CN107236793A

CN107236793A - 一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量pcr引物、探针、试剂盒和检测方法

Info

Publication number: CN107236793A
Application number: CN201710399547.7A
Authority: CN
Inventors: 张亮; 马健; 周伟平; 李泌; 周香城; 王颀; 于海静; 王波
Original assignee: Guangdong Maternal and Child Health Hospital
Current assignee: Guangdong Maternal and Child Health Hospital
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2017-10-10
Anticipated expiration: 2037-05-31
Also published as: CN107236793B

Abstract

本发明公开了一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和检测方法。本发明针对棒状杆菌属细菌23S rRNA基因及克氏棒状杆菌16S rRNA基因序列，设计特异性引物和探针，利用多重荧光定量PCR，鉴定生物样本中是否存在棒状杆菌属细菌及克氏棒状杆菌感染，对临床的针对性选择抗生素使用具有重要指导作用，合理的抗生素使用可有效缩短肉芽肿性乳腺炎的病程、避免手术切除乳腺组织，极大减轻患者生理和心理创伤，对肉芽肿性乳腺炎的临床诊治提供病因学依据。

Description

一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和检测方法

技术领域：

本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术：

近年来在医院临床实践中，发现非哺乳期乳腺炎发病率逐渐增高，甚至超过哺乳期乳腺炎。肉芽肿性乳腺炎是一种重要的非哺乳期乳腺炎症疾病，临床表现为乳腺肿块、脓肿窦道或溃疡，病变迁延不愈，反复发作，容易误诊误治。肉芽肿性乳腺炎病因复杂，涉及局部创伤、自身免疫、细菌感染等因素。近年来国内、外越来越多的研究表明棒状杆菌属细菌感染在肉芽肿性乳腺炎病变发展过程中发挥重要作用。最近，本团队通过高通量测序技术进行细菌宏基因组测序，明确了棒状杆菌是我国肉芽肿性乳腺炎发病的主要致病菌。

棒状杆菌为一种革兰氏染色阳性杆菌，因菌体的一端或两端膨大呈棒状而得名。胞壁多糖主要是阿拉伯糖和半乳糖。与分枝杆菌属和放线菌属相似，有交叉反应，其归类于放线菌目棒状杆菌科。近年研究显示，该菌属的多数菌种可作为条件致病菌在宿主抵抗力降低时引起各类感染。克氏棒状杆菌是一种革兰阳性短小棒状杆菌。在普通培养基上难以生长，而在含Tween 80的血平板中生长良好。由于其亲脂生长的特点，又因女性乳腺组织中脂肪含量较高，故与临床上女性感染性乳腺炎有关。该菌不含分枝菌酸、无芽孢，过氧化氢酶和七叶甙反应阳性，对利福平和万古霉素敏感。

分离培养法是临床上最常用的细菌鉴定技术，一般将分离物无菌划盘接种于5％绵羊血琼脂平板，于35℃培养24-96小时。根据不同的培养特性，细菌/菌落的形态、革兰氏染色情况及生化特性(如借助美国Remel公司的RapID CB Plus System)等进行鉴别确认。由于棒状杆菌属细菌及克氏棒状杆菌属于难培养细菌，存在耗时长，准确性差，阳性率低的问题，无法满足临床诊治的需求。

荧光定量PCR是一种核酸分析技术，因其具有操作简单、快捷方便，价格低廉等优点，目前使用最广泛。设计特异性引物和探针可对靶标序列双重识别，特异性好、假阳性低。此外，该技术综合了PCR扩增技术、荧光标记及信号获取技术，具有很高的灵敏度，可检测数个拷贝。通过荧光信号的采集可以直接对产物进行定量，线性关系好、线性范围宽。由于扩增和检测在同一管内完成，无需开盖，不存在污染的问题。因此通过荧光定量PCR来检测棒状杆菌，具有准确、快速的优点，将为肉芽肿性乳腺炎的有效防治提供重要的技术支撑手段。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测引物、探针、试剂盒和检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：为了鉴别棒状杆菌属细菌，针对靶基因23S rRNA基因设计特异性引物和探针；为了鉴别克氏棒状杆菌种，针对靶基因16SrRNA基因设计特异性引物和探针。

通过查找美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(NCBI)网站上23S rRNA和16S rRNA基因的序列，并结合文献，分别设计棒状杆菌属细菌及克氏棒状杆菌的特异性引物和探针。

本发明的第一个目的是提供一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

针对棒状杆菌属细菌：23S rRNA-F：5’-TGATAGCTGGTTCTCCCCGAA-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，23S rRNA-R：5’-CGATCTGGGCTGTTTCCCT-3’(其核苷酸序列如SEQID NO.2所示)；

针对克氏棒状杆菌：16S rRNA-F：5’-AGAACCTTACCTGGGCTTGA-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)，16S rRNA-R：5’-CGCTCGTTGCGGGACTTA-3’(其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示)。

用上述检测引物对克氏棒状杆菌的基因组DNA进行多重荧光定量PCR扩增，能够同时扩增出上述2个基因序列的片段。设计这类引物是本领域技术人员能够轻易完成的，优选的，特异性引物可用常规的合成技术进行合成，本领域的技术人员能够理解的。

本发明的第二个目的是提供一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：

针对棒状杆菌属细菌：5’-GTCCCGCTMAACCAWCCAGT-3’(其核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示)，M代表A或C碱基，W代表A或T碱基；

针对克氏棒状杆菌：5’-ACTGGATGCGGCCAGA-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)；

探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，两探针的5’端标记的荧光报告基团是不同的荧光报告基团。

优选，所述的荧光报告基团为VIC、HEX或FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1或MGB。

所设计的特异性探针可用常规的合成技术进行合成，本领域的技术人员能够理解的。

所述的检测引物或检测探针，用于Taqman荧光定量PCR技术检测棒状杆菌属细菌及克氏棒状杆菌。

本发明的第三个目的是提供一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括2×Prmix Ex Taq、上述的检测引物和检测探针。

本发明的第四个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样品的基因组DNA作为模板，使用上述的检测引物和检测探针进行多重荧光定量PCR扩增，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团的荧光信号，读取并记录样品的PCR扩增循环次数Ct，根据各样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌。

所述的多重荧光定量PCR扩增的扩增反应体系优选为：20μL；模板DNA 1μL，2×Prmix Ex Taq 10μL，终浓度均为200nmol/L的上述的各检测引物，终浓度均为400nmol/L的上述的各检测探针，余量为ddH₂O。

所述的多重荧光定量PCR扩增程序优选为：60℃1分钟并收集荧光信号，95℃5分钟；95℃15秒，56℃20秒，65℃50秒并收集荧光信号，40个循环；最后60℃1分钟并收集荧光信号。

本发明的第五个目的是提供上述的检测引物和检测探针在检测棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌中的应用。

结果判断标准：如果针对棒状杆菌属细菌探针的荧光报告基团通道的多重荧光定量PCR扩增曲线曲线上升且Ct值小于40，则判断为棒状杆菌属细菌阳性，如果40<Ct<42，判断为可疑，可以加大模板量，重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为棒状杆菌属细菌阳性，否则为阴性，如果无Ct值或Ct>40，则判断为阴性。如果针对克氏棒状杆菌探针的荧光报告基团通道的多重荧光定量PCR扩增曲线曲线上升且Ct值小于40，则判断为克氏棒状杆菌阳性，如果40<Ct<42，判断为可疑，可以加大模板量，重复扩增，如果得到相同的实验结果，则判断为克氏棒状杆菌阳性，否则为阴性，如果无Ct值或Ct>40，则判断为阴性。

如果只有棒状杆菌属细菌阳性，克氏棒状杆菌阴性，则表明样品中含有棒状杆菌属细菌，但不是克氏棒状杆菌。如果棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌均为阳性，则表明样品中含有棒状杆菌属细菌，至少一种棒状杆菌属细菌为克氏棒状杆菌。如果棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌均为阴性，则表明样品中不含有棒状杆菌属细菌。

本发明针对棒状杆菌属细菌23S rRNA基因及克氏棒状杆菌16S rRNA基因序列，设计特异性引物和探针，利用多重荧光定量PCR，鉴定生物样本中是否存在棒状杆菌属细菌及克氏棒状杆菌感染，对临床的针对性选择抗生素使用具有重要指导作用，合理的抗生素使用可有效缩短肉芽肿性乳腺炎的病程、避免手术切除乳腺组织，极大减轻患者生理和心理创伤，对肉芽肿性乳腺炎的临床诊治提供病因学依据。

本发明的有益效果是：(1)阳性检测准确率高达100％，重复性好，没有假阳性；(2)通量高，一次可以对96个样本进行检测；(3)灵敏度高，每次检测的DNA用量仅需20ng；(4)检测所需时间短，从样本DNA提取到检测结果出来最快只需要4个小时；(5)价格优惠。

附图说明：

图1是克氏棒状杆菌和棒状杆菌属细菌双阳性的多重荧光定量PCR扩增曲线图。

图2是克氏棒状杆菌阴性和棒状杆菌属细菌阳性的多重荧光定量PCR扩增曲线图。

图3是阴性对照的多重荧光定量PCR扩增曲线图。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1、基因组DNA提取：

1.1试剂、耗材和仪器

1.1.1试剂和耗材：基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit,DP304-02；天根公司)含：缓冲液GA；裂解液GB；缓冲液GD；漂洗液PW；洗脱缓冲液TE；蛋白酶K(20mg/mL)；吸附住；收集管(2mL)；1.5mL无菌收集管，无水乙醇。

1.1.2仪器：Eppendorf 5430R离心机，恒温水浴锅(江苏金坛市环宇科技仪器)，振荡仪(大龙兴创公司)，Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)。

1.2待测人乳房脓液总DNA模板的准备

1.2.1用一次性拭子或一次性注射器采取患者乳房中脓液，使用天根公司的血液基因组DNA提取试剂盒(主要成分为：缓冲液GA；裂解液GB；缓冲液GD；漂洗液PW；洗脱缓冲液TE；蛋白酶K；吸附柱CB3；收集管；1.5mL无菌收集管)提取人乳房脓液总DNA为待测DNA模板，具体步骤如下：

①将200μL脓液转移至1.5mL离心管，加入20μL蛋白酶K溶液，混匀；

②加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃恒温加热10分钟，裂解细胞；

③加200μL无水乙醇，充分混匀15秒，简短离心，去除管盖内壁的水珠；

④将所得混合溶液转移到吸附柱CB3中，12000rpm离心30秒，倒掉离下的废液，将吸附柱CB3放回收集管；

⑤向吸附柱CB3内加500μL已经加入适量无水乙醇的缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉离下的废液，将吸附柱CB3放回收集管；

⑥向吸附柱CB3内加600μL已经加入适量无水乙醇的漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉离下的废液，将吸附柱CB3放回收集管；

⑦重复⑥；

⑧继续12000rpm离心2分钟，倒掉离下的废液，将吸附柱CB3放回收集管，彻底晾干吸附材料中的漂洗液；

⑨将吸附柱CB3转入一个干净的离心管，向吸附膜中间悬空滴加50μL的洗脱缓冲液TE，室温放置5分钟，12000rpm离心2分钟，将DNA溶液收集到离心管中。

1.2.2取2μL的DNA溶液，采用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计(美国Thermo公司)对提取的DNA浓度质量进行测定，将提取的基因组DNA模板稀释到20ng/μL。

2、荧光定量PCR：

荧光定量PCR反应包括PCR体系配制，扩增循环及信号收集3个步骤。

2.1仪器和耗材：荧光定量PCR仪(美国ABI公司，Applied Biosystems)，96孔板(香港帝恩公司)，粘性封口膜(美国Thermo公司)，Prmix Ex Taq(Probe qPCR)(大连Tak ara公司)。

2.2序列查找和引物探针设计：

通过查找美国国立卫生研究院国立医学图书馆生物信息技术中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(NCBI)网站上棒状杆菌属细菌23S rRNA基因(其核苷酸序列如SEQID NO.8所示)和克氏棒状杆菌16S rRNA基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)的序列，分别设计棒状杆菌属细菌及克氏棒状杆菌的引物和探针。

针对棒状杆菌属细菌的检测引物和检测探针：

检测引物：23S rRNA-F：5’-TGATAGCTGGTTCTCCCCGAA-3’(其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)，23S rRNA-R：5’-CGATCTGGGCTGTTTCCCT-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)；检测探针：5’-VIC-GTCCCGCTMAACCAWCCAGT-BHQ1-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，M代表A或C碱基，W代表A或T碱基。

针对克氏棒状杆菌的检测引物和检测探针：

检测引物：16S rRNA-F：5’-AGAACCTTACCTGGGCTTGA-3’(其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示)，16S rRNA-R：5’-CGCTCGTTGCGGGACTTA-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)；检测探针：5’-FAM-ACTGGATGCGGCCAGA-MGB-3’(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)。

2.3荧光定量PCR反应体系的配制：

2.3.1 PCR反应体系配制，总体积20μL，2×Prmix Ex Taq(Probe qPCR)(Cat.RR390A，大连宝生公司)10μL，基因组DNA 1μL(总量20ng)，终浓度均为200nmol/L的引物23S rRNA-F/R和16S rRNA-F/R(四条引物)，终浓度均为400nmol/L的步骤2.2的探针(两条探针)，补水至20μL；将配制好的反应体系加入到96孔板中；

2.3.2将一张新的粘性封口膜盖住96孔板，用软胶板从中间向四周轻刮封口膜，确保膜封盖住每一个PCR反应孔；

2.3.3将密封好的96孔板置于离心机上3000rpm离心30s，使液体收集于反应孔底部。

2.4 PCR扩增和信号收集

2.4.1 PCR仪为美国ABI公司7500FAST。将96孔板放置在其中，打开7500 softwarev 2.3软件，设置实验名称、实验类型、探针信息以及PCR反应条件等，其扩增程序为：60℃1分钟并收集荧光信号；95℃5min；95℃15s，56℃20s，65℃50s并收集荧光信号，40个循环；最后60℃1分钟并收集荧光信号。

2.4.2点击软件上的RUN按钮，开始PCR扩增。Taqman探针法的原理是使用5’端带有荧光报告基团，3’端带有荧光淬灭基团的Taqman探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光报告基团受到3’端荧光淬灭基团的制约而不能发出荧光。当Taqman探针被分解后，5’端的荧光报告基团便会游离出来，发出荧光。PCR反应过程中，Taqman探针在退火时与模板DNA序列结合，而在延伸时，Taq DNA聚合酶的5’→3’外切酶活性会水解与模板结合的Taqman探针，从而发出荧光。

2.5结果分析：

7500 softwarev2.3软件展示的多重荧光定量PCR扩增曲线图(如图1所示)，表示了荧光信号强度与PCR扩增循环数之间的关系。FAM曲线为FAM探针信号曲线，该曲线上升且样品Ct值小于40表明脓液中含有克氏棒状杆菌；VIC曲线为VIC探针信号曲线，该曲线上升且样品Ct值小于40表明脓液中含有棒状杆菌属细菌；ROX曲线为参比染料ROX信号，作用是减小人为误差的影响，起校正作用。由于克氏棒状杆菌隶属于棒状杆菌属，因此若FAM曲线上升，则VIC曲线必然上升。图1表示克氏棒状杆菌阳性，棒状杆菌属细菌阳性；图2表示克氏棒状菌阴性，棒状杆菌属细菌阳性，图3表示阴性对照。

3、棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌的灵敏度

3.1棒状杆菌属细菌的灵敏度：

3.1.1将谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032的23S rRNA基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)克隆至pMD8-T载体上，获得棒状杆菌属细菌阳性质粒。

3.1.2取1×10⁷copies/mL的棒状杆菌属细菌阳性质粒进行10倍梯度稀释，获得浓度分别为1×10⁶copies/mL、1×10⁵copies/mL、1×10⁴copies/mL、1×10³copies/mL、1×10²copies/mL和50copies/mL的棒状杆菌属细菌阳性质粒样品DNA作为模板DNA，每个梯度3个重复，共18个样本。

3.1.3以针对棒状杆菌属细菌的检测引物和检测探针为引物和探针，按照实施例1步骤2的荧光定量PCR反应体系和荧光定量PCR扩增程序进行荧光定量PCR扩增。1×10⁶copies/mL、1×10⁵copies/mL、1×10⁴copies/mL、1×10³copies/mL和1×10²copies/mL的扩增反应曲线上升且Ct值都小于40，判断为棒状杆菌属细菌阳性。上述结果表明：本发明的棒状杆菌属细菌的检测引物和检测探针的检测下限为1×10²copies/mL。

3.2克氏棒状杆菌的灵敏度：

3.2.1将克氏棒状杆菌(Corynebacterium kroppenstedtii)DSM 44385的16SrRNA基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)克隆至pMD8-T载体上，获得克氏棒状杆菌阳性质粒。

3.2.2取1×10⁷copies/mL的克氏棒状杆菌阳性质粒进行10倍梯度稀释，获得浓度分别为1×10⁶copies/mL、1×10⁵copies/mL、1×10⁴copies/mL、1×10³copies/mL、1×10²copies/mL、50copies/mL的克氏棒状杆菌阳性质粒样品DNA作为模板DNA，每个梯度3个重复，共18个样本。

3.2.3以针对克氏棒状杆菌的检测引物和检测探针为引物和探针，按照实施例1步骤2的荧光定量PCR反应体系和荧光定量PCR扩增程序进行荧光定量PCR扩增。1×10⁶copies/mL、1×10⁵copies/mL、1×10⁴copies/mL、1×10³copies/mL和1×10²copies/mL的扩增反应曲线上升，且Ct值都小于40，判断为克氏棒状杆菌阳性。上述结果表明：本发明的克氏棒状杆菌的检测引物和检测探针的检测下限为1×10²copies/mL。

4、棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌的特异性

4.1棒状杆菌属细菌的特异性

分别以白喉棒状杆菌ATCC 39255、假白喉棒状杆菌CMCC 38203、痤疮棒状杆菌ATCC 6919、溃疡棒状杆菌ATCC 9015、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、结膜干燥棒状杆菌ATCC373、克氏棒状杆菌DSM 44385、牛棒状杆菌ATCC 7715、鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌ATCC 19698、星状诺卡氏菌ATCC 19247和粘性放线菌ATCC 15987的基因组DNA为模板，以实施例1步骤2的针对棒状杆菌属细菌的检测引物和检测探针作为引物和探针，按照实施例1步骤2的荧光定量PCR反应体系和荧光定量PCR扩增程序进行荧光定量PCR扩增。扩增结果表明，白喉棒状杆菌ATCC 39255、假白喉棒状杆菌CMCC 38203、痤疮棒状杆菌ATCC 6919、溃疡棒状杆菌ATCC 9015、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、结膜干燥棒状杆菌ATCC 373、克氏棒状杆菌DSM 44385和牛棒状杆菌ATCC 7715均为棒状杆菌属细菌阳性；鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌ATCC 19698、星状诺卡氏菌ATCC 19247和粘性放线菌ATCC 15987均为棒状杆菌属细菌阴性。上述结果表明：本发明的针对棒状杆菌属细菌的检测引物和检测探针的特异性高，与分枝杆菌属、诺卡氏菌属和放线菌属无交叉反应。

4.2克氏棒状杆菌的特异性

分别以白喉棒状杆菌ATCC 39255、假白喉棒状杆菌CMCC 38203、痤疮棒状杆菌ATCC 6919、溃疡棒状杆菌ATCC 9015、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、结膜干燥棒状杆菌ATCC373、克氏棒状杆菌DSM 44385、牛棒状杆菌ATCC 7715、鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌ATCC 19698、星状诺卡氏菌ATCC 19247和粘性放线菌ATCC 15987的基因组DNA为模板，以实施例1步骤2的针对克氏棒状杆菌的检测引物和检测探针作为引物和探针，按照实施例1步骤2的荧光定量PCR反应体系和荧光定量PCR扩增程序进行荧光定量PCR扩增。扩增结果表明，白喉棒状杆菌ATCC 39255、假白喉棒状杆菌CMCC 38203、痤疮棒状杆菌ATCC 6919、溃疡棒状杆菌ATCC 9015、谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032、结膜干燥棒状杆菌ATCC 373和牛棒状杆菌ATCC 7715均为克氏棒状杆菌阴性；克氏棒状杆菌DSM 44385为克氏棒状杆菌阳性；鸟分枝杆菌亚种副结核分枝杆菌ATCC 19698、星状诺卡氏菌ATCC 19247和粘性放线菌ATCC15987均为克氏棒状杆菌阴性。上述结果表明：本发明的针对克氏棒状杆菌的检测引物和检测探针的特异性高，与分枝杆菌属、诺卡氏菌属和放线菌属无交叉反应。

对于提取人脓液总DNA时需要脓液的量，本发明没有特别的限制，若脓液很黏稠，则取黄豆粒大小的脓液然后加溶液GA补足至200μL即可，若脓液很少，则用适量无菌1×PBS溶液冲洗拭子，取200μL即可。

由于本发明使用的检测方法可以快速检测样本DNA中的克氏棒状杆菌和棒状杆菌属细菌。

棒状杆菌属细菌及克氏棒状杆菌检测的意义在于如果确诊为棒状杆菌属细菌或克氏棒状杆菌感染则对临床的针对性选择抗生素使用具有重要指导作用。合理的抗生素使用可有效缩短肉芽肿性乳腺炎的病程、避免手术切除乳腺组织，极大减轻患者生理和心里创伤。

序列表

<110> 广东省妇幼保健院

<120> 一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR引物、探针、试剂盒和检测方法

<160> 8

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 棒状杆菌属细菌

<400> 1

tgatagctgg ttctccccga a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 棒状杆菌属细菌

<400> 2

cgatctgggc tgtttccct 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 克氏棒状杆菌

<400> 3

agaaccttac ctgggcttga 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 克氏棒状杆菌

<400> 4

cgctcgttgc gggactta 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 棒状杆菌属细菌

<400> 5

gtcccgctma accawccagt 20

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 克氏棒状杆菌

<400> 6

actggatgcg gccaga 16

<210> 7

<211> 1501

<212> DNA

<213> 克氏棒状杆菌（Corynebacterium kroppenstedtii）DSM 44385

<400> 7

cctggctcag gacgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggaaaggccc 60

tgcttgcagg gtgctcgagt ggcgaacggg tgagtaacac gtgggtgatc tgccccttac 120

tttgggataa gcctgggaaa ctgggtctaa tactggatag gaccatgctg taggtggtgt 180

ggtggaaaga ttttttcggt aagggatgag ctcgcggcct atcagcttgt tggtggggta 240

atggcctacc aaggcgtcga cgggtagccg gcctgagagg gtggacggcc acattgggac 300

tgagatacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca 360

agcctgatgc agcgacgccg cgtgggggat gacggccttc gggttgtaaa ctcctttcag 420

ccatgacgaa gcccttgtgg tgacggtagt ggtagaagaa gcaccggcta actacgtgcc 480

agcagccgcg gtaatacgta gggtgcgagc gttgtccgga attactgggc gtaaagagct 540

cgtaggtggt ctgtcgcgtc atttgtgaaa gcccggggct taactccggg ttggcaggtg 600

atacgggcat gactggagta ctgtagggga gactggaatt cctggtgtag cggtgaaatg 660

cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga aggcgggtct ctgggcagta actgacgctg 720

aggagcgaaa gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg 780

gtgggcgcta ggtgtgggtt tccttccacg ggatccgtgc cgtagctaac gcattaagcg 840

ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 900

aagcggcgga gcatgtggat taattcgatg caacgcgaag aaccttacct gggcttgaca 960

tgcactggat gcggccagag atggttgttc cctttgtggc tggtgtgcag gtggtgcatg 1020

gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080

tctcgtgttg ccagcatttg gttggggact cgcgggagac tgccggggtt aactcggagg 1140

aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgtcc agggcttcac acatgctaca 1200

atggctggta cagagagttg cgataccgtg aggtggggct aatctcttaa agccagtctc 1260

agttcggatt ggagtctgca actcgactcc atgaagtcgg agtcgctagt aatcgcagat 1320

cagcaatgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acgtcatgaa 1380

agttggtaac acccgaagcc ggtggcctaa actcgttagg gagccgtcga aggtgggatt 1440

ggcgattggg acgaagtcgt aacaaggtag ccgtaccgga aggtgcggct ggatcacctc 1500

c 1501

<210> 8

<211> 3087

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032

<400> 8

ttgttgtttt gtagggcaca cggtggatgc cttggcatat caagccgatg aaggacgtga 60

gaggctgcgt tatgcctcgg ggagttgcca actaagcgtt gatccgagga tgtccgaatg 120

gggaaaccca gccgcagtga tgtgtggtta cctgccagtg aatgtatagc tggtgtggag 180

gtttacacgg ggaagtgaaa catctcagta cccgtaggag aagaaaacaa ttgtgattcc 240

gttagtagtg gcgagcgaac gtggatgatg gctaaaactt atgtgtgtga tacccggcag 300

gggttgcatg taggtggttg tggggcaatg acgttcatat tctgccggat gtgggcatgt 360

gctgcgtggt tagtggaagt ggtgtggaaa cacctgccgt agaaggtgag agtcctgtac 420

acgaagatca tggtggtgtg tgtggttgtt gataccccga gtagcagcgg gctcgtggaa 480

tctgctgtga attagccggg accacccggt aagcctgaat acttgatatg accgatagcg 540

gattagtacc gtgagggaat ggtgaaaagt accccgggag gggagtgaaa tagtacctga 600

aaccgtgtgc tgtcaatccg tcagagcatc ctttgtggtg tgatggcgtg ccttttgaag 660

aatgagcctg cgagtcagcg gcatgtcgcg aggttaaccc gtgtggggta gccgtaggga 720

aaccgaatcc taacgagggt gattttagtg gcatgtcttg gacccgaagc ggagtgatct 780

acccatggcc agtgtgaagc agctgtaaga ggttgtggag gcgcgaaccc acttaggttg 840

aaaactgagg ggatgagttg tgggtagggg tgaaaggcca atcaaactcc gtgatagctg 900

gttctccccg aaatgcattt aggtgcagcg tcgtgtgttt cttgccggag gtagagctac 960

tggatggttt agcgggacca acatcttagc gacatcagcc aaactccgaa tgccggtaag 1020

ttagagcacg gcagtgagac tgcgggggat aagcttcgta gtcgagaggg aaacagccca 1080

gatcgccggc taaggcccct aagggtgtgc taagtggaaa aggaggtggg gtcgcgaaga 1140

cagccaggag gttggcttag aagcagccat ccttgaaaga gtgcgtaata gctcactggt 1200

cgagtgattc cgcgccgaca atgtagtggg gcttaagtac accgccgaag ccgcggcaat 1260

gatctttata ggattgttgg gtaggggagc gtcgtgcatg cgttgaagct ttggggtgac 1320

cttgggtgga gtgtgtgcga gtgagaatgc aggcatgagt aacgaatgat gcgtgagaaa 1380

cgtatccgcc ggatgactaa gggttcctgg gtcaagttaa tcttcccagg gtgagtcggg 1440

gcctaaggcg aggccgacag gcgtagtcga tggataacgg gttgatattc ccgtacccga 1500

gtatgagcga ccatggtgaa tcagtgatac taaccaccca taagcacccg cgaaaaggct 1560

ttgctttttt gtggtgtgtg gttgcgtggg acctgatctg gtagtagcta agtgatgggg 1620

tgacgcaggg aggtagctca gccacttatt ggattgtggt gtaagcgtgt ggcacgcagt 1680

gttggtaaat ccgcactgtt tttgtgtgag gcgtgatgcg gagcccgtaa agggtgaagt 1740

gggtgatcct gtgctgtcga gaaaagcctc tagcgatgtt gatattcggc ccgtacccta 1800

aaccgacaca ggtagtcagg tagagaatac taaggcgttc gggtgaactg tggttaagga 1860

actcggcaaa atgcccccgt aacttcggga gaaggggggc cacggcgtgt gaacaacttt 1920

tcgttgggag cgtgttgtgg tcgcagagaa tagagggaag cgactgttta ctaaaaacac 1980

aggtccgtgc gaagacgttt aagttgatgt atacggactg acgcctgccc ggtgctggaa 2040

ggttaagagg accggttagg aaaacttgtt ttttcgaagc tgagaattta agccccagta 2100

aacggcggtg gtaactataa ccatcctaag gtagcgaaat tccttgtcgg gtaagttccg 2160

acctgcacga atggcgtaac gacttccctg ctgtctcaac cacaggcccg gtgaaattgc 2220

agtacgagta aagatgctcg ttacgcgcgg caggacgaaa agaccccggg accttcacta 2280

tagcttggta ttggtgtttg attcggtttg tgtaggatag gtgggagact tcgatcatat 2340

gacgctagtt gtgtgtgagt cgttggtgaa ataccactct gatcggattg gatgtcttaa 2400

ccttggccca tgatctgggt tggggacagt gcctggtggg tagtttaact ggggcggttg 2460

cctcctaaaa tgtaacggag gcgcccaaag gtttcctcag cttggttggt aatcaggtgg 2520

tgagtgtaag tgcacaaggg agcttgactg tgacactgac aggtggagca gggacgaaag 2580

tcgggactag tgatccggca cctacttgtg gttgtggtgt cgctcaacgg ataaaaggta 2640

ccccggggat aacaggctga tcttccccaa gagtccatat cgacgggatg gtttggcacc 2700

tcgatgtcgg ctcgtcgcat cctggggctg gagtaggtcc caagggttgg gctgttcgcc 2760

cattaaagcg gcacgcgagc tgggtttaga acgtcgtgag acagttcggt ctctatccgc 2820

cgcgcgcgtt gaaacttgaa ggaaggctgt ccctagtacg agaggaccgg gacggacgta 2880

cctctggtgt gccagttgtt ccgccaggag cagggctggt tggctacgta cgggagggat 2940

aaccgctgaa agcatctaag cgggaagcct gtttcgagat gaggtttctt ttgaggttcc 3000

ctagagatta tggggttgat aggccagatc tggaagcact gtgaggtgtg gaggtgactg 3060

gtactaattt accgataaca acaaacc 3087

Claims

1.一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

针对棒状杆菌属细菌：23S rRNA-F：5’-TGATAGCTGGTTCTCCCCGAA-3’，23S rRNA-R：5’-CGATCTGGGCTGTTTCCCT-3’；

针对克氏棒状杆菌：16S rRNA-F：5’-AGAACCTTACCTGGGCTTGA-3’，16S rRNA-R：5’-CGCTCGTTGCGGGACTTA-3’。

2.一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述的检测探针如下所示：

针对棒状杆菌属细菌：5’-GTCCCGCTMAACCAWCCAGT-3’；

针对克氏棒状杆菌：5’-ACTGGATGCGGCCAGA-3’；

3.根据权利要求2所述的棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测探针，其特征在于，所述的荧光报告基团为VIC、HEX或FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ1或MGB。

4.一种棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，包括2×Prmix Ex Taq、权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针。

5.一种非疾病的诊断和治疗目的的棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌多重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取样品的基因组DNA作为模板，使用权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针进行多重荧光定量PCR扩增，反应结束后，根据探针标记的荧光报告基团的荧光信号，读取并记录样品的PCR扩增循环次数Ct，根据样品的Ct值，按照建立的判断标准，判断样品中是否含有棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的多重荧光定量PCR扩增的扩增反应体系为：20μL；模板DNA1μL，2×Prmix Ex Taq 10μL，终浓度均为200nmol/L的权利要求1所述的各检测引物，终浓度均为400nmol/L的权利要求2所述的各检测探针，余量为ddH₂O。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述的多重荧光定量PCR扩增程序为：60℃1分钟并收集荧光信号，95℃5分钟；95℃15秒，56℃20秒，65℃50秒并收集荧光信号，40个循环；最后60℃1分钟并收集荧光信号。

8.权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针在检测棒状杆菌属细菌和克氏棒状杆菌中的应用。