KR20040045871A

KR20040045871A - 식중독세균이 보유하는 내열성 용혈독소 관련유전자(ｔｄｈ 관련 독소 유전자)를 총체적으로검출·정량함으로써 용혈독소 생산균을 검출·정량하는 방법

Info

Publication number: KR20040045871A
Application number: KR10-2004-7005760A
Authority: KR
Inventors: 타케시 고이즈미; 사토시 야마모토; 타케시 이토; 히로시 나카가와
Original assignee: 가부시끼가이샤 니찌레이
Priority date: 2001-10-18
Filing date: 2002-10-17
Publication date: 2004-06-02
Also published as: CN1606622A; EP1445313A4; US20050239067A1; EP1445313A1; JP2003116579A; WO2003033702A1

Abstract

본 발명은 비브리오속 병원균이 생산하는 내열성 용혈독소군 단백질군[TDH, TRH 및 유사한 용혈독소단백질을 의미하며, 이하 'TDH 관련 독소' 라 함]의 유전자를 간편하고도 신속하게, 또한 정확하게 검출, 정량, 판별하는 방법이다. 본 발명은, 식품위생관리상 중요한 TDH 관련 독소를 생산하는 세균 자체를 검출 및 정량할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. TDH 및 TRH에 공통한 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열을 포함하는 한쌍의 프라이머를 사용하여, TDH 관련 독소 유전자를 총체적으로 검출·정량함으로써, TDH 관련 독소생산성 세균 자체의 검출 및 정량을 가능하게 하였다.

Description

식중독세균이 보유하는 내열성 용혈독소 관련 유전자(ｔｄｈ관련 독소유전자)를 총체적으로 검출·정량함으로써 용혈독소 생산균을 검출·정량하는 방법{Method of Detecting and Quantifying Hemolysin-producing Bacteria by Overwhelmingly Detecting and Quantifying Thermostable Hemolysin-related Genes(tdh-related Hemolysin Genes) of Food Poisoning Bacteria}

장염 비브리오, 콜레라균의 일부, 비브리오 미미커스, 비브리오 홀리세 등의 비브리오속 병원균은, 경구감염에 의하여 위독한 증상을 유발하며, 때로는 환자를죽음으로까지 이끄는, 식품위생관리상의 중요한 세균종군이다. 일본에서는 장염 비브리오 식중독의 발생건수가 특히 많으며, 늘 식중독 원인의 상위를 차지하고 있다. 이 때문에, 주요한 감염원인인 생식용 어패류등에서는, 장염 비브리오의 검사가 의무로 되어 있다. 장염 비브리오는, 내열성 용혈독소 단백질 및 그 유사독소 단백질(TDH related hemolysin: TRH)의 유전자를 보유하는 일부의 균만이 식중독의 원인균이 된다. 식품위생 현장에서는，식품(생선 어패류 등)으로부터 단리되는 장염 비브리오 세균에는 일정 이상의 비율로 독소 생산균이 존재한다는 전제하에，식품에 존재하는 장염 비브리오의 총 균수에 허용치의 상한을 설정하여 관리되고 있다. 즉，「식품위생 검사지침(食品衛生檢査指針)」에 의하여 장염 비브리오로 의심되는 균수를 계수하고，기준치 이하(100cfu/g 이하)이면 식용으로 제공하여도 무방한 것으로 되어 있다(일본국 후생 노동성 통달식기발 제 22호). 전술한 바와 같이，병원성이 있는 장염 비브리오는，TDH 또는 TRH의 생산능을 갖는 세균뿐이다. 또한, TDH는 장염 비브리오 이외의 비브리오속 세균에도 존재하고 있다. 따라서，널리 식중독 예방이라는 관점에서는, 장염 비브리오의 균수가 아니라，TDH 또는 TRH의 생산능을 갖는 세균의 유무나 균수를 지표로 한 관리가 요망된다.

장염 비브리오 이외의 비브리오속에 있어서도, 비브리오 콜레라 비 O1(Vibrio chorelae non-O1)，비브리오 홀리세, 비브리오 미미커스의 일부 균주에 TDH 생산 유전자인 tdh를 보유하는 균주가 존재하는 것으로 보고되어 있다(참조: 1986, Infect. Immun., 52, 319-322; 1989, J. Bacteriol., 171, 6859-6861; 1990, FEMS Microbiol. Lett., 84, 249-254). 즉，TDH 관련 독소 단백질은, 비브리오속병원균 자체의 계통과 무관하게 진화한 단백질로서, 수평전파(horizontal transmission)에 의하여 각 독소가 독립적으로 비브리오속 병원균에게 획득되어 온 점이 밝혀져 있다(참조: 1991, J. Bacteriol., 173, 5036-5046). 따라서，이미 알려진 독소 생산균 이외의 균종이 TDH 관련 독소의 유전자를 획득·보유하고 있을 가능성이 인정된다. 이러한 관점에서도 식품위생 관리의 현장에서는 TDH 관련 독소 단백질의 생산능을 갖는 세균 자체의 검출과 정량이 이상적이라고 할 수 있다. 그로나, 범용성과 신뢰성의 측면에서 우수한 TDH 관련 독소의 검출·정량의 수단은 존재하고 있지 않고，식품위생 관리의 현장에서 검사를 실시하는 것은 불가능하였다.

본 발명은 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 콜레라균(Vibrio cholerae)의 일부, 비브리오 미미커스(Vibrio mimicus), 비브리오 홀리세(Vibrio hollisae) 등의 비브리오속 병원균이 생산하는 내열성 용혈독소 단백질군[TDH(thermostable direct hemolysin), TRH(TDH related hemolysin) 및 유사한 용혈독소단백질을 의미하며, 이하 'TDH 관련 독소' 라 함]의 유전자를, 간편하고도 신속하게, 또한 정확하게 검출, 정량, 판별하는 방법에 관한 것으로서, 수산업, 식품업, 공중위생분야, 및 임상검사분야 등에 관한 것이다.

도 1a 내지 도 1c는 이미 알려진 TDH 및 TRH의 염기서열에 의한 정렬해석(multiple alignment analysis)의 결과를 나타내는 도면이다. Entrez Protein 데이타베이스에 존재하는 TDH 13종(V. parahaemolyticus8종,V. mimicus1종,V. cholerae 1종,V. hollisae3종), TRH 3종(V. parahaemolyticus만임)의 아미노산 서열의 시그날 펩타이드 서열(signal peptide sequence) 부분(전반 24 아미노산)을 삭제하고, 다중정렬해석을 행하였다. 세균종명 및 독소형에 이어 ':' 뒤의 번호는 데이타 베이스에서의 등록번호(accession number)를 나타낸다.

도 2는 PCR 법에 의하여 얻어진 증폭 DNA 산물의 아가로스 전기영동에 의한 해석결과를 나타내는 사진이다. 도 2에서, 레인 1은 100bp 래더 마커(ladder marker); 레인 2는 IFO12711 T(trh); 레인 3은 V89-655(trh1); 레인 4는 V89-656(tdh); 레인 5는 V99-157(tdh); 레인 6은 V99-161(tdh); 레인 7은 V99-177(tdh); 레인 8은 V99-215(tdh); 레인 9는 V99-223(tdh); 및, 레인 10은 대조군(negative control: DNA 없음)을 나타낸다.

도 3은 PCR법에 의하여 얻어진 증폭 DNA 산물의 아미노산 서열에 기초한 분자계통해석결과를 나타내는 도면이다. 해석한 염기서열을 아미노산 서열로 번역한 후 근린결합법(neighbor-joining method)에 의하여 분자계통수를 작성하였다. 도면 중 * 표로 표시한 부분은 본 발명에서 해석한 데이타임을 나타낸다. 그 이외의 데이타는 Entrez Protein 데이타 베이스에 존재하는 서열을 사용하였다(도 3 중

': ' 뒤의 번호는 데이타 베이스 상의 등록번호를 나타낸다). 장염 비브리오 표준주(IFO 12711 T)가 갖는 TRH 를 ←로 나타내었다.

도 4는 융해곡선분석에 의한 증폭유전자산물의 해석결과를 나타내는 그래프이다. LightCycler(Roche Diagnostics)로 증폭한 PCR 산물을 65℃로부터 95℃까지 초당 0.1℃의 비율로 승온하여, 증폭산물의 융해곡선분석을 행하였다. LightCycler에 부속된 LightCycler softwareversion3을 사용하여 이를 해석하였다.

발명이 해결하려고 하는 과제

전술한 바와 같이，식품위생 관리의 현장에서는, TDH 관련 독소 단백질의 생산능을 갖는 세균 자체의 검출과 정량이 이상적이며, 이를 위해서는, TDH 관련 독소 단백질을 암호화하는 유전자의 총체적 검출과, 카피 수(the number of copy)의 정량이 바람직하다. TDH 관련 독소 단백질 유전자를 검출·정량함으로써, 전기 독소를 보유하며 병원성을 가질 가능성이 있는 세균을 검출·정량할 수 있다.

그러나, 이 방법에 의한 검사에는 큰 기술적 문제가 존재한다. 즉，TDH 관련 독소 단백질군의 이미 알려진 유전자의 모든 유형을, 동시에 총체적으로 검출하는 방법이 존재하고 있지 않았다. 따라서, PCR법 등의 프라이머를 이용한 유전자증폭·검출을 행하는 경우，각 유형에 대하여 개별적으로 프라이머를 설계할 필요가 있고, 검사에 있어서도 여러 프라이머를 병용할 필요가 있어，실용적이지 못하였다. 또한, 후술하는 바와 같이，현존하는 프라이머의 조합으로는, 모든 TDH 관련 독소 유전자를 검출할 수 없을 가능성이 높다.

TDH는 장염 비브리오 식중독의 병원인자와 관련이 있는 카나가와 현상(Kanagawa phenomenon: 인간 적혈구를 용혈시키는 현상)의 원인 물질인 것으로 특정된 용혈독소이다. 정제된 TDH가 생균을 투여한 경우와 동일한 성질을 나타낸다는 동물실험의 결과로부터, TDH가 병원인자라고 인식되기에 이르렀다. 한편，TRH는 카나가와 현상을 나타내지 않는 식중독 환자 유래주로부터 발견되었다. TRH는 아미노산 레벨에서 TDH와 약 68％의 상동성을 나타내며，TDH와는 달리 열에 대하여 불안정한 용혈독이다(참조: 1988, Infect. Immun., 56, 961-965).

TRH를 암호화하는 유전자trh에는 염기서열이 16％ 정도 다른 2 종류(trh1및trh2）의 존재가 알려져 있다(참조: 1992, Appl. Environ. Microbiol., 58, 2449-2457). 또한, TDH형 독소군과 TRH형 독소군의 각각의 아미노산 서열의 정렬 비교(alignment comparison)로부터, 양 독소군이 장기간의 진화과정을 거치고 있다는 점 및, 각 독소군 내에서도 유전적 다양성을 획득하였음이 추정된다. 따라서, 미지의 중간형 서열을 갖는 독소가 존재할 가능성이 높다. 실제，비브리오 홀리세의 일부의 균주가 보유하는tdh유전자는 장염 비브리오 등 그 밖의 비브리오속이 보유하는tdh유전자와 계통적으로 다른 것으로 보고되어 있다(참조: 1996, Microbiol. Immunol., 40, 59-65). 더우기，그 보고에는，기존의tdh유전자 검출용 PCR 프라이머 3쌍 중의 2쌍으로는 시험에 제공된, 비브리오 홀리세가 보유하는 모든 유형의tdh유전자를 빠짐없이 검출할 수 없었음이 나타나 있다. 또한,trh유전자에 대해서는，균주에 따라trh1및trh2유전자의 염기서열의 불규칙이 보고되어 있지만(참조: 1992, Appl. Environ. Microbiol., 58, 2449-2457), 기존의trh유전자 검출용 PCR 프라이머는 설계시trh1및trh2유전자의 염기서열의 불규칙에 관하여 고려하지 않은 것이므로，trh 검출용 PCR 프라이머로서 완전하다고 하기 어렵다. 실제, 본 발명의 과정에서, 종래의 프라이머로는 증폭하기 어려운 새로운 TRH에 유사한 독소 유전자를 찾아냈다. 이러한 결과는, 이미 알려진 것 이외의 TDH 관련 독소 유전자가 존재할 가능성을 강하게 시사하고 있다.

현재，독소 유전자 검사용으로는, 이미 TDH 생산 유전자tdh，TRH 생산 유전자trh를 각각 검출하는 PCR 프라이머(tdh유전자만을 검출하는 프라이머，trh1유전자만을 검출하는 프라이머 및trh1·trh2유전자를 동시에 검출하는 프라이머)가 개발되어 있고(참조: 특개평 제 4-293486호; 1992, Mol. Cell. Probes, 6:477-487), 장염 비브리오 연구용 시약으로서 판매되고 있다. 그러나，상술한 이유로, 이들 시판 시약은 모두 식품에 존재할 가능성이 있는 TDH 관련 독소 또는 그 독소 유전자를 총체적으로 검출·정량하는 방법을 제공하지 않는다. 즉，식품위생 관리의 현장에서 이용하는 경우에는, 복수의 검출 시스템의 병용을 요하며, 그럼에도 의음성(false negative)으로 될 가능성을 부정할 수 없다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은, 상기의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 거듭한 결과，TDHTRH의 단백질상에 보존성이 높은 영역이 존재함을 발견하였다. 즉，이미 알려진 TDH，TRH의 아미노산 서열에 관하여 다중정렬(multi-alignment) 해석을 한 결과，TDH，TRH 어느쪽에도 높은 상동성을 보이는 영역이 존재함을 발견하고，본 발명을 완성하였다.

본 발명은 이와 같은 서열이 다른 2 종류의 용혈독에 관하여，양자에 높은 상동성을 나타내는 아미노산 서열에 대응하는 염기서열을 이용하여 혼합 프라이머(degenerate primer)를 설계하고，PCR 법에 의하여 이들 ２종류의 용혈독소를 암호화하는 유전자 tdh 및 trh의 양자의 단편의 증폭을 가능하게 하여, TDH 생산주로부터도, TRH 생산주로부터도 프라이머 사이의 서열의 증폭 단편을 얻어서,용혈독소 유전자 tdh，trh를 한번에 검출할 수 있음을 특징으로 한다. 또한，검출한 독소형(toxin type)을 동정할 수 있으며，TDH，TRH와 기능적으로 유사한 미지의 독소 유전자 단편을 검출할 수 있음을 특징으로 한다.

발명을 실시하기 위한 최량의 형태

본 발명은 비브리오속 세균의 일부가 보유하는tdh유전자 및trh유전자가 각각 암호화하는 TDH 및 TRH의 양 아미노산 서열에 공통된 서열부분을 암호화하는 혼합핵산서열을 이용하여，용혈독소를 생산할 가능성이 있는 비브리오속 세균의 검출 및 독소형의 동정을 행하는 것이다.

이미 알려진 내열성 용혈독소 TDH 13종 및 TDH 유사독소인 TRH ３종의 아미노산 서열을 클러스탈 더블유(Clustal W) 컴퓨터프로그램으로 다중정렬해석한 결과(참조: 도 1), 양 독소에 보존성이 높은 아미노산 서열이 존재함을 발견하였다. 이어서，이들 아미노산 서열을 핵산 서열로 역번역한 혼합 프라이머를 설계하여，동일한 프라이머에 의하여tdh，trh양 유전자가 PCR 법에 의하여 증폭가능한지의 여부를 검토하였다.

즉，높은 보존성을 갖는 아미노산 서열로서는, 예컨대，(1) LPS(V 또는 I)PFP(A 또는 S)PGSDE(L 또는 I)LFVVR，(2) KRKPY，(3) Y(M 또는 I)TV(N 또는 S)IN, (4) YTMAA(V 또는 L)SGYK，(5) YLDETP(E 또는 S)YFV，(6) VEAYESG，(7) VMCISNK의 서열을 들 수 있다. 이들 (1) 내지 (7)은 각각，서열표의 서열번호 １(참조: 도 1)의 아미노산 위치에서 (1)은 3 내지 21에, (2)는 45 내지 49에, (3)은 69 내지 75에, (4)는 79 내지 88에, (5)는 126 내지 135에, (6)은 137 내지 143에, (7)은 149 내지 155에 각각 해당한다. 또한, (가 또는 나)라는 표기는, ()의 위치에 있어서 아미노산이 ()중의 어느 1 개의 아미노산인 것을 나타낸다. 예컨대, (5) YLDETP(E 또는 S)YFV는, YLDETPEYFV 또는 YLDETPSYFV임을 나타낸다.

특히 바람직하기로는, 아미노산 서열 (1) LPS(V 또는 I)PFP(A 또는 S)PGSDE(L 또는 I)LFVVLR 중의 DE(L 또는 I)LFVV, (6) VEAYESG, (3) Y(M 또는 I)TV(N 또는 S)IN 중의 YMTVNIN, (5) YLDETP(E 또는 S)YFV 중의 DETPEYFV를 들 수 있다.

이들 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 암호화하는 혼합 프라이머를 작성한다. 예컨대, DE(L 또는 I)LFVV에 대하여 말하자면, 당해 아미노산 서열을 암호화하는 센스 프라이머(sense primer) 5'-gaygarhtnytnttygtngt-3' 및 VEAYESG를 암호화하는 안티센스 프라이머(antisense primer) 5'-ccnswytcrtangcytcnac-3'를 들 수 있다(한편，본원 명세서 중에서, n은 a，t，c，또는 g를 의미한다). 이들 프라이머를 이용하여，시료를 증폭함으로써，tdh또는trh유전자를 한번에 용이하게 검출할 수 있는 것이다.

또한, 본 프라이머를 이용하여，상기tdh，trh와 유사한 미지의 용혈독소 유전자를 검출하는 것도 가능하다. 이 경우，증폭 단편으로부터 직접염기서열결정반응(direct sequence reaction)을 할 수 있도록，미리 각 프라이머의 ５’말단에 이미 알려진 서열을 부가한다. 이 부가한 서열을 시퀀스 프라이머(sequence primer)로 이용함으로써，증폭 단편을 클로닝하지 않고 직접 염기서열을 결정할 수 있다.

본 발명에 있어서 증폭 DNA 단편의 해석은, 실시예에 나타낸 대로，염기서열의 결정없이，실시간(real time) PCR 해석에 있어서 융해곡선 분석 등으로 판정하는 것도 가능하다. 본 발명은 이들 아미노산 서열에 근거한 혼합 프라이머를 다른 시약과 조합한 용혈독소 유전자의 검출，정량 또는 동정용의 키트(kit)를 포함하는 것이다.

실시예 １

도 １ 에 나타낸 보존성이 높은 영역에 있어，(1) LPS(V 또는 I)PFP(A 또는 S)PGSD(L 또는 I)LFVVLR 중의 DE(L 또는 I)LFVV를 암호화하는 센스 프라이머 5'-gaygarhtnytnttygtngt-3' 및 (6) VEAYESG를 암호화하는 안티센스 프라이머 5'-ccnswytcrtangcytcnac-3'를 설계하였다. 각각의 프라이머는 장염 비브리오 TDH에 있어서 아미노산 위치 38 내지 44，161 내지 167에 상당하고，전자는 3072가지, 후자는 2048가지로 이루어진 혼합 프라이머이다. 이 프라이머의 조합을 이용한 PCR에 의하여，386bp의 증폭 DNA 단편이 얻어진다. 그러나，얻어진 DNA 단편이 미지의 용혈독소 유전자일 가능성도 있으므로, 증폭 단편으로부터 직접염기서열결정반응을 행할 수 있도록，미리 각 프라이머의 5’말단에 이미 알려진 서열(센스 프라이머 측：5'-caggaaacagctatgacc-3，안티센스 프라이머 측：5'-tgtaaaacgacggccagt-3')을 부가하였다. 이 부가한 서열을 시퀀스 프라이머(sequence primer)로서 이용함으로써，증폭 DNA 단편을 클로닝하지 않고직접 염기서열을 결정할 수 있게 된다. 한편, 증폭 DNA 산물은 이 서열의 부가에 의하여 422bp로 된다. 상기의 프라이머를 이용하여，표 1에 나타낸, TDH 또는 TRH를 생산하는 것으로 밝혀져 있는 장염 비브리오 ８주로부터 통상의 방법에 따라 추출한 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR 법에 의한 독소 유전자 단편의 증폭을 행하였다.

증폭반응은 내열성 DNA 중합효소(AmpliTaq Gold, Applied Biosystems)를 이용하고，GENE MATE 써멀 사이클러(GENE MATE thermal cycler, ISC BioExpress)를 사용하여 행하였다. 반응액은 DNA 0.1㎍，50mM KCl，10mM Tris-HCl pH 8.3，2.0mM MgCl₂，0.01% 젤라틴，각 0.2mM의 dNTP，2.5U의 AmpliTaq Gold，프라이머 각 1μM을 포함한 용액을 최종체적이 50㎕로 되도록 조제하였다. 반응조건은, AmpliTaq Gold의 활성화(95℃·10분간)에 이어，95℃·1분간，45℃·40초간, 72℃·1분 30초간의 반응을 5사이클 행한 후에, 94℃·1분간，46℃·40초간，72℃·1분 30초간의 반응을 35사이클 행하고, 마지막으로 72℃·10분간의 신장반응을 행하였다. 얻어진 PCR 산물은, 1% 아가로스 겔(Sea Plaque GTG agarose, BioWhittaker Molecular Applications)로 전기영동(0.5xTAE，100V·30분간) 후，에티디움 브로마이드(

ethidium bromide)로 10분간 염색하여, 자외선 조사하에서 증폭산물의 존재를 확인하였다.

그 결과，도 2에 나타낸 바와 같이，TDH 또는 TRH를 생산하는 모든 균주의 DNA로부터 422bp의 DNA 단편의 증폭이 인정되었다. 이들 증폭된 단편을 통상의 방법에 의하여 겔(gel)로부터 적출하여 정제한 후，상술한 시퀀스 프라이머를 이용하여 디데옥시법(dedeoxy method)에 의하여 그 염기서열을 결정하였다. 염기서열의 결정에는, ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems) 및 ABI PRISM 310 GENETIC ANALYZER(Applied Biosystems)를 사용하였다. 얻어진 염기서열(서열번호 41 내지 46)을 아미노산 서열로 번역한 결과，TDH 또는 TRH를 암호화하는 유전자임이 확인되었다.

또한, 지금까지，trh2유전자를 보유하는 것으로 보고되어 있던(참조: 1999, 제 33회 장염 비브리오 심포지움 요지; 2000, 임상과 미생물，27，p239）장염 비브리오 기준주(type strain)인 IFO12711 T의 독소 유전자(서열번호 40)는,trh2와 서열이 다르며(아미노산 레벨에서 82％，핵산 레벨에서 91％의 상동성), 지금까지 알려져 있는 것과 다른 신규한 것임이 판명되었다(참조: 도 3). 이 결과，TDH，TRH 단백질의 상동성이 높은 영역의 아미노산 서열에 근거한 혼합 프라이머에 의하여，tdh 및 trh 유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 미지의 TDH 관련 독소유전자를 검출할 수 있는 것으로 나타났다.

본 연구에서 사용한 장염 비브리오 균주

종명	균주명	혈청형	독소유전자	채취원
V.parahaemolyticus	IFO 12711 T		trh+	기준주⁽¹⁾
V.parahaemolyticus	V89-655	O3:K6	trh+	임상 추출물⁽²⁾
V.parahaemolyticus	V89-056	O4:K8	tdh+	임상 추출물
V.parahaemolyticus	V99-157	O1:K56	tdh+	임상 추출물
V.parahaemolyticus	V99-161	O4:K11	tdh+	임상 추출물
V.parahaemolyticus	V99-177	O4:K8	tdh+	임상 추출물
V.parahaemolyticus	V99-215	O3:K6	tdh+	임상 추출물
V.parahaemolyticus	V99-223	O4:K9	tdh+	임상 추출물

(1): 기준주(type strain)

(2): 임상 추출물(clinical isolate)

실시예 2

도 1에 나타낸 보존성이 높은 영역에 있어，Y(M 또는 I)TV(N 또는 S)IN 중의 YMTVNIN을 암호화하는 센스 프라이머 5'-tayatgacngtnaayathaayg-3', 및 YLDETP(E 또는 S)YFV 중의 DEPTEYFV를 암호화하는 안티센스 프라이머 5'-acraartaytcnggngtytcrtc-3'를 설계하였다. 각각의 프라이머는, 장염 비브리오 TDH에 있어서 아미노산 위치 100 내지 106，152 내지 159에 상당하고，양자 모두 512 가지의 혼합 프라이머이다. 이 프라이머의 조합을 이용한 PCR에 의하여，180bp의 증폭 DNA 단편을 얻을 수 있게 된다.

TDH 생산주 1주, 1형 TRH 생산주 및 본 발명에 의하여 신규의 TRH를 생산함이 판명된 장염 비브리오 기준주(IFO12711 T）유래의 염색체 DNA를 주형으로 하여, LightCycler System(Roche Diagnostics)를 사용한 실시간 PCR(real time PCR)에 의한 용혈독소 유전자의 검출·동정을 시도하였다. 반응액은 LightCycler-DNAMaster SYBR Green Ｉ kit(Roche Diagnostics)를 이용하여, DNA 0.1㎍를 가하여 최종체적이 20㎕가 되도록 조제하였다. 자동 핫 스타트(hot start)를 행하기 위하여, LightCycler-DNA Master SYBR Green Ｉ을 미리 항 Taq 중합효소 항체(Taq Start Antibody, Clontech)와 반응시켜 불활성화하였다.

반응조건은, Taq 중합효소의 활성화(95℃·90초간)에 이어서，95℃·0초간 44℃·10초간，72℃·30초간의 반응을 5사이클 실시한 후에, 94℃·0초간，45℃·10초간，72℃·30초간의 반응을 35사이클 실시하였다. 증폭반응에 이어서，65℃로부터 95℃까지 매초 0.1℃의 비율로 승온시켜，증폭산물의 융해곡선 분석을 실시하였다.

해석결과，어느 쪽의 DNA로부터도 증폭산물이 확인되었다. 또한, 융해곡선 분석의 결과，tdh유전자 단편，trh1유전자 단편 및 신규의trh유전자 단편은 각각 다른 Tm 값(특이적 융해온도)을 나타내었으며，용이하게 판별할 수 있었다(참조: 도 4).

종래의 써멀 사이클러를 이용하여 표적 유전자의 증폭 내지 전기영동에 의한 확인을 행하는 경우，대략 3 내지 4시간을 필요로 하지만, 본 발명을 이용한 실시간 PCR(real time PCR)로는, 표적 유전자의 증폭 내지 융해곡선 분석에 필요로 하는 시간이 대략 40분간으로서，단시간에 행할 수 있을 뿐만 아니라，동시에 독소의 유형을 판별할 수 있게 된다.

본 발명은, 다양한 아미노산 서열을 갖는 TDH 관련 독소 단백질군을 암호화하는 다양한 유전자군을, 공통의 방법에 의하여 총체적으로 검사하는 방법을 제공한다. 이에 의해，식품(특히 생식용 신선 어패류 등）중에, TDH 관련 독소 단백질의 유전자의 어느 하나를 갖는 세균이 존재하는지 여부의 신속한 판정이 가능해진다. 또한, 독소 유전자 보유균이 존재하는 경우에는, 그 존재수를 파악할 수 있음으로써, 식품으로서의 안전성을 신속하게 평가할 수 있게 된다. 이와 같이，식품제조·유통 등에 있어서 식중독의 방지，위생관리의 효율화·고정밀화에 크게 공헌한다.

또 본 발명은, 식중독 환자의 대변이나 식품으로부터의 TDH 관련 독소 단백질의 유전자의 검출과, 그 독소형의 신속한 판별을 가능하게 한다. 또한, 대변이나 식품으로부터 단리된 균주가, TDH 관련 독소 단백질의 유전자를 보유하는지 여부와，보유하는 경우에는 어느 독소형인지의 신속한 판별을 가능하게 한다.

한편, 본 출원명세서에는 우선권주장의 기초출원인 2001년 10월 18일에 일본국 특허청에 출원된 특허원 2001-320403호의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 인용문헌으로 포함한다.

Claims

비브리오속 병원균에 널리 분포하는 내열성 용혈독소 단백질군[TDH(thermostable direct hemolysin), TRH(TDH related hemolysin) 및 유사한 용혈독소단백질을 의미하며, 이하 'TDH 관련 독소' 라 함]의 아미노산 서열에 존재하는 공통 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열을 이용하여, TDH 관련 독소 유전자를 광범위하게 총체적으로 검출·정량하여, TDH 관련 독소유전자를 보유하는 병원균을 검출·정량하는 방법.
청구항 1에 기재된 공통 아미노산 서열인 하기 (1) 내지 (7)의 아미노산 서열로부터 선택되는 2 이상의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 암호화하고, 실질적인 프라이머로서의 기능을 가지는 복수의 올리고머 뉴클레오티드를 한쌍의 PCR 프라이머로 하여 비브리오속 병원균에 널리 분포하는 TDH관련 독소유전자를 총체적으로 증폭하여 TDH 관련 독소유전자를 보유하는 세균을 총체적으로 검출·판별하는 방법:

(1) LPS(V 또는 I)PFP(A 또는 S)PGSDE(L 또는 I)LFVVR; (2) KRKPY; (3) Y(M 또는 I)TV(N 또는 S)IN; (4) YTMAA(V 또는 L)SGYK; (5) YLDETP(E 또는 S)YFV; (6) VEAYESG; 및, (7) VMCISNK.
청구항 1에 기재된 공통 아미노산 서열인 하기 (1) 내지 (7)의 아미노산 서열로부터 선택되는 1개의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 TDH 관련 독소유전자 증폭용 프라이머:

(1) LPS(V 또는 I)PFP(A 또는 S)PGSDE(L 또는 I)LFVVR; (2) KRKPY; (3) Y(M 또는 I)TV(N 또는 S)IN; (4) YTMAA(V 또는 L)SGYK; (5) YLDETP(E 또는 S)YFV; (6) VEAYESG; 및, (7) VMCISNK.
아미노산 서열 (1) LPS(V 또는 I)PFP(A 또는 S)PGSDE(L 또는 I)LFVVR 중의 DE(L 또는 I)LFVV를 암호화하는 5'-gaygarhtnytnttygtngt-3’및 대응하는 상보 가닥을 포함하는 TDH 관련 독소유전자 증폭용 프라이머.
아미노산 서열 (6) VEAYESG를 암호화하는 염기서열의 상보가닥인 5'-ccnswytcrtangcytcnac-3’및 대응하는 상보 가닥을 포함하는 TDH 관련 독소유전자 증폭용 프라이머.
아미노산 서열 (3) Y(M 또는 I)TV(N 또는 S)IN 중의 YMTVNIN을 암호화하는5'-tayatgacngtnaayathaayg-3’및 대응하는 상보 가닥을 포함하는 TDH 관련 독소유전자 증폭용 프라이머.
아미노산 서열 (5)YLDETP(E 또는 S)YFV 중의 DETPEYFV를 암호화하는 염기서열의 상보 가닥인 5'-acraartaytcnggngtytcrtc-3’및 대응하는 상보 가닥을 포함하는 TDH 관련 독소유전자 증폭용 프라이머.
제 3항 내지 제 7항의 어느 한항의 프라이머를 사용하여 TDH 관련 독소유전자를 검출함으로써, TDH 관련 독소를 생산하는 세균을 총체적으로 검출·정량하는 방법.
TDH 및 TRH의 아미노산 서열상에 존재하는 공통 아미노산 서열을 암호화하는 유전자 서열을 유전자증폭시스템에 사용하여, TDH 관련 독소유전자를 총체적으로 증폭하고, 얻어진 증폭 산물의 Tm값(특이적 융해온도)을 해석하는 것을 특징으로 하는, 피험독소유전자를 암호화하는 독소형(toxin type)을 판별하는 방법.
제 3항 내지 제 7항의 어느 한항에 기재된 프라이머를 사용하는, TDH 관련 독소 단백질생산세균이 생산하는 독소형을 판별하는 방법.
제 3항 내지 제 7항의 어느 한항에 기재된 프라이머를 포함하는, TDH 관련 독소 단백질의 유전자, 및 TDH 관련 독소 단백질을 생산하는 세균의 검출·정량 또는 독소형 판정의 검사를 수행하기 위한 키트.