionamide in a dementia mouse model
  • Example 7 Based on the results of Example 7, it was attempted to investigate whether or not stem cells treated with ethionamide had an effect of reducing brain inflammation in a dementia mouse model. To this end, in the same manner as in FIG. 7, mesenchymal stem cells (primed) or untreated mesenchymal stem cells (hMSCs) treated with ethionamide were administered to the dementia mouse model into the ventricle of the mouse for a week. After the brain was excised, it was fixed with 4% paraformaldehyde.
  • tissue sections obtained by cutting the brain tissue were immunostained by treatment with GFAP (glial fibrillary acidic protein), an antibody related to brain inflammation, and observed with a fluorescence microscope, and the degree of fluorescence was quantitatively analyzed and compared.
  • GFAP glial fibrillary acidic protein
  • stem cells treated with ethionamide have an effect of reducing brain inflammation.
  • the present inventors have determined whether the ethionamide-treated stem cells according to the present invention have an effect of reducing Tau protein, another pathological phenomenon in the dementia mouse model. I tried to find out whether or not. Specifically, mesenchymal stem cells treated with ethionamide or untreated mesenchymal stem cells (hMSCs) were administered to the dementia mouse model into the ventricle of the mouse, and the brain was excised and homogenized 2 weeks later. Then, using the obtained brain tissue sample, the expression level of tau protein was measured through ELISA. At this time, the amount of tau in which threonine residues 181 and 231 of the tau protein were phosphorylated was confirmed, respectively.
  • hMSCs mesenchymal stem cells treated with ethionamide or untreated mesenchymal stem cells
  • Ethionamide according to the present invention enhances the efficacy of stem cells, such as enhancing the anti-inflammatory effect of stem cells and secretion at close range, and the stem cells treated with ethionamide have a therapeutic effect through substantial lesion improvement in a dementia model.
  • stem cells such as enhancing the anti-inflammatory effect of stem cells and secretion at close range
  • the stem cells treated with ethionamide have a therapeutic effect through substantial lesion improvement in a dementia model.
  • ethionamide and the stem cells treated with the ethionamide were enhanced with various efficacy, it is expected to be used in various fields including the development of therapeutic agents for inflammatory diseases and degenerative brain diseases.

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Abstract

본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는 줄기세포의 효능 강화용 배지 조성물, 상기 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 효능 강화방법 및 효능이 강화된 줄기세포의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리하는 간단한 과정으로 중간엽 줄기세포의 항염증 효과 및 근거리분비 인자들의 발현량을 효과적으로 증진시킬 수 있으며, 이러한 방법에 의해 얻어진 줄기세포는 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

에티오나마이드를 이용한 줄기세포의 효능 강화방법
본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는 줄기세포의 효능 강화용 배지 조성물, 상기 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 효능 강화방법 및 효능이 강화된 줄기세포의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 줄기세포 및 이의 용도에 관한 것이다.
염증(inflammation)은 병원균, 손상된 세포 등의 생체조직의 유해한 자극원에 대한 생체반응의 하나로 면역세포, 혈관, 분자생물학적 중간체들이 관여되어 있는 보호반응이다. 그러나 비정상적인 염증은 수많은 인간의 질병에 연관되어 있으며, 예컨대 알레르기, 아토피, 관절염, 심장병, 뇌질환, 순환기 장애뿐만 아니라 암 등과 같은 다양한 질환의 원인을 제공하게 된다. 많은 염증 관련 질환의 발병에는 대식세포의 활성화와 이에 따른 염증 관련 인자들의 과도한 생성이 연관되어 있는데, 대표적인 염증 관련 인자들로는 인터루킨-1ß(interleukin-1ß; IL-1ß), 종양괴사인사-α(tumor necrosis factor-α; TNF-α) 및 일산화질소(nitrogen oxide; NO) 등이 있다.
알츠하이머병 및 파킨슨병으로 대표되는 퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)은 빠른 고령화 진행에 따라 심각한 사회문제로 부상하고 있다. 알츠하이머 협회의 자료에 따르면, 미국에서 68초마다 발병하던 알츠하이머병이 2050년이 되면 33초마다 발병할 것으로 예측되고 있고, 미국에서 심장질환, 암에 이어 3번째로 치료 비용이 비싼 질환이며, 모든 연령대에 걸쳐서는 6번째, 65세 이상의 노인에 대해서는 5번째 주요 사망원인이 되고 있다. 국내의 경우 치매 환자 수가 2010년 47만명(65세 인구의 8.8%)에서 2020년 75만명(9.7%)이 될 것으로 추정하고 있으며, 뇌혈관질환은 지난 10여년간 우리나라 주요 사망원인 중 2위를 고수하고 있다.
이러한 퇴행성 뇌질환에 대하여 최근 과도한 뇌염증이 주요 발병 원인임을 제시하는 연구결과들이 전 세계적으로 보고되고 있다. 뇌염증 반응이란 알츠하이머와 파킨슨병 등 대부분의 퇴행성 뇌질환에서 나타나는 병리현상 중 하나로, 뇌염증 반응에 의해 면역세포로부터 생산되는 염증성 사이토카인이나 산화물질 등 염증매개물질에 의해 신경세포 사멸이 촉진되는 것이다. 따라서 이러한 뇌염증 반응을 억제하여 퇴행성 뇌질환을 치료하기 위한 연구들이 활발히 진행되고 있다.
한편, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)는 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역 반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여 다양한 질환의 치료제로 개발하고자 하는 노력이 꾸준히 이어져오고 있다. 예컨대, 중간엽 줄기세포는 자가면역 질환을 치료하기 위한 새로운 대안으로 떠오르고 있는데, 이의 면역억제 및 항염증 효과, T세포의 활성화 및 증식 억제 효과 등이 보고되어 있다. 또한, 중간엽 줄기세포는 신경세포 보호작용을 나타낸다고 보고되어 있는데, 퇴행성 신경계 환경에서 다양한 신경성장인자를 분비하여 신경세포의 생존 및 신경섬유의 재생에 기여하고, 중간엽 줄기세포는 면역조절 능력을 지니고 있어 다양한 면역 반응을 조절한다. 또한, 신경세포로의 분화 혹은 융합을 통하여 신경재생과 함께 퇴행성 신경계 환경을 조절한다고 알려져 있다(Hanyang Med Rev 2012; 32:145-153).
하지만, 중간엽 줄기세포의 일반적인 상기 효과들에 대해서만 공지되어 있을 뿐, 보다 향상된 치료적 효과를 갖도록 최적화된 중간엽 줄기세포의 개발은 미진한 실정인바, 염증성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 치료를 위해 효능이 강화되어 최적화된 줄기세포 치료제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자는 줄기세포의 항염증 효과 및 근거리분비 인자의 발현 등의 효능을 더욱 증진시킬 수 있는 방법에 대하여 연구한 결과, 종래 항생제로 알려져 있는 에티오나마이드(ethionamide)를 처리하였을 때 상기와 같은 줄기세포의 효능이 증진되며, 상기 줄기세포가 실질적으로 in vivo에서 뇌염증 및 치매의 병리 현상을 감소시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포의 효능 강화용 배지 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 효능 강화방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에서 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 효능이 강화된 줄기세포의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 효능이 강화된 줄기세포, 및 상기 줄기세포의 용도를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포의 효능 강화용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 에티오나마이드는 배지에 1 내지 200 μM의 농도로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 효능 강화는 줄기세포에서 근거리분비 인자의 발현이 증진되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 근거리분비 인자는 뇌유래신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial cell growth factor; VEGF), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor-1; IGF-1), 간세포성장인자(hepatocyte Growth Factor; HGF), 헴 산화효소-1(Heme oxygenase-1; HO-1), NAD(P)H:퀴논 산화환원효소(NAD(P)H:quinone oxidoreductase; NQO1), 글루타메이트-시스테인 리가아제 촉매소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit; GCLC) 및 글루타메이트-시스테인 리가아제 변형소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase modifier subunit; GCLM)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 효능 강화방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 효능이 강화된 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된, 효능이 강화된 줄기세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 감염성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren’s syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 염증성 질환 예방 또는 치료용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 뇌졸중, 뇌경색, 피크(Pick)병, 두부외상, 척수손상, 뇌동맥 경화증, 루게릭병, 다발성 경화증, 노인성 우울증 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용도를 제공한다.
본 발명자들은 염증반응이 유도된 소교세포를 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양하였을 때 중간엽 줄기세포에 의한 항염증 효과가 증진되고, 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포에서 다양한 성장인자 및 항산화 인자들의 근거리분비능이 증진된 것을 실험적으로 확인하였으며, 나아가 치매 동물모델에서 상기 중간엽 줄기세포 투여에 의한 아밀로이드 베타, 뇌염증, 인산화된 타우의 실질적인 감소효과를 확인하였다. 따라서 본 발명에 따르면 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리하는 간단한 과정으로 중간엽 줄기세포의 항염증 효과 및 근거리분비 인자들의 발현량을 효과적으로 증진시킬 수 있으며, 이러한 방법에 의해 제조된 줄기세포는 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1a는 염증반응이 유도된 소교세포(BV2)와 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 공동 배양한 후 iNOS의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 1b는 염증반응이 유도된 소교세포(BV2)와 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 공동 배양한 후 NO의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 1c는 염증반응이 유도된 소교세포(BV2)와 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 공동 배양한 후 ROS의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 2a는 염증반응이 유도된 소교세포(BV2)와 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 공동 배양한 후 염증성 사이토카인인 IL-6의 mRNA 발현수준을 측정한 결과이다.
도 2b는 염증반응이 유도된 소교세포(BV2)와 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 공동 배양한 후 염증성 사이토카인인 TNF-α의 mRNA 및 단백질의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 3은 염증반응이 유도된 소교세포(BV2)와 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 공동 배양한 후 웨스턴 블롯을 통해 NF-κB 활성을 측정하고, 발현수준을 이를 정량화한 결과이다.
도 4a는 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 농도별(50, 100 μM)로 처리한 후 근거리분비 인자로써 성장인자인 BDNF, VEGF, IGF-1 및 HGF의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 4b는 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 농도별(50, 100 μM)로 처리한 후 근거리분비 인자로써 항산화 관련 인자인 HO-1, NQO1, GCLC 및 GCLM의 발현수준을 측정한 결과이다.
도 5a는 치매 마우스 모델의 뇌실로 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 각각 투여하고 일주일 후 얻어진 뇌조직 절편에 대하여 아밀로이드 베타 항체(항-6E10)를 이용해 면역염색을 실시하고 이를 정량화한 결과이다.
도 5b는 상기 도 5a와 동일한 방법으로 치매 마우스 모델에 각 중간엽 줄기세포를 투여한 후 뇌조직을 균질화하여 얻어진 각 soluble fraction 및 insoluble fraction을 이용해 ELISA를 실시하여 아밀로이드 베타의 수준을 측정한 결과이다.
도 6은 상기 도 5a와 동일한 방법을 통해 얻어진 뇌조직 절편에 대하여 뇌염증 관련 항체(GFAP)를 이용해 면역염색을 실시하고, 이를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 상기 도 5b에서와 동일한 방법으로 치매 마우스 모델의 뇌실로 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 각각 투여하고 2주일 후 얻어진 뇌조직 샘플에 대하여 ELISA를 통해 트레오닌 181번 및 231번 잔기가 인산화된 타우 단백질의 수준을 각각 측정한 결과이다.
본 발명은, 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포의 효능 강화용 배지 조성물을 제공한다.
종래, 하기 화학구조를 갖는 에티오나마이드(2-ethylpyridine-4-carbothioamide)는 티오나마이드 계열의 항생제로써 세균에 의한 감염 질환 치료 용도가 알려져 있었으나, 본 발명에서는 에티오나마이드의 줄기세포 효능 강화 효과를 최초로 발견하였다.
[ethionamide]
Figure PCTKR2020009312-appb-I000001
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 에티오나마이드가 처리된 줄기세포의 효능 강화 효과를 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서는, 염증반응이 유도된 소교세포를 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 후 iNOS, NO 및 ROS의 수준을 측정한 결과, 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우 대조군 또는 에티오나마이드를 미처리한 경우에 비해 상기 인자들의 발현이 더욱 감소된 것으로 나타났으며, 이를 통해 에티오나마이드 처리에 의해 중간엽 줄기세포에 의한 항염증 효과가 향상된 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 염증반응이 유도된 소교세포를 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 후 염증성 사이토카인인 IL-6 및 TNF-α의 발현수준을 측정한 결과, 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우 대조군 또는 에티오나마이드를 미처리한 경우에 비해 염증성 사이토카인의 발현 저해 효과가 향상된 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 염증반응이 유도된 소교세포를 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 후 NF-κB의 활성을 측정한 결과, 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우 대조군 또는 에티오나마이드를 미처리한 경우에 비해 NF-κB 활성 저해효과가 더욱 향상된 것을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 농도별로 처리하고 다양한 성장인자 및 항산화 인자들의 분비량을 측정한 결과, 에티오나마이드의 처리농도에 비례하게 상기 근거리분비 인자들의 발현량이 증가한 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, in vivo 수준에서 에티오나마이드가 처리된 줄기세포의 효과를 확인하였다. 구체적으로, 치매 마우스 모델의 뇌실에 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포를 투여하고 뇌조직을 적출하여 면역염색 또는 ELISA 분석을 실시한 결과 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포에 의한 아밀로이드 베타, 뇌염증 및 인산화된 타우 단백질의 유의미한 감소효과를 확인하였다(실시예 7 내지 9 참조).
이에, 상기 결과들은 에티오나마이드 처리를 통해 인간 중간엽 줄기세포의 효능을 더욱 향상시킬 수 있음을 보여주는 것이다.
본 발명에서 배지에 포함되는 에티오나마이드의 농도에 제한은 없으나, 바람직하게는 1~200 uM의 농도, 보다 바람직하게는 50~200 uM로 포함될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50~150 uM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “줄기세포”란 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 성체로부터 유래된 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막 상피세포일 수 있고, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나 이에 한정되지 않으며, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양은 당업자에게 자명한 방법으로 수행될 수 있으며, 중간엽 줄기세포 특성의 변화 없이 줄기세포능을 유지하면서 증식시킬 수 있는 방법이라면 방법에 제한은 없다.
본 발명에서 줄기세포의 효능 강화란, 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환에 대한 줄기세포의 치료적 특성 및 효과가 향상되는 것을 의미하며, 보다 구체적으로 산화질소, 이의 관련인자 또는 활성산소종 발생 억제, 염증성 사이토카인 발현 억제 및 NF-κB 활성 감소 등을 통한 항산화 및 항염증 효과; 및 성장인자 및 항산화인자 등의 근거리분비 인자의 발현 효능이 향상되는 것을 의미한다.
상기 근거리분비 인자는 보다 구체적으로, 뇌유래신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial cell growth factor; VEGF), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor-1; IGF-1), 간세포성장인자(hepatocyte Growth Factor; HGF), 헴 산화효소-1(Heme oxygenase-1; HO-1), NAD(P)H:퀴논 산화환원효소(NAD(P)H:quinone oxidoreductase; NQO1), 글루타메이트-시스테인 리가아제 촉매소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit; GCLC) 및 글루타메이트-시스테인 리가아제 변형소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase modifier subunit; GCLM)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포의 효능 강화방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 효능이 강화된 줄기세포의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 효능이 강화된 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 항염증용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명세서 사용되는 용어, “염증성 질환(inflammatory disease)”이란 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 것으로, 보다 바람직하게 본 발명에 있어서 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 감염성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어, “퇴행성 뇌질환(degenerative brain disease)”이란 나이가 들어감에 따라 발생하는 퇴행성 질환 중 뇌에서 발생하는 질환으로, 보다 바람직하게 본 발명에 있어서 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 뇌졸중, 뇌경색, 피크(Pick)병, 두부외상, 척수손상, 뇌동맥 경화증, 루게릭병, 다발성 경화증, 노인성 우울증 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 상기 약학적 조성물은 에티오나마이드 처리에 의해 효능이 강화된 줄기세포를 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으나, 바람직하게는 뇌내 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다회 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 5 x 102 세포 내지 5 x 108 세포를 매일 또는 격일 투여하거나, 1회 내지 다회로 나누어 투여할 수 있다. 다회투여의 경우, 1주에서 1달 간격으로 다회투여 할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 염증성 질환 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인간 제대 중간엽 줄기세포의 준비
인간 제대 중간엽 줄기세포는 삼성서울병원의 IRB (IRB# 2015-09-023-003)에 의해 승인된 기준에 따라 탯줄을 확보한 후, 다음의 방법으로 중간엽 줄기세포를 분리하였다.
우선, 3-4 cm의 탯줄 조직을 잘게 자르고, 세포 외 기질을 분해하기 위해 콜라게나아제 용액(Gibco, USA)을 60-90분 동안 처리한 후, 0.25% 트립신(Gibco, USA)을 넣고 30분 동안 37℃에서 분해시켰다. 이후, 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)(Biowest, USA)을 넣고 1000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 얻은 후, 10% FBS와 50 ug/ml 젠타마이신(Gibco, USA)이 첨가된 MEM 배지(Minimum Essential Media) (Gibco, USA)를 이용하여 37℃, 5% CO2 환경에서 세포를 배양하여, passage 5 또는 6의 중간엽 줄기세포를 실험에 사용하였다.
실시예 2. 에티오나마이드 처리된 인간 제대 중간엽 줄기세포의 준비
상기 실시예 1의 방법에 따라 준비한 인간 제대 중간엽 줄기세포 cm2당 6 x 103 세포를 세포 배양용기에 분주하고, 이와 동시에 에티오나마이드를 50 μM 또는 100 μM 또는 150 μM 의 농도로 처리한 다음 72시간 동안 배양하였다.
실시예 3. 에티오나마이드 처리된 줄기세포의 항염증 효과 검증
중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리할 경우 상기 줄기세포의 항염증 효과가 향상되는지 여부를 검증하기 위해 하기와 같은 실험을 진행하였다. 구체적으로, 소교세포인 BV2 세포에 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 염증모델을 유도한 후, 에티오나마이드를 처리(primed)하거나 또는 처리하지 않은 중간엽 줄기세포(hMSCs)와 각각 공동 배양한 다음 산화질소(nitric oxide; NO), 산화질소 관련 인자 및 활성산소종의 발현수준을 측정하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이 대표적인 NO 관련 염증인자인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)의 경우 대조군 또는 에티오나마이드가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우에 비하여 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 함께 배양한 경우에서 유의미하게 mRNA의 발현이 감소한 것으로 나타났다 또한, NO 및 활성산소종(Reactive oxygen species; ROS)의 발현수준을 측정한 결과에서도 도 1b 및 도 1c에서 나타낸 바와 같이 대조군 또는 에티오나마이드 미처리 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우에 비해 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 함께 배양한 경우에서 발현수준이 유의미하게 감소된 것을 확인하였다. 상기 결과는 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리함으로써 상기 줄기세포의 항염증 효과가 증진된 것을 의미하는 것이다.
실시예 4. 에티오나마이드 처리된 줄기세포의 사이토카인 발현 저해 효과 검증
상기 실시예 1의 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 실시예 1에서와 동일한 염증모델을 유도한 후, 에티오나마이드를 처리(primed) 또는 미처리한 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 다음 대표적 염증성 사이토카인인 IL-6와 TNF-α의 발현수준을 측정하였다.
그 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이 대조군 또는 에티오나마이드가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우에 비하여 에티오나마이드가 처리된 줄기세포와 공동 배양한 경우에서 각각 IL-6 및 TNF-α mRNA의 발현이 다소 감소되었으며, IL-6의 경우에는 에티오나마이드의 처리 농도(100, 150 μM)에 비례하여 발현수준이 감소한 것으로 나타났다. 또한, 도 2b에 나타낸 바와 같이 ELISA를 통해 TNF-α 단백질 수준을 측정한 결과 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 군에서 단백질 수준이 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 상기 결과는 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리함으로써 상기 줄기세포의 염증성 사이토카인의 발현 저해 효과가 증진된 것을 의미하는 것이다.
실시예 5. 에티오나마이드 처리된 줄기세포의 NF-κB 활성 저해 효과 검증
NF-κB(Nuclear factor-κB)는 면역 세포에서 염증반응 기전에 관여하는 가장 중요한 전사인자로 알려져 있으며, 다양한 원인에 의한 비정상적인 NF-κB의 활성화는 퇴행성 뇌질환을 포함한 다양한 염증성 질환의 발병 기전으로 보고되어 있다. 따라서 상기 실시예 1 및 2의 결과를 바탕으로 에티오나마이드 처리가 중간엽 줄기세포에서 NF-κB의 활성 저해효과를 증진시킬 수 있는지 검증하고자 하였다. 이를 위해 상기 실시예 1 및 2와 동일하게 소교세포인 BV2에서 염증반응을 유도한 후 에티오나마이드가 처리 또는 미처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양하고 NF-κB의 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 대조군 또는 에티오나마이드가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우에 비해 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포와 공동 배양한 경우에서 에티오나마이드의 처리 농도(100, 150 μM)에 비례하게 NF-κB 단백질의 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 웨스턴 블롯에 대한 정량 결과를 통해 대조군에 비해 유의하게 발현이 감소된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리함으로써 상기 줄기세포에 의한 NF-κB 활성 저해 효과가 증진된 것을 의미하는 것이다.
실시예 6. 에티오나마이드 처리된 줄기세포의 근거리분비 인자 발현 증진 효과 검증
에티오나마이드 처리에 의해 중간엽 줄기세포의 근거리분비 인자의 발현수준이 변화되는지를 검증하기 위하여, 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 각각 50, 100 μM로 처리한 다음, 근거리분비 인자로 알려진 뇌유래신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial cell growth factor; VEGF), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor-1; IGF-1) 및 간세포성장인자(hepatocyte Growth Factor; HGF)의 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 에티오나마이드의 처리 농도에 비례하게 상기 근거리분비 성장인자들의 발현이 모두 증가한 것을 확인하였다.
다음으로, 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 상기와 동일한 방법으로 처리한 후, 항산화 관련 인자인 HO-1(Heme oxygenase-1), NQO1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase), GCLC(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit), 및 GCLM(Glutamate-cysteine ligase modifier subunit)의 mRNA 발현수준을 측정하였다. 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 대체로 에티오나마이드의 처리 농도에 비례하게 중간엽 줄기세포에서 HO-1, NQO1, GCLC, GCLM 유전자의 발현이 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다.
상기 결과들은 중간엽 줄기세포에 에티오나마이드를 처리함으로써 상기 줄기세포의 근거리분비 인자들의 발현이 증진된 것을 의미하는 것이다.
실시예 7. 치매 마우스 모델에서 에티오나마이드 처리된 줄기세포에 의한 아밀로이드 베타 감소효과 확인
본 발명자들은 에티오나마이드 처리된 중간엽 줄기세포가 실질적으로 퇴행성 뇌질환에 대한 치료효과가 있는지 여부를 알아보기 위해, 치매 마우스 모델을 이용하여 상기 중간엽 줄기세포의 투여에 따른 아밀로이드 베타의 수준 변화를 측정하였다.
구체적으로, 치매 마우스 모델에 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포(primed) 또는 처리되지 않은 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 상기 마우스의 뇌실로 투여하고 일주일 후에 뇌를 적출하였다. 적출한 뇌를 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정시킨 다음, 조직을 절단하여 얻은 조직 절편에 아밀로이드 베타에 대한 대표적 항체인 항-6E10을 처리하여 면역염색을 실시하고, 형광현미경을 통해 관찰하였다. 또한 형광 정도를 정량적으로 분석하여 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 대조군 또는 에티오나마이드가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포를 투여한 경우에 비해, 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포를 처리한 경우 아밀로이드 베타의 발현이 유의미하게 감소한 것으로 나타났다.
또한, 상기와 동일한 치매 마우스를 이용해 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포(primed) 또는 처리되지 않은 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 상기 마우스의 뇌실로 투여하고 일주일 후 뇌를 적출하였다. 이어서 적출한 뇌를 균질화(homogenization)하여 얻어진 샘플을 이용해 ELISA를 수행하여 아밀로이드 베타 단백질의 수준을 측정하였다. 이때, 상기 조직 샘플을 soluble fraction과 insoluble fraction으로 분리하여 각각 아밀로이드 베타 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 5b에서 볼 수 있는 바와 같이 대조군 또는 에티오나마이드가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포를 투여한 경우에 비해, 에티오나마이드를 처리한 중간엽 줄기세포를 처리한 경우 아밀로이드 베타의 발현이 유의미하게 감소한 것을 확인하였다.
상기 실험들을 통해 에티오나마이드가 처리된 줄기세포는 아밀로이드 베타를 감소시키는 효과가 있는 것을 알 수 있었으며, 이는 상기 줄기세포가 퇴행성 뇌질환의 병리현상을 감소시킴으로써 치료효과가 있음을 의미하는 것이다.
실시예 8. 치매 마우스 모델에서 에티오나마이드 처리된 줄기세포에 의한 뇌염증 감소효과 확인
상기 실시예 7의 결과에 근거하여, 치매 마우스 모델에서 에티오나마이드 처리된 줄기세포가 뇌염증을 감소시키는 효과가 있는지 여부를 조사하고자 하였다. 이를 위해, 상기 도 7에서와 동일한 방법으로, 치매 마우스 모델에 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포(primed) 또는 처리되지 않은 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 상기 마우스의 뇌실로 투여하고 일주일 후 뇌를 적출한 후 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 이후 뇌 조직을 절단하여 얻은 조직 절편에 뇌염증 관련 항체인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)를 처리하여 면역염색하고, 형광현미경으로 관찰하였으며 또한 형광 정도를 정량적으로 분석하여 비교하였다.
그 결과, 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이 야생형 마우스(WT)와 비교하여 아무 처리도 하지 않은 치매 마우스의 경우 GFAP의 발현이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 이에 반해, 에티오나마이드가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포 또는 에티오나마이드를 처리한 중간엽 줄기세포를 투여한 경우 GFAP의 발현이 감소한 것으로 나타났으며, 특히 에티오나마이드를 처리한 중간엽 줄기세포를 투여한 경우 더욱 높은 수준으로 GFAP의 발현이 감소하였다.
이러한 결과를 통해, 에티오나마이드가 처리된 줄기세포는 뇌염증을 감소시키는 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 9. 치매 마우스 모델에서 에티오나마이드 처리된 줄기세포에 의한 타우 감소효과 확인
나아가 본 발명자들은 상기 실시예 7 및 8의 결과를 바탕으로, 본 발명에 따른 에티오나마이드 처리된 줄기세포가 치매 마우스 모델에서 또 다른 병리적 현상인 타우(Tau) 단백질을 감소시키는 효과가 있는지 여부를 알아보고자 하였다. 구체적으로, 치매 마우스 모델에 에티오나마이드가 처리된 중간엽 줄기세포(primed) 또는 처리되지 않은 중간엽 줄기세포(hMSCs)를 상기 마우스의 뇌실로 투여하고 2주일 후 뇌를 적출하여 균질화시켰다. 이후 얻어진 뇌 조직 샘플을 이용하여 ELISA를 통해 타우 단백질의 발현수준을 측정하였다. 이때, 타우단백질의 트레오닌(threonine) 181번 및 231번 잔기가 인산화된 타우의 양을 각각 확인하였다.
분석 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 대조군 또는 에티오나마이드가 처리되지 않은 중간엽 줄기세포를 투여한 경우에 비해, 에티오나마이드를 처리한 중간엽 줄기세포를 처리한 경우 인산화된 타우의 발현이 유의미하게 감소된 것을 확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명에 따른 에티오나마이드는 줄기세포의 항염증 효과 및 근거리 분비능을 증진시키는 등 줄기세포의 효능을 강화시키고, 에티오나마이드가 처리된 줄기세포는 치매 모델에서 실질적인 병변 개선을 통한 치료효과를 나타내는 것을 확인하였는바, 에티오나마이드 및 상기 에티오나마이드가 처리된 다양한 효능이 강화된 줄기세포는 염증성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 치료제 개발을 비롯한 다양한 분야에서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (19)

  1. 에티오나마이드(ethionamide)를 포함하는, 줄기세포의 효능 강화용 배지 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 에티오나마이드는 배지에 1 내지 200 μM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 성체줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 효능 강화는 줄기세포에서 근거리분비 인자의 발현이 증진되는 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 근거리분비 인자는 뇌유래신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial cell growth factor; VEGF), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor-1; IGF-1), 간세포성장인자(hepatocyte Growth Factor; HGF), 헴 산화효소-1(Heme oxygenase-1; HO-1), NAD(P)H:퀴논 산화환원효소(NAD(P)H:quinone oxidoreductase; NQO1), 글루타메이트-시스테인 리가아제 촉매소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit; GCLC) 및 글루타메이트-시스테인 리가아제 변형소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase modifier subunit; GCLM)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
  7. 제1항의 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포의 효능 강화방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 효능 강화는 줄기세포에서 근거리분비 인자의 발현이 증진되는 것을 특징으로 하는, 효능 강화방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 근거리분비 인자는 뇌유래신경성장인자(brain-derived neurotrophic factor; BDNF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial cell growth factor; VEGF), 인슐린 유사 성장인자(insulin-like growth factor-1; IGF-1), 간세포성장인자(hepatocyte Growth Factor; HGF), 헴 산화효소-1(Heme oxygenase-1; HO-1), NAD(P)H:퀴논 산화환원효소(NAD(P)H:quinone oxidoreductase; NQO1), 글루타메이트-시스테인 리가아제 촉매소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit; GCLC) 및 글루타메이트-시스테인 리가아제 변형소단위체(Glutamate-Cysteine Ligase modifier subunit; GCLM)로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 효능 강화방법.
  10. 제1항의 배지 조성물에 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 효능이 강화된 줄기세포의 제조방법.
  11. 제10항의 방법에 의해 제조된, 효능이 강화된 줄기세포.
  12. 제11항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 피부염, 알레르기, 아토피, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 뇌졸중, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통 (fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 감염성 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  14. 제11항의 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 퇴행성 뇌질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 뇌졸중, 뇌경색, 피크(Pick)병, 두부외상, 척수손상, 뇌동맥 경화증, 루게릭병, 다발성 경화증, 노인성 우울증 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  16. 제11항에 따른 줄기세포를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료방법.
  17. 제11항에 따른 줄기세포의, 염증성 질환 예방 또는 치료용도.
  18. 제11항에 따른 줄기세포를 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료방법.
  19. 제11항에 따른 줄기세포의, 퇴행성 뇌질환 예방 또는 치료용도.
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