JPH0611240B2 - 歯周疾患検査薬 - Google Patents
歯周疾患検査薬Info
- Publication number
- JPH0611240B2 JPH0611240B2 JP23384886A JP23384886A JPH0611240B2 JP H0611240 B2 JPH0611240 B2 JP H0611240B2 JP 23384886 A JP23384886 A JP 23384886A JP 23384886 A JP23384886 A JP 23384886A JP H0611240 B2 JPH0611240 B2 JP H0611240B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- periodontal disease
- group
- proline
- residue
- naphthylamide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は歯周疾患検査薬、さらに詳しくは、検体中のあ
る種の歯周疾患原因菌を特異的に、かつ、簡便、迅速に
検出し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測する
ことのできる検査薬に関する。
る種の歯周疾患原因菌を特異的に、かつ、簡便、迅速に
検出し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測する
ことのできる検査薬に関する。
従来の技術および問題点 近年、歯周疾患に関する細菌学的研究が進み、歯周疾患
病巣部に多くのスピロヘータが検出され、種々の臨床的
指標と高い相関性を示すことが判明している。また、嫌
気性のグラム陰性桿菌が主要な歯周疾患の原因であるこ
とも判明しており、その中でも特に、バクテロイデス・
ジンジバリス(Bacteroides gingivalis)などの黒色色素
産生バクテロイデス(Black-pigmented Bacteroides)が
注目され、その病原性について多数の報告がなされてい
る。
病巣部に多くのスピロヘータが検出され、種々の臨床的
指標と高い相関性を示すことが判明している。また、嫌
気性のグラム陰性桿菌が主要な歯周疾患の原因であるこ
とも判明しており、その中でも特に、バクテロイデス・
ジンジバリス(Bacteroides gingivalis)などの黒色色素
産生バクテロイデス(Black-pigmented Bacteroides)が
注目され、その病原性について多数の報告がなされてい
る。
そこで、口腔内におけるこれらの原因菌の存在を検知
し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測し、歯周
疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みがなされて
いる。
し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予測し、歯周
疾患の治療、予防に、臨床的に応用する試みがなされて
いる。
しかしながら、細菌学的方法によるこれらの原因菌の検
知には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という高
度な技術、特殊な設備等を必要とし、操作が煩雑で、培
養の結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠点
があり、臨床的に実用化するには困難な点が多い。ま
た、免疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免
疫である血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫である
リンパ球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する
試みもなされているが、検体試料の調製に煩雑な操作を
必要とする問題があり、やはり、実用化はなかなか困難
である。
知には、暗視野顕微鏡の使用、嫌気性菌の取扱という高
度な技術、特殊な設備等を必要とし、操作が煩雑で、培
養の結果の判断にも長い時間や熟練を要するという欠点
があり、臨床的に実用化するには困難な点が多い。ま
た、免疫学的な面から、これらの原因菌に対する液性免
疫である血中の抗体価を測定したり、細胞性免疫である
リンパ球幼若化反応を測定し、原因菌の存在を検知する
試みもなされているが、検体試料の調製に煩雑な操作を
必要とする問題があり、やはり、実用化はなかなか困難
である。
このような事情にかんがみ、本発明者らは、臨床的に実
用化できる歯周疾患原因菌の検知を可能とすべく、鋭意
研究を重ねた。その結果、口腔内スピロヘータが非常に
特異的なアミノペプチダーゼ様酵素活性を有し、また、
バクテロイデス・ジンジバリス、バクテロイデス・イン
ターミーディアス、バクテロイデス・コーポリス、バク
テロイデス・メラニノジェニカス、バクテロイデス・デ
ンティコーラなどの黒色色素産生バクテロイデスも同様
な活性を有し、ある種の基質を用いることにより、この
酵素活性を特異的に、かつ、簡便、迅速に検出でき、し
かも、歯周疾患の症状が正確に反映されることを見出し
た。
用化できる歯周疾患原因菌の検知を可能とすべく、鋭意
研究を重ねた。その結果、口腔内スピロヘータが非常に
特異的なアミノペプチダーゼ様酵素活性を有し、また、
バクテロイデス・ジンジバリス、バクテロイデス・イン
ターミーディアス、バクテロイデス・コーポリス、バク
テロイデス・メラニノジェニカス、バクテロイデス・デ
ンティコーラなどの黒色色素産生バクテロイデスも同様
な活性を有し、ある種の基質を用いることにより、この
酵素活性を特異的に、かつ、簡便、迅速に検出でき、し
かも、歯周疾患の症状が正確に反映されることを見出し
た。
これまで、口腔内のスピロヘータやバクテロイデス・ジ
ンジバリスがトリプシン様酵素やフィブリン分解酵素を
産生することは知られているが［ジャーナル・オブ・ク
リニカル・マイクロバイオロジー(Journal of Clinical
Microbiology)，９７〜１０２，１９８２年１月；マイ
クロバイオス・レターズ(Microbios Letters)，２５，
１５７〜１６０，１９８４年；ジャーナル・オブ・ペリ
オドンタル・リサーチ(Journal of Periodontal Resear
ch)，２１，９５〜１００，１９８６年］、臨床症状と
の相関性や検出の特異性の点でこれらの酵素を指標とす
ることは困難である。
ンジバリスがトリプシン様酵素やフィブリン分解酵素を
産生することは知られているが［ジャーナル・オブ・ク
リニカル・マイクロバイオロジー(Journal of Clinical
Microbiology)，９７〜１０２，１９８２年１月；マイ
クロバイオス・レターズ(Microbios Letters)，２５，
１５７〜１６０，１９８４年；ジャーナル・オブ・ペリ
オドンタル・リサーチ(Journal of Periodontal Resear
ch)，２１，９５〜１００，１９８６年］、臨床症状と
の相関性や検出の特異性の点でこれらの酵素を指標とす
ることは困難である。
問題点を解決するための手段 本発明は、検体中のアミノペプチターゼ様酵素活性を測
定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断あるい
は予測するための検査薬であって、式： Ｘ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｙ ［Ｉ］ ［式中、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ
基保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する発色
基、ＺはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する
０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物を該酵素の基質としてなることを特徴
とする歯周疾患検査薬を提供するものである。
定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断あるい
は予測するための検査薬であって、式： Ｘ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｙ ［Ｉ］ ［式中、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ
基保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する発色
基、ＺはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する
０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物を該酵素の基質としてなることを特徴
とする歯周疾患検査薬を提供するものである。
本発明の検査薬を用いれば、唾液、歯垢、歯肉溝浸出液
などのような検体を、好ましくは、中性条件下(pH6.0〜
8.5)、式[I]の基質と反応させ、その水解活性の強弱を
発色反応により測定することにより、簡便かつ迅速に、
歯周疾患の罹患や進行を診断、予測することができる。
などのような検体を、好ましくは、中性条件下(pH6.0〜
8.5)、式[I]の基質と反応させ、その水解活性の強弱を
発色反応により測定することにより、簡便かつ迅速に、
歯周疾患の罹患や進行を診断、予測することができる。
基質として用いる式[I]の化合物は公知であるか、少な
くとも、公知のペプチド合成法によって容易に製造でき
るものであり、式[I]中のＸ基で示されるアミノ基保護
基はペプチド合成に用いられる公知のアミノ基保護基の
いずれのものでもよく、例えば、ホルミル基、アセチル
基、スクシニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾ
イル基、カルボベンゾキシ基、ｐ−トルエンスルホニル
基などが挙げられる。
くとも、公知のペプチド合成法によって容易に製造でき
るものであり、式[I]中のＸ基で示されるアミノ基保護
基はペプチド合成に用いられる公知のアミノ基保護基の
いずれのものでもよく、例えば、ホルミル基、アセチル
基、スクシニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾ
イル基、カルボベンゾキシ基、ｐ−トルエンスルホニル
基などが挙げられる。
Ｙ基の発色基は、発色による酵素活性の測定（紫外部、
可視部、赤外部の吸収、蛍光の測定によるものを包含す
る）に用いられるものいずれでもよく、例えば、β−ナ
フチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノール、７−アミノ
−４−メトキシクマリン、５−アミノイソフタル酸ジメ
チルエステル、７−アミノ−４−トリフルオロメチルク
マリンなどから由来する基が挙げられる。特に、適当な
発色試薬により、肉眼的に判定可能な発色を示すβ−ナ
フチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−ニトフェノール由来の基が好ま
しい。
可視部、赤外部の吸収、蛍光の測定によるものを包含す
る）に用いられるものいずれでもよく、例えば、β−ナ
フチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェノール、７−アミノ
−４−メトキシクマリン、５−アミノイソフタル酸ジメ
チルエステル、７−アミノ−４−トリフルオロメチルク
マリンなどから由来する基が挙げられる。特に、適当な
発色試薬により、肉眼的に判定可能な発色を示すβ−ナ
フチルアミン、４−メトキシ−２−ナフチルアミン、ｐ
−ニトロアニリン、ｐ−ニトフェノール由来の基が好ま
しい。
Ｚ基はそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する０
〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ
酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｚ基中の
Ｃ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン、フェニルアラ
ニンまたはこれらの保護誘導体残基であることが好まし
い。該保護誘導体には、セリンのＯＨ基、システインの
ＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン酸のβ−あるいは
γ−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベンジル基などで保
護されたものが包含される。
〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミノ
酸またはペプチドであればいずれでもよいが、Ｚ基中の
Ｃ末端アミノ酸残基がグリシン、リジン、フェニルアラ
ニンまたはこれらの保護誘導体残基であることが好まし
い。該保護誘導体には、セリンのＯＨ基、システインの
ＳＨ基、アスパラギン酸やグルタミン酸のβ−あるいは
γ−ＣＯＯＨ基が保護基、例えば、ベンジル基などで保
護されたものが包含される。
式[I]の化合物における各アミノ酸残基の立体配置は、
アミノペプチダーゼ様酵素の基質となりうる限り、特に
限定するものではない。
アミノペプチダーゼ様酵素の基質となりうる限り、特に
限定するものではない。
本発明の検査薬は、式[I]の化合物が検体由来のアミノ
ペプチダーゼ様酵素の基質として反応できる形態のもの
であればいずれでもよく、もっとも基本的には、式[I]
の化合物の水溶液でよく、好ましくは、測定時、pH6.0
〜8.5となるように緩衝剤を含有させる。用いる緩衝剤
は通常用いられるものいずれでもよく、例えば、トリス
塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ベロナール
緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤などを用いることができる。
該水溶液は、式[I]の化合物および、所望により、緩衝
剤を蒸留水に溶解するような公知の方法で製造すること
ができ、要すれば、さらに、防腐剤、抗生物質などの他
の添加物を適宜添加することができる。
ペプチダーゼ様酵素の基質として反応できる形態のもの
であればいずれでもよく、もっとも基本的には、式[I]
の化合物の水溶液でよく、好ましくは、測定時、pH6.0
〜8.5となるように緩衝剤を含有させる。用いる緩衝剤
は通常用いられるものいずれでもよく、例えば、トリス
塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、ベロナール
緩衝剤、ＨＥＰＥＳ緩衝剤などを用いることができる。
該水溶液は、式[I]の化合物および、所望により、緩衝
剤を蒸留水に溶解するような公知の方法で製造すること
ができ、要すれば、さらに、防腐剤、抗生物質などの他
の添加物を適宜添加することができる。
式[I]の化合物は、最終温度１０nM〜１０mM範囲、ま
た、緩衝剤は最終濃度１mM〜１Ｍの範囲で使用すること
が好ましく、前記の水溶液は、これらの濃度の式[I]の
化合物、所望により緩衝剤を含有する、そのまま直接、
検査に供することのできる形態にすることができ、ある
いは、使用時、適宜、蒸留水で所望の濃度に希釈する濃
厚液の形態とすることもできる。
た、緩衝剤は最終濃度１mM〜１Ｍの範囲で使用すること
が好ましく、前記の水溶液は、これらの濃度の式[I]の
化合物、所望により緩衝剤を含有する、そのまま直接、
検査に供することのできる形態にすることができ、ある
いは、使用時、適宜、蒸留水で所望の濃度に希釈する濃
厚液の形態とすることもできる。
本発明の検査薬には、これらの水溶液の形態のものを、
さらに、公知の方法により乾燥粉末化、顆粒化したもの
のごとき固体の形態のもの、粉末成分を混合した粉末、
その顆粒化物のごとき固体の形態のもの、あるいは、液
状の形態のものを濾紙、ペーパーディスク、スポンジ、
高分子物などの担体に含浸させものも包含される。
さらに、公知の方法により乾燥粉末化、顆粒化したもの
のごとき固体の形態のもの、粉末成分を混合した粉末、
その顆粒化物のごとき固体の形態のもの、あるいは、液
状の形態のものを濾紙、ペーパーディスク、スポンジ、
高分子物などの担体に含浸させものも包含される。
さらに、本発明の検査薬には、式[I]の化合物を含有す
る試薬と、緩衝剤、発色試薬などの他の試薬を組合せて
なるキットも包含される。
る試薬と、緩衝剤、発色試薬などの他の試薬を組合せて
なるキットも包含される。
発色試薬は、式[I]の化合物におけるＹ基に応じて適宜
選択でき、Ｙがβ−ナフチルアミン、４−メトキシ−２
ナフチルアミン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェ
ノール由来の基の場合、例えば、ファーストガーネット
ＧＢＣやファーストブルーＢＢあるいはこれらのジアゾ
ニウム塩や塩化亜鉛との塩のごとき塩などを、水、エタ
ノール、酢酸緩衝液、２−メトキシエタノールあるいは
これらの混合溶媒などに0.01〜５重量％の濃度で溶解し
た溶液や、0.5〜５Ｍの水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、酢酸などの水溶液が用いられる。これらの溶液ま
たはその濃厚液、さらには固形化物を式[I]の化合物を
含有する試薬と組合せてキットとして用いることができ
る。
選択でき、Ｙがβ−ナフチルアミン、４−メトキシ−２
ナフチルアミン、ｐ−ニトロアニリン、ｐ−ニトロフェ
ノール由来の基の場合、例えば、ファーストガーネット
ＧＢＣやファーストブルーＢＢあるいはこれらのジアゾ
ニウム塩や塩化亜鉛との塩のごとき塩などを、水、エタ
ノール、酢酸緩衝液、２−メトキシエタノールあるいは
これらの混合溶媒などに0.01〜５重量％の濃度で溶解し
た溶液や、0.5〜５Ｍの水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウム、酢酸などの水溶液が用いられる。これらの溶液ま
たはその濃厚液、さらには固形化物を式[I]の化合物を
含有する試薬と組合せてキットとして用いることができ
る。
本発明の検査薬を用いて検査を行なうには、まず、検体
を採取する。検体の採取は公知の方法で行なってもよ
く、例えば、歯肉溝浸出液や唾液は濾紙、キャピラリ
ー、ペーパーポイントなどで採取でき、歯垢は綿棒、キ
ュレット、スケラーなどで採取できる。
を採取する。検体の採取は公知の方法で行なってもよ
く、例えば、歯肉溝浸出液や唾液は濾紙、キャピラリ
ー、ペーパーポイントなどで採取でき、歯垢は綿棒、キ
ュレット、スケラーなどで採取できる。
ついで、式[I]の化合物濃度を１０nM〜１0mＭに調整し
た該化合物を含有する本発明の検査薬と検体を、例え
ば、試験管、マイクロタイタープレート、セル、バイア
ル瓶、プラスチック・キュベットなどの中で接触させ、
好ましくは、pH6.０〜8.5で水解反応を行なわせる。こ
の反応は、通常、１５〜４５℃で行なわれ、反応時間は
検体や反応温度により異なるが、３７℃で１５分間〜７
２時間程度の反応が好ましい。
た該化合物を含有する本発明の検査薬と検体を、例え
ば、試験管、マイクロタイタープレート、セル、バイア
ル瓶、プラスチック・キュベットなどの中で接触させ、
好ましくは、pH6.０〜8.5で水解反応を行なわせる。こ
の反応は、通常、１５〜４５℃で行なわれ、反応時間は
検体や反応温度により異なるが、３７℃で１５分間〜７
２時間程度の反応が好ましい。
反応終了後、発色試薬を添加し、発色の有無、強弱を肉
眼あるいは分光光度計や蛍光光度計で判定し、これによ
り、検体中のアミノペプチダーゼ様酵素毒活性の有無、
強弱を判断し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予
測する。
眼あるいは分光光度計や蛍光光度計で判定し、これによ
り、検体中のアミノペプチダーゼ様酵素毒活性の有無、
強弱を判断し、歯周疾患の罹患や進行を診断あるいは予
測する。
実験および実施例 つぎに、実験および実施例を挙げて本発明をさらに詳し
く説明する。
く説明する。
実験１ 各種口腔内嫌気性細菌のアミノペプチダーゼ様酵素活性 口腔内の嫌気性細菌であるトレポネーマ・デンティコー
ラ(Treponema denticola)４株、バクテロイデス・ジン
ジバリス５株、バクテロイデス・インターミーディアス
(Bacteroides intermedius)３株、バクテロイデス・コ
ーポリス(Bacteroides corporis)２株、バクテロイデス
・メラニノジェニカス(Bacteroides melaninogenicus)
３株、バクテロイデス・デンティコーラ(Bacteroides d
enticola)２株、アクチノマイセス・イスラエリー(Acti
nomyces israelli)２株、アクチノバチルス・アクチノ
マイセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemc
omitans)４株、およびフゾバクテリウム・ヌクレータム
(Fusobacterium nucleatum)３株のアミノペプチダーゼ
様酵素基質に対する水解活性をつぎのとおり測定した。
ラ(Treponema denticola)４株、バクテロイデス・ジン
ジバリス５株、バクテロイデス・インターミーディアス
(Bacteroides intermedius)３株、バクテロイデス・コ
ーポリス(Bacteroides corporis)２株、バクテロイデス
・メラニノジェニカス(Bacteroides melaninogenicus)
３株、バクテロイデス・デンティコーラ(Bacteroides d
enticola)２株、アクチノマイセス・イスラエリー(Acti
nomyces israelli)２株、アクチノバチルス・アクチノ
マイセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemc
omitans)４株、およびフゾバクテリウム・ヌクレータム
(Fusobacterium nucleatum)３株のアミノペプチダーゼ
様酵素基質に対する水解活性をつぎのとおり測定した。
トレポネーマ属の細菌はＴＹＧＵＳ培地を用い、３７℃
で７日間、他の細菌はブレイン・ハート・インフュージ
ョン・ブロスを用い、３７℃で４８〜７２時間嫌気的に
培養し、培養液を希釈して、各々、６６０nmにおける吸
光度が1.0の細菌懸濁液を調製した。
で７日間、他の細菌はブレイン・ハート・インフュージ
ョン・ブロスを用い、３７℃で４８〜７２時間嫌気的に
培養し、培養液を希釈して、各々、６６０nmにおける吸
光度が1.0の細菌懸濁液を調製した。
β−ナフチルアミン由来の種々の発色基を有するアミノ
ペプチダーゼ様酵素の基質化合物を０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液(pH7.0)に0.2mMの濃度で溶解し、基質溶液を調製
した。
ペプチダーゼ様酵素の基質化合物を０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液(pH7.0)に0.2mMの濃度で溶解し、基質溶液を調製
した。
この基質溶液1.5ｍに、前記の細菌懸濁液０．３ｍ
を加え、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、発
色試薬（１０％ツィーン２０を含有する１Ｍ酢酸緩衝液
(pH4.2)にジアゾニウム塩ガーネットＧＢＣを0.5mg/ｍ
の濃度で溶解して調製）0.6ｍを加え、１５分後に5
25nmにおける吸光度を分光光度計にて測定した。
を加え、３７℃で６０分間反応させた。反応終了後、発
色試薬（１０％ツィーン２０を含有する１Ｍ酢酸緩衝液
(pH4.2)にジアゾニウム塩ガーネットＧＢＣを0.5mg/ｍ
の濃度で溶解して調製）0.6ｍを加え、１５分後に5
25nmにおける吸光度を分光光度計にて測定した。
水解活性は、各細菌株のβ−ナフチルアミン遊離量の平
均値に基づき、つぎのとおり表示した。
均値に基づき、つぎのとおり表示した。
−：遊離量＜５ナノモル／ｍ ±：遊離量５〜１０ナノモル／ｍ ＋：遊離量１０〜＜２０ナノモル／ｍ ＋＋：遊離量２０〜＜４０ナノモル／ｍ ＋＋＋：遊離量４０ナノモル／ｍ以上 結果を第１表に示す。第１表中、基質化合物の略称はつ
ぎのとおりである。
ぎのとおりである。
Ａ：アラニン−β−ナフチルアミド Ｇ：グリシン−β−ナフチルアミド Ｒ：アルギニン−β−ナフチルアミド Ｋ：リジン−β−ナフチルアミド Ｐ：プロリン−β−ナフチルアミド ＶＡ：バリル−アラニン−β−ナフチルアミド ＬＧ：ロイシン−グリシン−β−ナフチルアミド ＳＹ：セリル−チロシン−β−ナフチルアミド ＦＰ：フェニルアラニル−プロリン−β−ナフチルアミ
ド ＫＰ：リジル−プロリン−β−ナフチルアミド ＧＰ：グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド ＣxKＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−リジル−プロリン−β
−ナフチルアミド ＢzGＰ：Ｎ−ベンゾイル−グリシル−プロリン−β−ナ
フチルアミド ＢzGＦＰ：Ｎ−ベンゾイル−グリシル−フェニルアラニ
ル−プロリン−β−ナフチルアミド ＣxVＫＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−リジル−プ
ロリン−β−ナフチルアミド ＣxPＡＧＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−プロリル−アラニ
ル−グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド ＢzRＧＦＰ：Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−
フェニルアラニル−プロリン−β−ナフチルアミド ＳcGＰＬＧＰ：Ｎ−スクシニル−グリシル−プロリル−
ロイシル−グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド 第１表に示すごとく、口腔内嫌気性菌のうち、歯周疾患
原因菌であるスピロヘータ（トレポネーマ・デンティコ
ーラ）および黒色色素産生バクテロイデスが特異的なア
ミノペプチダーゼ様酵素活性を示し、種々の基質化合物
中、式[I]で示される化合物を特異的に水解する。
ド ＫＰ：リジル−プロリン−β−ナフチルアミド ＧＰ：グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド ＣxKＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−リジル−プロリン−β
−ナフチルアミド ＢzGＰ：Ｎ−ベンゾイル−グリシル−プロリン−β−ナ
フチルアミド ＢzGＦＰ：Ｎ−ベンゾイル−グリシル−フェニルアラニ
ル−プロリン−β−ナフチルアミド ＣxVＫＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−バリル−リジル−プ
ロリン−β−ナフチルアミド ＣxPＡＧＰ：Ｎ−カルボベンゾキシ−プロリル−アラニ
ル−グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド ＢzRＧＦＰ：Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−
フェニルアラニル−プロリン−β−ナフチルアミド ＳcGＰＬＧＰ：Ｎ−スクシニル−グリシル−プロリル−
ロイシル−グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド 第１表に示すごとく、口腔内嫌気性菌のうち、歯周疾患
原因菌であるスピロヘータ（トレポネーマ・デンティコ
ーラ）および黒色色素産生バクテロイデスが特異的なア
ミノペプチダーゼ様酵素活性を示し、種々の基質化合物
中、式[I]で示される化合物を特異的に水解する。
実験２ 臨床所見との相関−１ 臨床所見上、健常であると認められた者５名、歯肉炎患
者６名および歯周炎患者６名から、各々、ペーパーポイ
ントにより歯肉溝浸出液検体を採取し、リンガー液1.5
ｍに分散後、位相差顕微鏡を用い、全菌数に対するス
ピロヘータの相当量 を測定した。また、このリンガー液0.3ｍを、実験１
におけると同様にして調製した基質溶液を用い、同様に
して水解活性を測定した。基質としては、式[I]の化合
物であるリジル−プロリン−β−ナフチルアミド（Ｋ
Ｐ）およびＮ−カルボベンゾキシ−プロリル−アラニン
−グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド（ＣxPＡＧ
Ｐ）を用いた。
者６名および歯周炎患者６名から、各々、ペーパーポイ
ントにより歯肉溝浸出液検体を採取し、リンガー液1.5
ｍに分散後、位相差顕微鏡を用い、全菌数に対するス
ピロヘータの相当量 を測定した。また、このリンガー液0.3ｍを、実験１
におけると同様にして調製した基質溶液を用い、同様に
して水解活性を測定した。基質としては、式[I]の化合
物であるリジル−プロリン−β−ナフチルアミド（Ｋ
Ｐ）およびＮ−カルボベンゾキシ−プロリル−アラニン
−グリシル−プロリン−β−ナフチルアミド（ＣxPＡＧ
Ｐ）を用いた。
結果を第２表に示す。なお、第２表中、水解活性は発色
を肉眼で判断し、つぎの基準により表示した。
を肉眼で判断し、つぎの基準により表示した。
−：オレンジ色 ＋：濃オレンジ色 ＋＋：褐色 ＋＋＋：濃褐色 第２表に示すごとく、水解活性はスピロヘータ量、臨床
所見と相関する。なお、両方の基質間において反応の差
は認められない。
所見と相関する。なお、両方の基質間において反応の差
は認められない。
実験３ 臨床所見との相関−２ 健常者群（１０名）、成人性歯周炎患者群（１０名）、
限局性若年性歯周炎患者群（４名）の各群の混合全唾液
遠心上清を検体として用い、前記と同様に、ただし、３
７℃で４時間反応させて水解活性を測定した。基質とし
て、リジル−プロリン−Ｐ−ニトロアニリド（ＫＰ−pN
Ａ）、リジル−プロリン−４−メトキシ−２−ナフチル
アミド（ＫＰ−４ＮＡ）およびリジル−プロリン−β−
ナフチルアミド（ＫＰ−βＮＡ）を用い、ＫＰ−pNＡの
場合はＩＮ水酸化ナトリウム、ＫＰ−４ＮＡおよびＫＰ
−βＮＡの場合はファーストブルーＢＢを用いて発色さ
せた。結果を第３表に示す。
限局性若年性歯周炎患者群（４名）の各群の混合全唾液
遠心上清を検体として用い、前記と同様に、ただし、３
７℃で４時間反応させて水解活性を測定した。基質とし
て、リジル−プロリン−Ｐ−ニトロアニリド（ＫＰ−pN
Ａ）、リジル−プロリン−４−メトキシ−２−ナフチル
アミド（ＫＰ−４ＮＡ）およびリジル−プロリン−β−
ナフチルアミド（ＫＰ−βＮＡ）を用い、ＫＰ−pNＡの
場合はＩＮ水酸化ナトリウム、ＫＰ−４ＮＡおよびＫＰ
−βＮＡの場合はファーストブルーＢＢを用いて発色さ
せた。結果を第３表に示す。
第３表に示すごとく、成人性歯周炎患者および限局性若
年性歯周炎患者は、いずれも、健常者と比べて約２倍以
上の高い値（活性）を示し、統計的にも有意差が認めら
れる。したがって、この活性の測定により、歯周患者の
診断、予測を客観的に行なうことができる。
年性歯周炎患者は、いずれも、健常者と比べて約２倍以
上の高い値（活性）を示し、統計的にも有意差が認めら
れる。したがって、この活性の測定により、歯周患者の
診断、予測を客観的に行なうことができる。
実施例１ リジル−プロリン−４−メトキシ−２−ナフチルアミド
の２mM蒸留水溶液を調製し、基質溶液とした。
の２mM蒸留水溶液を調製し、基質溶液とした。
0.1Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH7.0）を調製し、緩衝液と
して用いた。
して用いた。
１０％ツイーン２０を含有する１Ｍ酢酸緩衝液(pH4.0)
にゾアゾニウム塩ガーネットＧＢＣを0.5mg／ｍの濃
度で溶解し、発色試薬とした。
にゾアゾニウム塩ガーネットＧＢＣを0.5mg／ｍの濃
度で溶解し、発色試薬とした。
これらを組合せて、本発明の歯周疾患検査薬キットとし
た。
た。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるは
予測に用いることができる。
予測に用いることができる。
被検者の歯肉溝にペーパーポイントを３０秒間挿入して
検体を採取する。基質溶液0.1ｍおよび緩衝液0.9ｍ
で混合し、これに検体を加え、３７℃で一昼夜反応させ
る。反応終了後、発色試薬0.3ｍを加え、室温で１５
分間放置後、色調を肉厚観察する。検体を添加しない対
照と比較し、褐色の強弱を判定する。強い褐色の呈色は
歯周疾患の罹患を示す。
検体を採取する。基質溶液0.1ｍおよび緩衝液0.9ｍ
で混合し、これに検体を加え、３７℃で一昼夜反応させ
る。反応終了後、発色試薬0.3ｍを加え、室温で１５
分間放置後、色調を肉厚観察する。検体を添加しない対
照と比較し、褐色の強弱を判定する。強い褐色の呈色は
歯周疾患の罹患を示す。
実施例２ リジル−プロリン−４−メトキシ−２−ナフチルアミド
５００ナノモルをペーパーディスク（径0.6cm)に含浸さ
せて基質試薬を調製した。
５００ナノモルをペーパーディスク（径0.6cm)に含浸さ
せて基質試薬を調製した。
0.1Ｍリン酸緩衝液(pH7.2)を調製し、緩衝液として用い
た。
た。
これらと、実施例１におけると同様に調製した発色試薬
を組合せて、本発明の歯周疾患検査薬キットとした。
を組合せて、本発明の歯周疾患検査薬キットとした。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。
は予測に用いることができる。
緩衝液４００μをバイアル瓶に入れ、これに、被検者
から採取した混合唾液１００μを加え、さらに基質試
薬のペーパーディスクを加え、３７℃で４時間反応させ
る。反応終了後、発色試薬を加え、実施例１と同様に肉
眼観察して判定する。
から採取した混合唾液１００μを加え、さらに基質試
薬のペーパーディスクを加え、３７℃で４時間反応させ
る。反応終了後、発色試薬を加え、実施例１と同様に肉
眼観察して判定する。
実施例３ Ｎ−カルボベンゾキシ−プロリル−アラニル−グリシル
−プロリン−β−ナフチルアミド５００ナノモルをアン
プル（内径５mm、長さ３cm)内で凍結乾燥させて基質試
薬とした。0.05Ｍトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を調製
し、緩衝液とした。
−プロリン−β−ナフチルアミド５００ナノモルをアン
プル（内径５mm、長さ３cm)内で凍結乾燥させて基質試
薬とした。0.05Ｍトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)を調製
し、緩衝液とした。
１０％ツイーン２０を含有する１Ｍ酢酸緩衝液(pH4.2)
にジアゾニウム塩ファーストブルーＢを１mg／ｍの濃
度で溶解し、発色試薬とした。これらを組み合わせて、
本発明の歯周疾患検査薬キットとした。
にジアゾニウム塩ファーストブルーＢを１mg／ｍの濃
度で溶解し、発色試薬とした。これらを組み合わせて、
本発明の歯周疾患検査薬キットとした。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。
は予測に用いることができる。
被験者の歯肉薄にペーパーストリップを３０秒間挿入し
て検体を採取する。緩衝液１ｍを基質含有アンプルに
入れ基質を溶解させる。これに検体を加え、３７℃で一
昼夜反応させる。反応終了後、発色試薬0.4ｍを加
え、実施例１と同様に肉眼観察して判定する。
て検体を採取する。緩衝液１ｍを基質含有アンプルに
入れ基質を溶解させる。これに検体を加え、３７℃で一
昼夜反応させる。反応終了後、発色試薬0.4ｍを加
え、実施例１と同様に肉眼観察して判定する。
実施例４ Ｎ−ベンゾイル−アルギニル−グリシル−フェニルアラ
ニル−プロリン−β−ナフチルアミドを0.05Ｍリン酸緩
衝液(pH7.2)で２００ナノモル／ｍとなるように調製
し、その１００μを円形ろ紙（径１cm）に含浸乾燥さ
せ、キュベット（内径１cm）底に挿入して基質試薬とし
た。
ニル−プロリン−β−ナフチルアミドを0.05Ｍリン酸緩
衝液(pH7.2)で２００ナノモル／ｍとなるように調製
し、その１００μを円形ろ紙（径１cm）に含浸乾燥さ
せ、キュベット（内径１cm）底に挿入して基質試薬とし
た。
これらと実施例３におけると同様に調製した発色試薬を
組み合わせて、本発明の歯周疾患検査薬キットとした。
組み合わせて、本発明の歯周疾患検査薬キットとした。
このキットは、つぎのようにして歯周疾患の診断あるい
は予測に用いることができる。
は予測に用いることができる。
被検者から採取した混合唾液１００μをキュベットに
加え、３７℃で４時間反応させる。反応終了後、発色試
薬４０μを加え、実施例１と同様に肉眼観察して判定
する。
加え、３７℃で４時間反応させる。反応終了後、発色試
薬４０μを加え、実施例１と同様に肉眼観察して判定
する。
発明の効果 本発明の検査薬を用いれば、特殊な設備や高度の技術を
必要とせずに、簡便かつ迅速に歯周疾患の罹患や進行を
客観的に診断あるいは予測することができ、これによ
り、歯周疾患の治療や予防を適切に行なうことができ
る。
必要とせずに、簡便かつ迅速に歯周疾患の罹患や進行を
客観的に診断あるいは予測することができ、これによ
り、歯周疾患の治療や予防を適切に行なうことができ
る。
Claims (2)
- 【請求項１】検体中のアミノペプチターゼ様酵素活性を
測定することにより、歯周疾患の罹患や進行を診断ある
いは予測するための検査薬であって、式： Ｘ−Ｚ−Ｐｒｏ−Ｙ ［式中、Ｐｒｏはプロリン残基、Ｘは水素またはアミノ
基保護基、Ｙはプロリン残基のＣ末端に結合する発色
基、ＺはそのＣ末端がプロリン残基のＮ末端と結合する
０〜４個のアミノ酸またはその保護誘導体からなるアミ
ノ酸またはペプチドの残基を意味する］ で示される化合物を該酵素の基質としてなることを特徴
とする歯周疾患検査薬。 - 【請求項２】Ｚ基中のＣ末端アミノ酸残基がグリシン、
リジン、フェニルアラニンまたはこれらの保護誘導体残
基である前記第(1)項の歯周疾患検査薬。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23384886A JPH0611240B2 (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | 歯周疾患検査薬 |
| EP87306663A EP0255341B1 (en) | 1986-07-29 | 1987-07-28 | Reagent for testing periodontal diseases |
| AT87306663T ATE85362T1 (de) | 1986-07-29 | 1987-07-28 | Reagens zur pruefung von periodentalen erkrankungen. |
| ES87306663T ES2053547T3 (es) | 1986-07-29 | 1987-07-28 | Reactivo para someter a ensayo enfermedades periodontales. |
| DE8787306663T DE3783966T2 (de) | 1986-07-29 | 1987-07-28 | Reagens zur pruefung von periodentalen erkrankungen. |
| CA000543277A CA1310893C (en) | 1986-07-29 | 1987-07-29 | Reagent for detecting the presence and extent of periodontal diseases |
| US07/459,185 US5137811A (en) | 1986-07-29 | 1989-12-29 | Method for diagnosing periodontal diseases with a substrate specific for aminopeptidase activity of periodontopathic bacteria |
| GR920403143T GR3006962T3 (ja) | 1986-07-29 | 1993-02-04 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23384886A JPH0611240B2 (ja) | 1986-09-30 | 1986-09-30 | 歯周疾患検査薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6387999A JPS6387999A (ja) | 1988-04-19 |
| JPH0611240B2 true JPH0611240B2 (ja) | 1994-02-16 |
Family
ID=16961517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23384886A Expired - Lifetime JPH0611240B2 (ja) | 1986-07-29 | 1986-09-30 | 歯周疾患検査薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0611240B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7271341B2 (ja) * | 2019-06-28 | 2023-05-11 | サンスター スイス エスエー | 歯周病進行リスク測定方法及びキット |
-
1986
- 1986-09-30 JP JP23384886A patent/JPH0611240B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6387999A (ja) | 1988-04-19 |
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