CN112384633A - 用于预测辅助生殖技术程序结果的方法和试剂盒 - Google Patents

用于预测辅助生殖技术程序结果的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人类繁殖领域，更具体地涉及人类繁殖障碍的情况。本发明提供了可靠和高度准确的方法，用于预测辅助生殖技术(ART)程序例如体外受精和胞浆内精子注射(ICSI)程序没有导致成功怀孕的几率。本发明还提供了用于预测辅助生殖技术(ART)程序(例如体外受精和胞浆内精子注射(ICSI)程序)将导致成功怀孕的几率的手段和方法。

Description

用于预测辅助生殖技术程序结果的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及人类繁殖领域，更具体地涉及人类繁殖障碍的情况。本发明提供了一种可靠且高度准确的方法，其用于预测辅助生殖技术(ART)程序(例如体外受精和胞浆内精子注射(ICSI)程序)不会导致成功怀孕的几率。本发明还提供了用于预测辅助生殖技术(ART)程序(例如体外受精和胞浆内精子注射(ICSI)程序)将导致成功怀孕的几率的手段和方法。
背景技术
低生育力影响了西方世界中10％至15％的夫妻。这种低生育力在半数情况下可以归结于与女性生殖系统有关的原因，20％至26％的情况归因于男性，而25％至30％的情况原因是未知的(Evers，JL，2002，Lancet(柳叶刀)360：151-159)。许多夫妻转而使用辅助生殖技术(ART)程序例如体外受精(IVF)或胞浆内精子注射(ICSI)来满足他们想要孩子的愿望。
这些技术的成功率约为每个启动周期25％(25％per started cycle)(Andersen，A.等，2007，Hum.Reprod.(人类生殖学)22：1513-1525)。如果可以提高成功率，其将会在情感和经济上带来巨大的益处。
而且，考虑到ART程序的个人和社会负担，需要在该程序的早期就识别出成功几率低的夫妇，以便可以向他们提供替代程序来实现其想要孩子的愿望。
因此，不仅为改善治疗，还为了决定在个案中是否继续进行治疗，就需要能够准确预测女性在IVF/ICSI后是否不会怀孕和活产的模型。
十多年来，已有可用的模型基于临床数据来预测活产的机率，这些临床数据包括年龄、先前失败的IVF尝试次数和不孕的可能原因(Templeton，W.等，1996，Lancet 348：1402-1406)。Nelson和Lawlor(Nelson，S.M.和Lawlor D.A.2011，PLOS Medicine(PLOS医学)8：1-10)基于超过14万名女性的数据研发了一种模型，其利用年龄和不孕原因、(要)使用的程序、卵子来源以及想要孩子的时间进行分层。Selman等(J.Assisted Reproductionand Genetics(辅助生殖与遗传学)24：395-399(2007))公开了与IVF/妊娠结果有关的乳酸杆菌和葡萄球菌的检测。EP 2742359B1描述了一种基于尿液或阴道样品中属于乳酸杆菌菌群的细菌和属于葡萄球菌种的细菌的相对量来预测受试对象怀孕成功或未成功的机率的方法。
尽管如此，仍然需要更好、更可靠和易于使用的方法来限制不必要的ART程序的次数并预测ART程序结果失败的几率。这将有助于降低医疗成本。此外，有愿望得到孩子的女性可以更早地寻求替代解决方案。
发明内容
本发明涉及一种预测辅助生殖技术(ART)程序不会导致怀孕的可能性的方法，其中，对在ART程序之前或期间取自雌性哺乳动物受试对象中的样品分析其中是否存在阴道加德纳菌IST1(Gardnerella vaginalis IST1)，并还分析下列参数中的至少一个：
a)乳酸杆菌(Lactobacillus species)的相对丰度，
b)詹氏乳酸杆菌(Lactobacillus jensenii)的相对丰度，
c)变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度，
并且其中如果样品包含阴道加德纳菌IST1并且至少适用以下之一，则结论是该受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高：
I.乳酸杆菌属的相对丰度低于在15％至25％之间选定的值，或者
II.詹氏乳酸杆菌的相对丰度高于在25％至45％之间选定的值，或者
III.变形菌门的相对丰度高于在18％至38％之间选定的值。
本发明还涉及用于执行根据本发明的方法的试剂盒，其包括用于检测阴道加德纳菌IST1 DNA的扩增产物的正向引物CTGGATCACCTCCTTTCTAWG(SEQ ID NO：1)和反向引物AGGCATCCRCCATGCGCCCT(SEQ ID NO：2)，其中，阴道加德纳菌IST1DNA的扩增产物的长度为428-430个核苷酸，并且其中W表示A或T且其中R表示A或G。
发明的详细描述
在本文中我们提供了一种预测辅助生殖技术(ART)程序不会导致怀孕的可能性的方法，其中，对在ART程序之前或期间取自雌性哺乳动物受试对象中的样品，分析其中是否存在阴道加德纳菌，并还分析下列参数中的至少一个：
a)乳酸杆菌的相对丰度，
b)詹氏乳酸杆菌的相对丰度，
c)变形菌门的相对丰度，
并且其中如果样品包含阴道加德纳菌IST1并且至少适用以下之一，则结论是，该受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高：
I.乳酸杆菌属的相对丰度低于在15％至25％之间选定的值，或者
II.詹氏乳酸杆菌的相对丰度高于在25％至45％之间选定的值，或者
III.变形菌门的相对丰度高于在18％至38％之间选定的值。
分别在15％至25％、25％至45％以及18％至38％之间选定的值通常也被称为截止值(cut-off value)或阈值。可以将其选定为使得该方法提供所需的特异性和灵敏性。本领域技术人员充分知晓确定合适值的要求和界限。
在如上所述的本发明的优选实施方案中，确定阴道加德纳菌的存在与否以及乳酸杆菌属的相对丰度、詹氏乳酸杆菌的相对丰度和变形菌门的相对丰度。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及如上所述的方法，其中阴道加德纳菌是阴道加德纳菌IST1。阴道加德纳菌IST1在本文中被定义为特定的加德纳菌种，其可以根据制造商提供的规程(IS-pro技术，IS-Diagnostics，阿姆斯特丹，荷兰)利用基因间隔区(IS)扩增通过进行阴道微生物种群分析来鉴定。IS-pro是一种基于对16S-23S rRNA基因IS区域的长度进行检测和分类的真细菌技术。该IS区域的长度对于每一微生物物种是特定的。阴道加德纳菌IST1在此被进一步定义为当使用根据SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物时，产生长度为428、429或430个核苷酸的特定IS片段的阴道加德纳菌。
本文使用的术语ART程序表示人工生殖技术。特别地，该术语涉及体外受精(IVF)，细胞质内精子注射(ICSI)和子宫内授精(IUI)。
术语相对丰度用于表示样品中细菌总量或总数的分数。该分数以百分比(％)或0至1之间的数字表示。
在本文中，关于预测ART程序成功或失败的机率的术语“可能性高”用来表示所预测的成功率或失败率高于在接受ART程序的一般女性人群中的值。尤其是，如果满足了本文所述的阴性预测的标准，则如果受试对象具有高于60％的几率，例如65％的几率不会由于ART程序而怀孕，则该不会怀孕的可能性被称为“增高”。在这方面，高于65％包括例如高于77％，例如88％或更高，或者甚至94％或更高。
而且，如果满足如本文所述的阳性预测的标准，则如果受试对象具有高于35％的机率由于ART程序而怀孕，则该怀孕的可能性增高。在这方面，高于35％意指41％、49％或甚至50％或更高。
加德纳菌为革兰氏染色可变的兼性厌氧菌中的一个属，阴道加德纳菌是其中唯一的种。这种微生物是很小(直径为1.0-1.5μm)的、不形成芽孢、无运动性的球杆菌。曾经被归类为阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)，随后又被归类为阴道棒状杆菌(Corynebacterium vaginalis)，阴道加德纳菌在巧克力琼脂上生长成小的、圆形、凸面状的灰色菌落；它也可以在HBT琼脂上生长。阴道加德纳菌的选择性培养基是黏菌素-恶喹酸血琼脂(colistin-oxolinic acid blood agar)。确定阴道加德纳菌是否存在优选通过PCR(例如定量PCR)来进行。
乳酸杆菌是革兰氏阳性、兼性厌氧或微需氧的、杆状、不形成芽孢的细菌中的一个属。它们是乳酸菌群的主要组成部分(即，它们将糖转化为乳酸)。在人体中，它们在许多身体部位(诸如消化系统、泌尿系统和生殖系统)构成了微生物群的重要组成部分。在欧洲血统的妇女中，乳酸杆菌属通常是阴道微生物群的主要组成部分。乳酸杆菌在阴道和肠道菌群中形成生物膜，使它们在恶劣的环境条件下能够持续存在并维持足够的种群。乳酸杆菌与人体之间呈现互利共生的关系，因为它可以保护宿主免受潜在的病原体侵袭，反过来，宿主提供营养来源。
术语乳酸杆菌在本文中用于统指所有乳酸杆菌菌种。
詹氏乳酸杆菌是健康妇女下生殖道的常见栖息菌(inhabitant)。在正常人群中，詹氏乳酸杆菌约占自然产生的阴道菌群中的23％。
变形菌门是细菌中的一个主要的门。它们是革兰氏阴性菌。这意味着它们不会在革兰氏染色规程中保留紫色染料。在革兰氏染色试验中，在结晶紫后添加复染色剂(通常为番红(safranin))，将所有革兰氏阴性菌染成粉红色。该测试本身可用于根据细菌细胞壁的结构差异对两种不同类型的细菌进行分类。
变形菌门包括广泛种类的病原体，诸如大肠埃希菌、沙门氏菌、弧菌、螺杆菌和许多其他著名的属。其他则是自由生活(free-living)的，并且包括许多负责固氮的细菌。该群体主要根据核糖体RNA(rRNA)序列来定义。
有多种确定这些微生物的方法，并且技术人员熟知如何确定和定量样品中加德纳菌、乳酸杆菌、詹氏乳酸杆菌和变形菌门的相对量的技术。我们在此提供了一项研究结果，其中，我们从进行ART程序的192名女性群体获得的样品中确定了这些细菌的存在及其相对量。
我们使这些微生物的存在和相对数量相关联，发现它们的存在与否和/或丰度指示了ART程序的成功率或失败率。
在192名女性中，有125名在第一次尝试后未怀孕，而67名怀孕了。即ART程序的失败率为65％，成功率为35％(表1和表2)。
在根据本发明的方法中，必须将特定种类或属的细菌的相对丰度与预定参考值或截止值进行比较。预定参考值可以是任何合适的截止值。确定合适的截止值的过程完全在技术人员的能力范围内，并且可以由技术人员根据经验容易地确定。
优选地，它是从可与测试种群相当的种群中获得的样品的细菌组成中得到的值。甚至更优选的是从在参考种群中的ART程序的若干次独立实验的平均值得到的参考值。技术人员知道确定用于测量和确定细菌的相对丰度的参考值的细节。
因此，可以凭经验确定或任意选定所述预定的参考值，以实现该方法的适当的特异性和/或灵敏度。技术人员充分知晓如何选择适当的参考值。技术人员将知道如何改变预定的参考值以获得本方法所需的特异性和灵敏度。
作为示例，在上述方法中，第一预定参考值可以在15％至25％之间，例如20％，第二预定参考值可以在25％至45％之间，例如35％，并且第三预定参考值可以在18％至38％之间，例如28％。
当将所述第一、第二和第三参考值分别选定为20％、35％和28％，并且将表1的数据与阴道细菌种群的微生物组成数据相结合时，发现可以正确预测125个未成功的ART结果中的32个，即可以正确预测ART程序失败的案例中的26％(表2)。
因此，如上所述的根据本发明的方法产生高度可靠的结果，即，它仅在两个案例中未能预测出ART程序的不成功结果。在这两个案例中，ART程序导致怀孕，这被认为是理想的结果，即成功的结果。因此，如上所述，预测受试对象不会怀孕的方法的精度为32/34＝94％(表5)。
表2：基于4个参数中至少一个的相关矩阵
Figure BDA0002859426610000051
如果将如上所述的根据本发明的方法用作本研究的排除标准，则本研究将排除34名女性，并且158名女性而不是192名女性可以进入该程序，其中65名女性怀孕了。这意味着在这种情况下，ART程序的成功率将从67/192＝35％提高到65/158＝41％。这将ART程序的相对效率提高了6％。另一个好处是，这三十四名女性在被提供替代方法之前将不必接受ART程序。
如果该选择方法被应用于如本文所述的研究中的当前人群，则将导致ART程序的数量减少34/192＝18％。诸如IVF或ICSI之类的ART程序的平均总费用约为5000欧元。总体而言，应用根据本发明的方法将为每位IVF/ICSI患者平均节省900欧元，或者换句话说，该程序的花费将减少18％。
我们还单独地基于是否存在阴道加德纳菌(诸如阴道加德纳菌IST、特别是阴道加德纳菌IST1)确定了该方法的预测值。结果表明带有阴道加德纳菌IST1的女性有88％的几率不会怀孕(表3，表5)。因此，如上所述的其中阴道加德纳菌为阴道加德纳菌IST1的方法产生了良好的结果。
表3：基于阴道加德纳菌IST1的相关矩阵
Figure BDA0002859426610000061
因此，本发明还涉及如上所述的方法，其中，确定样品中是否存在阴道加德纳菌、优选阴道加德纳菌IST例如阴道加德纳菌IST1，并且其中，如果样品包含阴道加德纳菌、优选阴道加德纳菌IST1，则受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高。
如上所述，此方法的准确性和其他特征甚至可以通过应用以下方法来进一步提高，其中测量下列参数中的至少一个：
a)乳酸杆菌的相对丰度
b)詹氏乳酸杆菌的相对丰度，
c)变形菌门的相对丰度，并且其中如果样品包含阴道加德纳菌IST1，并且至少适用以下之一，则结论是，受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高：
I.乳酸杆菌属的相对丰度低于在15％至25％之间选定的值，或者
II.詹氏乳酸杆菌的相对丰度高于在25％至45％之间选定的值，或者
III.变形菌门的相对丰度高于在18％至38％之间选定的值。
当应用这些标准时，可以正确预测更多的样本。
从表1的数据中可以得出，预计总共192个样本中有34个不会成功怀孕。这34个样本中的32个可以通过根据本发明的方法正确地预测(表1，表2)。在32个正确预测的样本中，有15个可归因于阴道加德纳菌IST1的存在(标准1)。如果将此标准与乳酸杆菌的相对丰度(标准2)应小于15％的标准相结合，则可以正确预测这32个样本中的另外7个样本。如果将标准1与詹氏乳酸杆菌的相对丰度(标准3)应高于25％的标准相结合，则可以正确预测这32个样本中的另外6个样本。如果将标准1与变形菌门的相对丰度(标准4)应高于18％的标准相结合，则可以正确预测这32个样本中的另外5个样本。这些标准的其他组合也得到对方法的改进。下面的表7根据所使用的标准提供了正确预测的数。如果使用所有4个标准，则所有32个样本被检测到。
表7：基于不同标准对不会怀孕的正确预测。
标准 正确预测不会怀孕
1 15/32
1+2 22/32
1+3 21/32
1+4 20/32
1+2+3 28/32
1+3+4 26/32
1+2+3+4 32/32
我们还使用ISPRO技术确定了所提供样品中是否存在两种乳酸杆菌菌种(L.crispatus和L.iners)(实施例4)。结果示于表4中。
卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)是健康女性下生殖道的常见栖息菌。在正常人群中，L.crispastus在全部育龄女性中超过30％的女性中是优势菌种。
惰性乳酸杆菌(Lactobacillus iners)也是乳酸杆菌中的一种。它是革兰氏阳性的、过氧化氢酶阴性、兼性厌氧的棒状细菌。惰性乳酸杆菌是健康女性下生殖道的常规栖息菌。已对至少15个菌株的基因组进行了测序，并且其编码1,152至1,506个蛋白。与其他菌种相比，该菌种具有最小的乳酸杆菌基因组之一，其它菌种例如L.crispastus，其通常编码两倍以上的蛋白质。
有许多确定这些微生物的方法，并且技术人员非常了解关于如何确定和定量样品中乳酸杆菌菌种L.crispatus和L.iners的相对量的技术。
我们发现这两个菌种(L.crispatus和L.iners)也指示了ART程序的失败或成功。
特别地，发现如果卷曲乳酸杆菌的相对丰度高于第四预定参考值，则受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高。该第四预定参考值优选地在50％与70％之间选择，例如60％。当采用60％作为第四参考值时，65名女性满足了该标准，其中有15名由于ART程序而怀孕(表6)。失败率是77％＝，高于整个组的失败率(表5)。
还发现，如果卷曲乳酸杆菌的相对丰度低于第五预定参考值，则受试对象由于ART程序而怀孕的可能性高。该第五预定参考值优选地在50％至70％之间选择，例如60％。当采用60％作为第五参考值时，有127名女性满足该标准，其中有52名因ART程序而怀孕(表6)。成功率是41％，高于整个组的成功率(表5)。这些结果示于表6和表5。
表6：基于L.crispatus的相关矩阵
Figure BDA0002859426610000071
Figure BDA0002859426610000081
我们还确定了惰性乳酸杆菌的相对丰度，并发现，如果惰性乳酸杆菌的相对丰度高于第六预定参考值，则该受试对象由于ART程序而怀孕的可能性高。该第六预定参考值优选地在50％至70％之间选择，例如60％。当采用60％作为第六参考值时，有38名女性满足了这一标准，其中有19名因ART程序而怀孕(表5)。成功率是50％，高于整个组的成功率(表5)。
因此，我们描述了一种预测辅助生殖技术(ART)程序不会导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，分析其中卷曲乳酸杆菌的相对丰度，并且其中，如果卷曲乳酸杆菌的相对丰度高于第四预定参考值，则受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高。
我们还描述了一种预测辅助生殖技术(ART)程序将导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，分析其中卷曲乳酸杆菌的相对丰度，并且其中，如果卷曲乳酸杆菌的相对丰度低于第五预定参考值，则该受试对象由于ART程序而怀孕的可能性高。
我们还描述了一种预测辅助生殖技术(ART)程序将导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，分析其中惰性乳酸杆菌的相对丰度，并且其中，如果惰性乳酸杆菌的相对丰度低于第六预定参考值，则受试对象由于ART程序而怀孕的可能性很高。
在本文中，我们还描述了一种预测辅助生殖技术(ART)程序将导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，分析其中是否存在卷曲乳酸杆菌和惰性乳酸杆菌，并且其中，确定L.crispatus[LC]和L.iners[LI]的相对量，并且其中，如果[LC]低于第七预定参考值并且其中
a.[LC}<(a*[LI])+b且
b.[LC}>(c*[LI])+d且
则怀孕的可能性增高，其中a是在-0.55至-0.70之间的值，b是在0.80至0.90之间的值，c是在-0.50至-0.65之间的值，并且其中d是在0.3至0.45之间的值。
在一个优选的实施方案中，a＝-0.62，b＝0.85，c＝-0.58且d＝0.38。在这种情况下，发现本文所述研究的192名女性中有77名符合标准，其中38名(49％)因ART程序而怀孕(表5)。这些结果以图形化的方式呈现在图1中。
当第四、第五、第六和第七预定参考值彼此独立地在50％至70％之间选择，尤其是60％时，获得了特别好的结果。
图例
图1：通过本文举例说明的方法之一获得的数据的散点图，其中如果[LC]低于60％，并且其中
[LC}<(a*[LI])+b，且其中
[LC}>(c*[LI])+d，且其中
a＝-0.62，
b＝0.85，
c＝-0.58且
d＝0.38，
则怀孕的可能性增高。
表5
Figure BDA0002859426610000091
实施例
实施例1：研究人群
在荷兰的八个IVF中心进行了这项对于低生育力的育龄女性阴道微生物组(microbiome)的前瞻性研究。参加的中心是：伊拉斯姆斯医学中心(Erasmus MedicalCentre(Rotterdam))，拉德堡德大学医疗中心(Radboud UMC(Nijmegen))，乌得勒支大学医学中心(UMC Utrecht(Utrecht))，阿姆斯特丹自由大学医疗中心(VU MC(Amsterdam))，兹沃勒市伊萨拉医院(Isala kliniek(Zwolle))，蒂尔堡圣伊丽莎白医院(Sint ElisabethZiekenhuis(Tilburg))，莱德多普生育医学中心(MC Kinderwens(Leiderdorp))，马斯特里赫特大学医学中心(MUMC+(Maastricht))。入组进行了将近一年的时间(2015年6月1日至2016年3月31日)。该方案已由伊拉斯姆斯大学医学中心的机构审查委员会(InstitutionalReview Board)批准。所有参与者均已获得知情同意书。
联系曾到生殖健康诊所门诊就诊以及希望在两个月内进行首次IVF(有或无ICSI)程序的女性参加本研究。要满足的标准是：年龄在20至44岁之间并且有男性伴侣的女性。那些被排除在研究之外的女性具有以下情况：因癌症或其他原因而有紧急IVF意向，子宫内膜异位症AFS III/IV并经促性腺激素释放激素(GnRH)类似物预处理，开始IVF或IVF-ICSI前3个月使用了激素避孕药(排除为了周期调节目的使用口服避孕药3周)，以及病史中有既往妊娠或流产。
在这项研究中，最初招募了301名女性。根据排除标准排除了21位患者，另有86位出于个人或未知原因退出研究。由于处理错误，丢失了两个样本，因此最终对来自192个人的样本进行了研究。
实施例2：材料
参与者在IVF或IVF-ICSI程序开始之前自行获得阴道拭子。选择自收集方法，因为它对患者的侵入性最小，因此适合在日常实践中使用。用FLOQSwabsTM(Copan ItaliaS.p.A.，意大利)采集阴道样品，并指示参与者将拭子插入阴道3-5厘米，然后沿阴道壁擦拭拭子10-15秒。在此步骤之后，将拭子立即放入装有还原转运液(RTF，reduced transportfluid)缓冲液的Eppendorf管中，该缓冲液从IS-Diagnostics(IS-Diagnostics，阿姆斯特丹，荷兰)获得。在分析之前，将样品储存在-20至-80℃的冰箱中。
将尿液样品收集在100ml的无菌尿液收集器中。将10ml样品以1500RCF离心10分钟。倒出上清液，并将沉淀重新悬浮在3ml尿液中。将重新悬浮的样品在-20摄氏度储存以进行进一步处理。
用干冰将样品从8个诊所运送到IS-Diagnostics的微生物实验室，在该实验室进行分析。
实施例3：DNA的分离
根据制造商的说明，使用口腔拭子提取试剂盒，利用Chemagen(Chemagen,Baesweiler，德国)自动DNA提取机从阴道拭子中提取DNA。首先将拭子解冻并进行涡旋。将200μl样品与200μl Chemagen裂解缓冲液和10μl蛋白酶K(Qiagen，Hilden，德国)在56摄氏度温育，同时以500rpm的速度摇动。使用口腔拭子分析规程(protocol buccal SwabPrefilling)提取DNA。以100μl的Chemagen洗脱缓冲液进行DNA的洗脱。
根据制造商的说明，使用口腔拭子提取试剂盒，利用Chemagen(Perkin-Elmer，Baesweiler，德国)自动DNA提取机从浓缩的尿液悬浮液中提取DNA。简而言之，将尿液样品解冻并涡旋。将200μl样品与200μl Chemagen裂解缓冲液和10μl蛋白酶K在56摄氏度温育，同时以500rpm的速度摇动。以100μl的Chemagen洗脱缓冲液进行DNA的洗脱。
实施例4：间隔区(IS)分析
根据制造商(IS-Diagnostics，阿姆斯特丹，荷兰)提供的方案，用IS-pro分析法进行基因间间隔(IS)区域(intergenic spaces(IS)regions)的扩增。IS-pro是一种基于对16S-23S rRNA基因IS区域的长度进行检测和分类的真细菌技术。该IS区域的长度对于每种微生物物种是特定的。使用门(Phylum)特异性的荧光标记的PCR引物进行分类学分类。
简而言之，该方法由两个单独的标准PCR组成：第一PCR混合物包含靶向不同的细菌群的两个不同的荧光标记的正向引物，以及为这些菌群提供通用的(universal)覆盖范围的三个反向引物。第一正向引物对厚壁菌门(phyla Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、梭杆菌门(Fusobacteria)和疣微菌门(Verrucomicrobia)(FAFV)具有特异性，而第二标记正向引物对拟杆菌门(phylum Bacteroidetes)具有特异性。利用带有标记的正向引物与七种反向引物结合的单独PCR对变形菌门(phylum Proteobacteria)具有特异性[Budding，E.等，J.Clin.Microbiol.(临床微生物学杂志)，(2016)54：934-943]。
GeneAmp 9700PCR系统(Applied Biosystems(应用生物系统)，FosterCity，CA)进行了该扩增。PCR后，将5μl PCR产物与20μl甲酰胺和0.2μl自定义大小的标记物(IS-Diagnostics)混合。在ABI Prism 3500遗传分析仪(Applied Biosystems)上进行DNA片段分析。使用IS-pro专有软件套件(IS-Diagnostics)分析数据，并将结果显示为微生物绘图(microbial profiles)。使用专用的IS-pro软件套件(IS-Diagnostics)进行了自动的IS-pro峰菌种调取(calling)，其中将峰关联到包含超过500种微生物的IS-profile信息的数据库。小于128相对荧光单位(RFU)的峰被视为背景噪声，并在进一步的分析中剔除。从DNA分离到分析数据的整个过程在5小时内完成。
实施例5：结果的测量
使用在首次胚胎移植(ET)之后的怀孕结果作为终点。持续妊娠被定义为在妊娠7-9周之间通过使用超声波确认胎儿具有心脏活动。
实施例6：阴道加德纳菌IST1的测定
阴道加德纳菌IST1是通过使用IS-pro技术进行阴道微生物种群分析而鉴定的。根据长度为428-430个核苷酸的特定IS片段的存在，检测到阴道葡萄球菌IST1。
实施例7：微生物组的测定
微生物组分析是利用如先前所述的IS-pro技术进行的[Automated Broad-RangeMolecular Detection of Bacteria in Clinical Samples(临床样品中细菌的自动广谱分子检测)，Budding AE，Hoogewerf M,Vandenbroucke-Grauls CM,Savelkoul PH..J ClinMicrobiol.，2016年4月；54(4)：934-43。doi：10.1128/JCM.02886-15。Epub 2016年1月13日；IS-pro：high-throughput molecular fingerprinting of the intestinalmicrobiota(肠道微生物群的高通量分子指纹图谱)，Budding AE,Grasman ME,Lin F,Bogaards JA,Soeltan-Kaersenhout DJ,Vandenbroucke-Grauls CM,van Bodegraven AA,Savelkoul PH.]。
表1：阴道菌群的微生物组成；预测ART程序失败的机率。
样品ID G.vaginalis 总乳酸杆菌 L.jensenii 总变形菌 预测 结果 处理
F34 34.93％ 0.00％ 0.00％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
B83 17.61％ 44.59％ 0.00％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
C1 4.03％ 80.36％ 80.36％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
H9 1.63％ 95.51％ 0.00％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
B59 0.00％ 15.42％ 0.00％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B17 5.05％ 70.82％ 4.38％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
H3 0.71％ 86.97％ 31.80％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
B13 0.00％ 94.44％ 87.81％ 0.89％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B15 0.00％ 0.42％ 0.00％ 4.72％ 未怀孕 未怀孕 IVF
F40 0.00％ 0.00％ 0.00％ 5.33％ 未怀孕 未怀孕 IVF
A18 0.52％ 1.38％ 0.00％ 5.42％ 未怀孕 未怀孕 IVF
C25 0.00％ 0.00％ 0.00％ 8.03％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B11 0.00％ 63.86％ 63.86％ 8.99％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F23 0.00％ 17.49％ 0.00％ 9.85％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B88 6.49％ 0.00％ 0.00％ 21.88％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F6 14.48％ 37.47％ 0.00％ 29.16％ 未怀孕 未怀孕 IVF
F16 0.00％ 62.27％ 0.00％ 36.91％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
H7 3.08％ 17.47％ 0.00％ 23.15％ 未怀孕 怀孕 IVF
A32 0.00％ 15.93％ 0.00％ 29.43％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B18 0.00％ 14.88％ 0.00％ 7.03％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B65 3.05％ 23.59％ 0.00％ 22.67％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
D3 0.54％ 34.58％ 0.00％ 1.30％ 未怀孕 怀孕 ICSI
C11 10.62％ 24.40％ 0.00％ 5.21％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
样品ID G.vaginalis 总乳酸杆菌 L.jensenii 总变形菌 预测 结果 处理
B54 0.51％ 31.39％ 0.00％ 6.92％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B45 0.00％ 37.63％ 0.00％ 29.62％ 未怀孕 未怀孕 IVF
A41 0.00％ 52.79％ 0.00％ 46.04％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
D2 0.00％ 98.29％ 54.36％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
C47 1.60％ 45.01％ 0.00％ 21.76％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
C10 0.00％ 99.61％ 49.94％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F28 0.00％ 93.98％ 40.79％ 6.02％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F32 3.12％ 76.89％ 0.00％ 2.54％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F10 0.00％ 59.16％ 0.00％ 40.36％ 未怀孕 未怀孕 IVF
E38 0.00％ 95.46％ 35.98％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B41 6.45％ 68.57％ 0.00％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
C4 0.00％ 80.13％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
G3 0.00％ 99.36％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
F33 0.00％ 76.12％ 1.08％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F42 0.00％ 77.08％ 12.17％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
E7 0.00％ 72.39％ 27.61％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
C3 0.00％ 98.29％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
B51 0.00％ 78.65％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E40 0.00％ 100.00％ 19.29％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E44 0.00％ 100.00％ 12.73％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
E47 0.00％ 97.84％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
B29 0.00％ 100.00％ 1.92％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B28 0.00％ 100.00％ 1.79％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B26 0.00％ 100.00％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D6 0.00％ 100.00％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
H5 0.00％ 95.46％ 3.11％ 0.94％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C20 0.00％ 58.17％ 4.18％ 1.19％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C32 0.00％ 93.91％ 0.00％ 3.03％ 怀孕 未怀孕 IVF
F12 0.00％ 89.56％ 0.00％ 3.33％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B67 0.00％ 93.28％ 0.00％ 3.65％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B71 0.00％ 95.30％ 3.84％ 4.70％ 怀孕 未怀孕 IVF
B63 0.00％ 95.09％ 0.00％ 4.91％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B90 0.00％ 94.80％ 0.00％ 5.20％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B49 0.00％ 94.75％ 0.00％ 5.25％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E57 0.00％ 91.98％ 0.00％ 5.81％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E8 0.00％ 93.62％ 0.00％ 6.38％ 怀孕 未怀孕 IVF
F38 0.00％ 80.94％ 0.00％ 6.60％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F15 0.00％ 92.32％ 0.00％ 7.04％ 怀孕 未怀孕 IVF
A15 0.00％ 91.16％ 0.00％ 8.84％ 怀孕 未怀孕 IVF
A22 0.00％ 76.68％ 0.00％ 9.37％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C53 0.00％ 90.59％ 9.00％ 9.41％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A21 0.00％ 65.89％ 0.00％ 9.53％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F13 0.00％ 90.41％ 0.00％ 9.59％ 怀孕 未怀孕 IVF
A19 0.00％ 89.78％ 1.05％ 10.22％ 怀孕 未怀孕 ICSI
样品ID G.vaginalis 总乳酸杆菌 L.jensenii 总变形菌 预测 结果 处理
A16 0.00％ 77.71％ 0.00％ 12.12％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C39 0.00％ 85.32％ 0.00％ 12.44％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F9 0.00％ 29.92％ 0.00％ 12.70％ 怀孕 未怀孕 IVF
D21 0.00％ 85.39％ 15.74％ 14.26％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F17 0.00％ 85.66％ 1.69％ 14.34％ 怀孕 未怀孕 IVF
A20 0.00％ 81.20％ 0.00％ 15.55％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A36 0.00％ 82.86％ 7.96％ 17.14％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D23 0.00％ 79.02％ 3.82％ 20.15％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F36 0.00％ 99.44％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B76 0.00％ 100.00％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 IVF
B30 0.00％ 65.88％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B40 0.00％ 28.77％ 24.53％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B37 0.00％ 77.53％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B6 0.00％ 96.10％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B72 0.00％ 87.70％ 32.73％ 0.79％ 怀孕 怀孕 ICSI
B64 0.00％ 99.21％ 0.00％ 0.79％ 怀孕 怀孕 ICSI
B84 0.00％ 70.61％ 14.28％ 0.80％ 怀孕 怀孕 ICSI
B3 0.00％ 99.19％ 28.33％ 0.81％ 怀孕 怀孕 IVF
C14 0.00％ 75.92％ 16.39％ 1.12％ 怀孕 怀孕 ICSI
F37 0.00％ 85.77％ 0.00％ 1.43％ 怀孕 怀孕 ICSI
C36 0.00％ 92.31％ 1.14％ 2.42％ 怀孕 怀孕 ICSI
C33 0.00％ 97.29％ 0.00％ 2.71％ 怀孕 怀孕 IVF
B44 0.00％ 91.38％ 0.00％ 2.87％ 怀孕 怀孕 ICSI
B12 0.00％ 96.88％ 0.00％ 3.12％ 怀孕 怀孕 IVF
A3 0.00％ 92.46％ 0.00％ 5.65％ 怀孕 怀孕 ICSI
A5 0.00％ 67.98％ 23.08％ 7.01％ 怀孕 怀孕 ICSI
A40 0.00％ 88.26％ 0.00％ 7.03％ 怀孕 怀孕 IVF
B53 0.00％ 74.76％ 0.00％ 7.77％ 怀孕 怀孕 ICSI
F26 0.00％ 61.78％ 0.00％ 8.36％ 怀孕 怀孕 IVF
A23 0.00％ 84.41％ 32.28％ 14.15％ 怀孕 怀孕 ICSI
A26 0.00％ 66.14％ 0.00％ 19.43％ 怀孕 怀孕 ICSI
F35 0.00％ 95.34％ 0.00％ 4.14％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B36 0.00％ 92.76％ 2.70％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B85 0.00％ 71.82％ 0.00％ 0.62％ 怀孕 怀孕 ICSI
A10 0.00％ 87.21％ 8.77％ 12.79％ 怀孕 未怀孕 IVF
B19 0.00％ 98.50％ 10.85％ 1.50％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C42 0.00％ 92.65％ 0.00％ 7.35％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E18 0.00％ 98.99％ 0.00％ 1.01％ 怀孕 未怀孕 IVF
A47 0.00％ 91.06％ 1.65％ 8.94％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B70 0.00％ 96.30％ 6.57％ 3.70％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E36 0.00％ 84.73％ 8.64％ 5.38％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F20 0.00％ 77.54％ 0.00％ 22.46％ 怀孕 怀孕 ICSI
F1 0.00％ 85.95％ 33.17％ 14.05％ 怀孕 怀孕 ICSI
H8 0.00％ 93.77％ 3.65％ 4.53％ 怀孕 未怀孕 IVF
样品ID G.vaginalis 总乳酸杆菌 L.jensenii 总变形菌 预测 结果 处理
C55 0.00％ 21.54％ 0.00％ 16.63％ 怀孕 怀孕 ICSI
F8 0.00％ 75.26％ 0.00％ 18.63％ 怀孕 怀孕 ICSI
B47 0.00％ 79.87％ 9.26％ 18.41％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C28 0.00％ 96.89％ 9.70％ 2.06％ 怀孕 怀孕 ICSI
B7 0.00％ 98.16％ 10.54％ 0.77％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B55 0.00％ 99.64％ 31.26％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
C18 0.00％ 98.72％ 1.22％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E32 0.00％ 93.00％ 7.61％ 0.00％ 怀孕 怀孕 IVF
A8 0.00％ 90.23％ 0.00％ 9.41％ 怀孕 未怀孕 IVF
F5 0.00％ 78.48％ 4.45％ 19.45％ 怀孕 怀孕 IVF
F11 0.00％ 67.61％ 0.00％ 27.32％ 怀孕 怀孕 ICSI
H6 0.00％ 97.93％ 6.39％ 0.93％ 怀孕 怀孕 IVF
B39 0.00％ 88.13％ 0.00％ 11.09％ 怀孕 怀孕 IVF
E59 0.00％ 81.37％ 4.64％ 9.61％ 怀孕 怀孕 IVF
G1 0.00％ 30.30％ 0.00％ 5.33％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E29 0.00％ 95.59％ 7.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A29 0.00％ 43.74％ 0.00％ 16.69％ 怀孕 怀孕 IVF
B27 0.00％ 99.52％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
B25 0.00％ 99.41％ 1.22％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C51 0.00％ 53.99％ 3.71％ 13.15％ 怀孕 怀孕 ICSI
E48 0.00％ 93.85％ 0.00％ 6.15％ 怀孕 怀孕 ICSI
C60 0.00％ 66.96％ 0.00％ 0.56％ 怀孕 怀孕 ICSI
D9 0.00％ 99.14％ 7.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E39 0.00％ 99.52％ 12.88％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
A42 0.00％ 47.33％ 0.48％ 27.49％ 怀孕 未怀孕 IVF
B4 0.00％ 94.75％ 0.00％ 2.23％ 怀孕 未怀孕 IVF
B10 0.00％ 74.81％ 5.17％ 3.21％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E49 0.00％ 93.07％ 13.74％ 6.93％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B61 0.00％ 43.79％ 0.00％ 16.35％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B20 0.00％ 98.72％ 0.00％ 0.81％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E19 0.00％ 97.20％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
F2 0.00％ 53.49％ 0.00％ 17.92％ 怀孕 未怀孕 IVF
A45 0.00％ 84.93％ 0.00％ 14.02％ 怀孕 未怀孕 IVF
F41 0.00％ 46.28％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
F31 0.00％ 92.91％ 11.40％ 6.48％ 怀孕 未怀孕 IVF
F21 0.00％ 94.22％ 0.00％ 5.78％ 怀孕 怀孕 ICSI
A4 0.00％ 86.95％ 5.54％ 8.72％ 怀孕 未怀孕 IVF
E50 0.00％ 95.47％ 2.79％ 4.53％ 怀孕 怀孕 ICSI
F39 0.00％ 96.02％ 0.55％ 3.55％ 怀孕 怀孕 ICSI
C13 0.00％ 91.98％ 2.47％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B14 0.00％ 97.03％ 1.84％ 1.31％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C21 0.00％ 100.00％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
F24 0.00％ 94.81％ 1.60％ 4.52％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C15 0.00％ 77.16％ 18.79％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
样品ID G.vaginalis 总乳酸杆菌 L.jensenii 总变形菌 预测 结果 处理
D22 0.00％ 89.97％ 0.00％ 10.03％ 怀孕 怀孕 IVF
C56 0.00％ 100.00％ 34.59％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
C38 0.00％ 86.50％ 20.08％ 11.42％ 怀孕 怀孕 ICSI
B69 0.00％ 95.88％ 28.43％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B78 0.00％ 92.96％ 0.00％ 4.72％ 怀孕 怀孕 ICSI
A24 0.00％ 84.77％ 13.68％ 13.93％ 怀孕 未怀孕 IVF
C40 0.00％ 87.50％ 0.00％ 12.50％ 怀孕 未怀孕 IVF
C43 0.00％ 88.19％ 14.75％ 11.41％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A2 0.00％ 80.15％ 7.53％ 19.07％ 怀孕 怀孕 ICSI
E52 0.00％ 88.93％ 0.00％ 7.08％ 怀孕 怀孕 ICSI
C31 0.00％ 98.89％ 24.03％ 1.11％ 怀孕 怀孕 ICSI
A25 0.00％ 97.50％ 22.55％ 1.39％ 怀孕 怀孕 IVF
C49 0.00％ 75.18％ 0.00％ 8.93％ 怀孕 怀孕 ICSI
B87 0.00％ 75.19％ 0.00％ 20.94％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D14 0.00％ 93.16％ 0.00％ 5.35％ 怀孕 未怀孕 IVF
B9 0.00％ 96.41％ 0.00％ 3.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
C30 0.00％ 96.07％ 0.00％ 1.94％ 怀孕 怀孕 ICSI
A13 0.00％ 85.00％ 4.65％ 12.89％ 怀孕 怀孕 IVF
F22 0.00％ 80.52％ 0.00％ 7.63％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D20 0.00％ 94.40％ 0.00％ 5.60％ 怀孕 未怀孕 IVF
A30 0.00％ 82.46％ 0.00％ 15.75％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A43 0.00％ 81.82％ 0.00％ 16.76％ 怀孕 怀孕 ICSI
F30 0.00％ 83.95％ 0.00％ 15.28％ 怀孕 未怀孕 IVF/ICSI
A14 0.00％ 84.41％ 0.00％ 10.73％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B38 0.00％ 88.61％ 0.00％ 10.61％ 怀孕 怀孕 IVF
A12 0.00％ 90.33％ 0.00％ 8.55％ 怀孕 未怀孕 IVF
D15 0.00％ 89.45％ 0.00％ 9.06％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A7 0.00％ 89.86％ 0.00％ 8.26％ 怀孕 怀孕 ICSI
F14 0.00％ 99.13％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F19 0.00％ 90.53％ 0.00％ 8.87％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B33 0.00％ 90.60％ 0.00％ 8.81％ 怀孕 未怀孕 IVF
C23 0.00％ 97.67％ 7.02％ 1.79％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B77 0.00％ 96.25％ 5.11％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B42 0.00％ 93.63％ 0.00％ 2.01％ 怀孕 怀孕 ICSI
B57 0.00％ 97.90％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 IVF
B24 0.00％ 96.73％ 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B5 0.00％ 96.86％ 0.00％ 1.46％ 怀孕 未怀孕 ICSI
表4：阴道菌群的微生物组成；预测ART程序失败的机率。
样品ID L.crispatus L.iners 预测 结果 处理
F20 58.91％ 18.63％ 怀孕 怀孕 ICSI
B39 58.24％ 29.89％ 怀孕 怀孕 IVF
样品ID L.crispatus L.iners 预测 结果 处理
E48 57.83％ 36.02％ 怀孕 怀孕 ICSI
E32 57.50％ 27.89％ 怀孕 怀孕 IVF
B85 57.46％ 2.51％ 怀孕 怀孕 ICSI
E19 52.87％ 44.33％ 怀孕 怀孕 ICSI
F8 52.73％ 22.53％ 怀孕 怀孕 ICSI
A23 52.13％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
C14 49.36％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
E59 46.47％ 30.27％ 怀孕 怀孕 IVF
F5 44.90％ 29.12％ 怀孕 怀孕 IVF
F39 42.43％ 53.04％ 怀孕 怀孕 ICSI
B55 42.17％ 26.20％ 怀孕 怀孕 ICSI
B72 40.99％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
E50 40.00％ 52.68％ 怀孕 怀孕 ICSI
F11 38.29％ 29.32％ 怀孕 怀孕 ICSI
C13 36.40％ 53.11％ 怀孕 怀孕 ICSI
F1 33.57％ 19.22％ 怀孕 怀孕 ICSI
A26 30.90％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
C60 30.73％ 36.24％ 怀孕 怀孕 ICSI
F26 23.83％ 0.00％ 怀孕 怀孕 IVF
A5 20.93％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B9 16.84％ 79.57％ 怀孕 怀孕 ICSI
C30 16.34％ 79.73％ 怀孕 怀孕 ICSI
E52 16.23％ 72.70％ 怀孕 怀孕 ICSI
C51 14.89％ 35.39％ 怀孕 怀孕 ICSI
B40 4.24％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B57 3.34％ 94.56％ 怀孕 怀孕 IVF
B30 2.77％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B84 0.55％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
F36 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 ICSI
B76 73.00％ 27.00％ 怀孕 怀孕 IVF
A40 0.00％ 0.00％ 怀孕 怀孕 IVF
C55 0.00％ 21.54％ 怀孕 怀孕 ICSI
A29 0.00％ 31.04％ 怀孕 怀孕 IVF
F41 0.00％ 46.28％ 怀孕 怀孕 ICSI
F21 0.00％ 50.96％ 怀孕 怀孕 ICSI
D22 0.00％ 65.08％ 怀孕 怀孕 IVF
C56 0.00％ 65.41％ 怀孕 怀孕 ICSI
C38 0.00％ 66.42％ 怀孕 怀孕 ICSI
B69 0.00％ 67.45％ 怀孕 怀孕 ICSI
B78 0.00％ 70.19％ 怀孕 怀孕 ICSI
A2 0.00％ 72.62％ 怀孕 怀孕 ICSI
C31 0.00％ 74.86％ 怀孕 怀孕 ICSI
A25 0.00％ 74.95％ 怀孕 怀孕 IVF
C49 0.00％ 75.18％ 怀孕 怀孕 ICSI
样品ID L.crispatus L.iners 预测 结果 处理
A13 0.00％ 80.34％ 怀孕 怀孕 IVF
A43 0.00％ 81.82％ 怀孕 怀孕 ICSI
B38 0.00％ 88.61％ 怀孕 怀孕 IVF
A7 0.00％ 89.86％ 怀孕 怀孕 ICSI
B77 0.00％ 91.14％ 怀孕 怀孕 ICSI
B42 0.00％ 93.63％ 怀孕 怀孕 ICSI
E29 58.01％ 30.58％ 怀孕 未怀孕 ICSI
E36 57.47％ 18.62％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B4 55.67％ 39.08％ 怀孕 未怀孕 IVF
D9 55.28％ 36.86％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B20 54.81％ 43.91％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C20 53.99％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B27 51.55％ 31.46％ 怀孕 未怀孕 IVF
E39 49.12％ 37.51％ 怀孕 未怀孕 IVF
B47 47.04％ 23.57％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C21 42.67％ 57.33％ 怀孕 未怀孕 IVF
B14 40.89％ 54.30％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A45 39.73％ 45.20％ 怀孕 未怀孕 IVF
E49 36.14％ 43.19％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F24 35.67％ 57.54％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F31 32.89％ 48.63％ 怀孕 未怀孕 IVF
A4 30.38％ 51.03％ 怀孕 未怀孕 IVF
B10 29.68％ 39.96％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D14 16.50％ 76.65％ 怀孕 未怀孕 IVF
C40 15.67％ 71.83％ 怀孕 未怀孕 IVF
D20 13.13％ 81.27％ 怀孕 未怀孕 IVF
A42 9.19％ 37.67％ 怀孕 未怀孕 IVF
F2 9.03％ 44.46％ 怀孕 未怀孕 IVF
A20 2.27％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C43 1.53％ 71.91％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A12 1.39％ 88.93％ 怀孕 未怀孕 IVF
A30 1.11％ 81.34％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C4 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
G3 82.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
F33 45.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F42 73.00％ 4.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
E7 62.00％ 10.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
E8 93.62％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
A22 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F9 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
G1 0.00％ 30.30％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B61 0.00％ 43.79％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C15 0.00％ 58.38％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A24 0.00％ 71.08％ 怀孕 未怀孕 IVF
样品ID L.crispatus L.iners 预测 结果 处理
B87 0.00％ 75.19％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F22 0.00％ 80.52％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F30 0.00％ 83.95％ 怀孕 未怀孕 IVF/ICSI
A14 0.00％ 84.41％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D15 0.00％ 89.45％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F14 0.00％ 90.12％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F19 0.00％ 90.53％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B33 0.00％ 90.60％ 怀孕 未怀孕 IVF
C23 0.00％ 90.65％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B24 0.00％ 96.73％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B5 0.00％ 96.86％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D3 10.82％ 23.76％ 怀孕 怀孕 ICSI
H7 4.06％ 13.42％ 怀孕 怀孕 IVF
H3 55.17％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
B17 36.44％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F32 19.15％ 57.74％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B59 15.42％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
A41 9.26％ 43.53％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B65 4.55％ 19.04％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B45 2.78％ 34.85％ 怀孕 未怀孕 IVF
B41 1.41％ 67.16％ 怀孕 未怀孕 IVF
A32 1.40％ 14.54％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F34 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
B83 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C1 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
H9 95.51％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
B13 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B15 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
F40 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
A18 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
C25 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B11 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F23 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B88 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F6 0.00％ 0.00％ 怀孕 未怀孕 IVF
B18 0.00％ 14.88％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C11 0.00％ 24.40％ 怀孕 未怀孕 ICSI
B54 0.00％ 31.39％ 怀孕 未怀孕 ICSI
D2 0.00％ 43.93％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C47 0.00％ 45.01％ 怀孕 未怀孕 ICSI
C10 0.00％ 49.67％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F28 0.00％ 53.18％ 怀孕 未怀孕 ICSI
F10 0.00％ 59.16％ 怀孕 未怀孕 IVF
E38 0.00％ 59.48％ 怀孕 未怀孕 ICSI
样品ID L.crispatus L.iners 预测 结果 处理
B64 99.21％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
C33 97.29％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 IVF
B12 96.88％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 IVF
B6 96.10％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
B44 91.38％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
C36 91.17％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
F37 85.77％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
B37 77.53％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
B53 74.76％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
B3 70.86％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 IVF
A3 69.20％ 0.00％ 未怀孕 怀孕 ICSI
C28 63.01％ 24.18％ 未怀孕 怀孕 ICSI
H6 61.85％ 29.68％ 未怀孕 怀孕 IVF
B26 100.00％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
D6 100.00％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
B28 98.21％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B29 98.08％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
E47 97.84％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
B63 95.09％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B49 94.75％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F35 93.59％ 1.74％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B67 93.28％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
H5 92.35％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F15 92.32％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
E57 91.98％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B71 91.45％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
A15 91.16％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
F13 90.41％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
F12 89.56％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
A19 88.73％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B36 88.02％ 2.04％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
E44 87.27％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
F17 83.96％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
B19 83.50％ 4.15％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
E18 81.59％ 17.40％ 未怀孕 未怀孕 IVF
F38 80.94％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
E40 80.71％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B51 78.65％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
A16 77.71％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
C32 77.60％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
C42 77.31％ 15.35％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B90 76.46％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
D23 75.21％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
C3 74.35％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 IVF
样品ID L.crispatus L.iners 预测 结果 处理
C39 72.78％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B70 71.92％ 17.81％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
A47 71.75％ 17.65％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
H8 70.75％ 19.37％ 未怀孕 未怀孕 IVF
C18 70.00％ 27.50％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
D21 69.64％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
A21 65.89％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
A36 65.38％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
B25 65.07％ 33.12％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
A10 63.73％ 2.71％ 未怀孕 未怀孕 IVF
B7 62.95％ 24.66％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
A8 62.17％ 28.05％ 未怀孕 未怀孕 IVF
C53 61.89％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
F16 62.27％ 0.00％ 未怀孕 未怀孕 ICSI
总之，本文提供的数据可得出以下结论或条款。
一种用于预测辅助生殖技术(ART)程序不会导致怀孕的可能性的方法，其中，对在ART程序之前或期间取自雌性哺乳动物受试对象中的样品，分析其下列参数中的至少一个：
阴道加德纳菌是否存在，
乳酸杆菌的相对丰度
詹氏乳酸杆菌的相对丰度，
变形菌门的相对丰度，并且
其中，
如果样品包含阴道加德纳菌或
如果乳酸杆菌的相对丰度低于第一预定参考值，或
如果詹氏乳酸杆菌的相对丰度高于第二预定参考值，或
如果变形菌门的相对丰度高于第三预定参考值，
则所述受试对象有高的可能性不会由于ART程序而怀孕。
如本文所述的方法，其中，确定样品中是否存在阴道加德纳菌，并且其中，如果样品包含阴道加德纳菌、优选阴道加德纳菌IST1，则受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高。
如本文所述的方法，其中，分析样品的下列参数：
乳酸杆菌的相对丰度，
詹氏乳酸杆菌的相对丰度，和
变形菌门的相对丰度
并且其中，如果乳酸杆菌的相对丰度低于第一预定参考值，和/或如果詹氏乳酸杆菌的相对丰度高于第二预定参考值，和/或如果变形菌门的丰度高于第三预定参考值，则受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高。
如本文所述的方法，其中，第一预定参考值在15％至25％之间，第二预定参考值在25％至45％之间，并且第三预定参考值在18％至38％之间。
如本文所述的方法，其中，第一预定参考值为20％，第二预定参考值为35％，并且第三预定参考值为28％。
如本文所述的方法，其中，通过定量聚合酶链式反应(PCR)确定是否存在阴道加德纳菌。
如本文所述的方法，其中，使用正向引物CTGGATCACCTCCTTTCTAWG和反向引物AGGCATCCRCCATGCGCCCT进行PCR，并且其中，检测到扩增产物的长度为428-430个核苷酸，并且其中W表示A或T且其中R表示A或G。
用于预测辅助生殖技术(ART)程序不会导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，确定样品中的卷曲乳酸杆菌的相对量，并且其中，如果卷曲乳酸杆菌的相对丰度高于第四预定参考值，则不会由于ART而怀孕的可能性增高。
用于预测辅助生殖技术(ART)程序会导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，确定样品中卷曲乳酸杆菌的相对量，并且其中，如果卷曲乳酸杆菌的相对丰度低于第五预定参考值，则由于ART而怀孕的可能性增高。
用于预测辅助生殖技术(ART)程序会导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，确定样品中惰性乳酸杆菌的相对量，并且其中，如果惰性乳酸杆菌的相对丰度高于第六预定参考值，则由于ART而怀孕的可能性增高。
用于预测辅助生殖技术(ART)程序会导致怀孕的可能性的方法，其中，在ART程序之前或期间从雌性哺乳动物受试对象采集样品，并且确定其中卷曲乳酸杆菌[LC]和惰性乳酸杆菌[LI]的相对量并表示为0至1之间的分数，并且其中，如果：
[LC]低于第七预定参考值，且
[LC}<(a*[LI])+b，且
[LC}>(c*[LI])+d，则怀孕的可能性提高，其中a是-0.55至–0.70之间的值，b是0.8至0.9之间的值，c是-0.50至-0.65之间的值，并且d是0.30至0.45之间的值。
如本文所述的方法，其中，a＝-0.62，b＝0.85，c＝-0.58，且d＝0.38。
如本文所述的方法，其中，第四、第五、第六或第七预定参考值彼此独立地在0.5至0.7之间。
如本文所述的方法，其中，第四、第五、第六或第七预定参考值为0.6。
用于执行本文所述方法的试剂盒，其包括用于检测阴道加德纳菌DNA的扩增产物的正向引物CTGGATCACCTCCTTTCTAWG和反向引物AGGCATCCRCCATGCGCCCT，其中，阴道加德纳菌DNA扩增产物的长度为428-430个核苷酸，并且其中W表示A或T且其中R表示A或G。
如本文所述的方法，其中，样品是阴道拭子，和/或其中，哺乳动物受试对象是人。
如本文所述的方法，其中，所述ART程序是体外受精(IVF)程序，例如胞质内精子注射(ICSI)程序。
Figure BDA0002859426610000241
序列表
<110> 阿尔特普瑞德有限公司
<120> 用于预测辅助生殖技术程序结果的方法和试剂盒
<130> 77768PC9
<160> 2
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 阴道加德纳菌
<400> 1
ctggatcacc tcctttctaw g 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 阴道加德纳菌
<400> 2
aggcatccrc catgcgccct 20

Claims (10)

1.一种预测辅助生殖技术(ART)程序不会导致怀孕的可能性的方法，其中，对在所述ART程序之前或期间取自雌性哺乳动物受试对象中的样品分析其中是否存在阴道加德纳菌IST1(Gardnerella vaginalisIST1)，并还分析下列参数中的至少一个：
a)乳酸杆菌(Lactobacillus species)的相对丰度，
b)詹氏乳酸杆菌(Lactobacillus jensenii)的相对丰度，
c)变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度，
并且其中如果所述样品包含阴道加德纳菌IST1并且至少适用以下之一，则结论是，所述受试对象不会由于ART程序而怀孕的可能性高：
I.乳酸杆菌的相对丰度低于在15％至25％之间的值，或者
II.詹氏乳酸杆菌的相对丰度高于在25％至45％之间的值，或者
III.变形菌门的相对丰度高于在18％至38％之间的值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，乳酸杆菌的相对丰度低于20％，或者詹氏乳酸杆菌的相对丰度高于35％，或者变形菌门的相对丰度高于28％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，通过定量聚合酶链式反应(PCR)确定是否存在阴道加德纳菌IST1。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，用正向引物CTGGATCACCTCCTTTCTAWG(SEQ ID NO：1)和反向引物AGGCATCCRCCATGCGCCCT(SEQ ID NO：2)进行所述PCR，并且其中，检测到扩增产物的长度为428-430个核苷酸，并且其中W表示A或T且其中R表示A或G。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述下列参数中的至少一个是所述参数中的至少两个或全部三个。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述样品是阴道拭子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物受试对象是人类。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述ART程序是体外受精(IVF)程序，例如胞浆内精子注射(ICSI)程序。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述样品是在所述IVF程序之前的两个月内采集的。
10.用于执行权利要求1至9中任一项所述的方法的试剂盒，其包含用于检测阴道加德纳菌IST1 DNA的扩增产物的正向引物CTGGATCACCTCCTTTCTAWG(SEQ ID NO：1)和反向引物AGGCATCCRCCATGCGCCCT(SEQ ID NO：2)，其中，所述阴道加德纳菌IST1 DNA的扩增产物的长度为428-430个核苷酸，并且其中W表示A或T且其中R表示A或G。
CN201980043008.7A 2018-05-22 2019-05-09 用于预测辅助生殖技术程序结果的方法和试剂盒 Pending CN112384633A (zh)

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