CN113957143A - 一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的生物标志物、试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的生物标志物、试剂盒及其检测方法和应用，属于生物技术领域。本发明提供了一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的微生物菌群生物标志物，所述微生物菌群包括蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter中的至少一种。本发明通过检测所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量，确定待测对象否遭受质子射线辐射，及时进行事故救援、伤员处理和临床治疗应用，对辐射处理具有重要的意义。

Description

一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的生物标志物、试剂 盒及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的生物标志物、试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
随着我国载人航天和空间实验室建设的快速发展，登月和深空探测计划的实施将推动我国尖端科学技术的发展和国防实力的提升，还将奠定中国在未来世界新资源开发与利用、月球资源控制、太空探索与研究格局中的地位和作用。飞船交互对接、出舱活动、建立空间站、长期载人航天任务、载人登月等工程实施中，航天员在航天器舱内尤其是舱室外活动将面临暴露于复杂的空间辐射环境的健康危害。虽然空间辐射环境极为复杂，但质子仍是空间辐射中的主要成分且在空间辐射中占有重要地位。
质子辐射能够使受作用物质的分子或原子产生电离，作用于人体或生物体时，可引起组织细胞中原子或分子的变化，使受照细胞被杀伤或发生变异，从而导致对人体的各种健康危害。然而现有技术中缺乏简单、快速的质子辐射的检测方法。因此，发展一种快速、安全监测航天员受照剂量的检测技术就显得越来越迫切。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的微生物菌群生物标志物，通过检测所述微生物菌群生物标志物DNA表达量或相对表达量，能准确检测到待测对象是否遭受质子射线辐射。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的微生物菌群生物标志物，所述微生物菌群包括蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter中的至少一种。
本发明提供了上述微生物菌群作为生物标志物在制备检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射的产品中的应用。
优选的，通过检测样本中所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量以确定是否遭受质子射线辐射。
更优选的，所述样本为粪便。
本发明提供了一种试剂盒，包括：检测所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量的试剂。
优选的，所述试剂包括检测所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量的引物或探针。
更优选的，所述引物为引物组1、引物组2、引物组3和引物组4中的任意一组或几组；
所述引物组1中，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述引物组2中，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
所述引物组3中，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
所述引物组4中，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了上述的试剂盒在检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射中的应用。
本发明还提供了一种检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射的方法，所述方法包括：
提取样本中上述的微生物菌群的总DNA进行PCR扩增，所得的PCR扩增产物经测序、数据分析获得所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量，确定样本是否遭受质子射线辐射。
优选的，遭受质子射线辐射的样本中微生物菌群DNA表达量或相对表达量大于正常微生物菌群DNA的表达量或相对表达量。
本发明提供了一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的微生物菌群生物标志物，对Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠辐射后，可检测到蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、 Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter的表达量增加，对待测对象的蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、 Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter表达量或相对表达量与未遭受质子射线辐射的Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠进行比较，能检测到待测对象是否遭受质子射线辐射，及时进行事故救援、伤员处理和临床治疗应用，对辐射处理具有重要的意义。
附图说明
图1为Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠质子照射与未照射后收集粪便进行的菌群主成分PCoA分析。
图2为Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠质子照射与未照射后收集粪便进行的菌群在门一级的成分分析。
图3为Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠质子照射与未照射后收集粪便进行的菌门中显著性差异分析；其中，A为Balb/c小鼠质子照射后，表达量会发生变化的菌门；B为C57BL/6小鼠小鼠质子照射后表达量升高的菌门。
图4为Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠质子照射与未照射后收集粪便进行的菌属中显著性差异分析；其中，A为Balb/c小鼠质子照射后，表达量发生变化的菌属；B为C57BL/6小鼠小鼠质子照射后表达量发生变化的菌属。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的微生物菌群生物标志物，所述微生物菌群包括蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter中的至少一种。本发明中，所述蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter的DNA表达量或相对表达量在遭受质子射线辐射的样本中升高。
本发明提供了上述微生物菌群作为生物标志物在制备检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射的产品中的应用。本发明中，所述产品通过检测样本中所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量以确定是否遭受质子射线辐射。所述样本优选为待测样品的粪便。在本发明的具体实施例中，所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量优选为C57BL/6小鼠和Balb/c小鼠结直肠粪便中微生物菌群DNA的表达量或相对表达量。
本发明提供了一种试剂盒，包括：检测所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量的试剂。本发明中，所述试剂优选的包括检测所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量的引物或探针。所述引物为引物组1、引物组2、引物组3和引物组4中的任意一组或几组；所述引物组1中，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；所述引物组2中，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；所述引物组3中，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；所述引物组4中，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示。本发明中，通过利用所述引物扩增微生物菌群DNA不同的区域，检测该区域的基因表达量或相对表达量。所述引物扩增的基因片段如下表1所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明还提供了上述的试剂盒在检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射中的应用。本发明中，所述应用优选为利用上述试剂盒对所述微生物菌群DNA进行扩增，确定所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量，从而确定待测样品是否遭受质子射线辐射。
本发明还提供了一种检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射的方法，所述方法包括：
提取样本中上述的微生物菌群的总DNA进行PCR扩增，所得的PCR扩增产物经测序、数据分析获得所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量，确定样本是否遭受质子射线辐射。
本发明中，提取得到微生物菌群的总DNA后优选的还包括对DNA的提取质量进行检测；所述检测的方法优选为琼脂糖凝胶电泳。本发明中，对DNA的提取质量进行检测后选优的包括对DNA进行定量；所述定量的方法优选为紫外分光光度计。本发明对所述提取样本中微生物菌群总DNA的方法并没有特殊限定，在本发明的具体实施例中，所述方法优选为CTAB法。本发明对所述测序的平台并没有特殊限定，在本发明的具体实施例中，所述测序平台优选为NovaSeq 6000测序仪。
本发明中，所述数据分析能够用于将来自待测样品的所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量转换为所述待测样品的检测结果。本发明中，所述数据分析包括数据处理模块、多样性分析模块、物种注释并差异分析和高级分析模块；其中，所述数据拆分模块用于将对测序获得的双端数据进行拆分，并去除接头和 barcode序列，再通过数据的拼接和过滤，DADA2降噪；多样性分析模块用于将待测对象的所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量值与未遭受质子射线辐射的待测对象的微生物菌群DNA表达量或相对表达量值进行比较；物种注释并差异分析和高级分析模块用于输出结论。本发明中，所述数据分析所用的软件和版本具体如表2所示。
表2 软件版本及分析要求
分析内容 软件名称 版本
序列拼接 FLASH(http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/) v1.2.8
低质量序列过滤 fqtrim(http://ccb.jhu.edu/software/fqtrim/) v0.94
嵌合体过滤 Vsearch(https://github.com/torognes/vsearch) v2.3.4
去噪（DADA2） qiime2(https://qiime2.org/) 2019.7
去除测序接头 cutadapt(http://cutadapt.readthedocs.org/en/stable/guide.html) v1.9
去除低质量序列 fqtrim(http://ccb.jhu.edu/software/fqtrim/) v0.94
PCoA 联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool/24） V8.4.0
柱状图 联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool/17） V8.4.0
箱线图 联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool/1） V8.4.0
本发明中，若待测样品的微生物菌群DNA表达量或相对表达量大于未遭受质子射线辐射待测样品的微生物菌群DNA表达量或相对表达量，则结论是待测样品遭受了质子射线辐射；若待测样品的微生物菌群DNA表达量或相对表达量小于或等于未遭受质子射线辐射待测样品的微生物菌群DNA表达量或相对表达量，则结论是待测样品未遭受质子射线辐射。
本发明中，所用原料、试剂与设备均为已知产品，采用常规市售产品即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
利用微生物菌群生物标志物蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter中的至少一种检测样本是否遭受质子射线辐射的方法：
1. 实验流程
1.1 微生物组总DNA 提取
利用CTAB法对小鼠粪便样本进行微生物组总DNA的提取，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，同时采用紫外分光光度计对DNA 进行定量。
1.2 PCR 扩增
利用表1中的引物组对步骤1.1中获得的DNA进行扩增，其中，PCR反应的体系和条件分别如表3和表4所示。
表3 PCR 反应体系
PCR 反应成分 PCR 反应体积
Phusion Hot start flex 2X Master Mix 12.5微升
Forward Primer 2.5微升
Reverse Primer 2.5微升
Template DNA 50纳克
Add ddH<sub>2</sub>O to 25微升
表4 PCR反应条件
PCR反应温度 PCR反应时间 循环数
98℃ 30秒
98℃ 10秒
54℃ 30秒 35循环
72℃ 45秒
72℃ 10分钟
4℃ ∞
1.3 PCR产物定量
步骤1.2得到的PCR产物利用AMPure XT beads (Beckman Coulter Genomics,Danvers, MA, USA)纯化，然后通过Qubit(Invitrogen, USA)定量，再按照样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
1.4 扩增产物回收纯化
PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，回收采用AMPure XT beads回收试剂盒。
1.5 扩增产物定量混样上机测序
对纯化后的PCR产物使用Agilent 2100生物分析仪 ( Agilent， 美国)和Illumina (Kapa Biosciences, Woburn, MA，美国)的文库定量试剂盒进行评估，合格的文库浓度应在2nM以上。将合格的各上机测序文库（Index序列不可重复）梯度稀释后，根据所需测序量按相应比例混合， 并经NaOH变性为单链进行上机测序；使用NovaSeq 6000测序仪进行2×250bp的双端测序，相应试剂为NovaSeq 6000 SP Reagent Kit (500 cycles)。
实施例2
生物信息学分析流程
1.数据拆分
对测序获得的双端数据，首先需要根据barcode信息对样品进行数据拆分，并去除接头和 barcode序列。
2.数据拼接和过滤
具体步骤有：
1) 去除RawData的引物序列和平衡碱基序列；其中，使用的软件为cutadapt(v1.9)，参数：'-g R1 -G R2 -n 1 -O 17 -m 100'；
2) 将每一对paired-end reads根据overlap区拼接合并成一条更长的tag；其中，使用的软件为FLASH （v1.2.8），参数：'-m 10 -M 100 -x 0.25 -t 1 -z'；
3) 对测序reads进行窗口法质量扫描，扫描窗口默认为100bp，当窗口内平均质量值低于20 时，将read从窗口起始到3’终止的部分截掉；其中，使用的软件为fqtrim，参数：'-P 33 -w 100 -q 20 -l 100 -m 5 -p 1 -V -o trim.fastq.gz'；
4)去除截短后长度小于100bp的序列；
5)去除截短后N（不确定模糊碱基）的含量在5%以上的序列；
6)去除嵌合体序列；其中，使用的软件为Vsearch（v2.3.4），参数默认；
3. DADA2去噪
通过qiime dada2 denoise-paired调用DADA2进行长度过滤和去噪，获得ASV(feature）特征序列和ASV(feature）丰度表格，并去除singletons ASVs (即在全体样本中，序列总数仅为1的ASV(feature）， 默认操作)。
4.多样性分析
基于得到的ASV(feature）特征序列和ASV(feature）丰度表格进行alpha多样性分析和beta多样性分析。其中，alpha多样性分析主要通过observed_species， shannon，simpson，chao1， goods_coverage，pielou_e七大指数对生境内的多样性进行评估。Beta多样性分析主要通过计算四种距离（weighted_unifrac，unweighted_unifrac，jaccard，bray_curtis）采用六大分析对生境间（样本/分组间）的多样性进行评估分析。
5.物种注释
根据ASV(feature）序列文件采用SILVA（Release 138，https://www.arbsilva.de/documentation/release138/）数据库以NT-16S数据库进行物种注释，并根据ASV(feature）丰度表对各物种在样本中的丰度进行统计，注释的置信度阈值为：0.7
6.差异分析和高级分析
基于得到的物种丰度统计信息，进行各比较组之间的差异分析。根据样本情况选择不同的统计学方法：采用Fisher's exact test，对无生物学重复样品差异比较；Mann-Whitney U test，对有生物学重复两组样品差异比较；Kruskal-Wallis test，对有生物学重复样品的多组之间比较，筛选阈值：p<0.05。
实施例3
1.选择6-8周龄雄性小鼠，照射质子射线前在SPF级动物房饲养1周以适应环境，给予足量的水和饲料，光照时间为12：12小时，动物伦理符合军事医学研究院辐射医学研究所相关规定。其中，小鼠为Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠，购自于斯贝福公司。
将小鼠放进装置中依次进行5Gy的全身照射，待3天后，在无菌条件下取小鼠粪便5颗左右放入冻存管后，立即用液氮速冻处理1小时，-80℃保存，待用。其中，质子辐射源来自中国原子能科学研究院 100 MeV质子回旋加速器产生的90 MeV单能质子。
2.利用实施例1所述方法检测小鼠在照射质子射线前后的DNA表达量或相对表达量。
3.经联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool/24）（版本V8.4.0）得到图1，经联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool/17）（版本V8.4.0）得到图2，由联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool/1）（版本V8.4.0）得到图3-4。
可以看出，图1中C57BL/6小鼠质子照射后菌群与未照射组有明显的分离，证明差异显著，Balb/c小鼠质子照射后菌群与未照射组有分离的趋势。图2中发生变化的菌群排名前十的是：拟杆菌门Bacteroidetes，厚壁菌门Firmicutes，变形菌门Proteobacteria，疣微菌门Verrucomicrobia，脱铁杆菌门Deferribacteres，蓝藻门Cyanobacteria，未分类unclassified，ε变形菌Epsilonbacteraeota，放线菌门Actinobacteria和Patescibacteria。
图3-4表明蓝藻门Cyanobacteria和ε变形菌Epsilonbacteraeota在Balb/c和C57BL/6小鼠肠道菌群中均升高，Anaerovorax和变形菌门螺杆菌属Helicobacter在Balb/c和C57BL/6小鼠肠道菌群中均升高，厚壁菌门梭菌属Clostridium和Firmicutes_ unclassified在Balb/c和C57BL/6小鼠肠道菌群中均降低。
由以上实施例可知，在遭受了质子射线辐射的小鼠样本中，微生物菌群生物标志物蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter DNA表达量或相对表达量大于未遭受质子射线辐射的微生物菌群生物标志物的DNA表达量或相对表达量。表明微生物菌群蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter能够作为生物标志物用于检测或辅助检测样本是否遭受质子射线辐射，对辐射处理具有重要的意义。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的生物标志物、试剂盒及其检测方法和应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctacgggng gcwgcag 17
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactachvgg gtatctaatc c 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgycagcmg ccgcggtaa 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggactachvg ggtwtctaat 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgycagcmg ccgcggtaa 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggactachvg ggtwtctaat 20
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtgccagcmg ccgcgg 16
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgtcaattc mtttragttt 20

Claims (10)

1.一种用于检测或辅助检测质子射线辐射的微生物菌群生物标志物，其特征在于，所述微生物菌群包括蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter中的至少一种。
2.微生物菌群作为生物标志物在制备检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射的产品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过检测样本中所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量以确定是否遭受质子射线辐射。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述样本为粪便。
5.一种试剂盒，其特征在于，包括：检测所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量的试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括检测所述微生物菌群DNA表达量或相对表达量的引物或探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物为引物组1、引物组2、引物组3和引物组4中的任意一组或几组；
所述引物组1中，上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；
所述引物组2中，上游引物序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物序列如SEQ ID NO.4所示；
所述引物组3中，上游引物序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物序列如SEQ ID NO.6所示；
所述引物组4中，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示。
8.权利要求5-7任意一项所述的试剂盒在检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射中的应用。
9.一种检测或辅助检测是否遭受质子射线辐射的方法，其特征在于，所述方法包括：
提取样本中蓝藻门Cyanobacteria、ε变形菌Epsilonbacteraeota、Anaerovorax、螺杆菌属Helicobacter中至少一种的总DNA进行PCR扩增，所得的PCR扩增产物经测序、数据分析获得所述微生物菌群DNA的表达量或相对表达量，确定样本是否遭受质子射线辐射。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，遭受质子射线辐射的样本中微生物菌群DNA表达量或相对表达量大于正常微生物菌群DNA的表达量或相对表达量。
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