KR100639783B1 - 다중 성병 진단용 키트 및 이를 이용한 성병 원인균의검출방법 - Google Patents

다중 성병 진단용 키트 및 이를 이용한 성병 원인균의검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다중 성병 진단용 키트 및 이를 이용한 성병 원인균의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 증폭용 프라이머; 임균(Neisseria gonorrhoeae) 증폭용 프라이머; 우레아플라즈마 우레알리티컴(Ureaplasma urealyticum) 및 우레아플라즈마 파붐(Ureaplasma parvum) 증폭용 프라이머; 및 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 증폭용 프라이머를 함유하는 다중 성병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 프라이머, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 다중 성병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 조성물을 포함하는 프라이머, DNA 추출용 완충액, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 다중 성병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 다중 성병 진단용 키트를 이용하여 시료 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 시료 DNA를 PCR 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 PCR 산물을 판독하는 단계를 포함하는 성병 원인균의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다중 성병 진단용 키트를 이용한 성병 원인균의 검출방법은 한 번의 검사로 성병의 4가지 주요 원인균을 동시에 검출할 수 있고, PCR 반응을 이용하므로 진단 시간을 획기적으로 단축하여, 짧은 시간에 보다 높은 정확도로 검사가 가능하며, 높은 민감도 및 특이도로 성병 원인균을 검출할 수 있는 작용효과가 있 다.
성병, 프라이머, 클라미디아 트라코마티스, 임균, 우레아플라즈마 우레알리티컴, 우레아플라즈마 파붐, 마이코플라즈마 제니탈리움, 키트, 중합효소연쇄반응(PCR)

Description

다중 성병 진단용 키트 및 이를 이용한 성병 원인균의 검출방법{Multiple diagnostic kit for sexually transmitted disease and detection method for bacteria inducing sexually transmitted disease using the same}
도 1은 본 발명의 다중 성병 진단용 키트를 이용하여 양성 표준균주 시료 DNA를 주형으로 PCR을 실시한 후, 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 나타난 밴드 양상을 찍은 사진이다.
도 2는 본 발명의 다중 성병 진단용 키트를 이용하여 임상시료 DNA를 주형으로 PCR을 실시한 후, 증폭된 PCR 산물을 전기영동하여 나타난 밴드 양상을 찍은 사진이다.
도 3 내지 도 6은 본 발명의 다중 성병 진단용 키트를 이용하여 양성 표준균주 시료 DNA를 주형으로 PCR을 실시한 후, 증폭된 PCR 산물을 염기서열결정(Sequencing)한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 다중 성병 진단용 키트 및 이를 이용한 성병 원인균의 검출방법에 관한 것이다.
성병(venereal disease)에는 매독, 임질, 연성하감, 비임균성 요도염, 성병성 육아종, 서혜림프육아종 등 전염병 예방법의 규정에 포함되어 있는 대표적인 6개 질환과 트리코모나스 질염, 칸디다증 2가지를 추가한 것이 재래식의 설명이었으나, 근래에는 이들 이외에도 무수히 많은 질병이 성적 접촉에 의하여 매개되는 사실에 입각하여 이들을 통틀어 일명 성인성 질환(Sexually Transmitted Disease, STD)이라고 총칭한다.
성병의 검사에서 가장 중요한 것은 빠른 시간 내에 원인균을 진단하여 적절한 항생제를 처방하는 것이다. 그러나 기존의 배양 검사는 검사에 소요되는 시간이 너무 길고 또한 일부 세균의 경우는 배양 자체가 까다롭거나 힘들기 때문에 성병의 정확한 원인균을 진단하기 힘든 경우가 많다.
최근 각광을 받고 있는 중합효소연쇄반응(PCR) 검사는 배양 검사와는 달리 단 몇 시간의 반응으로 성병의 원인균을 정확히 진단할 수 있기에 환자의 고통이나 기다림 없이 적절한 항생제를 신속히 처방할 수 있다.
이에 본 발명자는 상기 결과들에 착안하여, PCR 검사를 기본으로 하되, 멀티 진단 기능을 추가한 새로운 성병 진단용 키트를 제조함으로써 성병의 4가지 주요 원인균을 동시에 검출할 수 있고, 진단 시간을 획기적으로 단축하며, 진단 결과의 정확도 및 민감도를 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 성병 4가지 주요 원인균을 동시에 검출할 수 있는 다중 성병 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 멀티 진단 기능이 있으며 높은 민감도 및 특이도로 신속히 성병 원인균을 검출할 수 있는 다중 성병 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 다중 성병 진단용 키트를 이용한 성병 원인균의 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 다음의 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머를 함유하는 다중 성병 진단용 조성물을 제공한다.
1) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 증폭용 프라이머;
서열번호 1: 5'-CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA-3'
서열번호 2: 5'-TCCTCAGGAGTTTATGCACT-3'
2) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지는 임균(Neisseria gonorrhoeae) 증폭용 프라이머;
서열번호 3: 5'-ACTGCGTTCTGAACTGGGTG-3'
서열번호 4: 5'-GGCGGTCAATTTCACGCG-3'
3) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어지는 우레아플라즈마 우레알리티컴(Ureaplasma urealyticum) 및 우레아플라즈마 파붐(Ureaplasma parvum) 증폭용 프라이머; 및
서열번호 5: 5'-GAAACGACGTCCATAAGCAACT-3'
서열번호 6: 5'-GCAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3'
4) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어지는 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 증폭용 프라이머
서열번호 7: 5'-AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTG-3'
서열번호 8: 5'-CATTACCAGTTAAACCAAAGCCT-3'
본 발명은 또한 상기 다중 성병 진단용 조성물을 포함하는 프라이머, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 다중 성병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 다중 성병 진단용 조성물을 포함하는 프라이머, DNA 추출용 완충액, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 다중 성병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 다중 성병 진단용 키트를 이용하여 시료 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 시료 DNA를 PCR 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 PCR 산물을 판독하는 단계를 포함하는 성병 원인균의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 다중 성병 진단용 키트는 성병의 주요한 원인균인 클라미디아 트라코마티스(이하 'CT'라고도 한다), 임균(이하 'NG'라고도 한다), 우레아플라즈마 우레알리티컴과 우레아플라즈마 파붐(이하 'UU'라고도 한다) 및 마이코플라즈마 제니탈리움(이하 'MG'라고도 한다)을 단 한 번의 PCR 반응으로 검출할 수 있다.
본 발명이 진단 내지 검출하고자 하는 성병의 원인균을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
클라미디아 트라코마티스는 성병을 일으키는 가장 흔한 원인균으로 성인에서 요도염을 비롯한 비뇨생식기계 감염을 일으키고, 감염된 산모를 통해 신생아에게 감염될 경우 결막염과 폐렴을 일으킨다. 클라미디아 트라코마티스는 일반 검사실에서 배양이 쉽지 않아 주로 면역학적 방법으로 항원이나 항체를 검출하는 방법을 진단에 이용하여 왔다. 클라미디아 트라코마티스의 PCR 검사는 면역학적 검사보다 높은 민감도나 양성 예측도를 보여 질환의 진단에 유용한 검사로 여겨지고 있다.
임균은 임균성 요도염과 같은 비뇨생식기계 감염을 일으키며 주로 성적 접촉을 통해 전파되며, 신생아에게 결막염을 일으키기도 한다. 임균을 검출하는 방법으로는 배양 검사가 기준(gold standard)으로 되어 있는데, 배양 검사의 민감도는 80∼95％ 정도이다. 임균은 운송, 보관 과정 중에 쉽게 사멸할 수 있어 검체를 즉시 배양하지 않을 경우 양성율이 감소하게 된다. 임균의 PCR 검사는 민감도나 특이도가 남자의 경우 90∼99％, 여자의 경우 78∼98％ 정도로 상당히 우수한 결과를 보이며, 검체 운송이나 수송 과정에 크게 영향을 받지 않는 장점도 있다.
우레아플라즈마 우레알리티컴과 우레아플라즈마 파붐은 비클라미디아성, 비임균성 요도염의 주요 원인균이다. 여성에서 감염될 경우 불임의 원인이 될 수 있으며 산모가 감염되어 있을 경우 저체중아를 출생하거나 폐렴, 뇌수막염, 패혈증을 일으키기도 한다. 우레아플라즈마은 일반 검사실에서 배양이 쉽지 않아 원인균 검출이 어려운데 PCR 검사를 시행할 경우 빠른 시간에 높은 민감도로 진단이 가능하다.
마이코플라즈마 제니탈리움은 비클라미디아성, 비임균성 요도염의 주요 원인균이다. 신우신염, 만성 전립선염을 일으키며, 최근에는 난소암을 비롯하여 각종 암과의 깊은 관련성이 보고되고 있다. 마이코플라즈마 제니탈리움은 일반 검사실에서 배양이 쉽지 않아 원인균 검출이 어려운데 PCR 검사를 시행할 경우 빠른 시간에 높은 민감도로 진단이 가능하다.
본 명세서에서는 특별히 다르게 언급하지 않는 한 상기 서열번호 1과 서열번호 2로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 "프라이머 CT1-CT2"로 기술하고, 상기 서열번호 3과 서열번호 4로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 "프라이머 NG1-NG2"로 기술하며, 상기 서열번호 5와 서열번호 6으로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 "프라이머 UU1-UU2"로 기술하고, 상기 서열번호 7과 서열번호 8로 이루어진 한 쌍의 프라이머를 "프라이머 MG1-MG2"로 기술한다.
본 발명의 다중 성병 진단용 조성물 또는 키트에 있어서, 각 균주의 PCR 표적은 다음과 같다.
본 발명에 따른 프라이머 CT1-CT2의 표적은 클라미디아 트라코마티스의 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)의 200-bp DNA 단편이다. 클라미디아 트라코마티스의 크립팁 플라스미드는 세포내 다수개 존재하며 그 수는 변하나, 최근 보고에 따르면 한 세포당 7 내지 10개의 플라스미드가 존재한다고 한다. 이와 같이 세포내 다수개 존재하는 플라스미드는 클라미디아 크라코마티스의 검출 여부를 판단함에 있어서 결정적인 증거가 될 수 있으며, PCR의 민감성을 높이게 된다.
본 발명에 따른 프라이머 NG1-NG2의 표적은 임균의 16S rRNA의 281-bp RNA 단편이다. 16S rRNA는 박테리아 리보좀을 구성하는 rRNA로서, 임균을 포함한 모든 박테리아에 존재한다. 따라서 상기 16S rRNA의 증폭 여부는 임균의 검출 여부를 판 단함에 있어서 결정적인 증거가 될 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 UU1-UU2의 표적은 우레아제(urease) 유전자의 429-bp DNA 단편이다. 우레아플라즈마 균주는 우레아를 가수분해하는 능력을 가지고 있는데, 이 우레아의 가수분해를 촉매하는 세포질내 효소가 바로 우레아제이다. 따라서 우레아제 유전자는 우레아플라즈마의 검출 여부를 판단함에 있어서 결정적인 증거가 될 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 MG1-MG2의 표적은 마이코플라즈마 제니탈리움의 부착(attachment) 단백질 MgPa 유전자의 347-bp DNA 단편이다. MgPa 단백질은 마이코플라즈마 제니탈리움이 숙주 세포에 부착하는 것을 매개하는 단백질로서, MgPa 유전자는 마이코플라즈마 제니탈리움의 검출 여부를 판단함에 있어서 결정적인 증거가 될 수 있다.
이와 같이 본 발명의 다중 성병 진단용 조성물은 상기 서열번호 1 내지 서열번호 8의 염기서열을 갖는 4쌍의 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머를 동시에 포함한다.
한편, 본 발명의 다중 성병 진단용 키트는 상기 다중 성병 진단용 조성물을 포함하는 프라이머, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어지거나 또는 상기 다중 성병 진단용 조성물을 포함하는 프라이머, DNA 추출용 완충액, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어진다.
본 발명의 다중 성병 진단용 키트는 상기 4가지 표적을 대상으로 단 한번의 PCR을 수행하여 4개의 타겟 유전자를 동시에 증폭함으로써 검체내의 4가지 원인균 을 한꺼번에 검출할 수 있게 된다.
성병의 4가지 주요 원인균이 동시에 검출가능한 의미에서 본 발명의 다중 성병 진단용 키트를 "STD 4-capture 키트"라고도 명명한다. 특히 본 발명의 다중 성병 진단용 키트는 우레아플라즈마 및 마이코플라즈마를 검출하는 키트로서는 최초로 시도된 것이다.
한편, 본 발명의 다중 성병 진단용 키트에 있어서, 정확도, 민감도 및 특이도는 다음의 조건들에 의하여 보다 향상된다.
1) 특수 DNA 추출용 완충액
2) 핫-스타트 Taq 폴리머라제
3) PCR 인핸서
이를 각 항목별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
본 발명에 있어서 시료 DNA의 추출은 GeneReleaser(Bioventures, Inc.)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 추출할 수도 있으나, 바람직하게는 상기 방법에 수정을 가한 특수 DNA 추출법을 이용하는 것이 좋다. 상기 특수 DNA 추출법은 먼저 시료를 스핀 다운하여(13,000rpm으로 약 5-10분간) 상층액을 버리고, 10mM Tris/HCl(pH 8.0) 및 0.1M EDTA(pH 8.0)로 이루어진 DNA 추출용 완충액(본 명세서에서는 '제1완충액'이라고도 한다)을 첨가하여 가라앉은 펠렛을 교반(vortexing)하여 재현탁시킨 후, 이것을 다시 원심분리하여 상층액을 버리고, 상기 제1완충액을 재첨가하여 교반한 후 PCR 튜브에 옮겨 GeneReleaser(Bioventures, Inc.) 버퍼(본 명세서에서는 '제2완충액'이라고도 한다)를 넣고 잘 섞어준 후, 랙(rack)에 꽂아 전자렌지에 넣고 반응시키는 방법이다. 반응이 완료되면, 원심분리하여 상층액만을 PCR 반응의 주형으로 사용한다. 구체적인 방법은 하기 실시예 1을 참조한다.
이와 같이 본 발명은 특수 DNA 추출용 완충액을 사용함으로써, 따로 DNA를 정제할 필요가 없어 매우 간편하고 검사 시간도 획기적으로 단축된다.
한편, 본 발명에서는 Taq 폴리머라제로서 특히 핫-스타트(Hot-start) Taq 폴리머라제를 사용함으로써 핫-스타트 PCR 반응을 유도할 수 있다. 핫-스타트 Taq 폴리머라제는 PCR 반응이 준비되는 동안에 폴리머라제 활성을 저해함으로써 비특이적 증폭은 감소시키고 표적물의 증폭은 증가시키게 된다. 이를 통해 본 발명의 다중 성병 진단용 키트는 높은 민감도 및 특이도로 성병의 원인균을 검출할 수 있게 된다.
또한, 본 발명에서는 PCR 반응의 민감도를 높이기 위해, 베타인(betaine), 소혈청알부민(Bovin Serum Albumin, BSA), TMA(Tetramethylammonium) 옥살레이트 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 PCR 인핸서를 추가로 첨가하는 것이 바람직하다.
베타인은 트리메틸글리신과 같은 양전해물질로서 DNA 해리시 염기쌍 조성 의존성을 감소시킴으로써 DNA 이중가닥의 분리를 용이하게 한다. 본 발명에서의 사용농도는 0.8-1.6M가 바람직하다. 소혈청알부민은 Taq 폴리머라제를 안정화시키는 기능이 있으며, 본 발명에서의 사용농도는 10-100㎍/mL가 바람직하다. TMA 옥살레이트(pH 8.0-8.6)는 TMA 히드록사이드를 옥살산으로 중화하여 제조되는 것으로, 본 발명에서의 사용농도는 2-5mM이 바람직하다.
이와 같이 본 발명의 다중 성병 진단용 키트는, 특수 DNA 추출용 완충액에 의하여 DNA를 추출하고, 핫-스타트 Taq 폴리머라제를 사용함으로써 민감도를 높이며, PCR 인핸서를 추가로 첨가함으로써 민감도 및 특이도를 더더욱 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다중 성병 진단용 키트에서 시료 DNA는 피검자의 생물학적 샘플, 예를 들어 소변, 질 분비물, 정액, 요도 분비물 등으로부터 검출한다.
한편, 본 발명의 성병 원인균의 검출방법은 상기 다중 성병 진단용 키트를 이용하여 시료 DNA를 추출하는 단계; 상기 추출된 시료 DNA를 PCR 증폭시키는 단계; 및 상기 증폭된 PCR 산물을 판독하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다중 성병 진단용 키트 및 이를 이용한 성병 원인균 검출방법은 한 번의 검사로 성병의 4가지 주요 원인균을 동시에 검출할 수 있고, 진단 시간을 획기적으로 단축하여, 짧은 시간에 보다 높은 정확도로 검사가 가능하며, 높은 민감도 및 특이도로 성병 원인균을 검출할 수 있게 된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 작용효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에만 한정되는 것이 아님은 당업자에게 있어서 자명한 사실이다.
실시예 1
1. 시료 DNA의 추출
(1) 양성 표준균주 시료
클라미디아 트라코마티스(ATCC VR-902B), 임균(ATCC 11688), 우레아플라즈마 우레알리티컴(ATCC 27618)과 우레아플라즈마 파붐(ATCC 700970D) 및 마이코플라즈마 제니탈리움(ATCC 33530)의 각 양성 표준균주로부터 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 다음과 같이 특수 DNA 추출법을 이용하였다.
각 표준균주의 시료 1.5㎖를 에펜도르프(eppendorf) 튜브에 옮기고, 13,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 펠렛이 흩어지지 않게 조심하여 상층액을 버리고, 다시 동일한 각 시료 1.5㎖를 같은 튜브에 담고, 13,000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 펠렛이 흩어지지 않게 조심하여 상층액을 버리고, 10mM Tris/HCl(pH 8.0) 및 0.1M EDTA(pH 8.0)로 이루어진 DNA 추출용 완충액(제1완충액) 200㎕를 첨가한 후 가라앉은 펠렛을 교반(vortexing)하여 재현탁시켰다. 이것을 13,000rpm으로 3분간 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 제1완충액 50㎕를 첨가한 후 살짝 교반하여 잘 섞어준 후, 5㎕만을 취하여 PCR 튜브에 넣었다.
GeneReleaser(Bioventures, Inc.) 버퍼, 즉 제2완충액을 사용전 15회 흔들어 준 후, 20㎕를 취하여 상기 PCR 튜브에 넣고 파이펫을 이용하여 잘 섞어준 후, 랙(rack)에 꽂아 전자렌지에 넣고 5분간 반응시켰다. 5,000rpm으로 1분간 원심분리하였다. 상층액 5㎕를 PCR 반응(30㎕)의 주형으로 사용하였다.
이때 나머지 샘플은 -20℃에 냉동 보관하여 추후 다시 사용할 수 있으며, 추후 사용시 녹인 용액을 30초간 원심분리한 후 상층액을 PCR 반응에 사용한다.
(2) 임상시료
한편, 중앙대학교 의과대학 비뇨기과의 실험실로부터 임상시료를 입수하였으며, 이로부터 상기와 동일한 방법으로 DNA를 추출하였다.
2. 중합효소연쇄반응(PCR)
상기 각 표준균주 시료 및 임상시료 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.
클라미디아 트라코마티스의 감염 여부를 알아보기 위해 프라이머 CT1-CT2를, 임균의 감염 여부를 알아보기 위해 프라이머 NG1-NG2를, 우레아플라즈마 우레알리티컴과 우레아플라즈마 파붐의 감염 여부를 알아보기 위해 프라이머 UU1-UU2를, 마이코플라즈마 제니탈리움의 감염 여부를 알아보기 위해 프라이머 MG1-MG2를 동시에 사용하여 다음과 같이 PCR 증폭을 수행하였다.
10×PCR 완충액(300mM Tris-HCl(pH 9.0), 300mM K+ 및 NH4 +로 구성되는 염, 20mM Mg2 +), 25pmol의 각 프라이머, 2.5mM의 각 dATP, dCTP, dGTP, dTTP(TaKaRa), 아이-스타트(i-start) Taq DNA 폴리머라제(iNtRON Biotechnology) 및 1.0M 베타인, 50㎍/mL BSA, 5mM TMA 옥살레이트를 포함하는 30㎕의 반응혼합물을 PCR 서머싸이클러(thermocycler, Perkin-Elmer Cetus, CA, USA)에 넣고, 94℃에서 5분간 변성(denaturation)후, 94℃에서 30초간 변성(denaturation), 54℃에서 30초간 프라이머 결합(primer annealing), 72℃에서 30초간 연장(extension)과정을 40 사이클 동안 반복한 뒤, 72℃에서 7분간 더 연장 반응을 하여, 증폭된 DNA를 수득하였다.
3. 판독
(1) 전기영동
PCR 산물의 일부(10㎕ 분취물)를 취하여 ㎖당 0.2㎍의 에티듐 브로마이드 (EtBr)를 함유한 1.5-2.0％ 아가로즈 겔상에서 전기영동하였다. 겔은 표준 DNA 크기 마커와 함께 50V하에 트리스-보레이트-EDTA(TBE) 완충액에서 전개한 후, UV하에서 DNA 증폭 여부를 확인하였다. 그 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1은 양성 표준균주 시료 DNA의 PCR 산물을 전기영동하여 나타난 밴드 양상을 찍은 사진이며, 도 2는 임상시료 DNA의 PCR 산물을 전기영동하여 나타난 밴드 양상을 찍은 사진이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 임상시료는 다른 원인균의 PCR 산물은 생성되지 않았으나, 우레아플라즈마(UU)의 PCR 산물이 생성되어, 우레아플라즈마균에 감염되었음을 알 수 있었다.
(2) 서열결정(Sequencing)
한편, 상기 양성 표준균주의 각 시료 DNA의 증폭된 PCR 산물에 대하여 ABIPRISMTM BigDyeTM Terminator Cycle sequencing Ready Reaction kit(Perkin Elmer Applied Biosystems Division, Foster City, CA)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 서열결정을 실시하였다. 그 결과는 도 3 내지 도 6에 나타내었다.
본 발명의 다중 성병 진단용 키트 및 이를 이용한 성병 원인균의 검출방법은 한 번의 검사로 성병의 4가지 주요 원인균을 동시에 검출할 수 있는 멀티 진단 기능을 발휘한다.
또한 본 발명은 PCR 반응을 이용하므로 진단 시간을 획기적으로 단축하여, 짧은 시간에 보다 높은 정확도로 검사가 가능하다.
또한 본 발명은 높은 민감도 및 특이도로 성병 원인균을 검출할 수 있는 작용효과가 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (10)

  1. 다음의 중합효소연쇄반응(PCR)용 프라이머를 함유하는 다중 성병 진단용 조성물:
    1) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 이루어지는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 증폭용 프라이머;
    서열번호 1: 5'-CTAGGCGTTTGTACTCCGTCA-3'
    서열번호 2: 5'-TCCTCAGGAGTTTATGCACT-3'
    2) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 이루어지는 임균(Neisseria gonorrhoeae) 증폭용 프라이머;
    서열번호 3: 5'-ACTGCGTTCTGAACTGGGTG-3'
    서열번호 4: 5'-GGCGGTCAATTTCACGCG-3'
    3) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 이루어지는 우레아플라즈마 우레알리티컴(Ureaplasma urealyticum) 및 우레아플라즈마 파붐(Ureaplasma parvum) 증폭용 프라이머; 및
    서열번호 5: 5'-GAAACGACGTCCATAAGCAACT-3'
    서열번호 6: 5'-GCAATCTGCTCGTGAAGTATTAC-3'
    4) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 이루어지는 마이코플라즈마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium) 증폭용 프라이머
    서열번호 7: 5'-AGTTGATGAAACCTTAACCCCTTG-3'
    서열번호 8: 5'-CATTACCAGTTAAACCAAAGCCT-3'
  2. 제1항의 조성물을 포함하는 프라이머, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 다중 성병 진단용 키트
  3. 제2항에 있어서, 상기 Taq 폴리머라제는 핫-스타트(Hot-start) Taq 폴리머라제인 다중 성병 진단용 키트
  4. 제2항에 있어서, 베타인(betaine), 소혈청알부민(Bovin Serum Albumin, BSA), TMA(Tetramethylammonium) 옥살레이트 및 이들의 혼합물 중 선택된 1종 이상의 PCR 인핸서를 추가로 포함하는 다중 성병 진단용 키트
  5. 제1항의 조성물을 포함하는 프라이머, DNA 추출용 완충액, PCR 완충액, dNTPs 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 다중 성병 진단용 키트
  6. 제5항에 있어서, 상기 DNA 추출용 완충액은 10mM Tris/HCl(pH 8.0) 및 0.1M EDTA(pH 8.0)로 이루어진 다중 성병 진단용 키트
  7. 제6항에 있어서, 상기 DNA 추출용 완충액으로 GeneReleaser(Bioventures, Inc.) 버퍼를 추가로 포함하는 다중 성병 진단용 키트
  8. 제5항에 있어서, 상기 Taq 폴리머라제는 핫-스타트(Hot-start) Taq 폴리머라제인 다중 성병 진단용 키트
  9. 제5항에 있어서, 베타인(betaine), 소혈청알부민(Bovin Serum Albumin, BSA), TMA(Tetramethylammonium) 옥살레이트 및 이들의 혼합물 중 선택된 1종 이상의 PCR 인핸서를 추가로 포함하는 다중 성병 진단용 키트
  10. 삭제
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