WO2021137641A1 - 면역계 신경교세포로의 분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도 - Google Patents

면역계 신경교세포로의 분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도 Download PDF

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WO2021137641A1
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김정범
이현아
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울산과학기술원
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    • C12N2506/08—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from cells of the nervous system

Definitions

  • compositions and methods for inducing direct cross-differentiation from somatic cells to neuroglia and to uses thereof.
  • the conventional method for differentiation of neuroglia using embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells is to establish embryonic stem cells by destroying embryos or after reprogramming from somatic cells to induced pluripotent stem cells. It could be produced only through differentiation into glial cells.
  • This conventional method may cause ethical problems in that it uses embryonic stem cells, and when using induced pluripotent stem cells, time and money costs and effort are required in the step of performing differentiation, and artificial differentiation of differentiation ability is easy to control. Therefore, there was a problem that the yield was low and inefficient.
  • the present inventors confirmed that direct cross-differentiation of somatic cells into glial cells can be effectively carried out by inducing ectopic expression by introducing a specific gene combination into somatic cells while conducting a study on a method for direct cross-differentiation from somatic cells to glial cells. , the present invention was completed.
  • Another object is to provide a method for direct cross-differentiation of somatic cells into glial cells in vitro using the composition.
  • Another object is to provide glial cells directly induced to cross-differentiation by the above method.
  • Another object is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases comprising the composition.
  • Another object is to provide a cell therapeutic agent for the prevention or treatment of immune diseases including the glial cells.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for screening drugs for preventing or treating immune diseases including the glial cells.
  • Another object is to provide a use of the composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating an immune disease.
  • one aspect is (1) PU.1 (Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) protein, RUNX1 (Runt-related transcription factor 1) protein and IRF8 (Interferon regulatory factor 8) protein at least one protein selected from the group consisting of; (2) a nucleic acid molecule encoding the protein; And (3) provides a composition for inducing direct cross-differentiation from somatic cells to glial cells (neuroglia), comprising at least one selected from the group consisting of vectors into which the nucleic acid molecule is introduced.
  • Direct Conversion refers to a process inducing conversion between mature (differentiated) cells having completely different cell types in higher organisms. Unlike the prior art in which somatic cells are reprogrammed into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) and redifferentiated to make them into desired cells, pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells It has a difference in that it induces conversion to the desired cell without going through the cell stage.
  • iPSCs Induced Pluripotent Stem Cells
  • pluripotent stem cells such as embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells It has a difference in that it induces conversion to the desired cell without going through the cell stage.
  • direct cross-differentiation is recognized for its use in disease modeling and new drug development, so it can be applied to gene therapy and regenerative medicine. known as technology.
  • composition for inducing direct cross-differentiation is (1) PU.1 (Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) protein, RUNX1 (Runt-related transcription factor 1) protein, and Interferon regulatory factor (IRF8) 8) at least one protein selected from the group consisting of proteins; (2) a nucleic acid molecule encoding the protein; and (3) at least one selected from the group consisting of vectors into which the nucleic acid molecule has been introduced.
  • PU.1 Single focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1
  • RUNX1 Raster-related transcription factor 1
  • IRF8 Interferon regulatory factor
  • the composition comprises at least one selected from the group consisting of a PU.1 protein, a nucleic acid molecule encoding the protein, and a vector into which the nucleic acid molecule is introduced; And it may include one or more proteins selected from the group consisting of RUNX1 and IRF8, one or more selected from the group consisting of a nucleic acid molecule encoding the protein, and a vector into which the nucleic acid molecule is introduced.
  • one selected from the group consisting of PU.1 (Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) protein, RUNX1 (Runt-related transcription factor 1) protein, and IRF8 (Interferon regulatory factor 8) protein Direct cross-differentiation into glial cells can be confirmed by introducing a vector containing a nucleic acid molecule encoding the above protein into a somatic cell.
  • vector is an expression vector capable of expressing a target protein in a host cell, and may refer to a gene delivery system comprising essential regulatory elements operably linked to express a gene insert.
  • the vector includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, an operator, a start codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and an enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose.
  • the promoter of the vector may be constitutive or inducible.
  • the expression vector contains a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, an origin of replication. Vectors can be self-replicating or integrated into host DNA.
  • the vector is a plasmid vector, a cosmid vector, a viral vector, a lentiviral vector, a retrovirus vector, a human immunodeficiency virus (HIV) vector, a Murineleukemia virus (MLV) vector, an Avian sarcoma/leukosis (ASLV) vector, SNV (Spleen necrosis virus) vector, RSV (Rous sarcoma virus) vector, MMTV (Mouse mammary tumor virus) vector, Adenovirus vector, Adeno-associated virus vector, Herpes simplex virus) may be one or more vectors selected from the group consisting of vectors and episomal vectors, but is not limited thereto.
  • a lentiviral vector may be used.
  • the PU.1 protein, RUNX1 protein, and IRF8 protein may include all PU.1 proteins, RUNX1 proteins and IRF8 proteins derived from mammals such as humans, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, and dogs.
  • the usable PU.1 protein, RUNX1 protein, or IRF8 protein is a protein having an amino acid sequence of their wild type, as well as one or more proteins selected from the group consisting of PU.1 protein, RUNX1 protein and IRF8 protein. variants (eg, subtypes of each protein).
  • the PU.1 protein, RUNX1 protein or a variant of the IRF8 protein refers to one or more amino acid residues in the native amino acid sequence of the PU.1 protein, RUNX1 protein or IRF8 protein by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. It refers to a protein having a sequence different from the native amino acid sequence while maintaining the intrinsic biological function of a wild-type protein.
  • the variant may be a functional equivalent that exhibits the same biological activity as a natural protein or a variant in which the physicochemical properties of the protein are modified as necessary, and may be a variant with increased structural stability to physical and chemical environments or with increased physiological activity have.
  • the PU.1 protein, the RUNX1 protein, the IRF8 protein, or a variant thereof may be isolated from nature, or may be recombinantly or synthetically produced (non-naturally occurring).
  • nucleic acid encoding the PU.1 protein, the RUNX1 protein or the IRF8 protein is a nucleotide sequence encoding the wild-type or mutant form of the PU.1 protein, the RUNX1 protein or the IRF8 protein, wherein one or more bases are substituted, It may be mutated by deletion, insertion, or a combination thereof, and may be isolated from nature or prepared using chemical synthesis.
  • the nucleic acid having the nucleotide sequence encoding the PU.1 protein, the RUNX1 protein and the IRF8 protein may be single-stranded or double-stranded, and may be a DNA molecule (genomic, cDNA) or RNA (mRNA) molecule.
  • matic cell may refer to all cells except germ cells, and may be derived from or isolated from mammals such as humans, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, and dogs.
  • the somatic cells include fibroblasts, epithelial cells, muscle cells, nerve cells, hair cells, hair follicles, hair follicle cells, oral epithelial cells, somatic cells extracted from urine, gastric mucosal cells, goblet cells, G cells, B cells, epidermal cells. It may be one or more selected from the group consisting of cells, astrocytes, blood cells, neural stem cells, hematopoietic stem cells, and mesenchymal stem cells, but is not limited thereto. In one embodiment, neural stem cells may be used.
  • glial cell is a cell supporting the tissues of the central nervous system as a cell that supplies substances necessary for nerve cells from the inside of the brain and spinal cord and creates a chemical environment suitable for the activity of nerve cells. It refers to a cell that is located between the nerve cell and supports the nerve cell, supplies nutrients, removes waste, and is responsible for phagocytosis.
  • the glial cells may be one or more selected from the group consisting of microglias, astrocytes, oligodendrocytes, and ependymal cells, but is not limited thereto. In one embodiment, it may be a microglia.
  • microglia is a glial cell of the central nervous system derived from the mesoderm, which has an elongated nucleus and twigs on the projections, which are responsible for the transport, destruction, and removal of substances in the tissue, and have amoebic phagocytosis. cells that do When activated by an external stimulus, they can differentiate into immunoreactive cells into M1 microglia or M2 microglia.
  • derived microglia and “iMG” may refer to microglia derived from a somatic cell, for example through direct cross-differentiation according to one aspect.
  • Another aspect is (1) one selected from the group consisting of PU.1 (Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) protein, RUNX1 (Runt-related transcription factor 1) protein and IRF8 (Interferon regulatory factor 8) protein more than one protein; (2) a nucleic acid molecule encoding the protein; and (3) contacting or inserting a composition comprising at least one selected from the group consisting of vectors into which the nucleic acid molecule has been introduced into somatic cells, providing a method for directly cross-differentiating somatic cells into glial cells in vitro do.
  • the direct cross-differentiation method comprises the steps of culturing somatic cells in a medium, transforming the cultured somatic cells with a vector into which a nucleic acid molecule encoding a protein for inducing cross-differentiation is directly inserted, and directly crossing the infected somatic cells. It may include culturing in culture conditions capable of inducing differentiation.
  • the nucleic acid molecule may be a combination of the following genes: PU.1; PU.1 and RUNX1; PU.1 and IRF8; or PU.1, RUNX1 and IRF8.
  • the medium used for culturing the somatic cells includes all media commonly used for culturing somatic cells in the art.
  • the medium used for culture generally contains a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component.
  • the culture conditions capable of inducing direct cross-differentiation of the somatic cells into glial cells may include a medium and/or conventional culture conditions conventionally used for inducing direct cross-differentiation to somatic cells in the art.
  • Ectopic expression of the direct cross-differentiation factors of PU.1, RUNX1 and IRF8 can be induced by introducing the composition for direct cross-differentiation into somatic cells.
  • Ectopic expression means that a gene is expressed outside the tissue or cell in which it is originally expressed, or expressed at a time different from the time at which it is originally expressed. According to the method of one aspect, glial cells can be effectively produced from somatic cells.
  • PU.1 Single focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1
  • RUNX1 Raster-related transcription factor 1
  • IRF8 Interferon regulatory factor 8
  • the glial cells induced by the composition or method according to an aspect may be characterized in that they express a glial cell-specific marker without expressing the derived original somatic cell-specific marker. Through this, it can be confirmed that the induced glial cells have characteristics unique to glial cells.
  • the induced glial cells may have cell proliferation and phagocytosis ability, and may be characterized by having the ability to differentiate into immune-reactive cells such as macrophages.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases comprising the composition as an active ingredient.
  • the glial cells prepared according to one aspect play an essential role in the immune system, and thus may be applied to the prevention or treatment of diseases caused by immune diseases.
  • prevention refers to any action that prevents the disease by eliminating the etiology or early detection of the disease.
  • treatment refers to any action in which symptoms caused by an immune disease are improved or changed advantageously.
  • the immune disease that can be prevented or treated may be, for example, one or more selected from the group consisting of autoimmune disease, transplant rejection, arthritis, graft-versus-host disease, bacterial infection, sepsis and inflammation, and the immune disease is specifically, for example, Crohn's disease, erythematosus, atopy, rheumatoid arthritis, Hashimoto's thyroiditis, pernicious anemia, Addison's disease, type 1 diabetes, lupus, chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, hypothyroidism, hyperthyroidism, scleroderma, Behcet's disease, inflammatory bowel disease, multiple Sclerosis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, myasthenia gravis, Meniere's syndrome, Guilian-Barre syndrome, Sjogren's syndrome, vitiligo, endometriosis, psoriasis, vitiligo, systemic scleroderma, asthma And it may be at least one
  • the pharmaceutical composition may further include one or more known active ingredients having an immune disease preventing or therapeutic effect together with the induced glial cells.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable additive, wherein the pharmaceutically acceptable additive includes, for example, starch, gelatinized starch, microcrystalline cellulose, lactose, povidone, colloidal silicon dioxide, calcium hydrogen phosphate, and lactose. , mannitol, syrup, gum arabic, pregelatinized starch, corn starch, powdered cellulose, hydroxypropyl cellulose, Opadry, sodium starch glycolate, carnauba wax, synthetic aluminum silicate, stearic acid, magnesium stearate, aluminum stearate, calcium stearate, Sucrose and the like may be used.
  • the pharmaceutically acceptable additive according to the present invention is preferably included in an amount of 0.1 to 90 parts by weight based on the pharmaceutical composition, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may be administered in various oral or parenteral formulations during actual clinical administration.
  • formulation commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, etc. are used. and suitable formulations known in the art are preferably those disclosed in the literature (Remington's Pharmaceutical Science, recently Mack Publishing Company, Easton PA).
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharides, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the condition and weight of the subject, the degree of disease, the drug form, the route and duration of administration, but may be appropriately selected by those skilled in the art.
  • one aspect of the direct cross-differentiation induced glial cells is, for example, about 1,000 to 10,000 cells/time, 1,000 to 100,000 cells/time, 1,000 to 10,000,000 based on an adult patient weighing 70 kg.
  • Cells/time, 1,000 ⁇ 10,000,000, 1,000 ⁇ 100,000,000 cells/time, 1,000 ⁇ 1,000,000,000 cells/time, 1,000 ⁇ 10,000,000,000 cells/time may be administered in divided doses once or several times a day at regular time intervals, or at regular time intervals Multiple doses may be administered.
  • the pharmaceutical composition may be administered to an individual by various routes. Any mode of administration can be envisaged, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular or subcutaneous injection.
  • subject refers to a subject in need of treatment for an immune disease, and more specifically, includes mammals such as human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses and cattle. it means.
  • the pharmaceutical composition may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy, and biological response modifiers for the prevention or treatment of immune diseases.
  • Another aspect provides a cell therapeutic agent for preventing or treating an immune disease comprising the glial cells induced by direct cross-differentiation as an active ingredient.
  • cell therapeutic agent refers to a therapeutic agent using autologous, allogenic, or xenogenic cells to restore the function of a tissue, and a therapeutic agent used for the prevention or treatment of immune diseases.
  • a therapeutic agent used for the prevention or treatment of immune diseases.
  • the direct cross-differentiation-induced glial cells are included as an active ingredient, they can be utilized as a cell therapy for the prevention or treatment of immune diseases.
  • the cell therapeutic agent may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be used by mixing, for example, saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, human serum albumin (HSA), and at least one of these components. and, if necessary, other conventional additives such as antioxidants, buffers and bacteriostats may be added.
  • the cell therapeutic agent may be additionally added with, for example, a diluent, a dispersing agent, a surfactant, a binder and a lubricant, and may be formulated in an injectable formulation such as an aqueous solution, suspension, emulsion, and the like.
  • compositions for drug screening for the prevention or treatment of an immune disease comprising glial cells induced directly cross-differentiation as an active ingredient.
  • the composition for screening a drug for the prevention or treatment of an immune disease is a method of confirming the reactivity of induced glial cells according to an aspect in the presence and absence of a therapeutic candidate substance for an immune disease. It can be usefully used to screen a therapeutic agent for an immune disease. .
  • the induced glial cells according to one aspect can be used to evaluate the toxicity or efficacy of a candidate substance as an important cell for the recovery or treatment of an immune disease.
  • the evaluation of the toxicity can be evaluated according to a method for judging toxicity in the art, such as IC 50 of induced glial cells in the presence and absence of a therapeutic candidate or according to an aspect.
  • the evaluation of the drug efficacy in the presence and absence of a therapeutic candidate material according to one aspect induced glial cells are damaged immune cells regeneration, or differentiation ability into immune cells such as macrophages and dendritic cells (dendritic cells). It can be evaluated according to a method that can be confirmed to be effective in the treatment of immune diseases in the art, such as promoting
  • compositions for the manufacture of a medicament for preventing or treating an immune disease.
  • Another aspect provides a method for preventing or treating an immune disease, comprising administering the pharmaceutical composition or the cell therapeutic agent to a subject in a therapeutically effective amount.
  • the direct cross-differentiation-inducing factor expression is used to efficiently differentiate into glial cells from somatic cells without going through the pluripotency stage of induced pluripotent stem cells. can induce, it is possible to effectively prevent and treat immune diseases.
  • the induced glial cells prepared by the direct cross-differentiation induction method according to another aspect have the ability to self-renew and differentiate into immune cells such as macrophages and dendritic cells, patient-specific immune cells It is possible to exclude immune rejection reactions, so it can be widely used in the field of immune disease treatment.
  • 1 is a result confirming the histological morphology of microglia generated in the process of inducing microglia by direct cross-differentiation from neural stem cells according to an aspect.
  • 3 is a result of confirming the gene expression pattern by performing RT-PCR on the induced microglia according to an aspect.
  • FIG. 6 is a result of confirming the cell shape change ( FIG. 6a ) and the change in the amount of gene expression related to the immune response ( FIG. 6b ) after activating the induced microglia according to an aspect.
  • Transcription factors (PU.1, RUNX1 and IRF8) were amplified by polymerase chain reaction (PCR) using cDNA of HepG2. Thereafter, the amplified transcription factor was introduced into a lentiviral vector and confirmed by nucleotide sequence analysis.
  • X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent (Roche, 06365787001) was used to prepare lentiviral transfer plasmid, packaging plasmid (psPAX2) and envelope plasmid (VSV-G). It was carried out by adding each in a ratio of 3 to 2 to 1.
  • 293T cells (Thermo Fisher Scientific) at 50% confluency were treated with a mixture of DMEM (Gibco, 10313-021) to a total volume of 200 ⁇ l and transformed for 48 hours. Thereafter, the cell culture medium was centrifuged at 80,000 g in an ultracentrifuge for 1 hour and 30 minutes, and then the lentivirus pellet obtained from the centrifuged supernatant was diluted in 1 ml of DMEM.
  • DMEM Gibco, 10313-021
  • the cells were incubated with the primary antibody at room temperature for 1 hour, and then washed three times with DPBS containing 0.05% Tween-20 (Sigma, P7949). Then, the secondary fluorescent antibody was treated and incubated in the dark for 1 hour. If double staining is required, an additional blocking step was performed for 30 minutes before treatment with the primary antibody according to the above procedure.
  • RNA without DNA was extracted using RNeasy mini kit (Qiagen).
  • cDNA was synthesized with SuperScript®III reverse transcriptase (Invitrogen) using a total of 500 ng of RNA per reaction.
  • the synthesized cDNA was used as a template using LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix (Roche) in a total volume of 20ul, and RT-PCR was performed for 35 cycles using Taq DNA polymerase recombinant (Invitrogen).
  • the experiment was repeated three times, and normalization was performed with the housekeeping gene GAPDH. Gene expression was measured by the Ct value calculation method, and all experiments were performed according to the manufacturer's protocol.
  • neural stem cells were aliquoted into 1 ⁇ 10 4 cells on a 6-well plate, and 24 hours later, in a medium containing 6 ⁇ g/ml protamine sulfate prepared in Example 1
  • the transcription factor PU.1; PU.1 and RUNX1; PU.1 and IRF8; A combination of PU.1, RUNX1 and IRF8 was transformed into neural stem cells.
  • the virus supernatant was removed and the culture medium was replaced with microglia differentiation.
  • the induced microglia population was mechanically separated, and the induced microglia were picked and subcultured on a gelatin-coated plate.
  • the histological morphology of microglia generated during the above experiment is shown in FIG. 1 .
  • cell aggregates were formed about 7 days after transformation with lentivirus, and it was confirmed that a typical microglia morphology appeared on the 7th day after three-dimensional culture. In particular, it was confirmed that the microglia induced by the above process showed a characteristic form that appears in actual microglia.
  • Example 2 To determine whether the microglia induced in Experimental Example 1 express microglia-specific markers IBA-1, CD11, CXCR3, CD45, P2RY12, TMEM119, immunocytochemical staining was performed by the method described in Example 2. Thus, the results are shown in FIG. 2 .
  • microglia derived from neural stem cells have the characteristics of microglia, and it was confirmed that microglia can be efficiently induced through the method disclosed in the above Example.
  • microglia-specific genes such as Fcrls, P2ry13, Mac1, P2ry12, Entpd1, CQ1, Csfr1, Pros1, Tmem119, Mertk, and Cx3cr1.
  • the cell culture medium is treated with green fluorescently-labeled latex beads, and whether the beads are introduced into the cytoplasm through phagocytosis. It was confirmed with a fluorescence microscope, and the results are shown in FIG. 4 .
  • the induced microglia have the ability to engulf foreign substances through the introduction of green beads into the cytoplasm of the induced microglia.
  • the induced microglia had cell proliferation ability by expressing Ki67, a cell proliferation marker.
  • Microglia are immune cells and are activated as M1 macrophages that cause an inflammatory response by foreign substances or pathogens or M2 macrophages that have anti-inflammatory action.
  • the cell morphology was observed, and the method described in Example 3 As a result, the expression level of immune response-related genes was confirmed through real-time RT-PCR analysis, and the results are shown in FIG. 6 .
  • the activated microglia exhibited a flat amoeba-shaped or rod-shaped cell form characteristic of phagocytic cells, and the expression of genes involved in inflammatory or anti-inflammatory activity was increased.

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Abstract

체세포로부터 신경교세포(neuroglia)로의 직접 교차분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 직접 교차분화 유도 인자 발현을 통해 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 신경교세포로의 분화를 유도할 수 있어, 면역 질환에 대한 효과적인 예방 또는 치료제로서 널리 활용될 것이다.

Description

면역계 신경교세포로의 분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도
체세포로부터 신경교세포(neuroglia)로의 직접 교차분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
기존의 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)를 이용한 신경교세포(neuroglia) 분화 방법은 배아를 파괴하여 배아 줄기세포를 확립하거나 체세포에서 유도 만능 줄기세포로 리프로그래밍(Reprogramming)한 후에 신경교세포로의 분화(Differentiation) 단계를 거쳐야 제작할 수 있었다. 이러한 종래의 방법은 배아 줄기세포를 이용한다는 점에서 윤리적 문제가 발생할 수 있으며, 유도 만능 줄기세포를 이용할 경우 분화를 수행하는 단계에 있어서 시간적, 금전적 비용과 노력이 소요되고, 인위적인 분화능의 조절이 용이하지 않으므로 수율이 낮아 비효율적이라는 문제점이 있었다. 또한, 시험관(in vitro) 수준에서 약물 대사와 독성 검증에 요구되는 충분한 수의 세포를 확보하기 어렵고, 신경교세포 기능 재생을 위한 세포 치료를 적용 단계에서 미분화세포로부터 유래한 기형종(teratoma)이 형성될 가능성이 높아 안전성의 문제점도 있었다.
상기와 같은 기형종 형성의 위험성을 없애기 위하여, 만능 줄기세포 상태를 통하지 않고 체세포를 다른 계통의 체세포로 또는 다분화능 줄기세포로 직접 교차분화(direct conversion)하기 위한 연구가 진행되고 있으나, 이러한 직접 교차분화 과정의 유도를 위해 사용된 유전자의 수가 너무 많아 자세한 기작을 규명하기 어렵기 때문에 현재까지 밝혀진 수준이 미미한 상태이다. 또한, 체세포로부터 특정 유전자 조합을 발현시켜 신경교세포를 제조하는 방법은 아직까지 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 체세포에서 신경교세포로의 직접 교차분화 방법에 관한 연구를 수행하던 중 특정 유전자 조합을 체세포에 도입하여 이소성 발현을 유도하면 효과적으로 체세포를 신경교세포로 직접 교차분화 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 체세포에 특정 유전자 조합의 도입 또는 특정 단백질 조합의 발현을 통하여 신경교세포(neuroglia)로의 직접 교차분화를 유도하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
다른 목적은, 상기 조성물을 이용하여 시험관 내에서 체세포를 신경교세포로 직접 교차분화하는 방법을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 직접 교차분화 유도된 신경교세포를 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 신경교세포를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 신경교세포를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 조성물을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 조성물의 용도를 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 면역 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 (1) PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 신경교세포(neuroglia)로의 직접 교차분화 유도용 조성물을 제공한다.
용어 "직접 교차분화(Direct Conversion)"는 고등생물에서 전혀 다른 세포 타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정을 말한다. 이는 체세포를 유도 만능 줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍 하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 종래 기술과 달리, 배아 줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도 만능 줄기세포와 같은 만능 줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가지며, 현재 직접 교차분화는 질병 모델링과 신약 개발 등에 이용될 가능성을 인정받고 있어 유전자 치료 및 재생 의학 등에도 응용될 수 있는 기술로 알려져 있다.
일 양상에서 제공되는 직접 교차분화 유도용 조성물은 (1) PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질, 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 PU.1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상; 및 RUNX1 및 IRF8로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
일 구현예로, PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질, 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 체세포에 도입하여 신경교세포로 직접 교차분화되는 것을 확인할 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미할 수 있다.
상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
또한, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 1종 이상의 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
상기 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 및 IRF8 단백질은 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 및 IRF8 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 사용 가능한 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 또는 IRF8 단백질은 이들의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 및 IRF8 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 변이체(예컨대, 각 단백질의 아형(subtype)들)를 포함할 수 있다.
상기 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 또는 IRF8 단백질의 변이체란 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 또는 IRF8 단백질의 천연 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 천연 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지면서 천연(wild-type) 단백질의 고유의 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있고, 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
상기 PU.1 단백질, RUNX1 단백질, IRF8 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 분리되거나, 재조합적 또는 합성적으로 제조된(non-naturally occurring) 것 일 수 있다.
또한, 상기 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 또는 IRF8 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 또는 IRF8 단백질을 코딩하는 염기서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 PU.1 단백질, RUNX1 단백질 및 IRF8 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
용어 "체세포"는, 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 것 또는 분리된 것일 수 있다.
상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 신경 줄기세포, 조혈모 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 신경 줄기세포를 사용할 수 있다.
용어 "신경교세포(neuroglia)"는 중추 신경계의 조직을 지지하는 세포로 뇌와 척수의 내부에서 신경세포에 필요한 물질을 공급하고 신경세포의 활동에 적합한 화학적 환경을 조성하는 기능을 하는 세포로서, 혈관과 신경세포 사이에 위치하여 신경세포의 지지, 영양 공급, 노폐물 제거, 식세포 작용 등을 담당하는 세포를 의미한다.
상기 신경교세포는 소교세포(microglias), 별아교세포(astrocytes), 희돌기교세포(oligodendrocytes) 및 상의세포(ependymal cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 소교세포 일 수 있다.
용어 "소교세포(microglia)"는 중배엽에서 유래한 중추 신경 계통의 신경 아교 세포로서, 핵의 모양은 길쭉하고 돌기에 잔가지가 있는데 조직 안에서 물질의 운반, 파괴, 제거를 담당하고 아메바성으로 포식 작용을 하는 세포를 말한다. 외부 자극으로 활성화 되었을 때 M1 소교세포 또는 M2 소교세포로 면역 반응성을 띄는 세포로 분화 할 수 있다.
용어 "유도된 소교세포" 및 "iMG"은 예를 들어, 일 양상에 따른 직접 교차분화를 통하여 체세포로부터 유도된 소교세포를 의미할 수 있다.
다른 양상은 (1) PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 체세포를 신경교세포로 직접 교차분화하는 방법을 제공한다.
상기 직접 교차분화 방법은 체세포를 배지에서 배양하는 단계, 상기 배양한 체세포에 직접 교차분화 유도용 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 삽입한 벡터를 형질전환(transformation)시키는 단계, 및 상기 감염된 체세포를 직접 교차분화를 유도할 수 있는 배양조건에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 직접 교차분화 방법에서는 핵산 분자는 다음과 같은 유전자의 조합일 수 있다: PU.1; PU.1 및 RUNX1; PU.1 및 IRF8; 또는 PU.1, RUNX1 및 IRF8.
상기 체세포의 배양에 사용되는 배지는 당해 분야에서 체세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.
또한, 상기 체세포를 신경교세포로 직접 교차분화 유도할 수 있는 배양조건은 당해 분야에서 체세포에 대하여 직접 교차분화를 유도하는 데 통상적으로 사용되는 배지 및/또는 통상적인 배양 조건을 포함할 수 있다.
상기 직접 교차분화 유도용 조성물을 체세포에 도입하는 단계를 통하여, PU.1, RUNX1 및 IRF8의 직접 교차분화인자들의 이소성 발현(Ectopic expression)을 유도할 수 있다. 이소성 발현이란, 어떤 유전자가 원래 발현하는 조직이나 세포 외에서 발현하는 것, 또는 원래 발현하는 시기와 다른 시기에 발현하는 것을 의미한다. 일 양상의 방법에 따르면 체세포로부터 신경교세포가 효과적으로 제조될 수 있다.
또 다른 양상은, (1) PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 삽입시켜 직접 교차분화 유도된 신경교세포를 제공한다.
일 양상에 따른 조성물 또는 방법에 의하여 유도된 신경교세포는 유래된 본래 체세포 특이적 마커를 발현하지 않으면서 신경교세포 특이적 마커를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이를 통하여, 상기 유도된 신경교세포가 신경교세포 특유의 특성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있다.
또한, 상기 유도된 신경교세포는 세포 증식능 및 포식작용 능력이 있으며, 대식세포 등의 면역 반응성 세포로의 분화능이 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 양상에 따라 제조된 신경교세포는 면역계에서 필수적인 역할을 하므로 면역 질환으로 인한 질병의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다.
용어 "예방"은 면역 질환의 병인을 제거하거나 조기 발견하여 해당 질환을 막는 모든 행위를 의미한다.
용어 "치료"는 면역 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
예방 또는 치료가 가능한 상기 면역 질환은 예컨대 자가 면역 질환, 이식 거부, 관절염, 이식 편대 숙주병, 세균 감염, 패혈증 및 염증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 면역 질환은 구체적으로 예를 들면 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성 피로 증후군, 섬유근육통, 갑상선 기능 저하증, 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역계의 기능 저하, 소실, 및/또는 비정상적 기능에 의하여 야기되는 모든 질병 및/또는 병적 증상을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 유도된 신경교세포와 함께 면역 질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 예컨대 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 약학 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 예컨대 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위하여 일 양상의 직접 교차분화 유도된 신경교세포는 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육 또는 피하 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
용어 "개체"란 면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
상기 약학 조성물은 면역 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또 다른 양상은, 상기 직접 교차분화 시켜 유도된 신경교세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
용어 "세포 치료제"는 조직의 기능을 복원하기 위하여 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 이용한 치료제로, 면역 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 치료제를 의미한다. 상기 직접 교차분화 유도된 신경교세포를 유효성분으로 포함하면 면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포 치료제로 활용할 수 있다.
상기 세포 치료제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예컨대 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 세포 치료제는 예컨대 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가할 수 있으며, 예컨대 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다.
또 다른 양상은, 직접 교차분화 유도된 신경교세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 면역 질환의 예방 또는 치료 약물 스크리닝용 조성물을 면역 질환의 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 일 양상에 따른 유도된 신경교세포의 반응성을 확인하는 방법으로 면역 질환의 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 일 양상에 따른 유도된 신경교세포를 면역 질환의 회복 또는 치료에 중요한 세포로서 후보 물질에 대한 독성 또는 약효를 평가하는데 사용할 수 있다.
상기 독성의 평가는 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 또는 일 양상에 따른 유도된 신경교세포의 IC50 등 당업계에서 통상적으로 독성을 판단하는 방법에 따라 평가할 수 있다. 또한, 상기 약효의 평가는 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 일 양상에 따른 유도된 신경교세포가 손상된 면역 세포의 재생, 또는 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell)와 같은 면역 세포로의 분화능을 촉진하는 등 당업계에서 면역 질환의 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있는 방법에 따라 평가할 수 있다.
또 다른 양상은, 면역 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 양상은, 상기 약학 조성물 또는 상기 세포 치료제를 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 체세포로부터 신경교세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물을 이용하면 직접 교차분화 유도 인자 발현을 통해 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 신경교세포로의 분화를 유도할 수 있어, 면역 질환에 대한 효과적인 예방 및 치료가 가능하다.
또한, 다른 양상에 따른 직접 교차분화 유도 방법에 의하여 제조된 유도 신경교세포는 자가 재생능 및 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell)와 같은 면역 세포로의 분화능이 있으므로, 환자 특이적인 면역세포의 제작이 가능하여 면역 거부 반응을 배제할 수 있어 면역 질환 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 신경 줄기세포로부터 직접 교차분화하여 소교세포를 유도하는 과정에서 생성되는 소교세포의 조직학적 형태를 확인한 결과이다.
도 2는 일 양상에 따른 유도된 소교세포에 대하여 면역세포화학염색을 수행하여IBA-1, CD11b, CX3CR1, P2RY12, CD45, TMEM119의 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 3은 일 양상에 따른 유도된 소교세포에 대하여 RT-PCR을 수행하여, 유전자 발현 패턴을 확인한 결과이다.
도 4는 일 양상에 따른 유도된 소교세포의 포식작용 능력을 확인한 결과이다.
도 5는 일 양상에 따른 유도된 소교세포에 대하여 면역세포화학염색을 Ki-67 단백질 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 6은 일 양상에 따른 유도된 소교세포를 활성화시킨 후, 세포 모양 변형(도 6a)과 면역 반응에 관련된 유전자 발현량의 변화(도 6b)를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 클로닝 및 렌티바이러스 플라스미드의 패키징
전사 인자(PU.1, RUNX1 및 IRF8)를 HepG2의 cDNA를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다. 이후, 상기 증폭된 전사 인자를 렌티바이러스 벡터에 도입하고 염기 서열 분석으로 이를 확인하였다. 렌티바이러스의 패키징을 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent(Roche, 06365787001)를 사용하여 렌티바이러스 트랜스퍼 플라스미드(lentiviral transfer plasmid), 패키징 플라스미드(packaging plasmid, psPAX2) 및 엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid, VSV-G)를 각각 3 대 2 대 1 비율로 첨가하여 수행하였다. DMEM(Gibco, 10313-021)을 첨가하여 총 부피를 200 ㎕로 한 혼합물을 50% 컨플루언시(confluency) 상태의 293T 세포(Thermo Fisher Scientific)에 처리하여 48시간 동안 형질전환시켰다. 이후, 세포 배양 배지를 초원심분리기에서 1시간 30분 동안 80,000 g로 원심 분리하였으며, 이후 원심 분리된 상등액에서 수득한 렌티바이러스 펠렛을 1 ㎖의 DMEM에 희석하였다.
실시예 2. 면역세포화학염색
세포를 실온에서 10분 동안 4% 파라 포름 알데히드(Tech & Innovation, BPP-9004)로 고정시켰다. 고정된 세포를 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS, Corning, 21-031-CV)로 3번 세척하였다. 이후, 실온에서 10분 동안 0.1% Triton X-100(Sigma, T9284)을 포함한 DBPS를 처리하여 세포를 투과성으로 만들었다. DPBS로 3회 세척한 후, 4% FBS를 포함한 DPBS로 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 결합을 차단하였다. 세포를 실온에서 1차 항체와 함께 1시간 동안 배양한 후, 0.05% Tween-20(Sigma, P7949)을 포함하는 DPBS로 3회 세척하였다. 이후, 2차 형광 항체를 처리하고, 암소에서 1시간 동안 배양하였다. 이중 염색이 필요하면 상기의 절차에 따른 1차 항체를 처리하기 전 30분 동안 추가적인 차단(blocking) 단계를 수행하였다.
실시예 3. RT-PCR
DNA가 없는 전체 RNA를 RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용하여 추출하였다. 반응 당 총 500 ng의 RNA를 이용하여 SuperScript®III 역전사효소(Invitrogen)로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 총 부피 20ul로 LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix(Roche)을 이용하여 주형으로 사용하고, Taq DNA 중합효소 재조합체(Invitrogen)를 이용하여 35 사이클로 RT-PCR을 수행하였다. 면역 반응 관련 유전자에 대하여 실험은 3회 반복하여 실시하였고, 항존 유전자(housekeeping gene) GAPDH로 정상화하였다. 유전자 발현은 Ct값 계산 방법으로 측정하였으며, 모든 실험은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
실험예 1. 직접 교차분화 인자에 의한 유도 소교세포(induced microglia)의 제조
체세포로부터 소교세포를 직접 교차분화 하기 위하여, 신경 줄기세포를 6-웰 플레이트 위에 1 × 104 cells로 분주하고, 24시간 후에 6 ㎍/㎖의 프로타민 설페이트를 함유하는 배지에서 실시예 1에서 제조한 렌티바이러스 발현 시스템을 통하여 전사 인자인 PU.1; PU.1 및 RUNX1; PU.1 및 IRF8; PU.1, RUNX1 및 IRF8의 조합을 신경 줄기세포에 형질전환시켰다. 24시간 경과 후, 바이러스 상층액을 제거하고 배지를 소교세포 분화 교체하여 배양하였다. 이후, 유도된 소교세포 군집을 기계적으로 분리하고 젤라틴 코팅된 플레이트에서 유도 소교세포를 선별(picking) 및 계대배양(subculture) 하였다. 상기 실험 과정에서 생성되는 소교세포의 조직학적 형태를 도 1에 나타냈다.
도 1에 나타난 바와 같이, 렌티바이러스로 형질전환 이후 7일 정도에 세포 집합체가 형성되며, 이를 3차원 배양 시킨 후 7일째가 되면 전형적인 소교세포의 형태가 나타나는 것을 확인하였다. 특히, 상기와 같은 과정에 의하여 유도된 소교세포는 실제 소교세포에서 나타나는 특징적인 형태가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. 유도된 소교세포의 특징 확인
실험예 2.1. 면역세포화학염색
실험예 1에서 유도된 소교세포가 소교세포 특이적 마커인 IBA-1, CD11, CXCR3, CD45, P2RY12, TMEM119를 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 2에 기재된 방법으로 면역세포화학염색을 수행하여 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2에 나타난 바와 같이, 유도된 소교세포가 IBA-1, CD11, CXCR3, CD45, P2RY12, TMEM119를 모두 발현하는 것을 확인하였다.
따라서, 신경줄기세포로부터 유도된 소교세포는 소교세포의 특성을 가지는것을 확인하여, 상기 실시예에 개시된 방법을 통하면 효율적으로 소교세포를 유도할 수 있음을 확인하였다.
실험예 2.2. RT-PCR
실험예 1에서 유도된 소교세포의 유전자 발현 패턴을 확인하기 위하여, RT-PCR분석을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타난 바와 같이, 유도된 소교세포가 Fcrls, P2ry13, Mac1, P2ry12, Entpd1, CQ1, Csfr1, Pros1, Tmem119, Mertk, Cx3cr1와 같은 소교세포 특이적 유전자를 발현하는 것을 확인하였다.
실험예 3. 유도된 소교세포의 포식작용(phagocytosis) 능력 확인
실험예 1에서 유도된 소교세포가 면역 세포의 대표적인 특성인 포식작용 능력을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 세포 배양액에 녹색 형광 표지된 latex bead를 처리하고, 포식 작용을 통해 bead가 세포질에 유입되는지 여부를 형광현미경으로 확인하여 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 유도된 소교세포의 세포질 내로 녹색의 bead가 유입된 것을 통하여 유도된 소교세포가 외부 물질을 포식하는 능력이 있음을 확인하였다.
실험예 4. 유도된 소교세포의 자가재생(self-renewal) 특성 확인
실험예 1에서 유도된 소교세포가 자가재생 및 자가증식 특성을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 세포 증식 마커인 Ki67 단백질에 대해 실시예 2에 기재된 방법으로 면역세포화학염색을 수행하고 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타난 바와 같이, 유도된 소교세포는 세포 증식 마커인 Ki67를 발현하는 것을 통하여 유도된 소교세포가 세포 증식능이 있음을 확인하였다.
실험예 5. 유도된 소교세포의 면역 반응(immune response) 확인
소교세포는 면역세포로서, 외부물질이나 병원균에 의해 염증반응을 일으키는 M1 대식세포 또는 항염증 작용을 하는 M2 대식세포로 활성화 된다. 실험예 1에서 유도된 소교세포의 배양액에 면역 반응 유발 물질 LPS, IL-4, TGFb1를 각각 또는 조합으로 처리하여 유도된 소교세포를 활성화시킨 후, 세포 형태를 관찰하고, 실시예 3에 기재된 방법으로 면역 반응 관련 유전자의 발현 정도를 실시간 RT-PCR 분석을 통해 확인하여, 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타난 바와 같이, 활성화된 소교세포는 포식작용 세포의 특징인 납작한 아메바 모양 또는 막대기 모양의 세포 형태를 나타내고, 염증 작용 또는 항염증 작용에 관여하는 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

Claims (13)

  1. (1) PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질;
    (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
    (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 신경교세포(neuroglia)로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 신경교세포는 소교세포(microglias), 별아교세포(astrocytes), 희돌기교세포(oligodendrocytes) 및 상의세포(ependymal cells)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 신경교세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 PU.1 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상; 및
    RUNX1 및 IRF8로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 신경교세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 신경 줄기세포, 희소돌기아교 전구세포, 조혈모 줄기세포, 제대혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 신경교세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터인 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 신경교세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  6. (1) PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질;
    (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
    (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계를 포함하는, 시험관내에서 체세포를 신경교세포로 직접 교차분화하는 방법.
  7. (1) PU.1(Spleen focus forming virus proviral integration oncogene, SPI1; SFPI1) 단백질, RUNX1(Runt-related transcription factor 1) 단백질 및 IRF8(Interferon regulatory factor 8) 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질;
    (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
    (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 체세포에 접촉 또는 삽입시켜 직접 교차분화 유도된 신경교세포.
  8. 청구항 1의 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 면역 질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증, 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 청구항 7의 직접 교차분화 유도된 신경교세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 세포 치료제.
  11. 청구항 7의 직접 교차분화 유도된 신경교세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 조성물.
  12. 면역 질환을 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 청구항 1 내지 5 중 어느 하나의 청구항에 기재된 조성물의 용도.
  13. 청구항 8의 약학 조성물을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료 방법.
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