CN111346676B - 一种铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶及其制备方法和用途 - Google Patents

一种铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

一种铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶及其制备方法和用途，属于纳米技术和催化材料领域，本发明提供的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，其结构式为K10P2W18Fe4(H2O)2O68/PDA，通过制备前体物Na8[HPW9O34]、制备K10P2W18Fe4(H2O)2O68及制备铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶得到本品。本发明材料具有过氧化物模拟酶的催化功能，可作为一种新颖的过氧化物模拟酶；可代替辣根过氧化氢酶在免疫分析、生物检测和临床诊断中应用；此外，本发明制备的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶可用于过氧化氢、谷胱甘肽和大肠杆菌的比色或荧光检测，检测有较好的灵敏度。

Description

一种铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于纳米技术和催化材料领域，具体涉及一种具有过氧化物酶活性的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，其制备方法、使用方法和用途。所述铁取代钨磷酸盐聚多巴胺纳米模拟酶为一种纳米结构复合材料。更具体地，本发明提供利用铁取代钨磷酸盐聚多巴胺纳米模拟酶的过氧化氢、谷胱甘肽和大肠杆菌O157：H7的检测方法。
背景技术
自然界所有生命现象都与酶有关，酶是一种具有催化功能的生物分子，以蛋白质为主。天然酶催化效率高，底物专一，在生物化学中发挥了重要的作用，已被广泛研究。辣根过氧化物酶(HRP)作为一种重要的天然酶，可以结合抗体催化底物显色用于酶联免疫分析。酶联免疫分析方法简单快速，被广泛应用于食品、药品与临床分析。但是，HRP的制备、储存比较耗时，价格昂贵，存在易变性失活等缺点。因此，人工模拟过氧化物酶的研究受到广泛的关注。
纳米模拟酶是一类既有纳米材料的独特性能，又有催化功能的模拟酶，是继环糊精、冠醚、卟啉、有机金属配合物模拟酶的新一代人工合成模拟酶。相对于天然酶来说，纳米模拟酶具有良好的催化活性，容易制备，来源广泛，价格低廉，活性易于调控，对极端pH值、温度和底物浓度具有更强的承受能力。2007年阎锡蕴研究小组在《NatureNanotechnology》上发表了氧化铁纳米颗粒具有过氧化物酶活性的论文，并以氧化铁纳米颗粒为标记物，用于酶联免疫分析测定乙肝表面抗原、肌钙蛋白。在酶催化反应中，酶底物被氧化，其颜色、吸光度、荧光等特性发生各种性质的改变和变化。利用这些变化可以实现对H2O2、底物、酶或相关物质的检测。目前，已有纳米模拟酶应用于肿瘤的诊断与治疗、血糖和尿酸的检测、免疫检测、体内无标记示踪、农药及神经毒剂检测等领域。此后，纳米模拟酶领域迅速成为研究热点，一系列兼具独特纳米性质和酶性质的纳米模拟酶材料被合成出来，显示出在环境、生物和医学领域的潜在应用价值。多金属氧酸盐，简称多酸，是由前过渡金属离子特别是钒，钼，钨元素与氧通过共价键形成的金属氧簇类化合物。多酸具有不可比拟的结构多样性以及优异的催化性质，制备简单，价格低廉，绿色环保。王晓红课题组上首次证明多酸具有过氧化物酶活性，可以替代辣根过氧化物酶，用于分析传感。此后一系列多酸的模拟酶性能被开发或制备出来。但是，这些具有模拟酶的多酸分子易溶于水，表面不易偶联生物分子，极大限制了其在检测中的应用。目前只有多酸与叶酸偶联的杂化纳米氧化酶被报道(Wang J,Mi X,Guan H,Wang X,Wu Y:Assembly of folate-polyoxometalatehybrid spheres for colorimetric immunoassay like oxidase.Chem Commun 2011；47:2940-2942)。但是，这个纳米杂化材料只能用于叶酸过表达肿瘤细胞的识别与传感，无法用于其他生物物质的分析，限制了多酸模拟酶在病毒，抗体，细菌、核酸等酶联免疫分析方法中应用。
聚多巴胺是一种新兴的仿生黏附聚合物，是多巴胺的氧化自聚合产物。聚多巴胺可以通过邻苯二酚官能团的强亲和力在几乎所有材料表面上形成涂层，该特性可克服多酸表面官能化问题，与多酸分子形成纳米杂化材料，并进一步偶联抗体、配体从而用于酶联免疫分析，发展基于多酸聚多巴胺纳米模拟酶的酶联免疫分析方法，具有重要的理论与实际意义。彭军等人报道了一例多酸和多巴胺形成的PMo10V2/PDA复合物，该复合物所包含的多酸为H5PMo10V2O40，所含主要元素为磷钼钒，结构为keggin型，尺度为0.6-1.7微米。(Ding Y-H,Peng J,Khan S-U,Yuan Y:A new polyoxometalate(pom)-based composite:Fabrication through pom-assisted polymerization of dopamine and properties asanode materials for high-performance lithium-ion batteries.Chemistry-AEuropean Journal 2017；23:10338-10343)这种微米复合材料具有优异的高电容性能和高循环稳定性的特点，主要应用于锂电池的阴极材料。在相同条件下，我们制备了文献报道的PMo10V2/PDA微米级复合物，该化合物无过氧化物酶活性。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶。
本发明还提供了这种模拟酶的制备方法。
本发明同时公开了这种模拟酶在检测过氧化氢、谷胱甘肽及大肠杆菌O157:H7中的用途。
本发明的另一个目的是，提供基于铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检比色、荧光检测过氧化氢的方法，该方法在不同浓度范围内可实现过氧化氢的灵敏、快速检测。比色检测过氧化氢含量的线性范围是0-500μM和500-6250μM；荧光检测过氧化氢含量的线性范围是0-250μM和250-3125μM。
本发明的再一目的是，提供基于铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色、荧光检测谷胱甘肽的方法，该方法可实现维生素C，氨基酸，离子同时干扰的谷胱甘肽的灵敏、特异检测，该方法对于谷胱甘肽比色检测的线性相应范围为2-8mM，荧光检测范围为15.63-250μM。
本发明的再一目的是，提供基于铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶结合抗体荧光检测大肠杆菌O157:H7的方法，该方法可以完成大肠杆菌O157:H7的灵敏、特异检测，该方法对于大肠杆菌O157:H7的荧光检测的线性范围为103到106cfu/mL。
本说明书中，术语“类过氧化物酶”指显示出过氧化物酶的催化活性的物质。具体地，本发明的类过氧化物酶催化氧化还原反应，并以过氧化氢为电子受体，氧化底物。
在本说明中，术语“OPD”是化合物邻苯二胺的缩写名称，但二者互换地使用。
本发明提供的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，其结构式为K10P2W18Fe4(H2O)2O68/PDA(简称P2W18Fe4/PDA)，是一种纳米尺度的球形结构；可以催化底物过氧化氢，邻苯二胺或3,3’,5,5’-四甲基联苯胺的显色反应直接检测过氧化氢。
本发明目的之二是提供一种铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，其结构式为K10P2W18Fe4(H2O)2O68/PDA的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备前体物Na8[HPW9O34]
分别称取二水钨酸钠120g溶于150mL 80～100℃的水中，在搅拌状态下向其中加入浓磷酸3mL，然后在剧烈搅拌状态下逐滴加入冰乙酸22mL，此操作在30min内完成，白色沉淀逐渐出现，然后过滤，将沉淀在250mL，4mol/L的氯化钠溶液中搅拌洗涤后再次过滤后，高温干燥得到所需物质Na8[HPW9O34]。
2)制备K10P2W18Fe4(H2O)2O68
将氯化铁或硝酸铁1.5mmol溶解于10-20mL水中,向此溶液加入0.75mmol的固体Na8[HPW9O34]，搅拌，将两者混合加热至均相，趁热过滤沉淀，向滤液中加入固体氯化钾(3-10g)，生成棕色沉淀，待滤液冷却至室温，沉淀用玻璃砂漏斗过滤，真空干燥，用5-10mL热去离子水溶解重新结晶，放置于4℃冰箱，1-2天得纯产物K10P2W18Fe4(H2O)2O68，真空干燥。
3)制备铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶
将1～4mM K10P2W18Fe4(H2O)2O68与0.1～0.8mM盐酸多巴胺在室温下混合搅拌溶解至澄清溶液后，调整溶液的pH值3～6，继续搅拌混匀1～3小时，溶液变为黑色，将黑色溶液转移至反应釜中，置入鼓风干燥箱120～180℃中反应，冷却至室温，得到铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液；
4)铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的纯化
将步骤3)制得的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液，在每分钟10000～15000转的转速下离心分离0.5～1h，弃去离心分离后的上清液，加入与上清液等体积的去离子水，分散均匀，再次离心，洗涤，三次后制得铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的黑色产物，60℃烘箱烘干。烘干后的产物再分散到水溶液中制得一定浓度的溶液，用于检测分析。
本发明还提供基于铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液测定过氧化氢含量的方法，该方法包括：以铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)，2.2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)或3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢水溶液反应，产生有色或发光物质，测定生成的有色或发光物质，以确定过氧化氢的含量。
优选地，所述铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液的浓度为0.001mg/mL～2mg/mL,荧光检测优选浓度为0.0125mg/mL，比色检测优选浓度为0.05mg/mL。
优选地，所述邻苯二胺(OPD)的浓度为0.11mM～1mM，优选为0.9mM。
优选地，所述反应是在pH值为3～8，比色反应优选为4，荧光反应优选为6。
优选地，所述反应是在10～60分钟，优选为10分钟的条件下进行。
优选地，缓冲液的种类为磷酸缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，乙酸-乙酸钠缓冲液，比色反应的优选缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液，荧光反应的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
优选地，比色检测谷胱甘肽的过氧化氢优选浓度范围是0-500μM或500-6250μM；荧光检测谷胱甘肽或大肠杆菌O157:H7的过氧化氢优选浓度范围是0-250μM和250-3125μM。
该检测方法的反应原理如下：
Figure BDA0002403959650000061
在本发明的一个实施方案中，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色测定过氧化氢的步骤如下：
(1)取80μL pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，依次向其中加入邻苯二胺、铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和过氧化氢水溶液，并使邻苯二胺的终浓度为0.9mM，铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶为50μg/mL，然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶与邻苯二胺的浓度；只改变过氧化氢水溶液的浓度0，0.025,0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50mmol/L；
(2)将步骤(1)中所得混合溶液在室温反应10分钟；
(3)用酶标板测定上述混合溶液吸光度值；
在本发明的一个实施方案中，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光法测定过氧化氢的步骤如下：
(1)取80μL pH为6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，依次向其中加入邻苯二胺、铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和过氧化氢水溶液，并使邻苯二胺的终浓度为0.9mM，铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶终浓度为12.5μg/mL，然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶与邻苯二胺的浓度；只改变过氧化氢水溶液的浓度,0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200mmol/L；
(2)将步骤(1)中所得混合溶液在室温反应10分钟
(3)用酶标板测定上述混合溶液荧光强度值。
本发明还提供一种基于铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶测定谷胱甘肽的方法，该方法包括：以铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液为催化剂，使邻苯二胺(OPD)，2.2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)或3,3’5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢水溶液反应，再加入谷胱甘肽抑制产生有色或发光物质，测定生成的有色或发光物质，以确定谷胱甘肽的含量。
优选地，检测的谷胱甘肽含量的线性范围是2～8mM(比色法)和15.63～250μM(荧光法)。
该检测方法的反应原理如下：铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶催化过氧化氢氧化邻苯二胺形成黄色荧光氧化产物，加入多巴胺后，由于多巴胺对铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的催化作用产生抑制效应，使形成的OPD黄色荧光氧化产物减少，导致吸光度值，荧光强度值下降。
在本发明的一个实施方案中，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色测定谷胱甘肽的步骤如下：
(1)取80μL pH为4的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，依次向其中加入邻苯二胺、铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，过氧化氢和谷胱甘肽水溶液，并使邻苯二胺的浓度为0.9mM，铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶为50μg/mL，加入过氧化氢水溶液6.25mM；然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1:5×108；只改变谷胱甘肽的浓度0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100mM；
(2)将步骤(1)中所得混合溶液在室温反应10分钟；
(3)用酶标板测定上述混合溶液吸光度值；
在本发明的一个实施方案中，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光法测定谷胱甘肽的步骤如下：
(1)取80μL pH为6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，依次向其中加入邻苯二胺、铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，过氧化氢和谷胱甘肽水溶液，并使邻苯二胺的终浓度为0.9mM，铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶为12.5μg/mL，然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶与邻苯二胺的摩尔比为1:1.25×108；只改变谷胱甘肽的浓度0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，0.5，1，2mM；
(2)将步骤(1)中所得混合溶液在室温反应10分钟
(3)用酶标板测定上述混合溶液荧光强度值。
本发明还提供一种基于铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶测定大肠杆菌O157:H7的特异性检测方法，该方法包括用大肠杆菌O157:H7多克隆抗体包被酶标板，用包被好的酶标板捕获大肠杆菌O157:H7，多克隆抗体利用大肠杆菌O157:H7多克隆抗体偶联铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶与其形成夹心式复合物，加入双氧水和邻苯二胺，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶催化反应发生，利用荧光法测定大肠杆菌O157:H7的含量。
优选地，检测的大肠杆菌O157:H7含量的线性范围是103到106cfu/mL。
在本发明的一个实施方案中，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶偶联大肠杆菌O157:H7多克隆抗体，利用夹心免疫学方法荧光检测大肠杆菌O157:H7的步骤如下：
(1)制备大肠杆菌O157:H7多克隆抗体偶联铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶复合物。
在pH＝7.4磷酸缓冲液中，将铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和大肠杆菌O157:H7多克隆抗体以质量浓度1:1的浓度温和混匀，37℃反应24h，离心机15000转离心除去未反应的多克隆抗体，多次磷酸缓冲液水洗，纯化偶联产物，纯化好的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体偶联铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶复合物用1～10％牛血清白蛋白在4℃.封闭24小时，然后15000转离，沉淀重新分散到pH＝7.4磷酸缓冲液中，储存于4℃冰箱。
优选的，牛血清白蛋白的用量为5％。
(2)制备大肠杆菌O157:H7多克隆抗体包被的酶标板。
a)将大肠杆菌O157:H7多克隆抗体溶解在包被液中；
b)步骤a)得到的酶标板包被液加入待包被的酶标板的各个微孔中，4℃～37°包被2～10小时；
c)所述酶标板用洗涤液洗2～5次，优选3次，并拍干；
d)向所述酶标板的各个微孔中加入酶标板封闭液，37℃封闭60-120分钟，或4摄氏度过夜，然后弃去封闭液、用200-300μLPBS或者不含去污剂的洗涤缓冲液，拍干、37～45摄氏度烘干，烘干时间在60-120分钟之间。将密封好的酶标板装入具有干燥剂的袋子中在干燥环境中保存在冰箱中待用，保存时间1～4个月。
e)步骤c)中酶标板封闭0.5～2小时后检测所述酶标板的包被均一度。
步骤a)中溶解后抗体在所述酶标板包被液中的浓度为0.1～10μg/mL，优选1～5μg/mL，更优选5μg/mL。
步骤b)中所述酶标板包被液的成分为pH 9.6，0.1mol L-1的碳酸氢钠。包被液的加入量为50～100μL/孔；
步骤c)中所述洗涤液成分为0.24g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，8g磷酸二氢钾和0.2g氯化钾溶于1L去离子水中，洗涤液用量为350μL/孔/次；步骤4)所述酶标板封闭液为1％～10％的牛血清白蛋白或脱脂奶粉，优选为2.5％的牛血清白蛋白，封闭液的加入量为200μL/孔；
步骤e)中酶标板均一度，用酶标仪测定各个孔封闭液在340nm波长处的吸光度值，计算各个孔的变异系数，所得变异系数反应各个班的包被的均一度。
(3)稀释大肠杆菌溶液。
准备好5个EP管，然后在每个EP管中加入200微升标准稀释液，编上编码，分别为1，2，3，4，5，6，7，在1号管中加入200微升标准品大肠杆菌溶液，用枪头反复吹打5～10次左右(注意控制幅度不要过大容易产生气泡)如果有涡旋仪可以在涡旋仪上涡旋1～10秒左右，然后换枪头，在1号管中取200微升加入到2号管，后面过程一次类推。最后稀释完，前面4个管中每管液体在200微升，5号管为400微升。浓度是从大到小。
优选地用枪头反复吹打5次，或者涡旋5分钟。大肠杆菌标准溶液最高浓度为1×109～9×109CFU/mL，优选2×109CFU/mL；
(4)标准大肠杆菌溶液、空白加样。
标准是每个浓度点2～6个孔(做平行)，每孔加入50～200微升，加样过程中注意换枪头，空白孔加入50～200微升标准稀释液或者样本稀释液。特别要说明的是，标准加样和样本加样尽量控制在10～20分钟内加完，如果时间拖的太长，会导致前面孔先反应后面孔才开始反应，这样数值偏差过大。加完样后盖上封板膜，至37摄氏度孵育20～240分钟。
优选地每个浓度点3个平行孔，标准溶液孔和空白空标准的每孔加入200微升，优选的加样时间为10分钟，优选孵育时间为30分钟。
(5)洗板。
将孵育好的酶标板，每孔加入250～300微升的洗涤剂或将酶标板放入震荡仪上振荡5～10秒左右，然后静止30秒，将板子在桌子上晃动5秒左右，然后静置30秒，甩干，拍板。
优选地洗涤液同(2)，洗涤次数为2～5次，优选地3次。
(6)铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶标大肠杆菌O157:H7多克隆抗体复合物的结合。
铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶标大肠杆菌O157:H7多克隆抗体复合物用稀释液稀释到浓度，加入酶标板，50μL～100μL/孔，优选的100μL/孔；空白孔中不需要加(空白孔为空)，放置在湿盒里37℃，30分钟～120分钟，优选地90分钟。加入洗涤液洗去未偶联的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶标大肠杆菌O157:H7多克隆抗体复合物，洗涤2～5次，优选地4次。洗涤液同(5)
(7)配制显色液
本发明提供一种酶连免疫显色底物液，其特征在于，包括显色液A和显色液B；
所述显色液A的组分及含量如下：
OPD             0.44M～2M
柠檬酸钠        5～20g/L
柠檬酸          2～10g/L
显色液A制备方法：各组分溶于1L蒸馏水中制备完成。
所述显色液B的组分及含量如下：
Figure BDA0002403959650000111
显色剂B的配制方法为将各组分溶解于含有柠檬酸，柠檬酸钠的1L缓冲液中。
优选地，所述双氧水0.5-1mol/L，优选地为1000mM，邻苯二胺(OPD)的浓度为0.44-1mM，优选为1.8mM。
(9)显色，先每孔中加入20-100微升的显色A液，然后每孔中加入20-100微升显色B液。避光37摄氏度显色10～20分钟。优选地，显色时间为10分钟。
优选地，A液100微升，B液100微升。
(10)读数
用酶标仪在564nm处测定荧光强度，根据标准曲线，阴性孔校正，测定大肠杆菌的浓度。
与现有技术相比，本发明至少具有以下的有益效果：
本发明制备铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米材料具有过氧化物模拟酶的催化功能，可作为一种新颖的过氧化物模拟酶；可代替辣根过氧化氢酶在免疫分析、生物检测和临床诊断中应用；此外，本发明制备的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶可用于过氧化氢的比色检测、荧光检测，对过氧化氢检测有好的灵敏度；
本发明制备的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，可以用于谷胱甘肽的比色、荧光检测，同时利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶的类过氧化物酶的催化功能，可以消除还原物质(如抗坏血酸等)对检测的干扰，从而对谷胱甘肽检测有好的选择性和灵敏度。
本发明制备的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶结合大肠杆菌O157：H7多克隆抗体形成酶标复合物，可以用于食源性致病菌大肠杆菌O157：H7的荧光检测，检测的选择性好，具有较好的线性范围。
本发明利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶替代原有天然酶，降低了试剂成本，在强酸条件下都具有很高的活性和化学稳定性。铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶制备过程简单，操作性好，回收率高，在水中的分散性好，可在水相体系中利用水热法一步自组装制备。
本发明的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶与其它具有单一的类过氧化物酶活性的多酸模拟酶相比，表面具有功能化集团，可以偶联生物分子和其它材料。在多金属氧酸盐外层包裹聚多巴胺，得到的复合纳米材料表现出协同作用，得到优于多金属氧酸盐的过氧化物酶活性。
附图说明
图1铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶的红外光谱图、zeta电位图；
图2铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶的扫描电子显微镜图、透射电子显微镜图、EDS能谱；
图3铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶类过氧化物酶活性测定；(a)比色法测定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶催化过氧化氢氧化邻苯二胺反应；(b)荧光法测定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶催化过氧化氢氧化邻苯二胺反应；(d)比色法测定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺反应；
图4铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶测定过氧化氢底物邻苯二胺浓度的选择；
图5铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶类过氧化物酶活性检测条件优化；
图6铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶检测过氧化氢；
图7铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶检测谷胱甘肽；
图8铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶谷胱甘肽方法的选择性；
图9铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶检测大肠杆菌O157：H7；
图10铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶检测大肠杆菌O157：H7的选择性。
下面结合具体实施例子，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例子仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1本发明铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米酶的合成
1)制备前体物Na8[HPW9O34]
分别称取二水钨酸钠120g溶于150mL 100℃的水中，在搅拌状态下向其中加入浓磷酸3mL，然后在剧烈搅拌状态下逐滴加入冰乙酸22mL，此操作在30min内完成，白色沉淀逐渐出现，然后过滤，将沉淀在250mL 4mol/L的NaCl溶液中搅拌洗涤后再次过滤后，高温干燥得到所需物质Na8[HPW9O34]。
2)制备K10P2W18Fe4(H2O)2O68
将氯化铁或硝酸铁1.5mmol溶解于10mL水中，向此溶液加入0.75mmol的固体Na8[HPW9O34]，搅拌，将两者混合加热至均相，趁热过滤沉淀，向滤液中加入固体氯化钾5g，生成棕色沉淀，待滤液冷却至室温，沉淀用玻璃砂漏斗过滤，真空干燥，用5mL热去离子水溶解重新结晶，放置于4℃冰箱，1-2天得纯产物K10P2W18Fe4(H2O)2O68，真空干燥。
3)制备铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶
将2mM K10P2W18Fe4(H2O)2O68与10mM盐酸多巴胺在室温下混合搅拌溶解至澄清溶液后，调整溶液的pH值4，继续搅拌混匀1小时，溶液变为黑色，将黑色溶液转移至反应釜中，置入鼓风干燥箱160℃中反应16小时，冷却至室温，得到铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液；
4)铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的纯化
将步骤3)制得的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液，在每分钟15000转的转速下离心分离1h，弃去离心分离后的上清液，加入与上清液等体积的去离子水，分散均匀，再次离心，再次洗涤，三次后制得铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的黑色产物，再分散到水溶液中制得一定浓度的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液。铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的红外光谱(见图1(a))、电位(见图1(b)；形貌通过扫描电镜，透射电镜测定见图2(a)-(c)；粒径为104纳米左右，见图2(a)；所含元素通过EDS，见图2(d)-(h)。所合成的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶用于实施例2-8。
实施例2铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶催化过氧化氢氧化其底物反应的实验
实施例2A铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶催化过氧化氢氧化邻苯二胺(OPD)反应的实验
(1)取800μL，0.1M，pH4的磷酸盐缓冲溶液，依次向其中加入500μL，0.9mM邻苯二胺(OPD)，500μL，250mM H2O2和200μL 25μg/ml铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，然后将上述溶液混合均匀；在室温下反应10分钟。
(2)用紫外可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在分别在350-700nm测定紫外吸收光谱，实验结果如图3(a)所示。用荧光分光光度计在450-700nm测定发射光谱，实验结果如图3(b)所示。
实施例2B铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶催化过氧化氢氧化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)反应的实验
(1)取2400μL，0.1M，pH4的磷酸盐缓冲溶液，依次向其中加入480μL，1.5mM 3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，60μL，250mM H2O2和60μL 25μg/ml铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，然后将上述溶液混合均匀；在室温下反应10分钟。
(2)用紫外可见吸收分光光度计测定上述混合溶液在分别在400-800nm测定紫外吸收光谱，实验结果如图3(c)所示。
实施例3铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测过氧化氢条件优化实验
实施例3A OPD浓度对铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测过氧化氢的影响
(1)取80μL，0.1M，pH4的磷酸盐缓冲溶液，依次向其中加入50μL，0～3.6mM邻苯二胺(OPD)，50μL，250mM H2O2和20μL 50μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液，然后将上述溶液混合均匀；所述混合溶液中固定铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶与过氧化氢的含量，只改变混合溶液中邻苯二胺(OPD)水溶液的浓度分别为0.11，0.22，0.44，0.88，1.76，3.52，7.04，14.08，28.16，56.32，112.5，225，450，900μmol/L。
(2)将步骤(1)中所得混合液反应30分钟；
(3)用紫外-可见分光光度计测定上述混合溶液紫外吸收光谱。
实验结果如图4所示，从图4可以看出450nm处的吸光度值在邻苯二胺浓度为0.9mM时达到平衡，本实验中优选为0.9mM邻苯二胺。
实施例3B反应pH对铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测过氧化氢的影响
(1)取80μL pH 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的磷酸盐缓冲溶液，依次向其中加入50μL3.6mM邻苯二胺，20μL 125μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和50μL，400mMH2O2，加入H2O2即开始计时，均匀混合溶液；
(2)将步骤(1)中得到的混合溶液再室温反应10分钟；
(3)用多功能酶标仪，在450nm测定体系的吸光度值，在564nm处测定体系的荧光强度，做出不同pH值下吸光度值和荧光强度的变化。体系优化结果如图5(a)和(d)所示，当pH为4和6时，吸光度和荧光达到最大。因此，选择pH值为4和6分别作为比色和荧光检测的最佳pH。
实施例3C缓冲溶剂对铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测过氧化氢的影响
(1)准确移取80μL，pH等于4和6的柠檬酸-柠檬酸钠，乙酸-乙酸钠，Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，依次向其中加入50μL，3.6mM邻苯二胺，20μL 125μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和50μL，400mM H2O2，加入H2O2即开始计时，均匀混合溶液；
(2)用多功能酶标仪，在450nm测定pH等于4的不同缓冲盐体系的吸光度值，在564nm处测定pH等于6的不同缓冲盐体系的荧光强度，测定体系的吸光度值和荧光度值随时间的变化。每隔30秒读数一次，共10分钟，至底物基本反应完全，绘制时间和吸光度或荧光强度关系曲线，结果如图5(b)和(e)所示。当缓冲液分别为乙酸和柠檬酸缓冲液时，吸光度和荧光达到最大。因此，选择乙酸-乙酸钠和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液分别作为比色和荧光检测的最佳缓冲液。以下实施例中比色传感所用皆为乙酸-乙酸钠缓冲液，荧光传感所用皆为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
实施例3D铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶浓度对检测过氧化氢的影响
(1)分别准确移取80μL，pH等于4和6的乙酸-乙酸钠缓冲液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，依次向其中加入50μL3.6 mM邻苯二胺，保持邻苯二胺和最后加入的双氧水的浓度，只改变铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的浓度，向溶液中分别加入20μL 0.98，1.95，3.9，7.8，15.6，31.25，62.5，125，250，500，1000μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，最后加入50μL，400mM H2O2，加入H2O2即开始计时，均匀混合溶液；
(2)将步骤(1)中得到的混合溶液再室温反应10分钟；
(3)用多功能酶标仪，在450nm测定体系的吸光度值，在564nm处测定体系的荧光强度，做出不同铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶浓度下吸光度值和荧光强度的变化。体系优化结果如图5(c)和(f)所示，当加入的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶浓度分别为50μg/mL和12.5μg/mL时，吸光度和荧光达到最大。因此，选择为50μg/mL和12.5μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液浓度分别作为比色和荧光检测的最佳浓度。
实施例4利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测过氧化氢
实施例4A铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色测定过氧化氢根据实施例3所选择的条件，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色测定过氧化氢，具体步骤如下：
(1)分别准确移取80μL，pH等于4的乙酸-乙酸钠缓冲液，依次向其中加入50μL3.6mM邻苯二胺，20μL 500μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，保持以上条件不变，只改变加入的过氧化氢的浓度，分别加入50μL，0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50mmol/L过氧化氢，加入H2O2即开始计时，均匀混合溶液；
(2)将步骤(1)中得到的混合溶液再室温反应10分钟；
(3)用多功能酶标仪，在450nm测定体系的吸光度值。
利用本发明的比色方法对过氧化氢的检测如图6(a)-(c)所示。其中，图6(a)是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测过氧化氢时得到的过氧化氢浓度与吸收值的响应曲线；过氧化氢的线性校正曲线，见图6(b)和(c)。有图6可以看出，该方法对于过氧化氢检测的线性范围分别为0-500μmol/L和500-6250μmol/L。线性关系良好，相关系数均大于0.99。
实施例4B铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光测定过氧化氢
根据实施例3所选择的条件，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光法测定过氧化氢的步骤如下：
(1)分别准确移取80μL，pH等于6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，依次向其中加入50μL3.6 mM邻苯二胺，20μL 125μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，保持以上条件不变，只改变加入的过氧化氢的浓度，加入50μL，0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100，200mmol/L H2O2，加入H2O2即开始计时，均匀混合溶液；
(2)将步骤(1)中所得混合溶液在室温反应10分钟
(3)用酶标板测定上述混合溶液在564nm处的荧光强度值。
利用本发明的荧光方法对过氧化氢的检测如图6(d)-(f)所示。其中，图6(d)是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测过氧化氢时得到的过氧化氢浓度与荧光强度的响应曲线；过氧化氢的线性校正曲线，见图6(e)和(f)。有图6可以看出，该方法对于过氧化氢的检测线性范围分别为0-250μmol/L和250-3125μmol/L。线性关系良好，相关系数均大于0.99。
实施例5利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测谷胱甘肽
实施例5A铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色测定谷胱甘肽根据实施例3和4所选择的条件，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色测定谷胱甘肽，具体步骤如下：
(1)分别准确移取80μL，pH等于4的乙酸-乙酸钠缓冲液，依次向其中加入20μL 500μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和50μL，25mmol/L过氧化氢，保持邻苯二胺，铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和过氧化氢浓度不变，只改变加入的谷胱甘肽的浓度，分别加入0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，25，50，100mmol/L，加入50μL，3.6mM邻苯二胺，均匀混合溶液，加入邻苯二胺即开始计时；
(2)将步骤(1)中得到的混合溶液再室温反应10分钟；
(3)用多功能酶标仪，在450nm测定体系的吸光度值。
利用本发明的比色方法对谷胱甘肽的检测如图7所示。其中，图7(a)是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测谷胱甘肽时得到的谷胱甘肽浓度与吸光度值变化的响应曲线；谷胱甘肽的线性校正曲线，见图7(a)内插图。由图7可以看出，该方法对于谷胱甘肽的检测线性范围为2～8mmol/L，最低检测限为0.18mmol/L。线性关系良好，相关系数均大于0.99。
实施例5B铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光测定谷胱甘肽
根据实施例3和4所选择的条件，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光法测定谷胱甘肽的步骤如下：
(1)分别准确移取80μL，pH等于6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液，依次向其中加入20μL 125μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，50μL 12.5mM H2O2，保持以上条件不变，只改变加入的谷胱甘肽的浓度，加入0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.125，6.25，12.5，0.5，1，2mmol/L谷胱甘肽，加入50μL，3.6mM邻苯二胺，均匀混合溶液，加入邻苯二胺即开始计时；
(2)将步骤(1)中所得混合溶液在室温反应10分钟；
(3)用酶标板测定上述混合溶液在564nm处的荧光强度值。
利用本发明的荧光方法对谷胱甘肽的检测如图7(b)所示。其中，图7(b)是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测谷胱甘肽时得到的谷胱甘肽浓度与荧光强度变化的响应曲线；谷胱甘肽的线性校正曲线见图7(b)内插图。由图7可以看出，该方法对于谷胱甘肽检测线性范围分别为15.63-250μmol/L，最低检测限为4.02μmol/L。线性关系良好，相关系数均大于0.99。
利用本发明的比色荧光方法对于谷胱甘肽的选择性检测结果如图8所示。图8(a)是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶比色检测谷胱甘肽特异性的柱形图，柱形图从左到右依次为空白对照组、2mM谷胱甘肽、2mM精氨酸、2mM甘氨酸、2mM赖氨酸、2mM苯丙氨酸、2mM丙氨酸、2mM Na+、2mM K+、2mM葡萄糖和0.2mM抗坏血酸等各种共存底物的条件下，测定反应体系吸收值。从结果可以得出，所有共存物质均没有明显的干扰。因此，所构建的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶对谷胱甘肽的比色测定法，选择性高，特异性好。图8(b)是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光检测谷胱甘肽特异性的柱形图，柱形图从左到右依次为空白对照组，0.2mM谷胱甘肽、0.2mM精氨酸、0.2mM甘氨酸、0.2mM赖氨酸、0.2mM苯丙氨酸、2mM丙氨酸、0.2mM Na+、0.2mM K+、2mM葡萄糖和0.2mM抗坏血酸等各种共存底物的条件下，测定反应体系荧光强度值。干扰结果如图8(b)所示，从结果可以得出，所有共存物质均没有明显的干扰。因此，所构建的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶对谷胱甘肽的荧光测定法，选择性高，特异性好。
实施例6利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测SH-SY5Y细胞中谷胱甘肽
根据实施例5B所选择的条件，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光法测定SH-SY5Y细胞中谷胱甘肽的步骤如下：
(1)SH-SY5Y细胞培养。SH-SY5Y细胞株来源为中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将SH-SY5Y细胞在含有10％胎牛血清和100U/ml青霉素链霉素和链霉素的DMEM培养基中培养，5％CO2、37℃培养箱中培养至对数生长期，向瓶内加入含EDTA的胰蛋白酶液，用胰酶将SH-SY5Y细胞从细胞培养瓶上消化下来，吸出消化液，向瓶内加入少量含血清的培养液，终止消化。使用弯头吸管，吸取瓶内培养液，按顺序反复轻轻吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。将细胞从培养瓶中转移到离心管中，用离心机1200rpm离心，除去培养基，重新分散于PBS缓冲液中，用计数板计数后，再次用离心机1200rpm离心，除去PBS缓冲液。
(2)向(1)步骤离心的2×105cells的SH-SY5Y细胞中加入200μL KPE缓冲液(缓冲液组成为含有0.1％TritonX-100，0.6％磺基水杨酸和5mM EDTA的0.1M pH 7.5磷酸钾缓冲液)，重悬，吹打分散。然后，将悬浮液用超声波处理2-3分钟，再在4℃ 3000g离心4分钟。将10μLSH-SY5Y细胞裂解液样品稀释到300μL作为谷胱甘肽测定样品。分别向SH-SY5Y细胞裂解稀释液中添加终浓度为0，5.00，10.00和20.00μM的谷胱甘肽标准品，将这四个谷胱甘肽添加的SH-SY5Y细胞稀释裂解液样品用于检测。
(3)向80μL pH6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，依次加入20μL 125μg/mL铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，50μL 12.5mM的双氧水，50μL步骤(2)制得的谷胱甘肽添加的SH-SY5Y细胞稀释裂解液样品。最后，加入50μL 3.6mM的邻苯二胺，混匀，混合即开始计时。
(4)将步骤(3)中所得混合溶液在室温反应10分钟。
(5)用酶标板测定上述混合溶液在564nm处的荧光强度值。
利用本发明的荧光方法对于SH-SY5Y细胞裂解液中谷胱甘肽的检测结果如表1所示，稀释后的SH-SY5Y细胞的谷胱甘肽含量为167.0μM，加标回收率在97.86-101.72％，相对标准偏差为0.06～4.39％。检测结果表明，所构建的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光检测谷胱甘肽法对视神经母细胞瘤细胞裂解液样品中谷胱甘肽的检测，结果准确，精密度高。
表1神经母细胞瘤SH-SY5Y中谷胱甘肽水平检测
Figure BDA0002403959650000231
实施例8利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测大肠杆菌O157:H7
根据实施例3和4所选择的条件，本发明利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶偶联大肠杆菌O157:H7多克隆抗体荧光检测大肠杆菌O157:H7的步骤如下：
(1)制备大肠杆菌O157:H7多克隆抗体偶联铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶复合物
在pH＝7.4磷酸缓冲液中，将铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶和大肠杆菌O157:H7多克隆抗体以质量浓度1:1的浓度温和混匀，37℃反应24h，离心机15000转离心除去未反应的多克隆抗体，多次磷酸缓冲液水洗，纯化偶联产物，纯化好的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体偶联铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶复合物用10％牛血清白蛋白在4℃.封闭24小时，然后15000转离心，沉淀重新分散到pH＝7.4磷酸缓冲液中，储存于4℃冰箱。
(2)制备大肠杆菌O157:H7多克隆抗体包被的酶标板
将大肠杆菌O157:H7多克隆抗体溶解在pH 9.6，0.1mol L-1的碳酸氢钠包被液中，浓度为5μg/mL；将得到的5μg/mL酶标板包被液以100μL/孔加入待包被的酶标板的各个微孔中，37o包被3小时。将0.24g氯化钠，1.44g磷酸氢二钠，8g磷酸二氢钾和0.2g氯化钾溶于1L去离子水中，制成洗涤液(下面步骤中使用的洗涤液都是此溶液)。酶标板用洗涤液350μL/孔/次洗3次，并拍干；向酶标板的各个微孔中加入酶标板封闭液10％的牛血清白蛋白200μL/孔，37℃封闭60分钟，或4摄氏度过夜，然后弃去封闭液、用200μLPBS缓冲液洗涤，拍干、37摄氏度烘干60分钟。将密封好的酶标板装入具有干燥剂的袋子中在干燥环境中保存在冰箱中待用。
(3)稀释大肠杆菌溶液
准备好5个EP管，然后在每个EP管中加入200微升标准稀释液，编上编码，分别为1，2，3，4，5，6，7，在1号管中加入200微升2×109CFU/mL标准品大肠杆菌溶液，用枪头反复吹打5次，然后换枪头，在1号管中取200微升加入到2号管，后面过程一次类推。最后稀释完，前面4个管中每管液体在200微升，5号管为400微升。浓度是从大到小。
(4)标准大肠杆菌溶液、空白加样
将200微升1×103CFU/mL，1×104CFU/mL，1×105CFU/mL，1×106CFU/mL，1×107CFU/mL 1×108CFU/mL的大肠杆菌溶液标准溶液加入到(2)中包被好的酶标板上，每个浓度点3个孔(做平行)，空白孔加入200微升标准稀释液。加完样后盖上封板膜，至37摄氏度孵育30分钟。
(5)洗板
将孵育好的酶标板，每孔加入250～300微升的洗涤液在震荡仪上振荡5秒，然后静止30秒，甩干，拍板。洗涤次数为3次。
(6)铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶标大肠杆菌O157:H7多克隆抗体复合物的结合
铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶标大肠杆菌O157:H7多克隆抗体复合物用稀释液100μL/孔加入酶标板；空白孔中不需要加，放置在湿盒里37℃，90分钟。加入洗涤液洗去未偶联的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶标大肠杆菌O157:H7多克隆抗体复合物，洗涤4次。
(6)显色
每孔加含有1.8mM邻苯二胺的pH6柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液100μL，加入100μL12.5mM H2O2，室温避光10min。
(7)读数
将酶标板置于酶标仪中，记录酶标仪在564nm处的荧光强度，根据标准曲线，阴性孔校正，测定大肠杆菌的浓度。
利用本发明的荧光方法对大肠杆菌O157：H7的检测如图9所示。其中，图9(a)是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶检测大肠杆菌O157：H7时得到的大肠杆菌O157：H7浓度与荧光强度变化的响应曲线；大肠杆菌O157：H7的线性校正曲线，见图9(b)内插图。由图9可以看出，该方法对于大肠杆菌O157：H7检测线性范围为103-106CFU/mL，线性关系良好，相关系数大于0.99，检测下限为4.2×102CFU/mL。线性关系良好，相关系数均大于0.99。
图10是用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶荧光检测大肠杆菌O157：H7特异性的柱形图，柱形图从左到右依次为添加了106CFU/mL金黄色葡萄球菌，106CFU/mL副伤寒沙门氏菌，106CFU/mL铜绿假单胞菌和106CFU/mL单核细胞增生性李斯特菌，测定其荧光强度值。干扰结果如图10所示。从结果可以观察出，所有物质均没有明显的干扰。因此，所构建的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶对大肠杆菌O157：H7的荧光测定法，选择性高，特异性好。

Claims (8)

1.一种铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶，其特征在于：结构式为K10P2W18Fe4(H2O)2O68@PDA，其制备方法包括以下步骤：
1）制备前体物Na8[HPW9O34]
分别称取二水钨酸钠120g 溶于150mL 80~100℃的水中，在搅拌状态下向其中加入浓磷酸3mL，然后在剧烈搅拌状态下逐滴加入冰乙酸22 mL，此操作在30 min内完成，白色沉淀逐渐出现，然后过滤，将沉淀在250 mL 4mol/L的NaCl溶液中搅拌洗涤后再次过滤后，高温干燥得到所需物质Na8[HPW9O34]；
2）制备K10P2W18Fe4(H2O)2O68
将氯化铁或硝酸铁1.5mmol 溶解于10-20mL水中,向此溶液加入0.75mmol的固体Na8[HPW9O34]，搅拌，将两者混合加热至均相，趁热过滤沉淀，向滤液中加入固体氯化钾（3-10g），生成棕色沉淀，待滤液冷却至室温，沉淀用玻璃砂漏斗过滤，真空干燥，用5-10mL热去离子水溶解重新结晶，放置于4oC冰箱，1-2天得纯产物K10P2W18Fe4(H2O)2O68，真空干燥；
3）制备铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶
将1~4mM K10P2W18Fe4(H2O)2O68 与0.1~0.8mM盐酸多巴胺在室温下混合搅拌溶解至澄清溶液后，调整溶液的pH值3~6，继续搅拌混匀1~3小时，溶液变为黑色，将黑色溶液转移至反应釜中，置入鼓风干燥箱120~180oC中反应，冷却至室温，得到铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液；
4）铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的纯化
将步骤3）制得的铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液，在每分钟10000~15000转的转速下离心分离0.5~1h，弃去离心分离后的上清液，加入与上清液等体积的去离子水，分散均匀，再次离心，再次洗涤，三次后制得铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的黑色产物，60oC烘箱烘干。
2.根据权利要求1所述的多酸聚多巴胺纳米模拟酶在检测过氧化氢中的应用。
3.根据权利要求1所述的多酸聚多巴胺纳米模拟酶在检测谷胱甘肽中的应用。
4.根据权利要求1所述的多酸聚多巴胺纳米模拟酶在检测大肠杆菌O157:H7中的应用。
5.根据权利要求2所述多酸聚多巴胺纳米模拟酶在检测过氧化氢中的应用，其特征在于：检测方法是以铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶的溶液为催化剂使邻苯二胺和过氧化氢水溶液反应，产生有色物质，测定生成的有色物质，以确定过氧化氢的含量；
所述铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶溶液的浓度为0.001mg/mL~2mg/mL, 荧光检测浓度为0.125 mg/mL，比色检测浓度为0.5mg/mL；
所述邻苯二胺的浓度为0.44mM~1mM；
所述反应是在pH值为3~8，比色检测pH值为4，荧光检测pH值为6；
所述反应是在10~60分钟条件下进行；
缓冲液的种类为磷酸缓冲液，柠檬酸缓冲液，乙酸缓冲液，比色反应的缓冲液为乙酸缓冲液，荧光反应的缓冲液为柠檬酸缓冲液；
比色检测的过氧化氢含量的线性范围是0-500μM和 500-6250μM; 荧光检测的过氧化氢含量的线性范围是0-250 μM 和 250-3125 μM。
6.根据权利要求3所述多酸聚多巴胺纳米模拟酶在检测谷胱甘肽中的应用，其特征在于：检测方法是以谷胱甘肽降低铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶催化双氧水氧化邻苯二胺，根据比色信号和荧光信号减弱的程度，从而确定谷胱甘肽的含量；
检测的谷胱甘肽含量的比色检测的线性范围为2-8 mM，荧光检测范围为15.63 - 250μM。
7.根据权利要求4所述多酸聚多巴胺纳米模拟酶在大肠杆菌O157:H7中的应用，其特征在于：检测方法是基于铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶测定大肠杆菌O157:H7的特异性检测方法，包括用大肠杆菌O157:H7多克隆抗体包被酶标板，用包被好的酶标板捕获大肠杆菌O157:H7，多克隆抗体利用大肠杆菌O157:H7多克隆抗体偶联铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶与其形成夹心式复合物，加入双氧水和邻苯二胺，利用铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶催化反应发生，利用荧光法测定大肠杆菌O157:H7的含量；
检测的大肠杆菌O157:H7含量的线性范围是103 到 106 cfu/mL。
8.根据权利要求4所述多酸聚多巴胺纳米模拟酶在大肠杆菌O157:H7中的应用，其特征在于：检测方法是将大肠杆菌O157:H7多克隆抗体溶解于pH=5.0~8.0的缓冲液中，获得浓度为2μg/mL~40μg/mL的大肠杆菌O157:H7多克隆抗体稀释液，将铁取代钨磷多酸聚多巴胺纳米模拟酶50μg/mL~500μg/mL与2μg/mL~40μg/mL大肠杆菌O157:H7等体积混合，在37摄氏度温和反应3~24小时，或4摄氏度12~24小时，离心，洗涤，除去未偶联的抗体；
其中大肠杆菌O157:H7多克隆抗体稀释液的缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH为7.4，浓度为10μg/mL；孵育反应时间为37摄氏度3小时，4摄氏度12小时。
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