CN117343929A - 一种pcr随机引物及用其加强靶向富集的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因技术领域，具体公开了一种PCR随机引物及用其加强靶向富集的方法。一种PCR随机引物，所述PCR随机引物从5’到3’端依次包括成环互补序列、通用序列、UMI序列、UMI定位点和随机序列，所述PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成被非高保真DNA聚合酶识别，但不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基。一种在NGS靶向文库构建中加强靶向富集的方法，包括将片段化的待测基因组DNA与PCR随机引物混合，再混合非高保真DNA聚合酶等的多轮链置换随机扩增和以多轮链置换随机扩增产物为模板，混合高保真DNA聚合酶等的靶向富集。本申请具有大幅度提高靶向文库的在靶率的效果。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其是涉及一种PCR随机引物及用其加强靶向富集的方法。
背景技术
二代测序中的靶向测序是分子诊断的一个重要的方法。相比全基因组测序，它只针对特定的基因组区域如突变热点，重要的SNP位点进行测序检测，可在降低测序成本的同时对这些特定区域进行高深度测序，达到分子诊断的目的。
目前靶向测序在NGS文库制备过程中主要有两种方法：1. 基于杂交捕获，即使用与靶序列互补的DNA或RNA探针对特定的基因组区域进行捕获，达到富集靶向区域的目的；2.使用PCR方法：即设计特异性的引物，使用PCR扩增靶区域序列，达到富集靶向区域的目的。在使用PCR进行靶向富集的方法中，有3种方法已有专利发表，其中两种方法需要使用连接酶的方法来引入接头序列，步骤较多，操作复杂【专利号：US10450597B2；CN106192018A】。第3种方法使用了一种随机引物来引入接头序列，使得建库过程进一步简化【专利号：CN111826421】。在随机引物引入接头的方法中，通过随机扩增引入接头后，生成的DNA产物中5’端为接头序列，3’端为接头序列的互补序列。在靶向富集PCR反应中，加入的3’接头引物可使用上一步生成的DNA产物作为模板，在PCR反应过程中对全基因组进行指数扩增。这也是很多全基因组扩增建库使用的方法之一，特别是当投入量低时，比如单细胞基因组建库。但是对于靶向建库，只需要对特定的基因组区域进行富集，全基因组扩增产物的存在反而会降低靶向区域在文库中的比例，会导致靶向区域在测序结果中在靶率较低。
发明内容
为了大幅度提高靶向文库的在靶率，本申请提供一种PCR随机引物及用其加强靶向富集的方法。本申请通过通过对PCR随机引物进行进一步优化，将PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成被非高保真DNA聚合酶识别，但不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基，通过在NGS靶向文库构建中使用进一步优化后的PCR随机引物，大幅提高了靶向文库构建的在靶率。
第一方面，本申请提供的一种PCR随机引物采用如下的技术方案：
一种PCR随机引物，所述PCR随机引物从5’到3’端依次包括成环互补序列、通用序列、UMI序列、UMI定位点和随机序列，其中，所述成环互补序列与所述通用序列中连接UMI序列端的部分序列反向互补，所述PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成被非高保真DNA聚合酶识别，但不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基；所述UMI序列用来区分线性扩增中的不同的扩增子；UMI定位点可以用来区分随机序列和UMI序列。
上述技术方案中，通过将PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成被非高保真DNA聚合酶识别，但不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基，在PCR随机引物和DNA片段在多轮链置换随机扩增的过程中，不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基跟随PCR随机引物在同一DNA片段的不同位置上被随机标记，将不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基带入多轮随机链置换扩增产物中，多轮链置换随机扩增产物进入后续靶向富集阶段后，使用高保真DNA聚合酶进行DNA片段复制时，高保真DNA聚合酶在遇到这类无法识别的碱基或修饰碱基时，会中断DNA片段的复制过程，DNA片段的延伸终止，从而抑制全基因组的扩增，此消彼长，靶向扩增产物DNA的比例得到提高，NGS靶向文库构建的在靶率得到提高。
优选的，所述PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成碱基U或修饰碱基I。
上述技术方案中，通过将PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成碱基U（尿嘧啶）或修饰碱基I（次黄嘌呤），碱基U（尿嘧啶）和修饰碱基I（次黄嘌呤）不被高保真DNA聚合酶识别，这样的做法能够大幅提到了靶向文库构建的在靶率。
优选的，所述UMI序列的长度为4~20bp。
优选的，所述随机序列的长度为5~15bp。
优选的，所述UMI定位点序列的长度为1~6bp。
优选的，所述UMI定位点序列选自SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:3。
上述技术方案中，本申请可以根据实际需求选择成UMI序列和随机序列。
第二方面，本申请提供的一种试剂盒采用如下的技术方案：
一种试剂盒，包括本申请第一方面所述的PCR随机引物。
上述技术方案中，本申请的试剂盒采用PCR随机引物进行多轮链置换随机扩增，提高起始核酸分子转化为文库的效率。
第三方面，本申请提供的一种非诊断治疗目的的PCR扩增方法采用如下的技术方案：
一种非诊断治疗目的的PCR扩增方法，包括用如本申请第一方面所述的PCR随机引物或如本申请第二方面所述的试剂盒进行PCR扩增。
上述技术方案中，本申请通过利用如本申请第一方面所述的PCR随机引物或如本申请第二方面所述的试剂盒进行PCR扩增，可以有效实现靶向特异性产物的扩增，有效降低非特异性产物的产生，有效提高PCR扩增的在靶率。
第四方面，本申请提供的一种在NGS靶向文库构建中加强靶向富集的方法采用如下的技术方案：
一种在NGS靶向文库构建中加强靶向富集的方法，包括如下步骤：
步骤1：多轮链置换随机扩增；
步骤1-1：将片段化的待测基因组DNA与如本申请第一方面所述的PCR随机引物混合，变性后，迅速冷却处理；
步骤1-2：将核苷酸单体混合物、非高保真DNA聚合酶、缓冲液，和步骤1）的产物混合，进行多轮链置换随机扩增；
步骤2：靶向富集；以步骤1-2的多轮链置换随机扩增产物为模板，利用特异性引物、5’接头引物、3’接头引物和高保真聚合酶进行靶向富集。
上述技术方案中，本申请通过在步骤1中加入对含有不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基的PCR随机引物，最终得到的多轮链置换随机扩增产物中5’端的接头序列含不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基，继而在步骤2中利用含不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基进行特异性产物的扩增，因为高保真DNA聚合酶无法识别这类碱基或修饰碱基，高保真DNA聚合酶会终止DNA链的延伸，因此不能完整的延伸DNA链，因此不可以对全基因组进行指数扩增，由于全基因组扩增产物的减少，靶向特异性产物比例得到提高，从而提高文库测序结果中的在靶率。
优选的，所述步骤2中的高保真DNA聚合酶选自phusion DNA聚合酶、Q5DNA聚合酶、KAPA HIFI DNA聚合酶或pfu DNA聚合酶中的一种。
上述技术方案中，本申请可以根据实际需求选取对应所需的高保真DNA聚合酶。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
本申请通过在PCR随机引物由3’端到5’端序列中，将至少2个碱基T替换成被非高保真DNA聚合酶识别，但不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基，在PCR随机引物和DNA片段在多轮链置换随机扩增的过程中，不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基跟随PCR随机引物在同一DNA片段的不同位置上被随机标记，将不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基带入多轮随机链置换扩增产物中，多轮链置换随机扩增产物进入后续靶向富集阶段后，使用高保真DNA聚合酶进行DNA片段复制时，高保真DNA聚合酶在遇到这类无法识别的碱基或修饰碱基时，会中断DNA片段的复制过程，DNA片段的延伸终止，从而抑制全基因组的扩增，此消彼长，靶向扩增产物DNA的比例得到提高，NGS靶向文库构建的在靶率得到提高。
附图说明
图1为本申请阻止全基因组扩增和促进靶向富集示意图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
如图1所示，本申请一些具体实施方式中通过在PCR随机引物中加入碱基U代替碱基T，经过本申请的步骤1的多轮链置换反应后，多轮链置换反应产物近5’端的接头序列含碱基U，在使用高保真DNA聚合酶进行本申请的步骤2的靶向富集的过程中，高保真聚合酶遇见碱基U后，DNA片段的延伸终止，因此全基因组扩增被抑制，见图1中A，相应地，靶向扩增产物因不存在碱基U的阻挡，靶向扩增产物的比例得到提高，见图1中B。
本申请一些实施例的UMI定位点序列选自SEQ ID NO:1~ SEQ ID NO:3。
gt(SEQ ID NO:1)
gtg(SEQ ID NO:2)
gtga(SEQ ID NO:3)
本申请一些实施例的成环互补序列选自SEQ ID NO:4~ SEQ ID NO:8。
agatcggaa(SEQ ID NO:4)
aagtgga(SEQ ID NO:5)
ctgagtcg(SEQ ID NO:6)
agatcg(SEQ ID NO:7)
agat(SEQ ID NO:8)
本申请一些实施例的通用序列选自SEQ ID NO:9~ SEQ ID NO:12。
实施例1
本实施例中使用了130条靶区域特异性引物，以及以Illumina TrueSsq接头为参考的随机引物和接头序列。
一种PCR随机引物：
本实施例基于专利号：CN111826421所公开的PCR随机引物5’-AGATCGGAATCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNGTNNNNNN-3’(SEQ ID NO:13)的基础上，通过金斯瑞生物科技股份有限公司对PCR随机引物进行重新合成，使用2个碱基U替代了靠近3’端的两个碱基T，得到本申请实施例1的PCR随机引物：
5’-AGATCGGAATCAGACGTGTGCTCTTCCGATCUNNNNNNGUNNNNNN-3’(SEQ ID NO:16)
5’接头序列(SEQ ID NO:20)：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTGTTCTCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGA-3’
3’接头序列(SEQ ID NO:21)：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGTTGGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
特异性引物序列：序列如SEQ ID NO:22～152所示。
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DNA模板：10ng来源于HEK293T细胞系的基因组DNA，使用前基因组DNA被DNA片段化酶（NEB消化成100-300bp 的片段）。
步骤1：多轮链置换随机扩增：
步骤1-1：10ng的片段化的DNA与1µL 10µM的随机引物混合后加无核酸酶去离子水补足至11µL，在95℃下变性2分钟，然后迅速移到冰浴中冷却3分钟。
步骤1-2：准备4µL以下酶混合物，加到变性的DNA和随机引物混合物中。
其中，酶混合物：1.5µL10 x cutsmart缓冲液（NEB），1µL10mM dNTPs(NEB)，12单位的Bst3 DNA聚合酶(NEB)。
步骤1-3：按照以下程序设定在PCR仪中进行反应：
1个循环：25℃ 5分钟，30℃ 5分钟，55℃ 15分钟；
3个循环：75℃ 1分钟，25℃ 5分钟，30℃ 5分钟，55℃ 15分钟；
1个循环：55℃ 10分钟，8℃保存，得多轮链置换随机扩增产物。
步骤2：靶向富集：
步骤2-1：将各组分混合。
各组分用量见表1：
步骤2-2：按照以下程序设定在PCR仪中进行反应：
1个循环：98℃ 30秒；
25个循环：98℃ 5秒；65℃ 5分钟；72℃ 30秒；
1个循环：72℃ 2分钟，8℃保存。
步骤3：测序：
步骤2所得产物用1倍体积的SPRIselect磁珠（Beckman Coulter）进行纯化，纯化产物在BGI2000测序仪上进行双端测序，测序长度为100bp/端。
步骤4：结果分析：
测序完成后，使用BWA-MEM软件与人基因组序列进行序列匹配，有8871293 reads可匹配到人类基因组hg19。使用Bedtools计算匹配到基因组靶目标区域的Reads数目，其中有6685895 reads 匹配到靶区域。
根据以下公式：在靶率（%）=[匹配到预扩增靶区域的reads数/总reads数]*100%，计算出本申请的在靶率为75.3%。
实施例1和专利号：CN111826421的专利在同样的反应条件下，专利号：CN111826421的专利的在靶率为46.2%，实施例1的在靶率为75.3%，实施例1的在靶率较【专利号：CN111826421】的专利有大幅的提升，表明使用本申请所设计的PCR随机引物得到的多轮链置换随机扩增产物的5’端的接头序列成功引入碱基U，利用这样的多轮链置换随机扩增产物进行靶向富集时，能够有效抑制全基因组扩增，显著提高靶向测序在靶率。
实施例2
本实施例与实施例1不同的是，使用了与华大平台兼容的随机引物。
一种PCR随机引物：
在PCR随机引物：5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTNNNNNNGTNNNNNN-3’(SEQ ID NO:14)的基础上，通过金斯瑞生物科技股份有限公司对PCR随机引物进行重新合成，使用2个碱基U替代了靠近3’端的两个碱基T，得到本申请实施例2的PCR随机引物：
5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCUNNNNNNGUNNNNNN-3’(SEQ ID NO:17)。
步骤1：多轮链置换随机扩增：
和实施例1一致。
步骤2：靶向富集：
和实施例1一致。
步骤3：测序：
和实施例1一致。
步骤4：结果分析：
使用本申请实施例2的随机引物和对照组的随机引物在同样的反应条件下进行反应，其中，对照组的随机引物为：
5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTNNNNNNGTNNNNNN-3’
对照组的在靶率为51.6%，实施例2的在靶率为83.7%，实施例2的在靶率较对照组的在靶率有大幅的提升，表明使用本申请所设计的PCR随机引物得到的多轮链置换随机扩增产物的5’端的接头序列成功引入碱基U，利用这样的多轮链置换随机扩增产物进行靶向富集时，能够有效抑制全基因组扩增，显著提高靶向测序在靶率。
实施例3
本实施例与实施例1不同的是，使用了与Ion torrent 平台兼容的随机引物。
一种PCR随机引物：
在PCR随机引物：5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATNNNNNNGTNNNNNN-3’(SEQ ID NO:15)的基础上，通过金斯瑞生物科技股份有限公司对PCR随机引物进行重新合成，使用2个碱基U替代了靠近3’端的两个碱基T，得到本申请实施例3的PCR随机引物：
5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAUNNNNNNGUNNNNNN-3’(SEQ ID NO:18)。
步骤1：多轮链置换随机扩增：
和实施例1一致。
步骤2：靶向富集：
和实施例1一致。
步骤3：测序：
和实施例1一致。
步骤4：结果分析：
使用本申请实施例3的随机引物和对照组的随机引物在同样的反应条件下进行反应，其中，对照组的随机引物为：
5’-CCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATNNNNNNGTNNNNNN-3’
对照组的在靶率为35.7%，实施例3的在靶率为60.8%，实施例3的在靶率较对照组的在靶率有大幅的提升，表明使用本申请所设计的PCR随机引物得到的多轮链置换随机扩增产物的5’端的接头序列成功引入碱基U，利用这样的多轮链置换随机扩增产物进行靶向富集时，能够有效抑制全基因组扩增，显著提高靶向测序在靶率。
实施例4
本实施例与实施例1不同的是，本实施例使用2个修饰碱基I替代了靠近3’端的两个碱基T，得到得到本申请实施例4的PCR随机引物：
5’-AGATCGGAATCAGACGTGTGCTCTTCCGATCINNNNNNGINNNNNN-3’(SEQ ID NO:19)。
步骤1：多轮链置换随机扩增：
和实施例1一致。
步骤2：靶向富集：
和实施例1一致。
步骤3：测序：
和实施例1一致。
步骤4：结果分析：
实施例4和专利号：CN111826421的专利在同样的反应条件下，专利号：CN111826421的专利的在靶率为46.2%，实施例4的在靶率为72.8%，实施例4的在靶率较【专利号：CN111826421】的专利有大幅的提升，表明使用本申请所设计的PCR随机引物得到的多轮链置换随机扩增产物的5’端的接头序列成功引入修饰碱基I，利用这样的多轮链置换随机扩增产物进行靶向富集时，能够有效抑制全基因组扩增，显著提高靶向测序在靶率。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种PCR随机引物，其特征在于，所述PCR随机引物从5’到3’端依次包括成环互补序列、通用序列、UMI序列、UMI定位点和随机序列，其中，所述成环互补序列与所述通用序列中连接UMI序列端的部分序列反向互补，所述PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成被非高保真DNA聚合酶识别，但不被高保真DNA聚合酶识别的碱基或修饰碱基；所述UMI序列用来区分线性扩增中的不同的扩增子；UMI定位点用来区分随机序列和UMI序列。
2.一种PCR随机引物，其特征在于，所述PCR随机引物由3’端到5’端序列中，至少2个碱基T替换成碱基U或修饰碱基I。
3.根据权利要求1所述的一种PCR随机引物，其特征在于，所述UMI序列的长度为4~20bp。
4.根据权利要求1所述的一种PCR随机引物，其特征在于，所述随机序列的长度为5~15bp。
5.根据权利要求1所述的一种PCR随机引物，其特征在于，所述UMI定位点序列的长度为1~6bp。
6.根据权利要求5所述的一种PCR随机引物，其特征在于，所述UMI定位点序列选自SEQID NO:1~ SEQ ID NO:3。
7.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1~6任一项所述的PCR随机引物。
8.一种非诊断治疗目的的PCR扩增方法，其特征在于，包括用如权利要求1~6任一项所述的PCR随机引物或如权利要求7所述的试剂盒进行PCR扩增。
9.一种在NGS靶向文库构建中加强靶向富集的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：多轮链置换随机扩增；
步骤1-1：将片段化的待测基因组DNA与如权利要求1~5任一项所述的PCR随机引物混合，变性后，迅速冷却处理；
步骤1-2：将核苷酸单体混合物、非高保真DNA聚合酶、缓冲液，和步骤1）的产物混合，进行多轮链置换随机扩增；
步骤2：靶向富集；以步骤1-2的多轮链置换随机扩增产物为模板，利用特异性引物、5’接头引物、3’接头引物和高保真聚合酶进行靶向富集。
10.根据权利要求9所述的一种在NGS靶向文库构建中加强靶向富集的方法，其特征在于，所述步骤2中的高保真DNA聚合酶选自phusion DNA聚合酶、Q5DNA聚合酶、KAPA HIFIDNA聚合酶或pfu DNA聚合酶中的一种。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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