CN114058725B - 鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的引物及方法 - Google Patents

鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的引物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的分子特征性荧光SSR标记引物及方法。所述分子特征性荧光SSR引物如下：上游引物Cg_U110F：5'‑FAM‑TCTTCTCCGCCCTTCAACTA‑3'；下游引物Cg_U110R：5'‑GCTGAGGTCATGGTGGAGTT‑3'本发明所述的分子特征性荧光SSR引物可利用幼叶DNA对特早熟玉环柚‘早玉文旦’进行快速的早期鉴别，同时也可对柚类品种葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦进行鉴别，方法简单、快捷、准确，是传统方法即在挂果后根据果实形态学特征鉴别柚类品种所不能替代的高效分子手段。

Description

鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的引物及方法
(一)技术领域
本发明涉及一种鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的分子特征性荧光SSR标记引物及方法。
(二)背景技术
中国是柚类起源中心之一，栽培历史悠久，种质资源丰富，形成了包括福建、浙江、台湾的东南沿海柚产区，和以广西及广东为主的华南柚区和以四川、重庆、湖南、贵州为主的西南柚区。浙江省作为东南沿海柚区重要组成之一，舟山、丽水、台州、温州等地具有许多特征明显的地方资源。
早熟玉环柚‘早玉文旦’是玉环县近年来出现的一个优良栽培品种，相比普通玉环柚可以提早一个半月上市，含糖高、化渣好，酸甜适中、丰产性和适应性强，2015年普通玉环柚平均每斤1.9元，特早熟玉环柚每斤8元；2016年普通玉环柚平均每斤4.5元，特早熟玉环柚每斤12元，且供不应求。农户经营特早熟玉环柚获得的经济效益相比经营普通玉环柚更好。目前特早熟玉环柚和普通玉环柚间的种质差异需等到挂果后才可以鉴别，很大程度上影响了玉环柚苗木的繁育周期和品种间鉴定。
柚类种质和品种资源繁多，现有的鉴别方法包括从叶片或果实形态学和生物化学方法对柚类品种(系)的鉴定和识别过程较为困难和复杂，准确度不高，成本较高且耗时耗力。尽管高光谱成像技术可用于柚类品种的鉴别，但数据波段数众多，数据量大，建模的计算工作量繁琐，直接影响建模的速度，而且光谱间存在强相关性，冗余信息多，影响建模的精度和稳定性。因此这些方法并不真正适合于柚类品种的鉴别。
自2000年以来，基于PCR的分子标记技术如RAPD(随机扩增多态性DNA)、SRAP(相关序列扩增多态性)和SSR(简单重复序列；或Microsatellite，微卫星)相继用于了柚类品种的亲缘关系和遗传多样性分析。SNP(单核昔酸多态性)基因分型技术也用于了柚类品种鉴定。RAPD和SRAP分子标记所采用的均为通用引物，需经大工作量的多态性筛选，而且PCR扩增图谱复杂、重复性较差，引物的特异性不高。利用SNP基因分型技术鉴定柚类品种存在的问题是SNP位点的获得较难，且单个SNP分子标记的多态信息含量较低。基于SNP的等位基因特异性PCR法(AS-PCR)在操作过程中对反应条件比较敏感，易发生非特异性扩增导致假阳性，易产生大量引物二聚体导致PCR失败；基于SNP的高分辨率熔解曲线法(HRMA)分析仪器昂贵，试剂成本较高。因此这些分子生物学技术也不是柚类品种鉴定的理想选择。
SSR(简单重复序列；或Microsatellite，微卫星)为共显性标记，能区分纯合子和杂合子，能检测复等位基因，且具有多态性丰富、操作简单、结果可靠、重复性好等优点。荧光SSR标记是基于DNA测序平台的毛细管电泳检测方法，是以不同颜色的荧光基团(如FAM、HEX、TAMRA等)来标记一对SSR引物中的一个引物末端，利用荧光检测器对产物检测，达到自动识别扩增产物的大小，具有快速、高效、精确、灵敏等技术优势。因此，利用荧光SSR标记技术开发柚类新品种或优良、特色品种的特征SSR指纹(基因型)，揭示特早熟玉环柚与其他柚类品种间的基因型差异，对于‘早玉文旦’优良品种的鉴别与知识产权保护具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种快速鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’的分子特征性荧光SSR标记引物及方法。
本发明采用的技术方案是：
鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的分子特征性荧光SSR标记引物，其核苷酸序列如下：
上游引物Cg_U110F：5'-FAM-TCTTCTCCGCCCTTCAACTA-3'；
下游引物Cg_U110R：5'-GCTGAGGTCATGGTGGAGTT-3'。
该引物对是基于荧光SSR标记技术，经过对大量自主开发的SSR引物在待测柚类品种间进行多态性筛选试验后获得的。利用该引物对对5个柚类品种进行荧光SSR检测，5个柚类品种(葡萄柚、红心柚、早香柚、玉环文旦、‘早玉文旦’)可稳定获得5种不同的SSR特征指纹(基因型)，即每个柚类品种均具备不同的特征基因型以区别于另外4个品种。因此该引物可用于快速鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’。需要说明的是，本发明分子特征性荧光SSR引物仅限于柚类品种的鉴别(鉴别其是否为特早熟玉环柚)，即待测样品仅限于柚类品种。
本发明还涉及可用于鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的分子特征性序列，核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示。
SEQ ID No.1(258bp)：
5'-TCTTCTCCGCCCTTCAACTATCCACAAGCCCACCACCACCACCACCATAACAACGCATCGCTTTTATCTCCTCTTCTTCCTCACTTTCTTCACCTTAGCTTTCACCCTCACTTTCTTCACTACCGCAATCAATCCCGCCTCCTCCGTCGCCTCTACCGCCAAATCTCTCCCTTCCTCTTCTTCCTCCTCCTCCTCCTCCATCATAACTGCCGCCTTGCTCCACTACACTCTCACTTCCAACTCCACCATGACCTCAGC-3'(下划线为SSR重复单元CCA*6)
SEQ ID No.2(261bp)：
5'-TCTTCTCCGCCCTTCAACTATCCACAAGCCCACCACCACCACCACCACCATAACAACGCATCGCTTTTATCTCCTCTTCTTCCTCACTTTCTTCACCTTAGCTTTCACCCTCACTTTCTTCACTACCGCAATCAATCCCGCCTCCTCCGTCGCCTCTACCGCCAAATCTCTCCCTTCCTCTTCTTCCTCCTCCTCCTCCTCCATCATAACTGCCGCCTTGCTCCACTACACTCTCACTTCCAACTCCACCATGACCTCAGC-3'(下划线为SSR重复单元CCA*7)
本发明还涉及一种快速鉴别鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的方法，所述方法包括：取待测柚类品种幼叶的基因组DNA作为模板，以分子特征性荧光SSR引物对Cg_U110F和Cg_U110R作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行毛细管电泳检测，若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为258/261，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’；若出现的基因型为264/267、249/258、249/261和252/258，则待测柚类品种分别为葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦；
所述分子特征性荧光SSR引物如下：
上游引物Cg_U110F：5'-FAM-TCTTCTCCGCCCTTCAACTA-3'；
下游引物Cg_U110R：5'-GCTGAGGTCATGGTGGAGTT-3'。
本发明方法关键在于扩增SSR引物的选择，DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定、荧光毛细管电泳检测以及数据统计分析，均可按照本领域常规方法进行。
优选的，所述PCR扩增反应条件如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃。
优选的，所述荧光毛细管电泳检测方法如下：将PCR扩增产物稀释后于96℃变性5min，将变性后的稀释产物在-20℃下迅速冷冻2min后置入ABI 3730XL Genetic Analyzer分析仪(ABI,CA,USA)，与内标GeneScanTM-500LIZ Size Standard(ABI)同步进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件(ABI)收集数据。
具体的，所述方法如下：
(1)取待测柚类品种幼嫩针叶，加液氮磨碎，提取柚类的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特征性SSR引物作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系每20μL组成如下：
PCR反应条件如下：
98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；最后于72℃补平2min，终止温度为4℃；
(3)内标配制：取10ml Hi-Di和80μL GeneScanTM-500LIZ Size Standard混匀，离心，以每孔10μL分装于96孔内标板，离心；将PCR扩增产物稀释，离心；取稀释产物按0.5μL/孔加入到分配好的96孔内标板中，混匀，离心，置入PCR仪，于96℃变性5min，之后在-20℃下迅速冷冻2min，离心，得到变性后的PCR产物；将变性后的PCR产物与内标同步置入ABI3730XL Genetic Analyzer进行毛细管电泳检测，用Data Collection 3.0软件收集数据；
(4)数据分析：用GeneMapper 4.1软件对Data Collection 3.0软件收集的原始数据进行分析，软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScanTM-500LIZ SizeStandard进行比较，直接读出目标SSR片段的准确峰值(bp数)，等位变异数据记录为X/X；
(5)结果判断：若荧光毛细管电泳峰图上出现的基因型为258/261，则待测柚类品种为特早熟玉环柚‘早玉文旦’；若出现的基因型为264/267、249/258、249/261和252/258，则待测柚类品种分别为葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦。
本发明的有益效果主要体现在：本发明所述的分子特征性荧光SSR引物可利用幼叶DNA对特早熟玉环柚‘早玉文旦’进行快速的早期鉴别，同时也可对柚类品种葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦进行鉴别，方法简单、快捷、准确，是传统方法即在挂果后根据果实形态学特征鉴别柚类品种所不能替代的高效分子手段。
(四)附图说明
图1为对代表5个柚类品种的DNA进行PCR扩增后的荧光毛细管电泳检测结果；A为葡萄柚(来自衢州和丽水)，B为红心柚(来自福建和台州)，C为早香柚(来自温州)，D为玉环文旦(来自玉环)，E为‘早玉文旦’(来自玉环)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(1)柚类品种基因组DNA的提取：
取待测硅胶保存的来自不同产地的10份样品(代表5个柚类品种)幼嫩叶片0.03g，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取利用新型快速植物基因组DNA提取盒(DP3111，北京百泰克)，以提取获得柚类品种的基因组DNA粗提物。
DNA粗提物通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳和DNA/RNA紫外分光光度计(NanodropTechnologies，USA)来检测完整性、纯度及浓度。OD260/OD280>1.8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20℃冰箱贮藏备用。
(2)分子特征性SSR标记引物，引物对的序列为：
上游引物Cg_U110F：5'-FAM-TCTTCTCCGCCCTTCAACTA-3'；
下游引物Cg_U110R：5'-GCTGAGGTCATGGTGGAGTT-3'。
由杭州有康生物科技有限公司合成。
(3)PCR扩增，20μL PCR反应体系组成如下：：
PCR反应液组成：2×T5 Super PCR Mix(PAGE)(TSE006，北京擎科新业生物)10μL，Cg_U110F(10μM)和Cg_U110R引物(10μM)各1.5μL，模板DNA(20ng/μL)3μL，ddH2O 4μL。
扩增反应在Life ECO型扩增仪(Bioer，杭州博日科技)上进行。扩增条件：98℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；最后于72℃补平2min。终止温度为4℃。
(4)内标配制：取10ml Hi-Di和80μL GeneScanTM-500LIZ Size Standard混匀，离心，以每孔10μL分装于96孔内标板，离心。
(5)荧光毛细管电泳检测：取步骤(3)PCR扩增产物5μL，稀释100倍后取0.5μL/孔加入到分配好的内标板中，混匀，离心，放入PCR仪，于96℃变性5min，之后在-20℃下迅速冷冻2min，离心，得到变性后的PCR产物。将变性后的PCR产物与内标GeneScanTM-500LIZ SizeStandard同步置入ABI 3730XL Genetic Analyzer进行毛细管电泳检测，用DataCollection 3.0软件收集数据。
(6)基因型分析与品种鉴别：用GeneMapper 4.1软件对Data Collection 3.0软件收集的原始数据进行分析。软件系统将根据目标峰的位置与同一泳道中的内标GeneScanTM-500LIZ Size Standard进行比较，直接给出目标SSR片段的准确峰值(bp)，等位变异数据记录为X/X。根据等位变异数据的差异性比较可以鉴别不同的柚类品种。上述5个柚类品种的基因型数据见表1。
表1：五个柚类品种的基因型
表1显示来自不同产地的每个品种(葡萄柚、红心柚、早香柚、玉环文旦、‘早玉文旦’)具有相同的基因型。‘早玉文旦’的基因型为258/261，显然不同于另外4个品种的基因型，即葡萄柚的基因型264/267、红心柚的249/258、早香柚的249/261和玉环文旦的252/258，且这4个品种间的基因型也彼此不同。这表明U110是在柚类品种间具高度多态性的SSR标记，Cg_U110不仅可以作为分子特征性SSR引物来鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’优良品种，还可以同时鉴别葡萄柚、红心柚、早香柚和玉环文旦。该分子特征性荧光SSR标记引物及方法是柚类品种鉴别与知识产权保护的有力工具。
序列表
<110> 浙江省林业科学研究院
玉环市自然资源和规划局
<120> 鉴别特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种的引物及方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 258
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
tcttctccgc ccttcaacta tccacaagcc caccaccacc accaccataa caacgcatcg 60
cttttatctc ctcttcttcc tcactttctt caccttagct ttcaccctca ctttcttcac 120
taccgcaatc aatcccgcct cctccgtcgc ctctaccgcc aaatctctcc cttcctcttc 180
ttcctcctcc tcctcctcca tcataactgc cgccttgctc cactacactc tcacttccaa 240
ctccaccatg acctcagc 258
<210> 2
<211> 261
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
tcttctccgc ccttcaacta tccacaagcc caccaccacc accaccacca taacaacgca 60
tcgcttttat ctcctcttct tcctcacttt cttcacctta gctttcaccc tcactttctt 120
cactaccgca atcaatcccg cctcctccgt cgcctctacc gccaaatctc tcccttcctc 180
ttcttcctcc tcctcctcct ccatcataac tgccgccttg ctccactaca ctctcacttc 240
caactccacc atgacctcag c 261
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
tcttctccgc ccttcaacta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
gctgaggtca tggtggagtt 20

Claims (1)

1.分子特征性荧光SSR标记引物在对特早熟玉环柚‘早玉文旦’品种进行快速早期鉴别中的应用，其特征在于，所述分子特征性荧光SSR标记引物核苷酸序列如下：
上游引物Cg_U110F：5'-FAM-TCTTCTCCGCCCTTCAACTA-3'；
下游引物Cg_U110R：5'-GCTGAGGTCATGGTGGAGTT-3'。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴梅筠等.《法庭生物学》.四川大学出版社,2006,第501-502页. *
宋其岩等.特早熟玉环柚"早玉文旦"的荧光SSR标记鉴别.《中国南方果树》.2022,第51卷(第5期),图1-2、表1. *

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