DE102020101487B4 - Verfahren zur kontrolle der qualität - Google Patents

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Abstract

Ein erster Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primer, dessen Nukleotidsequenz aus der Gruppe von SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 ausgewählt ist, kombiniert mit einem zweiten Polymerase-Kettenreaktions-Primer, dessen Nukleotidsequenz aus der Gruppe von SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:6 ausgewählt ist ausgewählt ist, wobei jeder der ersten und jeder der zweiten Primer in der Lage sind, mit der DNA des methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 zu hybridisieren und wobei SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:4; sowie SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:5; sowie SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:6 ein Primerpaar bilden, das zur PCR-Amplifikation der DNA verwendet wird.

Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Typisierung von Archaeen und zur schnellen Unterscheidung von Kontaminanten in Reinstammkulturen methanogener Archaeen.
  • Teile des Projektes, welches zur vorliegenden Patentanmeldung geführt hat, wurden durch die „Deutsche Bundesstiftung Umwelt“ unter dem Aktenzeichen AZ 33474/01 gefördert.
  • Das Streben nach effizienten Energieversorgungslösungen zu geringeren Kosten für die Umwelt ist eine Herausforderung, die in Klimaaktionsprogrammen auf der ganzen Welt formuliert wird; Somit stellt es für die Europäischen Kommission, US-amerikanische Unternehmensgruppen und Umwelt- und Regierungsverbände, hin zu Japan in seinem Versuch, nach dem tragischen Vorfall von Fukushima die Kernenergie für die Stromversorgung zu ersetzen, bis hin zu den sieben Schwellenländern ein weltweites Bestreben dar, dem Klimawandel entgegenzuwirken und schließlich die Temperatur des Planeten zu stabilisieren. Das letztendliche Ziel besteht darin, den steigenden Bedarf an nachhaltiger und erneuerbarer Energie zu decken und gleichzeitig dem Klimawandel entgegenzuwirken und einen Übergangzu einer kohlenstoffarmen modernen Wirtschaft zu begleiten.
  • Methan hat unter den flüchtigen Kohlenwasserstoffen die höchste Energiedichte pro Kohlenstoffatom, und sein Potenzial zur Energieumwandlung ist weitaus größer als das jedes anderen Erdgases, das direkt durch Verbrennung in Gegenwart von Sauerstoff oder mit Hilfe von Brennstoffzellen zur Stromerzeugung genutzt wird.
  • Als Erdgas stellt Methan daher eine nachhaltige und erneuerbare Energiequelle dar und ersetzt bereits heute zunehmend Kohle und andere fossile Brennstoffe. Allerdings sind die Bemühungen um eine dramatische Verringerung der Umweltauswirkungen und die Rentabilität der Methan Produktion, Lagerung und seines Transports noch nicht befriedigend.
  • Einer der größten technischen Nachteile bei der Nutzung von Methan in großem Maßstab hängt z.B. mit dem hohen Gehalt an Schadstoffen zusammen, die im fossilen Erdgas verbleiben, und damit mit der Notwendigkeit kostspieliger Reinigungsverfahren einzusehen. Darüber hinaus gibt es eine lange Liste noch ungelöster Fragen, wie z.B. die Notwendigkeit geeigneter Lagerungsanlagen für Methan, die damit verbundene Notwendigkeit besserer Druckrückhaltesysteme, Geruchsbelästigung durch Anhäufung großer Gasmengen, meist durch sulfatreiche Verunreinigungen im Erdgas, Explosionsgefahr, Leckagen während des Transports und der Lagerung - all dies behindert und verzögert derzeit die Methanausbeutung.
  • Nichtsdestotrotz hat das Potenzial von Methan für die Energieerzeugung auf dem globalen Markt zunehmend an Bedeutung gewonnen. Die jüngste Forschung konzentriert sich daher auf die Entwicklung und Verbesserung von Methoden zur Methanerzeugung mit Methanogenen, z.B. Archaea, die in der Lage sind, erneuerbares Methan aus Kohlendioxid und Wasserstoff sehr effizient zu erzeugen. Gegenwärtig beschreibt der Stand der Technik mehrere Ansätze, Gaszusammensetzungen mit Methan anzureichern, das durch den Einsatz von methanogenen Mikroorganismen erzeugt wird. Für die industrielle Produktion von Methan unter Verwendung von Archaea wird z.B. der Methanothermobacter thermoautotrophicus-Stamm DSM3590 - hinterlegt und kommerziell erhältlich bei der DSMZ, der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen - regelmäßig verwendet.
  • Diese Art der Methanproduktion findet in geeigneten Bioreaktoren/Zellen statt und kann überall auf der Welt, insbesondere in jeder Umgebung mit schlechter Infrastruktur, inder die allgemein benötigt Rohstoffe in der Atmosphäre vorhanden sind, leicht eingerichtet werden. Am wichtigsten ist, dass sie eine allgemeine Gaszusammensetzungen bereitstellt, die mit Methan und nur einer geringeren Menge an Verunreinigungen angereichert sind, wobei erwartet wird, dass solche Zusammensetzungen weniger Aufwand erfordern, bis sie bereit sind, in Energieversorgungssysteme eingespeist zu werden. Darüber hinaus ist die Umwandlung von Methan in Energie, bei der nur Kohlendioxid und Wasser anfällt, die sauberste Energie der Kohlenwasserstoffbrennstoffe.
  • Die Aufrüstung der Biomethanproduktion zu einer etablierten, skalierbaren und zuverlässigen erneuerbaren Energiequelle erweist sich weiterhin als Herausforderung, vor allem wegen der Forderung nach einem kontinuierlichen Prozess.
  • Nichtsdestotrotz steht die großtechnische Nutzung von Biomethan aufgrund seines vielversprechenden Potenzials unter aufmerksamer politischer und wirtschaftlicher Beobachtung, um die Technologie einträglich und kosteneffektiv zu machen; eine Nutzbarmachung von Methan wurde als wichtigstes kurzfristiges Ziel für die Bioverfahrenstechnik identifiziert und daher sind wirksame Lösungen für die oben genannten Nachteile und Verbesserungen der durch die methanogene Archaea angetriebenen Produktionsprozesse dringend erforderlich.
  • Eine wichtige Komponente für die Ermöglichung einer effizienten Produktion von methanangereicherten Gaszusammensetzungen sind verschiedene Stämme methanogener Mikroorganismen, die durch eine Reihe von Parametern charakterisiert sind und ein einheitliches Verhalten als Reaktion auf eine Reihe von Parametern zeigen. Es ist erwiesen, dass eine effiziente Methanisierung mit dieser Gleichförmigkeit des Verhaltens und damit mit der Reinheit der genannten Kultur zusammenhängen.
  • Wie normale heterogene Kulturen können auch Kulturen, die von einem reinen Stamm ausgehen, im Laufe ihres Lebenszyklus Anpassungen erfahren, z.B. aufgrund von Schwankungen der Übergangsparameter, die zum Auftreten von veränderten Organismen in der Kultur führen. Während die Anpassung eines natürlichen Systems in der Regel auf natürliche Anpassungsmechanismen zurückgeführt werden kann und darauf abzielt, die Kultur zu verbessern und die in der Umgebung vorhandenen Ressourcen bestmöglich zu nutzen, kann das Auftreten genetisch veränderter Organismen durch Anpassungsprozesse langfristig zu einer globalen Systemveränderung führen.
  • Bestehende Methoden zur genauen Typisierung von Archaeen, entweder mittels Fettsäureanalyse (Daria V. Dibrova, Environ Microbiol. 2014 Apr; 16(4): 907-918; Villanueva L. et al., Environ Microbiol. 2017 Jan;19(1):54-69. doi: 10.1111/1462-2920.13361. Epub 2016 Jul 7), Riboprinting (Clark CG, J Eukaryot Microbiol. 1997 Jul-Aug;44(4):277-83), Phänotypisierung oder PCR-Techniken sind jeweils nicht präzise, nicht genau und nicht allgemein zugänglich und/oder direkt verfügbar. Außerdem helfen sie nur bei der Unterscheidung zwischen Gattungen oder Familien von Mikroorganismen, nicht aber zwischen Arten. Außerdem wurde ihre Fähigkeit, hochauflösende Ergebnisse für Reinkulturen unter Bedingungen schwankender Parameter zu liefern, in diesen Dokumenten weder vorgeschlagen noch getestet.
  • Darüber hinaus sind Strategien zur Identifizierung methanogener Archaea in Boden, Fäkalien, Kulturen oder anderen ähnlichen Substraten oder ökologischen Nischen relativ neu, einige davon weniger als ein Jahrzehnt alt, und können unter anderem auf das wachsende Interesse an der Differenzierung zwischen Mikroorganismen zurückgeführt werden, die in der Lage sind, Kohlendioxid in den genannten Substraten zum Zwecke der Herstellung von verbessertem Biokraftstoff zu binden. Darüber hinaus kann es schwierig sein zwischen einzelnen Stämmen, im Falle von Kolonien von Mikroorganismen zu unterscheiden, da in komplexen Umgebungen aufgrund des synergischen Verhaltens dieser Spezies Ungenauigkeiten auftreten und aufrechterhalten werden; bis hin zu dem Punkt, dass bereits die Unterscheidung zwischen verschiedenen Arten aus verfügbaren Klonbibliotheken eine gewaltige Aufgabe darstellen kann.
  • Insbesondere Cleland et al., 2008 haben eine auf repetitiven Sequenzen basierende PCR-Methode getestet, die hauptsächlich für Bakterien entwickelt wurde und für die Quellenverfolgung von Krankenhaus- und Gemeindeinfektionen, Kontamination und epidemiologische Überwachung, für die Genotypisierung und Identifizierung von Archaea verwendet wird. In ihrem Beitrag konzentrierten sie sich auf Methanogene und extreme Halophile in Kulturen, in denen Wachstumsphase und Wachstumsgehalt nicht systematisch variiert worden waren. Es ist bekannt, wie die Fluktuationen dieser Parameter strukturelle DNA-Veränderungen hervorrufen können, die die Zuverlässigkeit derartiger Ergebnisse in Frage stellen, insbesondere bei der Anwendung auf Reinkulturen, die ständigen Schwankungen in ihrer Futterversorgung und Mikroumgebung ausgesetzt sind, und bei denen die Aufrechterhaltung dieser Reinheit für die Bereitstellung eines effizienten Methanisierungsprozesses von größter Bedeutung ist.
  • Ihre Methode verwendet die PCR-Amplifikation von sich wiederholenden kurzen DNA-Abschnitten zur Unterscheidung verschiedener Archaea-Arten; obwohl diese Wirksamkeit zeigt, wurde nicht berichtet, dass sie in variabler Umgebung und mit einer Kultur mit geringer Variabilität in Bezug auf ihre Bestandteile funktioniert.
  • Die Erwartung von Heterogenität in unkontrollierten/natürlichen Umgebungen verlangt sicherlich Methoden zur groben Identifizierung und/oder Diskriminierung und/oder Isolierung verschiedener Spezies, bietet aber möglicherweise keine gezielte hochauflösende Testmethode für Reinkulturen in kontrollierten Umgebungen, bei denen die Erwartung Heterogenität aufzufinden geringer ist.
  • Mutationen innerhalb derselben Art können aufgrund der Anpassung an die Kulturbedingungen und die Mikroumgebung in der gesamten Kultur auftreten.
  • In diesem Rahmen würde die Unterscheidung und/oder Isolierung von Unterschieden innerhalb derselben Spezies, die durch die Anpassung entstanden sind und zu sehr kleinen Variationen führen, eine äußerst genaue Methode erfordern, um diese kleinen Variationen zu identifizieren, indem man sie genau anvisiert, aber ohne vorher zu wissen, wo solche kleinen Variationen zu finden sind.
  • Es besteht daher die Notwendigkeit, schnelle und kostengünstige Qualitätskontrollen für, Monokulturen aus reinen Stämmen zu liefern, sowie weitere Methoden, die spezifisch genug sind, um auch die Unterscheidung zwischen Variationen innerhalb derselben Art zu ermöglichen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Überwindung der beschriebenen Nachteile des Standes der Technik, insbesondere die Bereitstellung einer zuverlässigen, schnellen und effektiven Methode zur Typisierung von Archaeen zur Gewährleistung von Reinkulturstämmen. Es ist daher ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, einen schnellen und effizienten Test für reine Archaea-Stammkulturen während ihres normalen Lebenszyklus zu etablieren, der durch einen parallelen reziproken Testansatz sogar optimiert werden kann, um dadurch Qualitätskontrolle und Genotypisierung in dynamischen Umgebungen zu ermöglichen.
  • Im gegenwärtigen Trend der technologischen Verbesserung zur Stabilisierung und Potenzierung der Methanproduktionsprozesse mit variablen Gaszusammensetzungen bei gleichzeitiger Gewährleistung einer hochreinen Methangaszusammensetzung im Abstrom, spielt die genaue Qualitätskontrolle der Kulturzusammensetzung eine wichtige Rolle.
  • Im Rahmen dieses technischen Fortschritts liefert die vorliegende Erfindung daher, wie in den Ansprüchen ausdrücklich spezifiziert, Lehren darüber, wie auf das Vorhandensein des reinen methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 (im folgenden M. thermoautotrophicus DSM3590 oder M.t. DSM3590) getestet werden kann und von anderen Archaeen unterschieden werden kann. Weiterhin wird gelehrt, wie man die Qualität und Reinheit einer gegebenen Zusammensetzung einer Archaea-Stammkultur, die am kontinuierlichen methanogenen Prozess beteiligt ist, sowie effektiv Genotypisierungsvarianten in dieser Kultur prüft.
  • Die Aufgabe der vorliegenden Anmeldung wurde durch die in Anspruch 2 der vorliegenden Erfindung beschriebene neu entwickelte Methode unter Verwendung von PCR-Primerpaaren gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung gelöst. Weitere Ausführungsformen beziehen sich auf Variationen dieser neu entwickelten Methode sowie auf einen Qualitätskontroll-Kit zur Verwendung beim Nachweis des methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 in einer gegebenen Probe. Zusätzlich sieht die Methode die Identifizierung von Varianten von M. thermoautotrophicus DSM3590 vor, die durch den Kit identifiziert und isoliert wurden, wie in den nachfolgenden abhängigen Ansprüchen beschrieben.
  • Insbesondere zur Erreichung des erklärten Ziels stellt die vorliegende Erfindung einen ersten Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Primer, ausgewählt aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 und/oder einen zweiten Polymerase-Kettenreaktions-Primer, ausgewählt aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:6, zur Verfügung, wobei jeder der ersten und jeder der zweiten Primer in der Lage ist, mit der DNA des methanogenen Mikroorganismus M. thermoautotrophicus DSM3590 zu hybridisieren, und wobei SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:4; sowie SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:5; sowie SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:6 ein Primerpaar bilden, das für die PCR-Amplifikation von Teilen einer genomischen DNA-Sequenz von M. thermoautotrophicus DSM3590 geeignet ist.
  • Der in der vorliegenden Anwendung verwendete Stamm „Methanothermobacter thermoautotrophicus, DSM3590“ wird auch als M. thermoautotrophicus str. hveragerdi bezeichnet und ist am DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, kommerziell erhältlich. Interessanterweise sind für diesen Stamm keine Sequenzdaten verfügbar.
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben es sich zur Aufgabe gemacht, eine einfache Methode zur Identifizierung von M. thermoautotrophicus DSM3590 in einer gegebenen Probe, die Archaea enthält, im Vergleich zu zeitaufwendigen Methoden nach dem Stand der Technik, z.B. Genomsequenzierung und/oder Amplikonsequenzierung, zurVerfügung zu stellen.
  • Zu Beginn entwarfen die Erfinder verschiedene Zufallsprimer mit dem Ziel, dass diese geeignet sind, DNA-Sequenzen von M. thermoautotrophicus DSM3590 zu amplifizieren und im AmplikonsExperiment DNA-Sequenzen von M. thermoautotrophicus DSM3590 von DNA-Sequenzen anderer nicht-M.-t.-DSM3590 Archaeen zu unterscheiden.
  • Mit anderen Worten, die Erfinder der vorliegenden Erfindung entwickelten Primerpaare zur spezifischen Amplifikation von Gensequenzen der Spezies M. thermoautotrophicus, DSM3590 für welche in Experimenten Amplikonsausgeschlossen wurde, dass sie geeignet sind, Gensequenzen von anderen Archaea-Arten als M. thermoautotrophicus, DSM3590 mittels PCR zu amplifizieren. Somit wurde eine Differenzierung gegenüber anderen Archaea-Arten möglich. Die Idee war also, dass die Verwendung dieser Primer in einer PCR-Reaktion die Prüfung ermöglicht, ob in einer Probe, die Archaea von M. thermoautotrophicus, DSM3590 enthält, solche DNA und ausschließlich solche DANN vorhanden ist.
  • Überraschenderweise stellten die Erfinder fest, dass aus der Vielzahl der getesteten Primer die gemäß der vorliegenden Erfindung offenbarten Primer nicht nur DNA-Sequenzen von M. thermoautotrophicus DSM3590 amplifizieren, sondern auch geeignet waren, DNA-Sequenzen mindestens eines weiteren Nicht-Methanothermobacter thermoautotrophicus Archaea zu amplifizieren.
  • Noch interessanter ist die Feststellung der Erfinder, dass die von den Primern der vorliegenden Erfindung erzeugten Amplikons einzelne Nukleotidvariationen innerhalb der Primer-amplifizierten DNA-Sequenzen (Amplikons) im Vergleich zu anderen, nicht mit M. thermoautotrophicusthermoautotrophicus Archaea verwandten Varianten und auch im Vergleich zu anderen mit M. thermoautotrophicus DSM3590 verwandten Varianten enthielten. Es wurde festgestellt, dass diese Einzelnukleotidvarianten eine Differenzierung von M. thermoautotrophicus DSM3590 gegenüber anderen, nicht mit M. thermoautotrophicus DSM3590 Archaea verwandten Varianten und sogar gegenüber anderen mit M. thermoautotrophicus DSM3590 verwandten Varianten unter Verwendung spezifischer nachgeschalteter Verdauungsreaktionen, wie im Folgenden beschrieben, ermöglichen.
  • Der besonders überraschende Effekt, durch den sich die Primer gemäß der vorliegenden Erfindung von anderen gewöhnlichen Primern unterscheiden, die sich an Nukleinsäuresequenzen methanogener Mikroorganismen binden können, beruht also auf ihrer Fähigkeit, mit hoher Auflösung innerhalb derselben Spezies zu unterscheiden und dabei die Identifizierung von Sequenzvariationen zu ermöglichten; welche bei Verwendung von anderen Primern derselben Spezies, aus der die Variation hervorgegangen ist, zugeschrieben worden wären.
  • Die genannten PCR-Primerpaare werden in dem Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins des methanogenen Mikroorganismus M. thermoautotrophicus DSM3590 gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, das die folgenden Schritte umfasst
    1. a. Gewinnen einer Probe, die methanogene Mikroorganismen (Zellen) enthält, und Anwendung von Mitteln und Techniken zum Freisetzen der DNA aus den Mikroorganismen, um eine ungereinigte DNA-Probe zu erhalten, oder Gewinnen einer Probe, die gereinigte DNA der methanogenen Mikroorganismen enthält;
    2. b. Verwenden der ungereinigten DNA-Probe oder der gereinigten DNA-Probe gemäß Schritt a. in einer PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaares, umfassend einen ersten und einen zweiten Primer nach Anspruch 1, um eine amplifizierte DNA-Sequenz (Amplikon) zu erhalten, wobei das Amplikon wenigstens eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz umfasst;
    3. c. Aufreinigen des jeweiligen Amplikons;
    4. d. Durchführen einer ersten Verdauungsreaktion mit dem Amplikon von Schritt c. durch Inkubieren des Amplikons in einem Reaktionspuffer mit wenigstens einem ersten Restriktionsenzym, das eine erste Erkennungssequenz erkennt, für eine Zeit, die ausreicht, um Restriktionsfragmente zu bilden;
    5. e. Bestimmen der Anzahl der gebildeten Restriktionsfragmente und ihrer Größe (Restriktionsmuster), z.B. durch Gelelektrophorese und;
    6. f. Genotypisieren des methanogenen Mikroorganismus auf der Grundlage des Restriktionsmusters;
    7. g. gegebenenfalls Sequenzieren des gereinigten Amplikons von Schritt c. oder wenigstens von Teilen davon und/oder des verdauten Amplikons von Schritt d. oder wenigstens von Teilen davon und/oder des Amplikons nach derVerdauungsreaktion von Schritt d. oder wenigstens von Teilen davon.
  • Um zu prüfen, ob die erfinderischen Primerpaare spezifisch amplifiziertes M. thermoautotrophicus, DSM3590 amplifizierten, führten die Erfinder nach der PCR-Amplifikation eine Qualitätskontrolle durch, indem sie das mit den Primern der vorliegenden Erfindung erzeugte Amplikon in einer Verdauungsreaktion durch Anwendung eines ersten Restriktionsenzyms exponierten. Interessant ist, dass das erste Restriktionsenzym, das eine erste Erkennungssequenz erkannte, das Amplikon von M. thermoautotrophicus DSM3590 nicht verdaut hat.
  • Überraschenderweise identifizierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung, indem sie die genannten Restriktionsenzym-Verdauungsreaktionen mit den spezifischen Amplikons unter Verwendung einer Probe durchführten, die vermutlich nur Archaea-Arten von M. thermoautotrophicus DSM3590 enthielt (d.h. die Probe wurde als reine Monokultur-Stammprobe angenommen), ein Restriktionsmuster, das mit dem von M. thermoautotrophicus DSM3590 nicht verwandt ist. Dieses nicht verwandte Restriktionsmuster deutete auf das Vorhandensein einer Stammvariante von DSM3590 hin, d.h. die Erfinder stellten fest, dass mittels Gelelektrophoreseanalyse mehr als das erwartete eine Restriktionsfragment sichtbar war.
  • Durch weitere Tests einschließlich der Amplikonsequenzierung fanden die Erfinder heraus, dass die genannten Primer auch in der Lage waren, die DNA-Sequenz anderer M. thermoautotrophicus-Stämme zu amplifizieren, die sich von M. thermoautotrophicus DSM3590 unterscheiden.
  • Die Genotypisierung des methanogenen Mikroorganismus als M. thermoautotrophicus DSM3590 in Schritt f) kann visuell auf der Grundlage des Restriktionsmusters des primeramplifizierten Produkts nach derVerdauungsreaktion bewertet werden.
  • Somit kann diese mindestens eine erste Restriktionsenzym-Erkennungssequenz in einer nachfolgenden Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP)-Analyse, wie sie nach dem Stand der Technik weithin bekannt ist, verwendet werden, um das gewonnene Restriktionsmuster des mit dem Restriktionsenzym behandelten spezifischen Amplikons von M. thermoautotrophicus DSM3590 von dem anderer, nicht mit M.-t.-DSM3590 Archaea enthaltender Proben, die insbesondere mit dem mindestens einen ersten Restriktionsenzym gleich behandelt wurden, zu unterscheiden.
  • Nach einer Verkörperung der vorliegenden Erfindung führt nur das Amplikon des M. thermoautotrophicus DSM3590 zu einem Restriktionsmuster des Amplikons, das dem jeweiligen unverdauten Amplikon entspricht, während andere M. thermoautotrophicus-Varianten aufgrund einer einzigen Nukleotidvariation in der ersten Erkennungssequenz des Amplikons mindestens zwei Restriktionsfragmente spezifischer Größe aufweisen, die im Idealfall so unterschiedlich groß sind, dass sie mit geeigneten Mitteln, insbesondere bei Verwendung der Gelelektrophorese klar unterschieden werden können.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung musste zunächst eine entsprechende Region der genomischen DNA gefunden und unter Verwendung der Primer der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden, um anschließend eine Aussage über das Vorhandensein der zu analysierenden Nukleotidsequenz treffen zu können. Eine weitere Voraussetzung für die erfinderische Methode ist das Vorhandensein einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz aufgrund einer einzigen Nukleotidvariation ausschließlich in der Archaea M. thermoautotrophicus DSM3590 oder umgekehrt in einer nicht-M.thermoautotrophicus DSM3590 (im Folgenden „nicht-M.-t.-DSM3590“) Sequenz.
  • Diese Einzelnukleotid-Variationen, auch als „Einzelnukleotid-Polymorphismen“ (SNPs) im Amplikon bezeichnet, erwiesen sich während laufender Experimente als geeignet, Verdauungsreaktionen unter Verwendung selektiver Restriktionsenzyme durchzuführen, die Erkennungssequenzen innerhalb des Amplikons erkennen, wobei das Vorhandensein einer Erkennungssequenz von der Identität der jeweiligen Nukleotidbase dieses SNPs, die in der Erkennungssequenz enthalten ist, abhängig ist. Mit anderen Worten, je nach Anwesenheit und Nukleotididentität dieses SNPs wird es entweder von dem jeweiligen Restriktionsenzym erkannt oder nicht, d.h. die Erkennungssequenz ist entweder vorhanden und lesbar oder nicht vorhanden, d.h. zerstört. Die erfindungsgemäße Methode erlaubt daher den direkten Nachweis des Vorhandenseins von Nukleotidvariationen ohne weitere Sequenzierung des Amplikons. Sie kann sogar verwendet werden, um den jeweiligen Archaea-Stamm aufgrund der genannten einzelnen Nukleotidvariation zu identifizieren.
  • Unter „Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP)“ ist gemäß der vorliegenden Erfindung auch jede Nukleotidveränderung (Transversion oder Transition) und sogar Deletionen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotide innerhalb einer Nukleotidsequenz zu verstehen, die im Allgemeinen letztlich (mindestens) eine einzelne Nukleotidveränderung innerhalb der Nukleotidsequenz bewirken.
  • Ein Vorteil der Methode, auch als PCR-RFLP- oder CAPS-Assay bezeichnet, die der erfindungsgemäßen Methode zugrunde liegt, besteht darin, dass das spezifische Fragmentmuster nach einer Verdauungsreaktion des PCR-Produktes mittels Gelelektrophorese leicht sichtbar gemacht werden kann. So kann es z.B. im Falle einer gemischten Archaea-Kultur von z.B. zwei Archaea-Varianten, die sich in SNP11, SNP19 oder SNP20 voneinander unterscheiden, durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung mindestens eines spezifischen Restriktionsenzyms, das aufgrund dieses SNP eine Restriktionssequenz erkennt, wobei der SNP in dieser Erkennungssequenz liegt und in den beiden verschiedenen Archaea jeweils unterschiedlich ist, zu spezifischen unterschiedlichen Banden im Restriktionsmuster dieser Kulturen kommen, die nach der Gelelektrophorese in einem Agarosegel sichtbar werden. Die Anwendung dieser Methode auf das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es daher, M. thermoautotrophicus DSM3590 mit einfachen visuellen Mitteln leicht und vorteilhaft von anderen Archaeen zu unterscheiden und zu analysieren, ob es sich um eine reine Kultur oder um eine Mischkultur handelt.
  • Vorteilhafterweise stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, dass mit dieser Methode eindeutig festgestellt werden konnte, ob eine bestimmte Ausgangsprobe eine reine M. thermoautotrophicus DSM3590-Kultur enthält bzw. nur M. thermoautotrophicus DSM3590 als Archaea enthält oder ob sie auch oder ausschließlich nicht M.-t.-DSM3590 Archaea enthält.
  • Bemerkenswert ist, dass die vorliegende Methode einfach durchzuführen ist und zuverlässige Ergebnisse liefert, um festzustellen, ob in einer gegebenen Probe, die methanogene Mikroorganismen enthält, die enthaltenen methanogenen Mikroorganismen nur M. thermoautotrophicus DSM3590 oder andere nicht-M.-t.-DSM3590-methanogene Archaea enthalten, indem zeit- und kostenintensive Methoden vermieden werden. Darüber hinaus ist es mit der vorliegenden Methode möglich, M. thermoautotrophicus DSM3590 zu identifizieren und gegenüber anderen methanogenen Archaeen zu differenzieren, und sogar andere auf M. thermoautotrophicus basierende Stämme zu identifizieren, indem zeit- und kostenintensive Sequenzierungsmethoden, wie z.B. die Sequenzierung des gesamten Genoms, vorteilhaft vermieden werden. Angesichts der Genauigkeit der erfinderischen Methode ist selbst die Sequenzierung des mit PCR-Primerpaaren erzeugten Amplikons nicht erforderlich, kann aber natürlich aus weiteren Qualitätsprüfungsgründen durchgeführt werden.
  • Die Amplifikation der gewünschten DNA-Region wird durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erreicht. Unter „Amplifikation“ ist gemäß der vorliegenden Erfindung die Herstellung von zusätzlichen Kopien einer Nukleinsäuresequenz zu verstehen. Dies geschieht in der Regel mit Hilfe von in der Technik bekannten PCR-Technologien. Die „Polymerase-Kettenreaktion“ oder „PCR“ ist ein Verfahren zur Erhöhung der Konzentration eines Segments einer Zielsequenz in einem Gemisch genomischer DNA unter Verwendung von PCR-Primern.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist unter „Primer“ ein Oligonukleotid zu verstehen, unabhängig davon, ob es natürlich wie in einem gereinigten Restriktionsverdau vorkommt oder synthetisch hergestellt wird, das unter Bedingungen, unter denen die Synthese eines Primerverlängerungsprodukts, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, induziert wird (d.h. in Gegenwart von Nukleotiden und einem induzierenden Agens wie der DNA-Polymerase und bei geeigneter Temperatur und geeignetem pH-Wert), als Ausgangspunkt der Synthese wirken kann. Der Primer ist vorzugsweise einsträngig für maximale Effizienz bei der Amplifikation, kann aber alternativ auch doppelsträngig sein. Wenn der Primer doppelsträngig ist, wird er zunächst behandelt, um seine Stränge zu trennen, bevor er zur Herstellung von Verlängerungsprodukten verwendet wird. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonukleotid. Der Primer muss ausreichend lang sein, um die Synthese von Extensionsprodukten in Gegenwart des induzierenden Agens vorzubereiten. Die genauen Längen der Primer hängen von vielen Faktoren ab, einschließlich der Temperatur, der Primerquelle und der Anwendung der Methode. PCR-Primer sind vorzugsweise mindestens etwa 10 Nukleotide lang, am besten mindestens etwa 20 Nukleotide. Beispiele für PCR-Primer, die in den erfindungsgemäßen Methoden verwendet werden können, sind Primer, wie sie in SEQ ID NO: 1 - 6 zu finden sind.
  • Die hier verwendeten Begriffe „Restriktionsendonukleasen“ und „Restriktionsenzyme“ beziehen sich auf bakterielle Enzyme, von denen jedes doppelsträngige DNA an oder in der Nähe einer spezifischen Nukleotidsequenz schneidet, die als „Erkennungssequenz“ bekannt ist. Es handelt sich um „sequenzspezifische DNA-Endonukleasen“, die in der Lage sind, Doppelstrangbrüche in doppelsträngiger DNA auf sequenzspezifische Weise an einer oder mehreren Erkennungssequenzen zu erzeugen. Diese DNA-Spaltung kann zu stumpfen Enden oder so genannten „klebrigen“ Enden der DNA (mit einem 5'- oder 3'-Überhang) führen. Die Spaltstelle kann innerhalb oder außerhalb der Erkennungssequenz lokalisiert sein. Es können verschiedene Arten von Endonukleasen eingesetzt werden. Restriktionsenzyme sind in der Kunst gut bekannt und können z.B. leicht aus verschiedenen kommerziellen Quellen bezogen werden (z.B. New England Biolabs, Inc., Beverly, Massachusetts). Auch die Methoden zur Verwendung von Restriktionsenzymen sind in der Kunst allgemein bekannt und Routine. Bevorzugte Restriktionsenzyme sind solche, die beim Schneiden des Amplikons mindestens 2 DNA-Fragmente produzieren. DNA-Fragmente, die mit Hilfe von Restriktionsenzymen gewonnen werden, können z.B. durch Gelelektrophorese als Banden nachgewiesen werden. Restriktionsenzyme können verwendet werden, um Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs) zu erzeugen. „RFLPs“ sind im Wesentlichen einzigartige Fingerabdruck-Momentaufnahmen eines DNA-Stücks, sei es ein ganzes Chromosom (Genom) oder ein Teil davon, wie z.B. die Region des Genoms, die die in der vorliegenden Erfindung offenbarten SNP-Loci umfasst.
  • RFLPs werden durch Schneiden („Restriktion“) eines DNA-Moleküls mit einer Restriktionsendonuklease erzeugt. Viele hundert solcher Enzyme wurden isoliert, wie sie natürlicherweise von Bakterien hergestellt werden. Jedes der vielen hundert verschiedenen Restriktionsenzyme schneidet (d.h. „spaltet“ oder „restriktiert“) DNA an einer anderen Sequenz der 4 grundlegenden Nukleotide (A, T, G, C), aus denen alle DNA-Moleküle bestehen, z.B. könnte ein Enzym spezifisch und nur die Sequenz A-AT-G-A-C erkennen, während ein anderes spezifisch und nur die Sequenz G-T-A-C-T-A erkennen könnte, usw. Je nach dem einzigartigen Enzym können solche Erkennungssequenzen unterschiedlich lang sein, von nur 4 Nukleotiden bis zu 21 Nukleotiden. Je grösser die Erkennungssequenz ist, desto weniger Restriktionsfragmente entstehen, da die Wahrscheinlichkeit, dass sie in der gesamten DNA wiederholt gefunden wird, umso geringer ist, je grösser die Erkennungsstelle ist.
  • Nach der Verdauung werden die entstandenen Einzelfragmente nach ihrer Größe voneinander getrennt.
  • Jede Methode, die zur Trennung von DNA geeignet ist, wird von den Methoden der vorliegenden Erfindung umfasst, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gelelektrophorese, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), Massenspektroskopie und Verwendung einer mikrofluidischen Vorrichtung.
  • In einerVerkörperung werden die DNA-Fragmente durch Agarosegelelektrophorese getrennt. Bei der Gelelektrophorese werden unterschiedlich große geladene Moleküle durch ihre Bewegungsgeschwindigkeit durch ein stationäres Gel unter dem Einfluss eines elektrischen Stroms getrennt. Diese getrennten DNA-Fragmente können leicht sichtbar gemacht werden, z.B. durch Färbung mit Ethidiumbromid und durch Betrachtung des Gels unter UV-Beleuchtung. Das Bandenmuster spiegelt die Größe der restriktionsverdauten DNA wider.
  • Andere Methoden, die die neuartigen SNPs der Erfindung zum Nachweis oder Genotyp von M. thermoautotrophicus DSM3590 oder zur Differenzierung von M. thermoautotrophicus DSM3590 gegenüber Varianten von M. thermoautotrophicus DSM3590 nutzen, werden hier ebenfalls vermittelt. Zu diesen Methoden gehören Hybridisierungsmethoden, entweder unter Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls der Erfindung als Sonde oder eines Nukleinsäuremoleküls, das in der Lage ist, an eine offenbarte Nukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung zu hybridisieren. Siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molekulares Klonen: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Solche Methoden, die Hybridisierungstechniken verwenden, sind einem Fachmann gut bekannt und hierin enthalten. Dazu gehören unter anderem Techniken, die einem Fachmann bekannt sind, wie Southern Blotting, Shift Mobility Assays und Flourescent In Situ Hybridization (FISH).
  • Bei Hybridisierungstechniken kann es sich bei der/den Hybridisierungssonde(n) um genomische DNA-Fragmente, PCR-amplifizierte Produkte oder andere Oligonukleotide handeln, und sie kann/können die gesamte oder einen Teil einer bekannten, hier offengelegten Nukleotidsequenz umfassen. Darüber hinaus kann sie mit einer nachweisbaren Gruppe wie 32P oder einem anderen nachweisbaren Marker wie anderen Radioisotopen, einer fluoreszierenden Verbindung, einem Enzym oder einem Enzym-Co-Faktor markiert sein. Der Begriff „markiert“ soll in Bezug auf die Sonde sowohl die direkte Markierung der Sonde durch Kopplung (d.h. physikalische Verknüpfung) einer nachweisbaren Substanz an die Sonde als auch die indirekte Markierung der Sonde durch Reaktivität mit einem anderen direkt markierten Reagenz umfassen. Beispiele für indirekte Markierung sind die Endmarkierung einer DNA-Sonde mit Biotin, so dass sie mit fluoreszenzmarkiertem Streptavidin nachgewiesen werden kann.
  • Methoden, die eine der oben angegebenen Hybridisierungstechniken umfassen, können auch zur Isolierung des jeweiligen M. thermoautotrophicus DSM3590 oderzur Isolierung der jeweiligen Variante verwendet werden.
  • Mit „Probe“ ist im Sinne des vorliegenden Antrags eine flüssige oder feste angegebene Quelle methanogener Archaea gemeint, die z.B. aus deponierten Sammlungen von Mikroorganismen stammt und/oder alternativ aus einer Reihe von Umweltquellen gewonnen wird, wie im Stand der Technik berichtet. Beispiele für Umweltquellen methanogener Mikroorganismen sind im Allgemeinen anaerobe Böden und Sande, Moore, Sümpfe, Marschland, Ästuare, dichte Algenmatten, Schlamm und Sedimente sowohl an Land als auch im Meer, z.B. der Untergrund eines Gezeitenflut-Sediments, Tiefsee- und Tiefbrunnenböden, Abwasser- und organische Abfallstandorte und - behandlungsanlagen sowie Darmwege und Fäkalien von Tieren. Darüber hinaus kann die „Probe“, die methanogene Archaea umfasst, eine Probe sein, die direkt aus der flüssigen Phase eines laufenden Bioreaktors, d.h. einer bioverfahrenstechnischen Fermentation, gewonnen wird.
  • Nach dem Verständnis der vorliegenden Erfindung steht ein Bioreaktor für einen biologischen Reaktor und ist entweder ein Bioreaktionsgefäß oder eine Bioreaktionshülle oder ein Bioreaktionstank und/oder mindestens eine Bioreaktionskammer und/oder eine Zelle oder eine Kombination davon, wie auch nach dem Stand der Technik vorgesehen, die den Schwankungen von e standhalten kann.g. Temperatur und/oder Druck u.a. widerstehen kann und/oder in der Lage ist, die jeweils zugeordneten oder aufrechtzuerhaltenden Werte von z.B. Temperatur und/oder Druck vor, nach oder während des Reaktionsprozesses aufrechtzuerhalten, und wobei die für die Ausführung der Erfindung relevanten beabsichtigten Reaktionen stattfinden können. Solche Reaktionen werden als Bioreaktionen verstanden, soweit sie sich auf den Bereich der Reaktionen beziehen, an denen Mikroorganismen beteiligt sind, und beziehen sich hierauf ihre normale Physiologie - wie z.B. metabolische Gärung oder aerobe oder anaerobe Verdauung - und die als solche geeignete Umgebungen, geeignete Kulturen von Mikroorganismen, geeignete Kulturmedien und geeignete Reaktanten erfordern, damit sie stattfinden können. Ein Bioreaktor im Sinne der Erfindung arbeitet zuverlässig innerhalb der Toleranzwerte jeder Variablen, um die Methode wie offenbart zu ermöglichen, und es wird erwartet, dass er die aufgeführten Schritte im Laufe der Zeit zuverlässig ausführen kann.
  • In einerVerkörperungdervorliegenden Erfindung umfasstdie Methode ferner den Schritt Sequenzierung des gereinigten Amplikons von Schritt d. oder zumindest von Teilen davon und/oder des Amplikons nach derVerdauungsreaktion von Schritte. oder zumindest von Teilen davon. Dieser Schritt kann optional durchgeführt werden, um die Ergebnisse nach der zuvor vorgestellten Methode der vorliegenden Erfindung weiter zu validieren.
  • Entsprechend einer Verkörperung der vorliegenden Erfindung umfasst die Methode ferner den Schritt
  • Anwendung von mindestens einem Gefrier- und Auftauzyklus auf die Probe, die methanogene Mikroorganismen gemäß Schritt a. enthält, um die DNA von den methanogenen Mikroorganismen freizusetzen. Somit ist es auch möglich, Mittel und Techniken zur Freisetzung der DNA aus den methanogenen Mikroorganismen anzuwenden, bevor eine PCR-Reaktion gemäß Schritt b. des genannten Verfahrens durchgeführt wird. Andere Mittel und Techniken zur Freisetzung der DNA aus Zellen, einschließlich methanogener Einzelzell-Mikroorganismen, sind dem Fachmann gut bekannt und werden hierin eingeschlossen. Die Verwendung von nicht gereinigter, aus diesem Ansatz gewonnener DNA für weitere PCR-Reaktionen nach der Methode der vorliegenden Erfindung bringt den Vorteil, eine zeit- und kostenintensive Aufreinigung zu ersparen. Hindernisse und Risiken für nachfolgende Reaktionen können jedoch nach wie vor darin bestehen, dass die Menge der DNA in nicht gereinigten DNA-Proben nicht berechnet wird und dass DNAse vorhanden sind, die die genomische DNA der Probe aktiv verdauen können. Durch die Verwendung frischer Zellproben und die Durchführung der DNA-Präparation immer auf Eis können diese Faktoren jedoch kontrolliert und minimiert werden. Selbstverständlich ist es weiterhin möglich, diesen Proben DNAse-Inhibitoren zuzusetzen, die Komponenten nachfolgender Reaktionen (z.B. PCR) nicht stören, und/oder die DNA-Menge mit geeigneten, dem Stand der Technik entsprechenden Methoden, die dem Handwerker bekannt sind, zu berechnen.
  • Nach einer anderen Verkörperung der Methode der vorliegenden Erfindung umfasst die Methode ferner die folgenden Schritte:
    • • Durchführung einer Qualitätskontrolle der Genotypisierungvon Schritt f. durch Durchführung einer zweiten Verdauungsreaktion, mit dem Amplikon von Schritt b. oder Schritt c. durch Inkubation des Amplikons in einem Reaktionspuffer mit mindestens einem zweiten Restriktionsenzym, das eine zweite Erkennungssequenz erkennt, die sich teilweise mit der ersten Erkennungssequenz für eine zur Bildung von Restriktionsfragmenten ausreichende Zeit überschneidet;
    • • die Bestimmung der Anzahl der gebildeten Restriktionsfragmente und deren Größe (Restriktionsmuster), z.B. durch Gelelektrophorese und
    • • Genotypisierung des methanogenen Mikroorganismus auf der Grundlage des Restriktionsmusters;
  • Die zweite Erkennungssequenz ist zumindest im Amplikon dieses Archaea-Stamms vorhanden, der in der ersten Verdauungsreaktion aufgrund eines Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) in der zweiten Erkennungssequenz des Amplikons nicht vom ersten Restriktionsenzym geschnitten wurde. Somit ist die zweite Erkennungssequenz zumindest im Amplikon von M. thermoautotrophicus DSM3590 oder zumindest im Amplikon des Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea vorhanden.
  • Nach einer Verkörperung der vorliegenden Erfindung ist die zweite Erkennungssequenz sowohl im Amplikon von M. thermoautotrophicus DSM3590 als auch im Amplikon der Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea vorhanden.
  • In einer anderen Verkörperung ist die zweite Erkennungssequenz aufgrund eines Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) in der zweiten Erkennungssequenz des Amplikons von M. thermoautotrophicus DSM3590 nur im Amplikon von M. thermoautotrophicus DSM3590 vorhanden, so dass das zweite Restriktionsenzym so gewählt wird, dass nur das von M. thermoautotrophicus DSM3590 abgeleitete Amplikon verdaut wird.
  • Überraschenderweise haben die Erfinder nach der Identifizierung eines Restriktionsmusters, das nicht mit dem von M. thermoautotrophicus DSM3590 verwandt ist, durch die Durchführung der zweiten Verdauungsreaktion herausgefunden, dass dies ein Restriktionsmuster ergibt, das zur weiteren Unterscheidung der gefundenen Variante vom M. thermoautotrophicus DSM3590 nützlich ist.
  • Optional kann anschließend auch ein Genotypisierungsschritt auf Basis der amplifizierten DNA (Amplikon), z.B. gemessen durch Sequenzierung des Amplikons oder zumindest von Teilen des Amplikons der Variante, durchgeführt werden.
  • Diese gefundene, mit M. thermoautotrophicus DSM3590 verwandte Variante konnte eindeutig identifiziert und/oder charakterisiert werden durch optionale Genotypisierung dieser Stammvariante auf der Grundlage der amplifizierten DNA (Amplikon) und anschließenden Vergleich mit Sequenzen, die in öffentlichen Sequenzdatenbanken gefunden wurden, um die Genotypisierung des methanogenen Mikroorganismus auf der Grundlage des Restriktionsmusters gemäß Schritt i.) der vorliegenden erfinderischen Methode zu überprüfen. Darüber hinaus können öffentlich zugängliche Programme, die eine Vorhersage der Restriktionsstellen in einer bestimmten DNA-Sequenz unter Verwendung eines spezifischen Restriktionsenzyms erlauben, auf das sequenzierte Amplikon angewandt werden, um das beobachtete frühere größenabhängige Restriktionsmuster, das von den Erfindern gefunden wurde, vorteilhaft weiter zu beweisen und somit eine weitere Qualitätskontrolle zu ermöglichen.
  • „Qualitätskontrolle“ oder „Qualitätsprüfung“ im Sinne der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf die sorgfältige und systematische Kontrolle oder Überprüfung der Identität einer Art / eines Stammes innerhalb der Kultur, um ihre Reinheit zu beurteilen. Gemäß der vorliegenden Erfindung bedeutet Reinheit einer Spezies/eines Stammes, dass das Genom aller Individuen dieser Kultur bei Individuen derselben Monospezies/Stammkultur vergleichbar identisch ist. Mit „vergleichbar identisch“ sind im Allgemeinen Nukleotidsequenzen des Genoms gemeint, die zu mindestens 95 %, 96 %, 97 % oder 98 % oder zu mindestens 98 % oder 99 % identisch sind. Methoden zur Sequenzierung eines kleinen DNA-Abschnitts als Amplikon sind einem Fachmann gut bekannt und umfassen z.B. die Sequenzierung nach Sanger.
  • Überraschenderweise konnten die Erfinder nach einer anderen Verkörperung sogar in einem weiteren Schritt besagte gefundene Stammvariante mit den gängigen Methoden des Standes der Technik isolieren. Diese Variante könnte optional in einem weiteren Schritt auf der Grundlage eines Vergleichs der genomischen DNA dieser Variante genotypisiert werden, z.B. durch Sequenzierung der genomischen DNA oder zumindest von Teilen davon ausgewertet werden.
  • So konnten die Erfinder mit der vorliegenden Methode einen M. thermoautotrophicus, bezeichnet als Stamm UC 120910, identifizieren. Der in der vorliegenden Anmeldung verwendete Stamm „Methanothermobacter thermoautotrophicus, Stamm UC 120910“ wird synonym auch ECH0100 (Laborname) genannt.
  • Nach einer weiteren Ausführungsform wird die Methode der vorliegenden Erfindung zur Unterscheidung des Stammes M. thermoautotrophicus DSM3590 von anderen M. thermoautotrophicus-Stämmen verwendet, oder z.B. aus anderen Archaeen, der Gruppe bestehend aus Methanothermobacterium, Methanobrevibacter, Methanothermobacter, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Methanospirillium, Methanosaeta, Methanogenium, Methanoculleus und Methanothermococcus oder Mischungen der vorgenannten.
  • Manchmal können Kulturen von Archaeen als Reaktion auf die besonderen Bedingungen, unter denen die Kultivierung durchgeführt wurde, natürliche Veränderungen erfahren. Die Kulturbedingungen werden von mehreren Parametern wie Temperatur, pH-Wert, Druck, Zelldichte, Volumen, Feuchtigkeit, Salzgehalt, Leitfähigkeit, Kohlenstoffgehalt, Stickstoffgehalt, Vitamingehalt, Aminosäuregehalt, Mineralstoffgehalt oder einer Kombination davon beeinflusst, und entsprechend jeder dieser Bedingungen kann von einer beliebigen Anzahl von Spezies innerhalb der Reaktorumgebung ein spezifischer Anpassungsprozess vorgenommen werden.
  • Der Vorteil der Verwendung eines bestimmten Reinststammes liegt in der höheren Methanisierungseffizienz und damit in der Überprüfung seiner Identität im Laufe der Zeit, um sicherzustellen, dass die Reinheit erhalten bleibt. Die derzeit angebotene Methode ist sehr geeignet, zwischen den Stämmen zu unterscheiden und somit Reinkulturen zu garantieren und dementsprechend eine hohe Methanisierungseffizienz zu erhalten.
  • Gemäß einer Ausführungsform unterscheidet das vorgesehene Verfahren verschiedene Stämme auf der Basis von mindestens einem SNP im Amplikon, wobei dieser SNP Teil einer überlappenden Sequenz der ersten Erkennungssequenz des ersten Restriktionsenzyms und der zweiten Erkennungssequenz des zweiten Restriktionsenzyms ist und wobei der SNP aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SNP19, SNP11 und SNP20 ausgewählt ist.
  • Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Antrag von „SNP19“ wird unter „SNP19“ ein Einzelnukleotid-Polymorphismus an Position 418 im PCR-Fragment (Amplikon) der genomischen Nukleotidsequenz eines Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea, der durch das Primerpaar SEQ ID NO: 3 (vorwärts) und SEQ ID NO: 6 (rückwärts) im Vergleich zu dem PCR-Fragment (Amplikon) der genomischen Nukleotidsequenz an dieser Position von M. thermoautotrophicus DSM3590, amplifiziert durch dasselbe Primerpaar, PCR-amplifiziert wurde.
  • In einer Verkörperung der vorliegenden Erfindung ist der Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea M. thermoautotrophicus UC 120910 und der Einzelnukleotid-Polymorphismus ist eine G-zu-A-Übergangsmutation im entsprechenden Amplikon.
  • Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Antrag von „SNP11“ ist ein Einzelnukleotid-Polymorphismus an Position 105 im PCR-Fragment (Amplikon) der genomischen Nukleotidsequenz eines Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea, die durch das Primerpaar, nämlich SEQ ID NO: 1 (vorwärts) und SEQ ID NO: 4 (rückwärts), im Vergleich zu dem PCR-Fragment (Amplikon) der genomischen Nukleotidsequenz an dieser Position von M. thermoautotrophicus DSM3590, die durch das Primerpaar, nämlich SEQ ID NO: 1 (vorwärts) und SEQ ID NO: 4 (rückwärts), PCR-amplifiziert wurde.
  • Im Zusammenhang mit dem vorliegenden Antrag von „SNP20“ ist ein Einzelnukleotid-Polymorphismus an Position 168 im PCR-Fragment (Amplikon) der genomischen Nukleotidsequenz eines Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea, die durch das Primerpaar, nämlich SEQ ID NO: 2 (vorwärts) und SEQ ID NO: 5 (rückwärts), im Vergleich zum PCR-Fragment (Amplikon) der genomischen Nukleotidsequenz an dieser Position von M. thermoautotrophicus DSM3590, die durch das Primerpaar, nämlich SEQ ID NO: 2 (vorwärts) und SEQ ID NO: 5 (rückwärts), PCR-amplifiziert wurde.
  • In einer Verkörperung der vorliegenden Erfindung trägt die nicht-M.-t-DSM3590Archaea, die als Einzelnukleotid-Polymorphismus identifiziert wurde, eine Einbasen-Deletionsmutation.
  • Nach einer anderen Ausführungsform können die drei SNPs, d.h. SNP19, SNP11 und SNP20 auch komplementär für eine solche Diskriminierung verwendet werden, und als solche kann die Methode gemäß der vorliegenden Erfindung SNP19, SNP11 und SNP20 parallel für diese Diskriminierung verwenden. Für den Fall, dass widersprüchliche Ergebnisse erzielt werden und sich eines der Ergebnisse für einen entsprechenden SNP vom anderen unterscheidet, kann eine Sequenzierung der fraglichen Amplikons durchgeführt werden, um den Genotyp des Archaea-Stamms, der in der zu analysierenden Probe enthalten ist, zu bestimmen.
  • Nach einer anderen Verkörperung, bei der der SNP SNP19 ist, ist das erste Restriktionsenzym BamHI und das zweite Restriktionsenzym Avall. Nach noch einer anderen Ausführungsform, bei der der SNP SNP11 ist, das erste Restriktionsenzym Sfcl und das zweite Restriktionsenzym BstNI oder ECORII ist oder bei der der SNP SNP20 ist, ist das erste Restriktionsenzym Ndel.
  • Nach einer weiteren Ausführungsform wird die mit der Methode der Erfindung identifizierte Nicht-M.-t.-DSM3590-Variante als M. thermoautotrophicus UC 120910 bezeichnet.
  • In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Qualitätskontroll-Kit zur Verwendung beim Nachweis des Vorhandenseins des methanogenen Mikroorganismus M. thermoautotrophicus DSM3590 innerhalb einer gegebenen Probe bereitgestellt, das Folgendes umfasst
    • - mindestens einen Behälter
    • - einen ersten Primer nach Anspruch 1, der als Vorwärtsprimer dient;
    • - einen zweiten Primer nach Anspruch 1, der als Reverse Primer dient;
    • - wobei der erste und der zweite Primer ein Primerpaar bilden, das in der Lage ist, eine DNA-Sequenz des methanogenen Mikroorganismus M. thermoautotrophicus DSM3590 durch PCR zu amplifizieren;
    • - mindestens ein erstes Restriktionsenzym oder mindestens ein erstes und mindestens ein zweites Restriktionsenzym gemäß der vorliegenden Erfindung;
    • - optional mindestens einen Puffer, z.B. Elutionspuffer, Speicherpuffer und/oder Reaktionspuffer; und optional
    • - Gebrauchsanweisungen.
  • Insbesondere ist der Qualitätskontroll-Kit für die Verwendung bei der Sondierung und Genotypisierung einer Kultur methanogener Mikroorganismen vorgesehen.
  • Die im Kit enthaltenen Restriktionsenzyme eignen sich hervorragend zur Verwendung in der RFLP-Analyse.
  • Der Kit kann auch eine Kontrollprobe oder eine Reihe von Kontrollproben (positiv und negativ) enthalten, die untersucht und mit der enthaltenen Testprobe verglichen werden können. Jede Komponente des Kits ist normalerweise in einem einzelnen Behälter eingeschlossen, und alle verschiedenen Behälter befinden sich zusammen mit einer Gebrauchsanweisung in einer einzigen Packung. Der Kit kann auch ein Konservierungsmittel oder ein proteinstabilisierendes Mittel enthalten.
  • Das erste und zweite Restriktionsenzym werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus Avall, BamHI, BstNI, Ndel, Sfcl und EcoRII besteht.
  • Insgesamt können die drei SNP-Tests, wie sie im Kit gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, auch komplementär verwendet werden und als solche parallel durchgeführt werden. Für den Fall, dass widersprüchliche Ergebnisse erzielt werden und sich einer der Assays von den anderen unterscheidet, sollte in jedem Fall eine Sequenzierung der betreffenden Amplikons durchgeführt werden, um den Genotyp des Archaea-Stammes, der in der zu analysierenden Zellprobe enthalten ist, zu bestimmen.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Varianten des methanogenen Mikroorganismus M. thermoautotrophicus DSM3590, die mit dem Kit gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert und isoliert wurden.
  • In diesem Zusammenhang erwies sich die erfindungsgemäße Methode auch als geeignet, eine bestimmte Variante zu identifizieren, die als M. thermoautotrophicus UC 120910 bezeichnet wird.
  • Literaturhinweise
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  • Figurenliste
    • : Agarosegel, das die Ergebnisse der Elektrophorese von PCR-Produkten zeigt, die mittels Temperaturgradienten-PCR für SNP11- und SNP20-Amplikon erzeugt wurden, wobei die Annealing-Temperaturen zwischen 55° C und 70°C getestet wurden.
    • : Agarosegel, das die Ergebnisse der Elektrophorese von PCR-Produkten zeigt, die mittels Temperaturgradienten-PCR erzeugt wurden, um die optimale Annealing-Temperatur für SNP19-Primer zu bestimmen (Bahnen 9-15). Von links nach rechts wurden die Ergebnisse für SNP19-Amplikon mit steigender Annealing-Temperatur aufgetragen. Die Negativkontrolle der SNP19-Primer wurde aus Platzgründen auf ein separates Gel aufgetragen.
    • : Untersuchung der Assay-Sensitivität. Die PCR wurde mit allen Primern, die SNP11, SNP19 und SNP20 amplifizierten, unter Verwendung verschiedener Verdünnungen (1:10, 1:50 und 1: 100) einer 547 ng/µl Ausgangs-DNA-Lösung als PCR-Template und einer entsprechenden Negativkontrolle (Bahn „NTC“) durchgeführt.
    • : Agarosegel mit beladenen Proben aus der Verdauungsreaktion des SNP19-Amplikons nach Gelelektrophorese unter Verwendung gereinigter genomischer DNA-Proben als Ausgangstemplate für die PCR. Das Amplikon von DSM3590 und das Amplikon von nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea wurden mit dem BamHI-Restriktionsenzym für 2 h inkubiert und dann auf ein 2,5%iges Agarosegel sowie ein NTC (N) und das unbehandelte PCR-Amplikon aufgetragen. Als Marker (M) wurde der GeneRuler 50 bp DNA-Leiter von Thermo Fisher verwendet. Bei Verwendung von NEBuffer in der Verdauungsreaktion trat die erwartete Verdauungsreaktion des Amplikons, das aus einer Nicht-M.t.-DSM3590 Archaea-Probe stammt, nicht ein, und das Amplikon wurde nicht geschnitten. Die Umstellung von NEBuffer auf CutSmart-Puffer führte jedoch zu den erwarteten Ergebnissen, d.h. das Amplikon, das aus einer Nicht-M.-t.-DSM3590-Archaea-Probe gewonnen wurde, wurde geschnitten und war auf dem Gel gut sichtbar.
    • : Agarosegel mit beladenen Proben aus der Verdauungsreaktion des SNP11-Amplikons nach Gelelektrophorese unter Verwendung gereinigter genomischer DNA-Proben als Ausgangstemplate für die PCR. Das Amplikon von DSM3590 und das Amplikon von nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea wurden mit dem Sfcl-Restriktionsenzym für 2 h inkubiert und dann auf ein 2,5%iges Agarosegel sowie ein NTC und das unbehandelte PCR-Amplikon aufgetragen. Als Marker wurde die GeneRuler 50 bp DNA-Leiter von Thermo Fisher verwendet.
    • : Agarosegel mit beladenen Proben aus der Verdauungsreaktion des SNP20-Amplikons nach Gelelektrophorese unter Verwendung gereinigter genomischer DNA-Proben als Ausgangstemplate für die PCR. Das Amplikon von DSM3590 und das Amplikon von nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea wurden mit Ndel-Restriktionsenzym in a für 2 h inkubiert und dann auf ein 2,5%iges Agarosegel sowie ein NTC (N) und das unbehandelte PCR-Amplikon aufgetragen. Als Marker wurde die GeneRuler 50 bp DNA-Leiter von Thermo Fisher verwendet.
    • : Agarosegel mit beladenen Proben aus der ersten und zweiten Verdauungsreaktion des SNP19-Amplikons nach der Gelelektrophorese mit ungereinigter DNA aus einer Zellprobe als Testvorlage und gereinigten DNA-Proben als Positivkontrollen. Die Amplikons UC 120910 und DSM3590 wurden mit BamHI oder Avall fürjeweils 2h inkubiert und dann auf ein 2,5%iges Agarosegel sowie eine No-Template-Kontrolle (NTC, Wasser statt DNA-Probe) und eine Probe des unbehandelten jeweiligen PCR-Amplikons aufgetragen. Als molekularer Marker wurde die GeneRuler 50 bp DNA-Leiter von Thermo Fisher verwendet (✔: erfolgreicher Ansatz; (✔): erfolgreicher Ansatz; ×: teilweise erfolgreicher Ansatz.
    • : Agarosegel mit beladenen Proben aus der ersten und zweiten Verdauungsreaktion des SNP19-Amplikons nach der Gelelektrophorese mit ungereinigter DNA aus einer Zellprobe als Testvorlage und gereinigten DNA-Proben als Positivkontrollen. Die Amplikons UC 120910 und DSM3590 wurden mit BamHI oder Avall fürjeweils 2h inkubiert und dann auf ein 2,5%iges Agarosegel sowie eine Negativkontrolle (Wasser statt DNA-Probe) und eine Probe des unbehandelten jeweiligen PCR-Amplikons aufgetragen. Der verwendete molekulare Marker war der GeneRuler 50 bp DNA-Leiter von Thermo Fisher Spezifische Banden wurden nach Verdauung des SNP19-Amplikons mit BamHI erhalten. Unspezifische Banden wurden nach Verdau des SNP19-Amplikons mit Avall für jede der gereinigten DNA-Proben und der ungereinigten DNA-Probe aus der Frischzellpräparation erhalten✔: : erfolgreicher Ansatz; ×: nicht erfolgreicher Ansatz.
    • : Agarosegel mit beladenen Proben aus der ersten und zweiten Verdauungsreaktion des SNP20-Amplikons nach der Gelelektrophorese mit ungereinigter DNA aus einer Zellprobe als Testvorlage und gereinigten DNA-Proben als Positivkontrollen. Die Amplikons UC 120910 und DSM3590 wurden mit Ndel fürjeweils 2h inkubiert und dann auf ein 2,5%iges Agarosegel sowie eine Negativkontrolle (Wasser statt DNA-Probe) und eine Probe des unbehandelten jeweiligen PCR-Amplikons aufgetragen. Der Ansatz mit ungereinigter DNA des Stammes UC 120910, die aus einer Zellprobe stammt, ist ähnlich wie bei der UC 120910-Positivkontrolle: Die entsprechenden Amplikons wurden nur unvollständig verdaut✔: erfolgreicher Ansatz; (✔): teilweise erfolgreicher Ansatz.
    • : Agarosegel mit beladenen Proben aus der ersten und zweiten Verdauungsreaktion des SNP11-Amplikons nach der Gelelektrophorese mit ungereinigter DNA aus einer Zellprobe als Testvorlage und gereinigten DNA-Proben als Positivkontrollen. Die Amplikons UC 120910 und DSM3590 wurden mit Sfcl oder BstNI für jeweils 2h inkubiert und dann auf ein 2,5%iges Agarosegel sowie eine Negativkontrolle (Wasser statt DNA-Probe) und eine Probe des unbehandelten jeweiligen PCR-Amplikons aufgetragen. Als molekularer Marker wurde der GeneRuler 50 bp DNA-Leiter von Thermo Fisher verwendet. Ergebnis: Falsche Ergebnisse der Analyse der Verdauungsreaktionen von SNP11 unter Verwendung ungereinigter DNA-Proben von M. thermoautotrophicus UC 120910. Die aus UC 120910-Zellen gewonnene Probe in den Spalten 2-4 weist nicht dasselbe Muster auf wie die ECHO-Positivkontrolle (gekreuzte Pfeile). Stattdessen ist das Bandenmuster ähnlich wie bei der Positivkontrolle (Pfeile)✔: : erfolgreicher Ansatz; ×: nicht erfolgreicher Ansatz.
  • Beispiele
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen praktikable Möglichkeiten, die beschriebene Methode wie beabsichtigt durchzuführen, ohne die Erfindung auf die genannten Beispiele zu beschränken.
  • AllgemeinerTeil
  • Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben es sich zur Aufgabe gemacht, eine vereinfachte Methode zur Identifizierung von M. thermoautotrophicus DSM3590 in einer gegebenen Probe, die Archaea enthält, im Vergleich zu zeitaufwendigen Methoden nach dem Stand der Technik, z.B. Genomsequenzierung und/oder Amplikonsequenzierung, zurVerfügung zu stellen.
  • So entwarfen die Erfinder viele Primer mit dem Ziel, dass diese geeignet sind, DNA-Sequenzen von M. thermoautotrophicus DSM3590 zu amplifizieren und von DNA-Sequenzen anderer Nicht-Methanothermobacter thermoautotrophicus Archaea zu unterscheiden, und analysierten diese in Experimenten.
  • Überraschenderweise fanden die Erfinder heraus, dass Primer gemäß der vorliegenden Erfindung nicht nur DNA-Sequenzen von M. thermoautotrophicus DSM3590 amplifizieren, sondern auch einige andere, nicht von Methanothermobacter thermoautotrophicus Archaea stammende Sequenzen.
  • Noch interessanter ist die Feststellung der Erfinder, dass die von den Primern der vorliegenden Erfindung erzeugten Amplikons im Vergleich zu anderen Nicht-Methanothermobacter thermoautotrophicus Archaea und auch zu anderen Varianten von M. thermoautotrophicus DSM3590 einzelne Nukleotidvariationen aufweisen. Diese so genannten SNPs im Amplikon erwiesen sich später als geeignet, Verdauungsreaktionen mit Hilfe selektiver Restriktionsenzyme durchzuführen, die Erkennungssequenzen innerhalb des Amplikons erkennen, wobei das Vorhandensein einer Erkennungssequenz von der Identität der jeweiligen Nukleotidbase dieses SNPs, die in der Erkennungssequenz enthalten ist, abhängig ist. Mit anderen Worten, je nach Vorhandensein einer gegebenen jeweiligen Nukleotidbase an dieser SNP-Stelle wird diese entweder von dem jeweiligen Restriktionsenzym erkannt oder nicht, d.h. die Erkennungssequenz ist je nach Vorhandensein des jeweiligen SNPs für das Restriktionsenzym entweder vorhanden und lesbar oder unlesbar (zerstört). Die erfindungsgemäße Methode erlaubt daher den direkten Nachweis des Vorliegens von Nukleotidvariationen ohne weitere Sequenzierung des Amplikons. Sie kann sogar verwendet werden, um den jeweiligen Archaea-Stamm aufgrund der genannten einzigen SNP-Basenvariation zu identifizieren.
  • Die Färbung in allen getesteten Agarosegelen wurde mit 100-fach konzentriertem GelRed (Biotium, Fremont, USA) nach der Methode von Huang et al., 2010 durchgeführt, wobei dem Gel-Ladepuffer 100-fach konzentriertes GelRed zugegeben und dann mit den jeweiligen Proben und dem verwendeten Größenmarker (Gene Ruler 50 bp DNA-Leiter, Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland) gemischt wurde.
  • Die Nukleotidsequenzen der gemäß der vorliegenden Erfindung entworfenen Primer sind inTabelle 1 angegeben. Tabelle 1. IDs (Primer), Primersequenz und erwartete PCR-generierteAmplifikatgröße unter Verwendung genomischer DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 als PCR-Template. A = Adenosin; C = Cytosin; G = Guanin; T = Thymin.
    Primer-Name (ID) Primer-Sequenz (5'-3') SNP-ID Amplicon-Größe [bp]
    SEQ ID NO:1 (vorwärts) TCGGCCCCAGTATTTCTCATGG SNP11 Ca. 300
    SEQ ID NO:4 (Rückseite) TGGGTGGAATGGGTGGAATG
    SEQ ID NO:2 (vorwärts) TGGGTCGTCGTGTGTTCGATGAC SNP20 Ca. 325
    SEQ ID NO:5 (Rückseite) TATGAACTCCACGAGGTGCC
    SEQ ID NO:3 (vorwärts) CTCCACAAAGACGTCCTCCCCC SNP19 Ca. 500
    SEQ ID NO:6 (Rückseite) TTTAGTTGGAGGAGGAGGATGGGGGGGG
  • Zunächst wurde versucht, ein gemeinsames Protokoll mit den gleichen Versuchsbedingungen für alle PCR-Reaktionen mit den erfinderischen Primerpaaren zu entwickeln, so dass alle Assays gleichzeitig durchgeführt werden können. Zu Beginn wurde gereinigte genomische DNA aus einem reinen M. thermoautotrophicus DSM3590 und einer nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea extrahiert. Die Konzentration der DNA des erhaltenen Präparats wurde photometrisch bestimmt. In einem ersten Schritt wurde die Menge des Templates, das die besten Ergebnisse für die PCR lieferte, experimentell bestimmt. Dies war der Fall bei der Verwendung von 10-20 ng DNA, obwohl manchmal deutlich niedrigere oder höhere Konzentrationen eine erfolgreiche Amplifikation der Templates ermöglichten. Alle Primerkombinationen ergaben Fragmente der erwarteten Größe (siehe Tabelle 1).
  • Als DNA-Polymerase wurde die AccuPOL-Polymerase verwendet. Aufgrund ihrer 3' bis 5' Exonuklease-Aktivität ist sie in der Lage, eingefügte Nukleotide zu screenen. Die Proofreading-Aktivität führt nach dem Stand der Technik zu einer Fehlerrate von 1,1 × 10-6 pro Base pro Amplifikationsduplikation. Im Vergleich zur Taq-DNA-Polymerase ist die Genauigkeit höher. Die Fehlerrate der Taq-DNA-Polymerase beträgt nach dem Stand der Technik 8,0 × 10-6. Basierend auf dem AccuPOL-Polymerase-Protokoll wird die Mastermix-Formulierung gemäß Tabelle 2 verwendet. Tabelle 2. Master Mix für einen PCR-Ansatz.
    Komponenten Volumen pro Reaktion [µl] Endgültige Konzentration oder Menge
    Wasser 15.48 -
    10× PCR-Puffera) 2.0 1×
    dNTPs (je 12,5 mM) 0.32 Jeweils 200 µM
    Vorwärts-Primer (10 µM) 0.4 0.2 µM
    Rückwärtsprimer (10 µM) 0.4 0.2 µM
    AccuPOL-DNA-Polymerase (2,5 Einheiten/µl) 57 1 Einheit
    DNA-Vorlage 72 ca. 50 ng

    a) bezeichnet: Schlüsselpuffer, VWR International, Darmstadt, Deutschland (bestehend aus Tris-HCl, pH 8,8, (NH4)2SO4, 15 mM MgCl2, 1% Tween 20).
  • Um die Bildung von experimentellen Artefakten zu vermeiden, wurde die Dehnungszeit so weit wie möglich reduziert, ohne die Verstärkung des längsten Amplikons zu beeinträchtigen. Um die Gesamtzeit für die Amplifikation zu minimieren, wurden auch die Denaturierungszeit pro Zyklus und die anfängliche Denaturierung verkürzt, was zu erheblichen Zeiteinsparungen führte. Um die Ausbeute und die Stringenz der PCR zu erhöhen, wurde für alle Primer eine Temperaturgradienten-PCR durchgeführt. Als Beispiel zeigt das Ergebnis für SNP11 und SNP20 und zeigt die Ergebnisse für SNP19. Für die Primer, die SNP11 und SNP19 amplifizierten, führte die PCR mit der Annealing-Temperatur 57,5 °C zu den stärksten Banden. Bemerkenswert ist, dass die Primer, die SNP19 amplifizieren, bei der vorherigen Annealing-Temperatur von 55,1 °C nur eine schwache Bande produzierten.
  • Die Primer, die SNP20 amplifizieren, funktionierten am besten bei der höchsten Temperatur von 70,1 °C. Es gab einen sichtbaren Betrag PCR-Produkt/Temperaturgradienten. Bei 55,1 °C war keine Bande auf dem Gel sichtbar. Mit steigender Annealing-Temperatur wurde auch die Intensität der Banden erhöht.
  • Die experimentell ermittelten idealen Reaktionsbedingungen wurden dann für alle jeweiligen Primer in das Standardprotokoll übernommen, d.h. eine Annealing-Temperatur von 57,1°C für die SNP11 und SNP19 amplifizierenden Primer und eine Annealing-Temperatur von 70,1°C für die SNP20 amplifizierenden Primer.
  • Um die Spezifität der PCR-Reaktionen weiter zu erhöhen, wurde für alle Assays ein Touchdown-Programm eingerichtet, soweit es die ermittelte ideale Annealing-Temperatur zuließ (nicht im Falle von SNP 20). Dieses Programm sah eine Absenkung der Annealing-Temperatur um 1 ° C pro Zyklus vor, bevor die weitere Amplifikation über mehrere Zyklen bei der Verlängerungstemperatur erfolgte.
  • Die angewandten Parameter der Touchdown-PCR für die Primerpaare zur Amplifikation von SNP 11 (SEQ ID NO:1 (vorwärts); SEQ ID NO:4 (rückwärts)) und SNP19 (SEQ ID NO:2 (vorwärts), SEQ ID NO:5 (rückwärts)) sind in Tabelle 3 dargestellt.
    Figure DE102020101487B4_0001
  • Die Primerpaare zur Amplifikation von SNP 20 (SEQ ID NO:3 (vorwärts); SEQ ID NO:6 (rückwärts)) haben eine optimale Annealing-Temperatur von 70 °C. Eine Touchdown-PCR ist daher nicht durchführbar. Daher wurde die neue Annealing-Temperatur in das verbesserte PCR-Programm der Tabelle 4 integriert. Die Dauer der einzelnen Schritte sowie die Anzahl der Zyklen wurde nicht verändert. Das PCR-Programm zur Amplifikation von SNP20 ist in Tabelle 4 beschrieben.
    Figure DE102020101487B4_0002
    Figure DE102020101487B4_0003
    Unter Verwendung des nun etablierten PCR-Protokolls wurde die Sensitivität der Assays untersucht, indem eine Verdünnungsreihe der DNA-Vorlage erstellt wurde. Die ursprüngliche Konzentration des unverdünnten DNA-Templates wurde photometrisch bestimmt und betrug 547 ng/µl. Aus dieser DNA-Lösung wurde eine Verdünnung von 1:10, 1:50 und 1:100 hergestellt, und diese Lösungen wurden jeweils als Template für einen PCR-Ansatz mit den verschiedenen Primer-Kombinationen verwendet ( ).
  • In zwei der verschiedenen Assays (SNP11, SNP19) wurden unabhängig von der Menge der verwendeten Schablone durchweg zuverlässige Ergebnisse erzielt. Nur im Fall des SNP19-Tests nahm die Amplikonausbeute mit zunehmender Verdünnung des Templates ab. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden standardmäßig etwa 5 ng genomische DNA als Template für die Positivkontrolle für alle weiteren Experimente verwendet, nur etwa 50 ng Template wurden standardmäßig für die SNP19-PCR verwendet.
  • Verdauung von PCR-Amplikons: Prüfung und Optimierung
  • Alle verwendeten Restriktionsenzyme wurden von New England BioLabs, Frankfurt am Main, bezogen. Nach Optimierung des Amplifikationsprotokolls wurden die ausgewählten Restriktionsenzyme in einer ersten Verdauungsreaktion getestet, um die mit der DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 erzeugten Amplikons, die unverdaut bleiben sollten, spezifisch nicht zu schneiden.
  • Eine Reihe vorläufiger Experimente ergab, dass eine zuverlässige Verdauungsreaktion die Reinigung der PCR-Amplikons erforderte (Daten nicht gezeigt). Die Reinigung der Amplikons ist notwendig, um Salze, Primer, Nukleotide und andere inhibierende Substanzen vor dem Restriktionsverdau zu entfernen. Zu diesem Zweck wurden zunächst verschiedene Aufreinigungs-Kits getestet (z.B. QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland und Roti-Prep PCR purification Kit, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland). Der Vergleich der Kits zeigte, dass alle getesteten Produkte zu einem vergleichbar guten gereinigten Endprodukt führten und daher fortan der Kit mit den geringsten Anfangskosten verwendet wurde (GF-1 PCR Clean-up Kit, GeneOn, Ludwigshafen, Deutschland).
  • In einem ersten Schritt wurden alle Verdauungsreaktionen mitAmplikons getestet und optimiert, die mit gereinigter genomischer DNA als PCR-Template hergestellt wurden. In einem zweiten Schritt wurden die etablierten Verdauungsreaktionen dann in dreifacher Ausführung (n=3) mitAmplikons getestet, die mit nicht gereinigten Zellproben erzeugt wurden (siehe unten).
  • Durchführung der Verdauungsreaktion
  • Die mit den Primern der vorliegenden Erfindung erzeugten Amplikons wurden in einer ersten Verdauungsreaktion verwendet. Die Testproben waren die gleichen wie oben, d.h. einerseits gereinigte genomische DNA, extrahiert aus M. thermoautotrophicus DSM3590, die innerhalb der durch die vorliegenden spezifischen Primer zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht die Erkennungssequenz für das/die eingesetzte(n) Restriktionsenzym(e) trägt, und andererseits gereinigte genomische DNA, extrahiert aus einer Archaea (nicht M.-t.-DSM3590 Archaea), die innerhalb der zu amplifizierenden DNA-Sequenz die Erkennungssequenz für das/die eingesetzte(n) Restriktionsenzym(e) trägt. Dementsprechend enthielten keine Template-Kontrollen (NTC) oder auch Negativkontrollen genannt den jeweiligen SNP-spezifischen Mastermix, sondern Wasser (H2O) anstelle des DNA-Templates.
  • Jede Amplikonvorlage wurde mit jedem der amplikonspezifischen Enzyme verdaut. Die Beschränkung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Nach Angaben des Herstellers (New England Biolabs) können die Proben 5-15 Minuten, aber auch über Nacht inkubiert werden, ohne dass es zu einem DNA-Abbau kommt. Es wurde (zunächst) eine Inkubationszeit von zwei Stunden gewählt. Vorzugsweise wird die Verdauungsreaktion in einem Thermocycler oder in einem Inkubator (37 ° C) durchgeführt.
  • SNP19
  • Die Verdauung des SNP19-PCR-Produkts mit BamHI wurde zunächst in NEBuffer3.1 gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt, aber sowohl der M. thermoautotrophicus DSM3590 als auch das Amplikon, das von der genomischen DNA der Archaeen stammt, die nicht von M.-t.-DSM3590 stammt, blieben nach einer Verdauungsreaktion unverdaut. Auch bei einer Erhöhung der Inkubationszeiten auf 4 h bis hin zu einer Inkubation über Nacht konnte das Ergebnis nicht verbessert werden. In weiteren Tests wurde neben dem NEBuffer 3.1 auch der CutSmart-Puffer (New England Biolabs, Frankfurt am Main, Deutschland) verwendet, der nach Angaben des Herstellers ebenfalls zu 100% Aktivität des Enzyms führt. Mit dem alternativen Puffer wurde im Falle der genomischen DNA von Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea das entsprechende PCR-Produkt bereits nach 2 h hydrolysiert (siehe ). In den weiteren Experimenten mit dem SNP19 und dem Restriktionsenzym BamHI wurde daher der CutSmart-Puffer verwendet.
  • SNP11
  • Wie im Falle des Amplikons, das mit der gereinigten genomischen DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 (Positivkontrolle) erzeugt wurde, kam es erwartungsgemäß nicht zur Restriktion des Amplikons, und die Länge des detektierten Fragments im Agarosegel entsprach der Größe des Volllängen-PCR-Produkts, das ursprünglich in derVerdauungsreaktion eingesetzt wurde. Handelt es sich bei der Probe jedoch um ein spezifisch gereinigtes Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea, so zeigte die genomische DNA-Verdauungsreaktion des gereinigten SNP11-PCR-Produkts mit Sfcl erwartungsgemäß die Spaltung des Amplikons des Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea in zwei Fragmente unterschiedlicher Länge (ca. ca. 200 bp und ca. ca. 100 bp), die auf dem aufgetragenen Agarosegel nach der Gelelektrophorese deutlich visuell unterschieden werden konnten (siehe ).
  • SNP20
  • Ähnlich wie der Verdau des SNP11-Amplikons wurde die Verdauungsreaktion des SNP20-PCR-Produkts durch das Restriktionsenzym Ndel durchgeführt (BILD 6). Das Amplikon M. thermoautotrophicus DSM3590 blieb unverdaut, d.h. es hatte nach Inkubation mit dem Restriktionsenzym Ndel die gleiche Größe wie das unbehandelte PCR-Produkt (ca. ca. 325 bp). Handelt es sich bei der Probe jedoch um eine gereinigte genomische DNA einer spezifischen Nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea, so zeigte die Verdauungsreaktion des gereinigten SNP20-PCR-Produkts mit Ndel eine Spaltung des DNA-generierten Amplikons in zwei Fragmente unterschiedlicher Länge, die nach der Gelelektrophorese auf dem verwendeten Agarosegel deutlich sichtbar waren (siehe ).
  • Testen der entworfenen Primer mit frischen Archaea-Zellproben, die aus einem laufenden Bioreaktor ohne vorherige DNA-Reinigung stammen
  • In einem nächsten Schritt, nachdem die Protokolle für die Nachweisreaktionen der drei SNPs festgelegt worden waren, wurde DNA frischer, lebender Zellen aus einer laufenden Bioreaktor-Zellprobe als Vorlage für die PCR-Amplifikation verwendet und nach der Methode der vorliegenden Erfindung aufbereitet. Die Zellen der Bioreaktor-Zellprobe wurden nur durch wiederholte Einfrier-(bei -80 ° C) - und Auftauzyklen mechanisch aufgebrochen und dabei die DNA freigesetzt. Die Menge der freigesetzten genomischen DNA (ungereinigte DNA) reichte aus, um vergleichbare PCR-Produktausbeuten mit den zuvor entwickelten Protokollen für gereinigte DNA zu erzielen (Daten nicht gezeigt). Die zeitaufwändige Isolierung der genomischen DNA nach dem Stand der Technik konnte hier mit der Methode gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft entfallen. Die anschließende Verdauungsreaktion der erzeugten Amplikons verlief analog zu den zuvor untersuchten Proben. Es war nur zu beobachten, dass die Verdauungsreaktion bei der Verwendung von DNA aus frischen Zellproben eines Bioreaktors, die vor der Anwendung der PCR nicht gereinigt wurde, etwas häufiger unvollständig war als bei der Verwendung von gereinigter DNA für die PCR.
  • Bewertung der Assay-Zuverlässigkeit
  • Nach der Optimierung des Testprotokolls wurde die Zuverlässigkeit des Stammidentifikationstests untersucht. Zu diesem Zweck wurden die PCR-Amplifikations- und Verdauungsreaktionen aller drei SNP-Amplikons an drei aufeinander folgenden Tagen unabhängig voneinander getestet. Als zu identifizierende Probe wurden Archaea-Zellen aus einem laufenden Bioreaktor-Experiment verwendet, bei denen es sich vermutlich um reine M. thermoautotrophicus DSM3590 handelte. Alle Primerpaare wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen getestet. Positivkontrollen waren zum einen extrahierte gereinigte DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590, die innerhalb der zu amplifizierenden DNA-Sequenz nicht die Erkennungssequenz für die eingesetzten Restriktionsenzyme trägt, und zum anderen spezifische extrahierte gereinigte DNA von nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea, die innerhalb der zu amplifizierenden DNA-Sequenz die Erkennungssequenz für die eingesetzten Restriktionsenzyme trägt. Die Negativkontrolle (keine Template-Kontrolle, NTC) enthielt Wasser statt eines Templates.
  • SNP19
  • Überraschenderweise stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung fest, dass das Amplikon aus Archaea-Zellproben, die aus einem laufenden Bioreaktor geerntet wurden, in der Verdauungsreaktion durch das eingesetzte Restriktionsenzym BamHI zumindest teilweise in zwei Fragmente zerschnitten wurde (siehe , Lane 3), während das Amplikon aus gereinigter genomischer DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 erwartungsgemäß unverdaut blieb (siehe , Lane 10). Um auszuschließen, dass es sich um ein experimentelles Artefakt handelte, wurde das Experiment mehrmals wiederholt, sogar mit neu präparierten Reaktionskomponenten und neu präparierter genomischer DNA, die aus einer anderen Probe des genannten Bioreaktors geerntet und sogar in gereinigter Form getestet wurde (Daten nicht gezeigt). Dennoch blieb das Ergebnis in allen Fällen vergleichsweise gleich wie zuvor, d.h. das Amplikon wurde nach der Verdauungsreaktion offensichtlich zumindest teilweise in zwei unterschiedlich große Fragmente von ca. 400 bp und ca. 100 bp geschnitten, während einige der applizierten Amplikons manchmal unverdaut blieben (ca. 500 bp), wie auf Agarosegel sichtbar ist (siehe , Spur 3). Diese beiden Restriktionsfragmente wurden auch nach der Verdauungsreaktion erhalten, wenn jeweils gereinigte DNA-Proben verwendet wurden, die aus den genannten Archaea-Zellproben des laufenden Bioreaktors anstelle der nicht gereinigten geerntet wurden, wobei ein experimentelles Artefakt weiter ausgeschlossen wurde (Daten nicht gezeigt).
  • Um dieses unerwartete Ergebnis weiter zu analysieren, führten die Erfinder eine weitere Parallelverdauungsreaktion mit denselben Amplikonproben durch, die sie aus dem nicht gereinigten DNA-Ansatz wie zuvor für das Experiment mit BamHI erhalten hatten, verwendeten aber statt BamHI ein anderes Restriktionsenzym, nämlich Avall. Das aus der Zellprobe des Bioreaktors gewonnene SNP19-Amplikon (ca. 500 bp) wurde geschnitten, um drei gut unterscheidbare, unterschiedlich große Restriktionsfragmente (ca. 320 bp, ca. 130 bp, ca. 50 bp, siehe , Spur 2) zu erhalten. Darüber hinaus erhielt das Amplikon aus gereinigter genomischer DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 (volle Länge ca. 500 bp) erwartungsgemäß vier unterschiedlich große Restriktionsfragmente (ca. 230 bp, ca. 130 bp, ca. 100 bp, ca. 50 bp; siehe , Lane 9.
  • In der ersten Runde, wie in , Bahn 6, dargestellt, zeigte die Positivkontrolle für nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea jedoch schwache, aber spezifische Banden zusätzlich zu den vorhergesagten Banden durch Verdauung mit Avall. Dies war zuvor nicht beobachtet worden. In einem anderen Experiment wurde die Positivkontrolle für nicht-M.-t.-DSM3590 Archaea wie erwartet mit Avall geschnitten (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass die Ergebnisse bezüglich dieser Positivkontrolle des ersten Testlaufs anscheinend ein experimentelles Artefakt waren.
  • Durch anschließende Amplikonsequenzierung wurde herausgefunden, dass es sich bei dem methanogenen Organismus der aus dem Bioreaktor stammenden Zellprobe um eine Reinkultur von M. thermoautotrophicus UC 120910 handelt. Bei Verwendung einer nachweislich gereinigten genomischen DNA-Probe von M. thermoautotrophicus UC 120910 zeigte sich bei Anwendung der erfindungsgemäßen Methode ein vergleichbares Restriktionsmuster im Vergleich zu den Zellproben des oben genannten M. thermoautotrophicus UC 120910. Näheres dazu: Das generierte PCR-Amplikon der gereinigten genomischen DNA-Probe von M. thermoautotrophicus UC 120910 unter Verwendung der SNP19-Primer (siehe , Spur 8) wurde unter Verwendung von BamHI und Avall verdaut, um auf dem Agarosegel das gleiche Restriktionsmuster zu erhalten, wie die DNA aus der oben genannten untersuchten Zellprobe, die sich als M. thermoautotrophicus UC 120910 herausstellte. thermoautotrophicus UC 120910 war und somit das Ergebnis der Amplikonsequenzierung bestätigte (vgl. , Lanes 4 und 8 (PCR-Produkt); Lanes 3 und 7 (BamHI-Verdau); Lanes 2 und 9 (Avall-Verdau)). Die Restriktionseffizienz für ungereinigte DNA-Proben aus Zellproben des Stammes UC 120910 und gereinigte DNA-Kontrollen des Stammes UC 120910 war in allen Fällen gleich, es konnte jedoch nicht geklärt werden, warum ein vollständiger BamHI-Verdau sowohl für die ungereinigte DNA aus Zellproben als auch für die gereinigte DNA von M. thermoautotrophicus UC 120910 nicht erreicht wurde (vgl. , Lanes 3 und 7).
  • In einem nächsten Schritt wurde die Methode gemäß der vorliegenden Erfindung an einer Zellprobe einer bekannten M. thermoautotrophicus DSM3590-Quelle getestet. Das PCR-Amplikon der Zellprobe und der gereinigten DNA-Probe hatte die erwartete Grösse (vgl. , Spur 14 und 17). Erwartungsgemäß war auch das Ergebnis der ersten Verdauungsreaktion mit BamHI, bei der das PCR-Amplikon von DSM3590 überhaupt nicht verdaut wurde (vgl. , Zellprobe und gereinigte DNA-Probe Lane 13 und 16). Unerwartet zeigte jedoch die zweite Verdauungsreaktion mit Avall ein weniger spezifisches Restriktionsmuster, d.h. es wurden mehr als die vier erwarteten Fragmente (ca. 230 bp, ca. 130 bp, ca. ca. 100 bp, ca. 50 bp) erhalten.
  • Daher konnte eine eindeutige Identifizierung des M. thermoautotrophicus DSM3590 auf der Grundlage der Avall-Verdauungsreaktion nicht durchgeführt werden. Die Ergebnisse der ersten Testung des Primerpaares auf SNP19 zeigten jedoch, dass zumindest mit gereinigter DNA des M. thermoautotrophicus DSM3590 auch der zweite mit Avall reagierende Verdau wie erwartet funktionierte, was dafür spricht, dass der Assay prinzipiell funktioniert.
  • Daher kann die erfindungsgemäße Methode verwendet werden, um auf das Vorkommen von M. thermoautotrophicus DSM3590 zu testen und es gegenüber dem Vorkommen von Varianten von M. thermoautotrophicus DSM3590 als M. thermoautotrophicus UC 120910 zu differenzieren. Das erhaltene charakteristische Restriktionsmuster der Varianten (Anzahl und Größe der Restriktionsfragmente), das in beiden Verdauungsreaktionsassays der DNA aus Bioreaktorzellproben von M. thermoautotrophicus DSM3590 und M. thermoautotrophicus UC 120910 gezeigt wurde, kann zur Genotypisierung des dahinter liegenden methanogenen Mikroorganismus verwendet werden. Darüber hinaus kann die Methode gemäß der vorliegenden Erfindung auch zur weiteren Isolierung des genotypisierten methanogenen Mikroorganismus dahinter verwendet werden.
  • Die Restriktionseffizienz für Zellproben des Stammes UC 120910 und gereinigte DNA-Kontrollen des Stammes UC 120910 war in allen Fällen gleich. Angesichts der Tatsache jedoch, dass BamHI die DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 überhaupt nicht verdaut, erlaubt die Differenzierung zwischen letzterer und M. thermoautotrophicus UC 120910, die nach einer Verdauungsreaktion mit BamHI ein spezifisches Restriktionsmuster von mindestens zwei Restriktionsfragmenten aufweist, eine klare Unterscheidung zwischen beiden.
  • Aufgrund der prinzipiell positiven Versuchsergebnisse mit den genannten Zellproben aus einem laufenden Bioreaktor mit reinem M. thermoautotrophicus UC 120910 wurden diese auch für die weitere Analyse mit SNP11- und SNP20-Primerpaaren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Auch die erwähnte gereinigte DNA eines bewährten M. thermoautotrophicus UC 120910 wurde in jedem weiteren Experiment als Positivkontrolle verwendet.
  • SNP11
  • In der ersten Verdauungsreaktion mit dem ersten Restriktionsenzym Sfcl führten die Positivkontrollen in allen Läufen zu den erwarteten Ergebnissen, d.h. das Amplikon wurde im Falle der gereinigten DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 entweder gar nicht verdaut oder im Falle der gereinigten DNA von M. thermoautotrophicus UC 120910 zu zwei Fragmenten unterschiedlicher und erwarteter Größe verdaut. Die PCR war in allen Fällen erfolgreich, erzeugte jedoch schwächere Banden (Daten nicht gezeigt). Die Analyse der frischen Zellproben aus dem laufenden Bioreaktor, d.h. Zellproben von reinem M. thermoautotrophicus UC 120910, die zwei Fragmente unterschiedlicher und erwarteter Grösse als entsprechende Positivkontrolle ergeben sollten, funktionierte nicht, da das Amplikon dieser Testproben überhaupt nicht mit dem M. thermoautotrophicus UC 120910 spezifischen ersten Restriktionsenzym Sfcl verdaut wurde (siehe ).
  • In der zweiten Verdauungsreaktion unter Verwendung des zweiten Restriktionsenzyms BstNI führten die Positivkontrollen in allen Läufen zu Ergebnissen, d.h. das Amplikon wurde im Fall von gereinigter DNA von M. thermoautotrophicus UC 120910 entweder gar nicht verdaut oder im Fall von gereinigter DNA von M. thermoautotrophicus DSM3590 zu zwei Fragmenten unterschiedlicher und erwarteter Größe verdaut. Die PCR war in allen Fällen erfolgreich (Daten nicht gezeigt).
  • Interessanter ist, dass die Verdauung des SNP11-Amplikons aus M. thermoautotrophicus UC 120910 unter Verwendung des zweiten Restriktionsenzyms BstNI zu einem DSM3590-bezogenen Restriktionsmuster führte. BstNI sollte jedoch DSM3590-spezifisch sein und sollte das Amplikon des Stammes UC 120910 aufgrund eines SNP in der Erkennungssequenz für dieses Enzym nicht verdauen.
  • SNP20
  • Die Analyse des SNP20-Amplikons lieferte reproduzierbare Ergebnisse. Die Restriktion der Zellprobe des Stammes UC 120910 mit dem ersten Restriktionsenzym Ndel war in allen Fällen erfolgreich. Allerdings wurde auch beim Stamm UC 120910 positive Kontrolle teilweise ein teilweiser Verdau beobachtet, und die Abgrenzung zum Stamm DSM3590 war eindeutig möglich, da das entsprechende Amplikon DSM3590 in allen Fällen unverdaut blieb. Näheres dazu: Die Hydrolyse der gereinigten DNA des UC 120910 (Positivkontrolle) und der ungereinigten DNA-Probe aus einer frischen Zellprobe war in allen Fällen an der richtigen Stelle: Die DSM3590-Kontrolle wurde nicht hydrolysiert. Allerdings waren sowohl der Verdau des ungereinigten als auch des gereinigten DNA-Templates unvollständig, wie in dargestellt (vgl. Lanes 2 und 5). Die für dieses Primerpaar typischen regelmäßigen Banden erschienen jedoch in jedem Lauf. Dennoch war es möglich, das Restriktionsmuster eindeutig dem UC 120910 zuzuordnen (vgl. ).
  • In Tabelle 5 sind die Parameter und Merkmale der ersten Verdauungsreaktion und in Tabelle 6 die Parameter und Merkmale der zweiten Verdauungsreaktion jeweils für die jeweiligen SNPs und die verschiedenen getesteten Archaea-Varianten, d. h. Methanothermobacter thermoautotrophicus (M. t.) DSM3590-Stamm und M. t. UC 12091-Stamm, angegeben. Die verwendeten Restriktionsenzyme sowie die Anzahl und Größe der nach der Verdauungsreaktion eventuell entstehenden Restriktionsfragmente sind ebenfalls angegeben. Tabelle 5.: Parameter und Charakteristika der durchgeführten ersten Verdauungsreaktion. R = A oder G (Purin); Y = C oder T (Pyrimidin); W = A oder T. „^“ = Spaltstelle des Restriktionsenzyms. „_“ = Rahmenverschiebung.
    Gezielte SNP SNP11 SNP20 SNP19
    Amplicon-Größe [bp] ca. 300 ca. 325 ca. 500
    Verwendetes erstes Restriktionsenzym Sfcl Ndel BamHI
    die bei der Aufschlussreaktion verwendete Temperatur 37 °C 37 °C 37 °C
    Inkubationszeit der Verdauungsreaktion 2h 2h 2 h
    erste Erkennungssequenz (5'-3') C^TRYAG CA^TA_TG G^GATCC
    Anzahl der Restriktionsfragmente nach der Aufschlussreaktion mit einer reinen M. t.-Stammprobe UC 120910 2 2 2
    Größe der Restriktionsfragmente unter Verwendung einer Probe mit reinem M. t.-Stamm UC 120910 ca. 200 bp + ca. 100 bp ca. 170 bp + ca. 160 bp ca. 400 bp + ca. 100 bp
    Anzahl der Restriktionsfragmente nach der Verdauungsreaktion unter Verwendung einer reinen M. t.-Stammprobe DSM3590 1 (Original-Amplikon) 1 (Original-Amplikon) 1 (Original-Amplikon)
    Restriktionsfragmente nach der Verdauungsreaktion unter Verwendung einer reinen M. t.-Stammprobe DSM3590 ca. 300 bp ca. 325 bp ca. 500 bp
    Tabelle 6.: Parameter und Charakteristika der durchgeführten zweiten Verdauungsreaktion. W = A oder T. „^“ = Spaltstelle des Restriktionsenzyms. „_“ = Rahmenverschiebung.
    Gezielte SNP SNP11 SNP19
    Amplicon-Größe [bp] ca. 300 ca. 500
    Verwendetes zweites Restriktionsenzym BstNI AvaII
    die bei der Aufschlussreaktion verwendete Temperatur 37 °C 37°C
    Inkubationszeit der Verdauungsreaktion 2h 2 h
    zweite Erkennungssequenz (5'-3') CC^WGGG G^GWCC
    Anzahl der Restriktionsfragmente nach der Aufschlussreaktion mit einer reinen M. t.-Stammprobe UC 120910 1 (Original-Amplikon) 3
    Größe der Restriktionsfragmente unter Verwendung einer Probe mit reinem M. t.-Stamm UC 120910 ca. 300 bp 329 bp + 133 bp + 58 bp
    Anzahl der Restriktionsfragmente nach der Verdauungsreaktion unter Verwendung einer reinen M. t.-Stammprobe DSM3590 2 4
    Restriktionsfragmente nach der Verdauungsreaktion unter Verwendung einer reinen M. t.-Stammprobe DSM3590 208 + 214 230 bp + 133 bp + ca. 100 bp + 58 bp
  • Die Ergebnisse der unabhängigen Zuverlässigkeitstests für alle vier SNP-PCR-Produkte (Amplikons) sind in Tabelle 7 zusammengefasst. Die Amplifikation der untersuchten Genomregionen aus ungereinigter DNA aus Zellproben und Genomregionen aus gereinigter DNA war nach dem etablierten Testprotokoll immer erfolgreich. Tabelle 7.: Ergebnisse der unabhängigen Zuverlässigkeitstests für alle vier SNP-PCR-Produkte (Amplikons): ✔ = erfolgreicherAnsatz; (✔) = teilweise erfolgreicherAnsatz; ×= nicht erfolgreicher Ansatz; a) = unvollständiger Verdau; b) Amplicon meist nicht verdaut.
    Amplicon Vorlage Einschränkung Enzym Erwartete Restriktionsfragmente [bp] Zellprobe (ungereinigte DNA) Gereinigte DNA
    1 2 3 1 2 3
    SNP11 unverdautes Amplikon - ca. 300 ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔
    Stamm UC 120910 Sfcl ca. 200 + ca. 100 × × × ✔ ✔ ✔
    DSM3590 Stamm Sfcl ca. 300 - - - ✔ ✔ ✔
    SNP20 unverdautes Amplikon - ca. 325 ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔
    Stamm UC 120910 NDEla) ca. 170 + ca. 160 ✔a) ✔a) ✔a) ✔ ✔a) ✔
    DSM3590 Stamm Ndel ca. 325 - - - ✔ ✔ ✔
    SNP19 unverdautes Amplikon - ca. 500 ✔ ✔ ✔ ✔ ✔ ✔
    Stamm UC 120910 BamHIa) ca. 400 + ca. 100 ✔ (✔)b) ✔ ✔ (✔)b) ✔
    DSM3590 Stamm BamHI - - - - ✔ ✔ ✔
  • Insgesamt können die drei verwendeten SNP-Tests als komplementär betrachtet werden und können zusammen parallel durchgeführt werden. Für den Fall, dass widersprüchliche Ergebnisse erzielt werden und sich einer der Assays vom anderen unterscheidet, sollte in jedem Fall eine Sequenzierung der fraglichen Amplikons durchgeführt werden, um den Genotyp des Archaea-Stamms, der in der zu analysierenden Zellprobe enthalten ist, zu bestimmen.
  • Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO ST.25. Dieses kann sowohl in DEPATISnet als auch im DPMAregister aufgerufen werden.

Claims (10)

  1. Ein erster Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Primer, dessen Nukleotidsequenz aus der Gruppe von SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 ausgewählt ist, kombiniert mit einem zweiten Polymerase-Kettenreaktions-Primer, dessen Nukleotidsequenz aus der Gruppe von SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:6 ausgewählt ist ausgewählt ist, wobei jeder der ersten und jeder der zweiten Primer in der Lage sind, mit der DNA des methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 zu hybridisieren und wobei SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:4; sowie SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:5; sowie SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:6 ein Primerpaar bilden, das zur PCR-Amplifikation der DNA verwendet wird.
  2. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins des methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590, umfassend die folgenden Schritte: a. Gewinnen einer Probe, die methanogene Mikroorganismen (Zellen) enthält, und Anwendung von Mitteln und Techniken zum Freisetzen der DNA aus den Mikroorganismen, um eine ungereinigte DNA-Probe zu erhalten, oder Gewinnen einer Probe, die gereinigte DNA der methanogenen Mikroorganismen enthält; b. Verwenden der ungereinigten DNA-Probe oder der gereinigten DNA-Probe gemäß Schritt a. in einer PCR-Amplifikation unter Verwendung eines Primerpaares, umfassend einen ersten und einen zweiten Primer nach Anspruch 1, um eine amplifizierte DNA-Sequenz (Amplikon) zu erhalten, wobei das Amplikon wenigstens eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz umfasst; c. Aufreinigen des jeweiligen Amplikons; d. Durchführen einer ersten Verdauungsreaktion mit dem Amplikon von Schritt c. durch Inkubieren des Amplikons in einem Reaktionspuffer mit wenigstens einem ersten Restriktionsenzym, das eine erste Erkennungssequenz erkennt, für eine Zeit, die ausreicht, um Restriktionsfragmente zu bilden; e. Bestimmen der Anzahl der gebildeten Restriktionsfragmente und ihrer Größe (Restriktionsmuster), z.B. durch Gelelektrophorese und; f. Genotypisieren des methanogenen Mikroorganismus auf der Grundlage des Restriktionsmusters; g. gegebenenfalls Sequenzieren des gereinigten Amplikons von Schritt c. oder wenigstens von Teilen davon und/oder des verdauten Amplikons von Schritt d. oder wenigstens von Teilen davon und/oder des Amplikons nach derVerdauungsreaktion von Schritt d. oder wenigstens von Teilen davon.
  3. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins des methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 nach Anspruch 2, das weiterhin die folgenden Schritte umfasst: h. Durchführen einer Qualitätskontrolle der Genotypisierung von Schritt f. mittels Durchführen einer zweiten Verdauungsreaktion, mit dem Amplikon von Schritt b. oder Schritt c. durch Inkubieren des Amplikons in einem Reaktionspuffer mit wenigstens einem zweiten Restriktionsenzym, das eine zweite Erkennungssequenz erkennt, die sich teilweise mit der ersten Erkennungssequenz überlappt für eine Zeit, die ausreicht, um Restriktionsfragmente (verdautes Amplikon) zu bilden; i. Bestimmen der Anzahl der gebildeten Restriktionsfragmente und ihrer Größe (Restriktionsmuster), z.B. durch Gelelektrophorese; und j. Genotypisieren des methanogenen Mikroorganismus auf der Grundlage des Restriktionsmusters.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, ferner umfassend die Schritte des Isolierens der Stammvariante und optional des Genotypisierens der Stammvariante.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4 zum Unterscheiden des Stammes Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 von anderen Methanothermobacter thermoautotrophicus-Stämmen oder von anderen Archaeen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methanothermobacterium, Methanobrevibacter, Methanothermobacter, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Methanospirillium, Methanosaeta, Methanogenium, Methanoculleus und Methanothermococcus und Mischungen der vorgenannten.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Unterscheiden auf wenigstens einem SNP in dem Amplikon basiert, wobei dieser SNP Teil einer überlappenden Sequenz der ersten und der zweiten Erkennungssequenz ist und wobei der SNP aus der Gruppe von SNP19, SNP11 und SNP20 ausgewählt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der SNP SNP19 ist und wobei das erste Restriktionsenzym BamHI ist und das zweite Restriktionsenzym Avall ist, oder wobei der SNP SNP11 ist und das erste Restriktionsenzym Sfcl ist und das zweite Restriktionsenzym BstNI oder ECORII ist, oder wobei der SNP SNP20 ist und das erste Restriktionsenzym Ndel ist.
  8. Ein Qualitätskontrollkit zur Verwendung beim Nachweisen des Vorhandenseins des methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 innerhalb einer gegebenen Probe, umfassend: - wenigstens einen Behälter - einen ersten Primer nach Anspruch 1, der als Vorwärtsprimer dient; - einen zweiten Primer nach Anspruch 1, der als Rückwärtsprimer dient; wobei der erste und der zweite Primer ein Primerpaar bilden, das in der Lage ist, eine DNA-Sequenz des methanogenen Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590 durch PCR zu amplifizieren; - wenigstens ein erstes Restriktionsenzym oder wenigstens ein erstes und wenigstens ein zweites Restriktionsenzym nach Anspruch 7; - optional wenigstens einen Puffer, z.B. Elutionspuffer, Speicherpuffer und/oder Reaktionspuffer.
  9. Methanogener Mikroorganismus Methanothermobacter thermoautotrophicus DSM3590-Variante, identifiziert und isoliert mit dem Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens einen SNP umfasst, der aus der Gruppe von SNP19, SNP11 und SNP20 ausgewählt ist.
  10. Der gemäß Anspruch 9 identifizierte methanogene Mikroorganismus, wobei die Variante Methanothermobacter thermoautotrophicus UC 120910 ist.
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