KR102650835B1 - 녹농균 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

녹농균 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102650835B1
KR102650835B1 KR1020220001299A KR20220001299A KR102650835B1 KR 102650835 B1 KR102650835 B1 KR 102650835B1 KR 1020220001299 A KR1020220001299 A KR 1020220001299A KR 20220001299 A KR20220001299 A KR 20220001299A KR 102650835 B1 KR102650835 B1 KR 102650835B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cee
mrsa
culture
resistant
antibacterial
Prior art date
Application number
KR1020220001299A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220099102A (ko
Inventor
한성수
베드리칸난
최순모
조선미
원소연
Original Assignee
영남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 영남대학교 산학협력단 filed Critical 영남대학교 산학협력단
Publication of KR20220099102A publication Critical patent/KR20220099102A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102650835B1 publication Critical patent/KR102650835B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/27—Pseudomonas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N25/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests
    • A01N25/34—Shaped forms, e.g. sheets, not provided for in any other sub-group of this main group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas
    • C12R2001/385—Pseudomonas aeruginosa

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 녹농균 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항생제 내성균, 특히 식품 매개 병원체에 대해 항균 활성을 가지는 항균 조성물, 이의 제조방법 및 이를 활용한 식품 포장용 하이드로겔 필름을 제공한다.
상기 조성물은 우수한 항균 활성으로 다제내성 식품 매개 병원체의 생장을 억제할 수 있어 보다 안전하고 효과적인 식품 포장재로 활용할 수 있다.

Description

녹농균 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도{ANTI-MICROORGANISM COMPOSITION COMPRISING PSEUDOMONA `S AERUGINOSA CULTURE OR ITS EXTRACT AND USES THEREOF}
본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 가지는 항균 조성물, 이의 제조방법 및 이를 활용한 식품 포장용 필름에 관한 것이다.
항생제 내성(antibiotic resistance, AR) 또는 항균 내성(antimicrobial resistance, AMR)의 출현과 확산은 공중 보건에 세계적으로 위협이 되고 있다. 지난 10년 동안 많은 나라들이 AMR 감염을 통제하는 연구를 진행하였지만 여전히 많은 환자에게 퍼지고 있다. 미국에서는 연간 280만 건 이상의 AMR 감염이 발생하며 35,000명 이상의 사망자가 발생한다. 시간이 지나면서 항생제에 대한 의료 설비가 증가하였지만, 미생물의 내성이 증가함으로써 균형을 이루고 있다.
황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 병원 및 지역사회에서 습득되는 감염의 주요 원인 중 하나로, 혈류, 피부, 연조직, 하부 호흡기에 영향을 미칠 수 있으며 심장내막염, 골수염은 물론 중추선 관련 혈류 감염(CLABSIs)을 유발할 수 있다. 황색포도상구균은 독극성 인자와 독소로 구성된 레퍼토리를 가지고 있으며, 독성 쇼크 증후군, 스케일링 피부 증후군, 포도상구균 식품 매개 질병(SFD)을 포함한 독소 매개 질병을 일으킬 수 있다. 감염 치료를 위해 페니실린이라는 항생제가 등장한 후, 1942년에 페니실린에 내성을 가진 황색포도상구균이 출현했다. 1959년에 다른 반합성 항생제 메티실린의 발견으로 저항성이 상쇄되었지만, 1960년에 메티실린 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant S. aureus, MRSA)이 확인되었고 병원 환경에서 25-50%의 높은 사망률을 보였다. MRSA는 또한 모든 사용가능한 페니실린과 대부분의 β-락탐(β-lactam) 약물에 대해 주된 내성을 나타낸다. 지난 수십 년 동안 항균제의 무분별한 사용으로 인해 MRSA의 유행과 역학은 끊임없이 변화해왔으며, 새로운 MRSA 클론들의 출현은 전세계 여러 지역에서 그것을 "슈퍼버그(superbug)"로 만들었다.
MRSA 균주는 의료 관련, 식품 매개 질병에 모두 주요 기여자로 간주되었다. 1990년대 이전에는 대부분의 MRSA가 병원관련 MRSA(hospital-associated MRSA, HA-MRSA) 및 지역사회 관련 MRSA(communityassociated MRSA, CA-MRSA)였지만, 나중에 가축 관련 MRSA(livestock-associated MRSA, LA-MRSA)가 중요한 그룹으로 부상했으며, 이러한 모든 그룹은 사람이 섭취할 목적으로 설계된 식품/온라인 식품 등에서 찾아볼 수 있다.
미국 국립 항균 내성 모니터링 시스템(NARMS)은 2010-2011년의 1년 동안 조사를 실시한 결과, 미국 내 여러 주에서 수집된 소매 육류 중 27.9%가 황색포도상구균을 포함하고 1.9%가 MRSA에 양성 반응을 보임을 확인하였다. MRSA의 37.2%를 포함하여, 황색포도상구균의 약 10.4%는 다제내성이었다. MRSA의 가장 높은 유병률은 칠면조(3.5%)였고, 돼지고기(1.9%), 쇠고기(1.7%), 닭고기(0.3%)가 그 뒤를 이었다. 한국의 포도상구균 식중독 감염 환자들의 대변 샘플에서 채취한 황색포도상구균에서는 독성 쇼크 증후군 독소에 대한 유전자 tsst-1이 보고되었다. 이러한 다제내성 식품 병원체의 오염은 도축, 식품 가공 및/또는 포장 과정의 환경에 노출되면서 발생한다.
최근 항균 식품 포장 시스템은 유통기한 연장, 품질 유지, 식품 안전 보장에 중점을 두고 있다. 항균제의 선택은 식품에서 억제/소멸될 미생물에 의해 결정되며, 이는 또한 세포벽 구성, 호기성/혐기성 및 병원체의 성장 온도에 의해 결정된다. 일반적으로 식품 포장 시스템에 포함된 항균 물질에는 항생제, 항산화제, 효소, 항균 중합체, 에센셜 오일, 미생물/식물 대사물 및 금속 산화물 나노복합체가 포함된다. 활성포장기술(active packaging technology)은 식품 병원균 생장을 억제하여 식품을 보호하고, 이를 통해 다양한 환경 요인에 대해 유통기한을 연장한다. 다양한 나노필러와 항균제가 활성 포장 시스템을 위한 재료 제작에 사용되지만 그들의 독성 효과로 인해 규제의 적용을 받는다. 금속 나노입자들은 높은 표면적 대 부피 비율과 독특한 물리화학적 특성으로 인해 다제내성 식품 병원성 미생물에 대해 매우 효과적이다. 금속 나노입자 나노필러로 보강된 생분해성 고분자를 나노 바이오 복합체로 사용함으로써 기계적 물성, 가스 차단(gas barrier)과 같은 재료 특성이 향상되나, 일부 실험에서는 기존 비닐봉투에 보관한 것에 차이가 없음이 입증되었다. 또한, 생분해성 고분자 식품 포장 시스템에서 금속(산화물) 나노입자를 사용할 때의 장점과 단점을 평가한 결과, 분해 과정 중 나노 크기의 화합물이 방출되어 환경 오염이 나타났으며, 먹이사슬에서 생물 축적/생물 농축이 있었다. 이에 다제내성 식품 매개 병원체에 대한 우려가 커짐에 따라 새로운 천연 항균 화합물의 개발이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2011-0117922호 (2011년10월28일 공개)
본 발명의 목적은 우수한 항균 활성을 가지는 천연물 유래 물질 및 이의 제조방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 물질을 이용한 식품 포장제를 제공하는 데에 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기의 항균 조성물 및 생분해성 고분자를 포함하여 제조되는 하이드로겔 필름을 제공한다.
또한, 본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 배양하여 배양물을 생성하는 단계; 상기 생성된 배양물을 원심분리하여 수득한 무세포 상층액을 에틸 아세테이트와 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 감압 농축하는 단계;를 포함하는 녹농균 배양물의 추출물 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) 배양물의 추출물은 항생제 내성균에 대해 우수한 항균 활성을 가지는 바, 이를 항균 조성물로 활용할 수 있다.
상기 추출물은 천연물 유래 물질로 인체 및 환경에 영향을 미치지 않아 안전하고, 상기 추출물을 이용하여 하이드로겔 필름을 제조하면, 우수한 항균 활성으로 다제내성 식품 매개 병원체의 생장을 억제할 수 있어 보다 효과적인 식품 포장재로 활용할 수 있다.
도 1은 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA)에 대한 녹농균 (Pseudomonas aeruginosa) YUSA1 배양물의 조 에틸 아세테이트 추출물(CEE)의 항균 활성에 관한 것으로, (A)는 MRSA에 대한 P. aeruginosa YUSA1의 in vitro 항균 활성을 측정하기 위한 이중 배양 분석 결과이고, (B)는 P. aeruginosa YUSA1의 전계방출 주사전자현미경 (FE-SEM) 이미지를 나타낸 것이다. (C)는 Kirby-Bauer 디스크 확산 방법에 의해 결정된 MRSA에 대한 항균 활성에 관한 것으로, (a)는 PBS (대조군), (b)는 젠타마이신 처리군 (250μg), (c)는 CEE 처리군 (250μg), (d)는 CEE 처리군 (500μg)을 나타낸다. 또한, (D)는 TS 브로스에서 MRSA에 대한 CEE의 다양한 농도(1×, 2× 및 4× MIC)에 따른 타임-킬 운동성(time-kill kinetics)을 분석한 것이다. 결과는 평균 ± SD (n = 3)로 표시된다.
도 2는 16S rRNA 유전자의 염기서열을 기반으로 한 항-MRSA YUSA1 균주의 계통발생학적 분석을 수행한 결과로, NJ(Neighbor-Joining) 방법을 사용하여 분지 패턴(branching pattern)을 생성하였다. 부트스트랩 확률 값은 분기점에 표시되며(트리는 1000번 재샘플링됨), 등록 번호는 괄호 안에 표시되었다. 눈금 막대는 뉴클레오티드 위치당 0.005개의 치환을 나타낸다.
도 3은 Live/Dead BacLIght를 사용하여 박테리아의 생존율을 분석한 형광 현미경 이미지로, (A)는 미처리 대조군, (B)는 1× MIC CEE, (C)는 2× MIC CEE, (D)는 4× MIC CEE를 각각 8시간 처리한 군이다 (배율 ×1000, 축적 막대: 10μm).
도 4는 생물막(biofilm)에서 박테리아 세포 생존율에 대한 CEE의 영향을 평가하기 위한 MTT 분석 결과로, (A)는 24시간 동안 다양한 농도의 CEE로 배양된 MRSA 생물막의 in vitro 대사 활성을 분석한 그래프이고, (B)는 다양한 농도의 CEE에 노출된 MRSA에 의한 생물막 바이오매스 형성을 나타낸 것으로, 삽입된 이미지는 96웰 플레이트에서 크리스탈 바이올렛으로 염색된 MRSA 생물막 바이오매스를 나타낸다. 결과는 세 가지 실험의 평균 ± SD로 표시되며, 대조군과 CEE 처리된 MRSA 차이의 유의성은 양측 비대응 t-검정을 이용하여 결정되었다 (***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001). (C)는 다양한 농도의 CEE 존재하에서 in vitro MRSA 생물막 바이오매스 형성의 광학 현미경 이미지를 나타낸 것으로, 24시간 배양 후 CEE의 최종 농도가 (a) 0μg/mL (대조군), (b) 400μg/mL, (c) 200μg/mL, (d) 100μg/mL, (e) 50μg/mL, (f) 25μg/mL, (g) 12.5μg/mL, (h) 6.25μg/mL, (i) 3.12μg/mL 및 (j) 1.56μg/mL 인 것을 나타내었다 (배율 ×40, 축적 막대: 100μm).
도 5는 인간 피부 섬유아세포(HSF)에서 CEE의 in vitro 세포 독성을 분석한 결과로, (A)는 다양한 농도의 CEE에 24시간 동안 노출된 인간 피부 섬유아세포의 생존율을 나타낸 그래프로, 세 가지 실험의 평균 ± SD로 표시되며, 대조군과 CEE 처리군과의 유의성은 양측 비대응 t-검정을 이용하여 결정되었다 (***P ≤ 0.001; ****P ≤ 0.0001). (B)는 2시간 또는 4시간 동안 서로 다른 농도의 CEE가 존재하는 3000:1의 MOI에서 MRSA에 의한 HSF의 부착 및 침습에 관한 것으로, 데이터는 치료당 평균 모집단 ± SD로 표시되며, 삼중으로 수행되었다. 대조군과 CEE 처리군과의 유의성은 양측 비대응 t-검정을 이용하여 결정되었다 (*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01; ***P ≤ 0.001). (C)는 다른 농도의 CEE로 처리된 섬유 아세포의 광학 현미경 이미지로, 24시간 배양 후 CEE의 최종 농도가 (a) 0μg/mL (대조군), (b) 400μg/mL, (c) 200μg/mL, (d) 100μg/mL, (e) 50μg/mL, (f) 25μg/mL, (g) 12.5μg/mL, (h) 6.25μg/mL, (i) 3.12μg/mL 및 (j) 1.56μg/mL 인 것을 나타내었다 (배율 ×200, 축적 막대: 100μm).
도 6은 폴리비닐알콜(PVA)/CEE 하이드로겔의 원형 디스크에서 in vitro 항균 특성을 확인한 것으로, (A)는 동결/해동을 통해 제작된 PVA/CEE 하이드로겔을 나타낸 것이고, (B)는 PVA/CEE 하이드로겔의 늘어남(stretching)을 보여주며, (C)는 서로 다른 배양 시간 후 서로 다른 농도의 CEE를 함유하는 PVA/CEE 하이드로겔에서 MRSA의 박테리아 생존율을 분석한 것이다. 세 가지 실험의 평균 ± SD로 표시되며, 대조군 하이드로겔과 CEE 처리된 하이드로겔 차이의 유의성은 양측 비대응 t-검정을 이용하여 결정되었다 (*P ≤ 0.05; #P ≤ 0.01; §P ≤ 0.001; ΦP ≤ 0.0001).
이하, 본 발명을 상세하게 설명하기로 한다.
본 발명자는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa YUSA1) 유래 추출물에서 항생제 내성 균주에 대한 우수한 항균 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항균 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, "녹농균(Pseudomonas aeruginosa, 슈도모나스 에루지노사)"이란, 진정세균류 슈도모나스과의 세균으로, 사람을 포함한 포유동물에서 질병을 유발한다. 특히, 면역이 결핍되면 기회주의적 감염을 유발하며, 호흡기, 소화-배설기관, 화상부위, 상처 등에 감염을 일으키는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서, "배양물"이란, 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액 등 배양액 자체로 부터 파생되는 가공물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, "추출물"이란, 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 의미하는 것으로, 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함할 수 있다.
상기 추출물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출될 수 있고, 예를 들어, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다
바람직하게는, 상기 녹농균은 기탁번호 MN535798로 기탁된 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 녹농균 YUSA1 일 수 있다.
바람직하게는, 상기 추출물은 상기 녹농균 배양물을 원심 분리하여 수득한 무세포 상층액을 에틸 아세테이트와 1 : (1 내지 3), 보다 바람직하게는 1 : (1 내지 2)의 부피비로 혼합한 후 감압 농축하여 수득한 것일 수 있다.
바람직하게는, 상기 배양물 또는 이의 추출물은 1 내지 400μg/mL의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 배양물 또는 이의 추출물은 전체 조성물 100 중량부에 대하여, 0.001 내지 50 중량부 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항균 조성물은 항생제 내성균, 특히 식품 매개 병원체에 대해 항균 활성을 가질 수 있다.
상기 항생제는 베타-락탐(beta-lactam)계 항생제일 수 있고, 상세하게는 페니실린(penicillin)계, 반코마이신(vancomycin)계, 세팔로스포린(cephalosporin), 또는 카바페넴(carbapenem)계 항생제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 페니실린계 항생제는 벤질페니실린(benzylpenicillin), 페녹시메틸페니실린(penoxymethylpenicillin), 암피실린(ampicillin), 아목사실린(amoxycillin), 바캄피실린(bacampicillin), 메티실린(methicillin), 옥사실린(oxacillin), 클록사실린(cloxacillin), 피페라실린(piperacillin), 카베니실린(carbenicillin) 및 티카실린(ticarcillin)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 항균 조성물은 항생제 내성균인 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA), 다제내성 황색포도상구균(multiple drug-resistant S. aureus, MDRSA), 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin resistant S. aureus, VRSA) 및 반코마이신 중등도 내성 황색포도상구균(vancomycin intermediate S. aureus, VISA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균에 대해 항균 활성을 가질 수 있고, 보다 바람직하게는, 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 또는 다제내성 황색포도상구균(MDRSA)에 대해 우수한 항균 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)"은 페니실린 계열의 항생제인 메티실린의 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균으로, 병원 내 감염을 유발하는 병원균 중 가장 빈번히 나타나는 원인균이고, 면역력이 저하된 환자나 노약자에게 치명적인 균이다.
상기 "다제내성 황색포도상구균(MDRSA)"은 메티실린 뿐만 아니라 다양한 계열의 항생제에 내성을 가진 황색포도상구균으로, 다양한 항생제 사용이 많아지면서 생겨난 변종균으로, 대부분의 항생제에 내성을 보여 극히 제한된 항생제로만 치료가 가능한 균이다.
상기 항균 조성물은 상기 항생제 내성균의 피부 섬유아세포로의 부착 또는 침습을 억제할 수 있고, 상기 항생제 내성균의 생물막(biofilm)의 형성을 억제하거나 상기 생물막에서의 대사 활성을 억제할 수 있다.
이에, 상기 항균 조성물은 항균, 살균, 방부, 방오 등의 목적을 달성하기 위해, 식품, 화장품, 의약품 등으로 광범위하게 사용될 수 있다.
본 발명은 항균 조성물 및 생분해성 고분자를 포함하여 제조되는 하이드로겔 필름을 제공한다.
본 명세서에서, "생분해성(biodegradable) 고분자"는 곰팡이, 박테리아 등과 같은 미생물에 의해 물과 이산화탄소, 메탄 등으로 완전히 분해되는 고분자로, 천연 고분자, 합성 고분자 또는 이들의 블렌드 등으로 구분될 수 있다.
상기 생분해성 고분자는 화학적 합성에 의해 얻어진 분해성이 좋은 폴리에스터계 고분자에서 선택될 수 있고, 예를 들어, 폴리비닐알콜(poly vinyl alcohol, PVA) 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA), 폴리카프로락톤(poly(caprolactone), PCL) 및 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 폴리비닐알콜(PVA)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 생분해성 고분자는 천연 고분자로, 다당류 또는 단백질계 천연 고분자에서 선택될 수 있고, 예를 들어, 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen), 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 풀루란(pullulan), 및 셀룰로오스(cellulose)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 하이드로겔 필름은 상기 항균 조성물 및 상기 생분해성 고분자를 가교하여 제조될 수 있고, 이에 제한되지 않고 종래의 하이드로겔의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 제조된 하이드로겔 필름은 식품 포장용으로 활용할 수 있다.
상기 식품 포장용 하이드로겔 필름은 식품 매개 병원체의 성장을 억제하고 식품의 저장 수명을 연장하여 식품 안정성을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 배양하여 배양물을 생성하는 단계; 상기 생성된 배양물을 원심분리하여 수득한 무세포 상층액을 에틸 아세테이트와 혼합하는 단계; 및 상기 혼합물을 감압 농축하는 단계;를 포함하는 녹농균 배양물의 추출물 제조방법을 제공한다.
상기 생성된 배양물 및 에틸 아세테이트는 1 : (1 내지 3), 바람직하게는 1 : (1 내지 2)의 부피비로 혼합될 수 있다.
보다 상세한 것은 하기 실험예에 의해 후술될 것이다.
또한, 본 발명은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 배양물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항생제 내성균 생장 억제용 시약 조성물을 제공한다.
상기 항생제 내성균은 식품 매개 병원체로, 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA), 다제내성 황색포도상구균(multiple drug-resistant S. aureus, MDRSA), 반코마이신 내성 황색포도상구균(vancomycin resistant S. aureus, VRSA) 및 반코마이신 중등도 내성 황색포도상구균(vancomycin intermediate S. aureus, VISA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 균일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 항생제 내성균 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 항생제 내성균 관련 질환 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 조성물을 유효성분으로 함유하는 항생제 내성균 관련 질환 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 항생제 내성균 관련 질환은 상기 항생제 내성균 감염에 의한 질환으로, 농양, 피부염, 골관절염, 균혈증, 폐렴, 독소쇼크증후군, 식중독, 고열, 패혈증, 부종병, 유방염 또는 장형대장균증 등에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에 상응하는 특징들은 상술된 부분에서 대신할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
1. 실험방법
1-1. 실험재료
트립틱 소이 브로스(Tryptic soy (TS) broth), 뮐러-힌튼(Mueller-Hinton, MH) 브로스, 영양 브로스(nutrient broth, NB) 및 한천은 Difco Laboratories (Detroit, MI, USA)에서 구매되었다. 메티실린 내성 황색포도상구균 (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) (ATCC BAA 1707, MW2)은 영남대학교 화학공학과의 이진태 교수에 의해 기증되었다. 다제내성(multidrug-resistant) 황색포도상구균 균주 (CCARM 0045, CCARM 0204, CCARM 3990, CCARM 3A020, CCARM 3A518, CCARM 3A601, CCARM 3A840, CCARM 3A860)는 한국 항생제내성균주은행(Culture Collection of Antimicrobial Resistant Microbes, CCARM)에서 구매하였다. 모든 균주는 TS broth에 배양하여 TS 한천 (TSA) 플레이트에 보관하였으며, 보존 배양은 50% (w/v)의 글리세롤이 함유된 TS broth를 제조하여 -80℃에서 보관하였다. 실험은 생체안전 수준 2 (Biosafety level 2, BSL-2)의 캐비닛에서 수행되었다. 인간 피부 섬유아세포 (CCD-986Sk; CRL-1947)는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 구매하였다. Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM)은 Gibco Life Technologies (NY, USA)사의 제품이다. 폴리비닐알콜(Poly(vinyl alcohol, PVA, Mw: 89,000-98,000 g/mol, 99+% hydrolyzed), 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS), 1× 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptomycin), 0.25% 트립신(trypsin)-EDTA와 3-(4,5-디메틸치아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT]는 Sigma-Aldrich (USA)에서 구매되었다. PrestoBlue 세포 생존율 시약과 LIVE/DEAD BacLight 생존율 시약은 Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, USA)에서 구매되었다.
1-2. 시료 수집, 박테리아 분리 및 항-MRSA 활성 스크리닝
담수 시료는 2019년 7월 한 달간 영남대학교 내에 위치한 호수 고인 부분에서 채취하였다. 8개의 구분되는 박테리아 콜로니 (YUSA1-8) 형태형이 담수 시료로 접종된 트립신 대두 한천 (TSA) 배지에서 분리되었다. 각 분리주는 TSA에서 37℃에서 16시간 동안 계대 배양하여 정제되었다. 이중 배양 분석으로 지표 균주인 MRSA에 대한 항박테리아 활성을 확인하기 위해 콜로니를 스크리닝하였다.
간단히 말해서, 순수한 분리 콜로니를 MRSA 박테리아 현탁액 (TS 배지에서 배양)으로 닦은 MH 한천 플레이트에 도포하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 분리주의 길항 활성을 나타내는 클리어 존(clear zones)의 모양이 측정되었다. 분리된 박테리아의 형태를 전계방출 주사전자현미경 (FE-SEM, Model S-4800, Hitachi)으로 관찰하였다. 생장 단계(log-phase) 박테리아 현탁액을 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)/PBS로 고정하고 1% 사산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 후고정한 후 에탄올 시리즈를 이용하여 시료를 탈수하고 건조시켰다. 이 시료들을 백금으로 스퍼터 코팅하고 10kV의 작동 전압에서 FE-SEM으로 관찰하였다.
1-3. 게놈 DNA 추출, 16S rRNA 유전자 증폭, 염기서열 및 계통수 분석
게놈 DNA 분리, 16S rRNA 유전자의 PCR 증폭 및 PCR 생성물의 정제 및 염기서열 분석은 Leach et al.(1992)이 설명한대로 수행되었다. YUSA1의 DNA는 genomic DNA purification kit (Nucleogen, South Korea)를 이용해 추출했으며, 16S rRNA 유전자 증폭은 PCR (Polymerase chain reaction)에 의해 수행되었다. 즉, 16S rRNA 유전자는 범용 PCR 프라이머인 fD1 (5′ -GAGTTTGATCCTGGCTCA-3′ ) 및 rP2 (5′ - CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)를 사용하여 증폭되었다.
증폭된 DNA는 Genotech (Daejeon, South Korea)에서 염기서열 분석되었으며, 이 염기서열은 NCBI BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)를 사용하여 이전의 염기서열과 비교되었다 (Altschul et al., 1990). 16S rRNA 유전자의 모든 염기서열은 다중 염기서열 정렬 프로그램인 Cluster Omega에 의해 정렬되었고, 정렬된 염기서열은 그 간극을 확인하였으며, 각 행에서 60 bp의 블록으로 배열된 뒤 MEGA v7.0 소프트웨어를 사용하여 분자 진화 유전자 분석(molecular evolutionary genetics analysis, MEGA) 형식으로 저장되었다. 쌍방향 진화 거리는 Kimura 2-parameter 모델을 사용하여 계산되었다 (Kimura, 1980). 계통수(phylogenetic tree)를 구성하기 위한 다중 거리 행렬을 계산하기 위하여 MEGA v7.0 프로그램을 사용하여 부트스트랩 데이터 세트가 직접 사용되었다 (Kumar et al., 2016). 계산된 다중 거리 행렬은 이웃 결합 (NJ) 방법을 사용하여 계통수를 구성하기 위해 사용되었다 (Naik et al., 2008; Sitou & Nei, 1987).
1-4. 녹농균 ( Pseudomonas aeruginosa ) YUSA1에서 항-MRSA 화합물의 추출
P. aeruginosa YUSA1의 초기 접종물은 진탕 배양기의 단일 콜로니로부터 37℃, 600 nm에서 광학 밀도(OD)가 0.1에 도달할 때까지 NB 배지에서 성장되었다. 다음으로 밤새 소규모로 배양된 배양물 5 mL을 NB 1L에 접종하고 30℃, 150 rpm에서 5일 동안 진탕기에서 배양하였다. 이어서, 박테리아 배양물을 4℃에서 20분 동안 3200×g로 원심분리하고, 무세포 상층액을 에틸 아세테이트(EtOAc)와 1:1 (v/v)로 혼합하여 분리 깔때기에서 10분간 격렬하게 진탕한 다음, 15분간 휴지시켰다. 유기(상부)층을 조심스럽게 모아 회전 증발기 (Daihan Scientific Co., Ltd., South Korea)로 50℃에서 감압 농축하였다. 이렇게 획득된 조 에틸 아세테이트 추출물(crude ethyl acetate extract, CEE)을 최종적으로 메탄올에 현탁시켰다.
1-5. 시험관내( in vitro ) 항균 감수성 분석
MRSA (ATCC BAA-1707, MW2) 균주에 대한 CEE의 항생 효과는 Kirby-Bauer 디스크 확산법을 사용하여 Mueller Hinton (MH) 한천 (BD Difco, USA) 플레이트에서 평가되었다. 밤새 배양된 MRSA 배양물을 사용하여 MH 한천 플레이트를 닦은 다음, 250 및 500μg의 CEE가 포함된 종이 디스크를 배치하였다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 디스크 주변의 MRSA 성장 억제 영역 (ZOI)의 직경(밀리미터)이 측정되었다. 젠타마이신(gentamicin, 250μg)이 양성대조군으로, 인산완충용액(phosphate-buffered saline, PBS)이 음성 대조군으로 사용되었다.
항생제 내성 황색포도상구균 균주에 대한 CEE의 항균 감수성은 미국 임상검사표준연구원 (CLSI, 2011)이 발행한 지침에 따라 96웰 플레이트에서 broth 미세희석법을 사용하여 최소 억제 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)와 최소 살균 농도(minimal bactericidal concentration, MBC)를 결정하여 평가하였다. MBC는 MIC 보다 높은 CEE의 농도에서 배양 웰의 콜로니 형성 단위(colony forming unit, CFU)를 계산하여 평가되었다. MBC는 처리되지 않은 대조군에 비해 CFU에서 2-log10을 초래하는 농도로 정의되었다.
1-6. Time-kill 운동성 분석
MRSA에 대한 CEE의 Time-kill 운동성 연구는 Perim et al. (2019)이 설명한대로 수행되었다. 1×, 2× 또는 4× MIC의 CEE가 배양 밀도 ~1.5×108 CFU/ml로 TS broth에서 배양된 생장 단계(log-phase)의 MRSA에 첨가한 뒤, 37℃에서 배양하였다. CEE로 처리되지 않은 MRSA는 생장 대조군 역할을 하였다. 매 시간 시료를 추출한 뒤 단계별로 희석하였고, TSA 플레이트에 도포하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 생존 가능한 세포 수는 CFU를 세어 결정되었고, 킬링 곡선은 시간에 대해 log10 CFU/ml를 플로팅하여 구성되었다.
1-7. 박테리아 생존율 분석
CEE로 처리된 MRSA의 생존 가능성을 열거하고 디지털화하기 위해 형광 현미경 분석이 수행되었다. Live/Dead BacLIght 박테리아 생존율 시약은 PBS 용액 1mL에 SYTO 9 (4μL; 3.34 mM) 및 프로피디움 아이오디드(propidium iodide, PI) (4μL; 20 mM)를 혼합하여 제조되었다. 서로 다른 농도의 CEE (1×, 2× 또는 4× MIC)는 MRSA (~1.5×108 CFU/ml)에 8시간 동안 처리되었고; 처리되지 않은 박테리아는 음성 대조군으로 사용되었다. 배양 후 시료는 같은 양의 LIVE/DEAD BacLight 박테리아 생존율 시약에 혼합되었고 역형광 현미경 (Nikon Ti Eclipse)에서 485 nm (SYTO 9)와 535 nm (PI)의 여기(excitation) 파장을 이용하여 ×1000의 비율로 관찰되었다.
1-8. 생물막(biofilm) 바이오매스의 형성과 대사 활동에 대한 CEE의 영향
MRSA 생물막 형성에 미치는 CEE의 시험관 내(in vitro) 효과는 (i) 크리스탈 바이올렛(crystal violet, CV) 염색에 의한 생물막 바이오매스 평가 및 (ii) MTT 분석에 의한 대사 활성 세포의 정량화를 위해, 96웰 평평한 바닥의 폴리스티렌 미세역가 플레이트에서 조사되었다. 간략하게, 2% (v/v)의 포도당을 함유한 TS broth에서 밤새 배양된 MRSA를 신선한 배지로 1.5×108 CFU/ml로 희석한 뒤 0-400μg/mL의 최종 CEE 농도를 제공하기 위하여 웰에 분배하였고, 처리되지 않은 세포는 대조군으로 사용되었다.
37℃에서 24시간 동안 배양한 뒤, (i) 생물막 바이오매스를 평가하기 위해 웰은 멸균된 PBS로 2회 세척 후 건조되었고, 0.1% CV 용액으로 15분간 염색하고 33%의 아세트산 200μL로 용출한 뒤, 광학 밀도는 590 nm (OD590)에서 Epoch microplate reader (BioTek Instruments, USA)를 사용하여 분광학적으로 측정하였고, (ii) 생물막에서 세포의 대사 활동을 정량화하기 위해, 먼저 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 멸균 PBS로 웰을 2회 세척한 후 100μL의 0.05% MTT 시약을 첨가한 뒤 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 활성 세포에 의해 형성된 세포 내 포르마잔(formazan) 결정체는 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)로 용해되었으며, 기준 파장 690 nm를 이용하여 570 nm에서 흡광도가 측정되었다. CV 염색된 바이오매스의 광학 현미경 분석 또한 수행되었다 (Nikon Ti eclipse).
1-9. in vitro 독성 분석
인간 피부 섬유아세포 (HSFs)는 DMEM의 48웰 배양 플레이트에서 50,000 세포/웰의 밀도로 배양한 다음, 37℃, 가습된 5% CO2 분위기에서 24시간 동안 배양되었다. 플레이트 배양 후, 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)를 사용하여 웰이 세척되었고, CEE는 0-400μg/mL의 최종 농도로 첨가한 뒤 24시간 동안 배양하였다. HSF 생존율은 PrestoBlue 세포 생존율 시약을 이용하여 PrestoBlue 분석을 이용하여 평가되었다. 색 변화는 Epoch microplate spectrophotometer (BioTek Instruments Inc., USA)의 기준 파장 600 nm을 사용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. HSF 생존율 억제에 대한 CEE의 반-최대 억제 농도(IC50)는 회귀 분석으로 결정되었다. 또한, HSF의 형태학과 부착력에 대한 CEE의 영향은 광학 현미경을 사용하여 조사되었다.
1-10. 부착(adhesion) 및 침습(invasion) 분석
MRSA에 의한 식품 매개 질병을 예방하는 CEE의 능력을 평가하기 위해, 부착 및 침습 분석은 다양한 CEE 농도 (0-400μg/mL)에서 수행되었다. 숙주-병원체 상호작용을 정의하기 위한 모델 시스템으로서 HSF에 대해 MRSA 박테리아 부착 및 침습은 일부 수정된 Bouchard et al. (2013)이 정의한 대로 수행되었다.
MRSA는 밤새 TS broth에서 배양되었고, 20분 동안 3200×g에서 원심분리한 뒤, PBS 완충제로 3회 세척한 후, 필터 살균된 혈청 및 항생제-프리 DMEM(serum and antibiotic-free DMEM, SAFM)에 재투여되었다. HSF는 48웰 플레이트에서 100,00 cells/well 의 밀도로 80%가 융합될 때까지 배양된 다음, CEE와 함께 다른 농도들에서 24시간 동안 배양되었다. 그런 다음, MRSA 현탁액을 첨가하여 3000 : 1 의 감염의 다중도(MOI)를 달성하고, 세포는 가습된 5%의 CO2 대기에서 2시간 동안 37℃로 배양되었다. 이후 부착되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)를 사용하여 충분히 웰을 세척하였고, trypsin/EDTA를 사용하여 HSF를 분리하였다. 분리된 HSF에 SAFM을 추가한 뒤 MRSA와 관련된 세포를 방출하기 위해 냉각 조건에서 30 kHz (Branson Sonic Power Co., Danbury, CT, USA)로 10초간 약간 초음파 처리하였다. 세포 용해물은 연속적으로 희석된 뒤 TSA 플레이트에 3회 도포되었다.
부착된 MRSA의 수는 기존의 콜로니 계수 방법을 사용하여 결정되었다. 유사하게, 박테리아 침습을 평가하기 위해 HSF 처리된 MRSA는 젠타마이신(500μg/mL)이 포함된 SAFM 배지에서 2시간 동안 추가 배양하여 세포외 박테리아를 사멸시켰다. 각 웰에서 침윤된 MRSA의 수는 DPBS에서 3회 세척된 HSF, 초음파 처리에 의한 세포 용해물, 연속 희석, TSA 플레이트 상에 도금, 밤새 배양 및 생존 가능한 MRSA 세포를 계수하여 계산되었다. MRSA 부착 및 침습 결과는 밀리미터당 회수된 CFU의 수로 표기된다. 비침습성 부착 MRSA 세포의 CFU 계수는 젠타마이신 처리 전 HSF와 관련된 총 MRSA에서 젠타마이신 처리 후 내재화된 숫자를 빼서 계산되었다.
1-11. PVA/CEE 하이드로겔의 in vitro 항균 검사
폴리비닐알콜(poly(vinyl alcohol), PVA) 고분자는 완전한 용해를 달성하기 위하여 90℃에서 6시간 동안 자기 교반기가 장착된 핫 플레이트에서 용액을 가열하여 멸균 조건의 PBS에서 10 wt% PVA를 제조하는 데 사용되었다.
PVA/CEE 하이드로겔을 제조하기 위해, PVA 용액은 다양한 농도의 CEE (400-1.56μg/mL)와 혼합(PVA/CEE-400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 또는 PVA/CEE-1.56)되었고, 페트리 디쉬에 ~3 mm 두께로 부은 뒤 12시간 동안 -80℃에 두었다. CEE가 포함되지 않은 PVA 용액은 대조군으로 사용되었다. 동결한 후, 이 하이드로겔들은 상온에서 12시간 동안 해동되었다. PVA/CEE 하이드로겔을 제조하기 위해 최대 10회의 동결(freeze)-해동(thaw) 사이클이 반복되었다. 이 하이드로겔들은 실험을 위해 직경 ~5 mm의 디스크로 잘려졌다.
PVA/CEE 하이드로겔의 in vitro 항균 활성은 앞서 설명한 바와 같이 접촉 활성 프로토콜을 사용하여 결정되었다 (Gao et al., 2017). 간단히 말해, mid-log phase로 성장한 MRSA 배양물을 수확하고 3200×g에서 20분간 원심분리하여 PBS로 세척한 뒤, PBS에 재투여되었다. MRSA 배양물 (~3×108 CFU)의 10μL 분취량을 무균 조건에서 PVA/CEE 하이드로겔 디스크 표면에 로딩하고, 37℃에서 1, 4, 8, 12, 16 시간 동안 배양하였다. 각 배양 후 MTT 분석을 사용하여 박테리아의 생존율을 평가하였다. 세포 내 보라색 포르마잔 결정을 형성하기 위해 대사 활성 세포에 의해 환원된 테트라졸리움 MTT 시약은 DMSO를 사용하여 용해되었고, 멀티웰 분광광도계 (BioTek Instruments, USA)를 사용하여 기준 파장 690 nm와 570 nm에서 흡광도를 측정하여 정량화하였다. 흡광도 값은 대사적으로 활성화된 생존 가능한 세포의 수에 비례한다.
1-12. 통계학적 분석
그룹 간 차이의 유의성은 양측 비대응 t-검정을 이용하여 측정되었다. 결과는 평균 ± SDs로 표시되며, P값 < 0.05 에 대해 통계적 유의성이 인정되었다.
2. 실험결과
2-1. MRSA에 대한 CEE의 항균 활성의 분리 및 스크리닝 확인
8개의 다른 형태형 박테리아 분리주 (YUSA1-8) 중 YUSA1는 MRSA에 대하여 가장 길항 활성을 보였다 (도 1(A)). YUSA1의 상층액에 존재하는 세포 외 화합물은 유의한 항균 활성을 나타내었고, YUSA1의 배양 상층액의 항균 조 에틸 아세테이트 추출물(CEE)은 ~140mg/L의 농도였다. FE-SEM 이미지를 통해 YUSA1는 막대 모양의 형태를 나타냄을 확인할 수 있다 (도 1(B)).
2-2. 16S rRNA 유전자 증폭, 시퀀싱 및 계통수 확인
범용 프라이머 fD1 및 rP2를 사용한 16S rRNA 유전자의 증폭은 ~1.5kb의 앰플리콘(amplicon)을 보여주었다. 16S rRNA 유전자 염기서열의 계통발생학적 분석 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 항균 균주 YUSA1은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로 확인되었다 (99% 유사도). 16S rRNA 유전자의 염기서열은 수탁번호 MN535798로 NCBI GenBank에 기탁되었다.
2-3. in vitro 감수성 및 생존율 확인
도 1(C)는 Kirby-Bauer 디스크 확산 방법에 의해 결정된 MRSA에 대한 CEE의 항균 활성에 관한 것으로, 이를 참조하면, CEE는 양성 대조군(젠타마이신 250μg/mL에서 12.3±0.8 mm)과 비교하여 250 및 500μg/mL에서 각각 ZOI가 16.4±0.3 mm 및 18.5±0.4 mm로 MRSA를 유의하게 억제하였다. 다양한 농도의 CEE(0-400μg/mL)에 노출된 갓 배양된 MRSA (~1.5×108 CFU/ml)는 각각 25 및 50μg/mL의 MIC 및 MBC 값을 가졌다. 이 MBC/MIC 비율 2.0은 CEE가 MRSA 및 기타 다른 MDR S. 아우레우스(S. aureus) 균주에 대해 정균 활성보다 살균 활성을 나타냄을 의미한다 (CLSI, 2011)(표 1).
하기 표 1은 다제내성 S. aureus 균주에 대한 YUSA1 CEE의 MIC 및 MBC 값을 나타낸 것이다.
도 1(D)는 시간 경과에 따른 MRSA에 대한 CEE의 time-kill kinetics를 분석한 것으로, 이를 참조하면, 무처리 대조군의 time-kill kinetics 곡선은 박테리아의 특징적인 성장 곡선 패턴을 나타낸 반면, 1× MIC 처리된 MRSA는 박테리아 CFU 수의 초기 감소 후 거의 직선을 생성하는 성장 억제 효과를 나타냈다. 2× 및 4× MIC에서 CFU 수는 30분 동안 급격히 감소한 다음 6시간까지 약간 감소한 다음, 8시간에 CFU 수의 >99% 감소로 감소하였다.
CEE에 노출된 후 살아있는 박테리아 세포와 죽은 박테리아 세포를 구별하기 위해 두 가지 유형의 스펙트럼이 다른 형광단 염색(SYTO9 및 propidium iodide)이 포함된 LIVE/DEAD BacLight 박테리아 생존율 키트를 사용하였다. SYTO9는 생존 세포막과 생존 불가능 세포막 모두에 침투하여 세포에 녹색 형광을 부여하는 반면, 프로피듐 요오드화물은 손상된 막을 통해 흡수되어 적색으로 형광을 발한다.
도 3을 참조하면, 대조군(미처리)은 밝은 녹색 형광을 나타내어 손상되지 않은 세포막과 ~100% 생존력을 나타낸다. CEE의 농도가 증가함에 따라 살아있는 세포의 비율이 감소하는 바, 상세하게는 1× MIC에서 죽은 박테리아 세포의 백분율은 36.4±8.7 %였으며, 2× 및 4× MIC에서는 각각 96.5±1.2 % 및 >99%로 증가하였다.
2-4. 생물막 바이오매스 및 총 대사 활성 확인
박테리아 생물막(biofilm)은 식품 산업에서 계속 화두되는 문제이며, 특히 항생제 내성 박테리아 생물막은 식품 매개 질병 및 생물막에서 분비되는 독소와 관련이 있다. 현재 연구에서 CEE에 노출된 MRSA 세포는 생물막 바이오매스 및 생물막에서 대사 활성 세포의 형성에 대해 정량화되었다. 생물막에서 박테리아 세포 생존율에 대한 CEE의 영향을 평가하기 위해 MTT 분석을 수행하였다. 활발하게 호흡하는 세포의 미토콘드리아 효소에 의한 보라색-청색 포르마잔 결정으로의 황색 테트라졸륨 염의 효소적 환원은 세포 생존율 및/또는 생존 세포의 상대적 수로 측정된다. 포르마잔 결정의 용해 후 세포 상층액의 흡광도는 대사 활성 세균 세포의 수에 비례한다.
도 4를 참조하면, (A)에서 CEE의 존재하에 성장한 모든 생물막이 CEE 처리되지 않은 대조군보다 세포 생존율이 현저히 낮았으며 1×, 2× 및 4× MIC에서 CEE가 대사 활성을 미처리 대조군과 비교하여 각각 15.6±1.9, 12.8±1.3, 및 11.4 ± 0.4%로 유의하게 감소시켰음을 확인할 수 있다. 또한, CEE 농도가 높을수록 생물막에서 대사 활동이 더욱 감소하였다.
생물막 바이오매스를 정량화하기 위해 크리스탈 바이올렛(CV) 염색을 수행하였다. CV는 음전하를 띤 표면 분자와 세포외 기질의 다당류에 결합하는 염기성 염료로, 도 4(C)를 참조하면, 생물막 바이오매스의 광학 현미경 이미지는 CEE 농도가 증가함에 따라 MRSA 생물막의 염색된 바이오매스에서 뚜렷한 감소를 보여주었다. 더 높은 농도의 CEE는 플랑크톤 세포 성장을 유의하게 억제했으며, 따라서 관찰된 생물막 바이오매스의 감소는 우리의 현미경 및 박테리아 생존 결과를 확증했다 (도 4B).
2-5. in vitro 세포 독성 확인
S. aureus는 인간 피부 표면의 주요 박테리아 병원체이자 공생 박테리아이다. CEE의 in vitro 세포 독성은 인간 피부 섬유아세포를 모델 시스템으로 사용하여 평가되었다. 레자주린 기반 세포 생존율 분석은 막 투과성, 비형광성 청색 레자주린을 레소루핀(적색 형광)으로 환원시키는 것을 기반으로 하며 흡광도 또는 형광에 의해 포유동물 세포 생존율을 정량화하는 데 사용된다.
도 5를 참조하면, (A)에서 CEE는 HSF에서 ≥100μg/mL에서만 상당한 세포독성을 나타내었다. DMEM 배지에서 CEE에 24시간 노출 후 PrestoBlue 분석에 의해 결정된 IC50 값은 105.8μg/mL로 명확한 용량-반응 관계가 확립되었고, CEE의 IC50 값은 용량-반응 플롯을 사용하여 결정되었다. 세포 생존율(%)은 CEE 용량 의존적이었고 더 높은 농도의 CEE(≥100μg/ml)는 HSF 증식 및 생존율에 상당한 부정적인 영향을 미쳤다. 다양한 농도의 CEE에 노출된 HSF의 광학 현미경 이미지는 100-400μg/mL의 CEE 농도에서 상당한 세포 분리, 위족 구조의 손실, 세포 형태 변화 및/또는 용해를 보여주었다. 이러한 결과는 CEE가 1× 및 2× MIC에서 HSF와 생체 적합성임을 시사한다 (도 5C).
2-6. MRSA 부착 및 침습에 대한 CEE의 효과 확인
MRSA의 부착 및 침습을 방지하기 위한 다양한 농도의 CEE (0-400μg/mL)의 능력을 평가하기 위해 HSF를 숙주 세포로 사용하였다.
그 결과, 도 5(B)에 나타난 바와 같이, 모든 농도의 CEE는 HSF에 대한 MRSA의 부착력을 유의하게 감소시켰다 (P ≤ 0.05). 처리되지 않은 대조군의 3.9×108 CFU/mL과 비교하여, CEE 농도를 1.56에서 400μg/mL로 증가시키면 부착력은 7.15×106에서 3.8×103 CFU/mL로 증가하였다. 최대 부착 감소(99.9%)는 HSF가 400μg/mL의 CEE로 처리되었을 때 관찰되었다. 1× 및 2× MIC에서 MRSA 부착력은 각각 8.5×105 ± 5.6×105 및 1×106 ± 2.8×105 CFU/mL 이었다.
유사하게, CEE (1.56-400μg/mL)의 모든 농도가 MRSA 침습을 어느 정도 억제했지만 (44.9%-99.9%), 400μg/mL의 CEE는 처리되지 않은 세포 (9.2×105 CFU/mL)에 비해 침습을 99.9% (30±14 CFU/mL)로 유의하게 억제하는 것으로 나타났다 (P ≤ 0.05). 1× 및 2× MIC에서 MRSA 침습 감소는 처리되지 않은 대조군(9.2×105 ± 3.5×104 CFU/ml)과 비교하여 각각 61.7% (3.5×105 ± 1.3×105 CFU/mL) 및 99.9% (1×104 ± 5.3×103 CFU/mL)로 나타났다.
숙주 세포에 부착된 후 내재화되는 MRSA의 비율은 CEE 농도가 증가함에 따라 감소했다. 그러나 부착된 모든 박테리아 세포가 동일한 효율로 숙주 세포를 침범하는 것은 아니다. 일반적으로 피브로넥틴 결합 단백질(Fibronectin-binding protein, FnBP)은 S. aureus invasin으로 작용하고, 인테그린(integrin) α5β1은 S. aureus FnBP와 상호작용하는 숙주 세포 수용체 역할을 한다. S. aureus FnBP와 integrin α5β1 사이의 피브로넥틴 의존 브리징(Fibronectin-dependent bridging)은 S. aureus의 침입에 관여하므로 CEE의 살균 효과에도 불구하고 숙주 세포 integrin α5β1 발현 조절에도 관여할 수 있으며 이러한 관여는 MRSA에 의한 HSF의 침습성의 차이를 설명할 수 있다.
2-7. PVA/CEE 하이드로겔의 in vitro 항균 분석
항균 식품 포장은 식품을 오염시키는 미생물의 활동을 방지할 수 있다. 소비자의 건강을 위협하는 이러한 식품 병원체는 식품 안전성이 강화된 생체 적합성 항균제를 통합한 식품 포장 시스템으로 처리할 수 있다. 항균제는 지연기를 연장하여 미생물의 성장을 방지하고 성장률을 감소시켜 미생물 수를 감소시킨다. 식품 입자의 식품 병원체에 직접 작용하거나 일정 기간 동안 포장재에서 지속적으로 방출되어 식품 품질과 안전성을 유지하여 유통 기한을 연장할 수 있다.
폴리(비닐 알코올)(PVA)은 식품 포장에서 하이드로겔 필름을 만들어 활성 분자의 확산 및 방출을 지원하는 데 사용될 수 있는 주요 중합체 중 하나이다. 고분자 하이드로겔의 in vitro 접촉 활성 항균 특성을 확립하기 위해 PVA/CEE 하이드로겔의 원형 디스크를 제작하고 MRSA 박테리아 세포로 평가하였다 (도 6A 및 B).
박테리아 (~3×108 CFU)를 하이드로겔 위에 여러 시간 동안 로딩하고 MTT 분석으로 세포 생존율을 평가한 결과, 도 6(C)에 나타난 바와 같이, 다른 농도의 CEE를 함유하는 PVA/CEE 하이드로겔은 MRSA에 대해 상이한 수준의 항균 활성을 나타내었다. 각각 400 및 200μg/mL의 CEE를 함유한 PVA/CEE-400 및 PVA/CEE-200 하이드로겔은 모든 배양 시간 동안 상당한 항균 활성을 보였고 박테리아 수는 대조군과 비교하여 각각 1시간 및 16시간 배양 후 2.3%에서 0.7%로, 18.6%에서 3.2%로 감소하는 것으로 나타났다.
그러나 <200μg/mL의 CEE 농도를 포함하는 다른 PVA/CEE 하이드로겔은 더 긴 배양 시간 후에도 상당한 항균 활성을 나타내지 않았으며, 이는 하이드로겔 표면에서 많은 수의 박테리아가 생존했음을 시사한다.
식품 포장에 사용되는 대부분의 항균 필름은 포장재에서 살균 성분을 침출시켜 식품에 직접 작용한다. 용액 내 CEE와 달리 CEE를 포함하는 물리적으로 가교된 PVA 하이드로겔은 하이드로겔 외부로 CEE의 확산을 제한한다. 따라서 PVA/CEE-400 및 PVA/CEE-200 하이드로겔은 MRSA 박테리아를 죽이는 데 필요하며, 이러한 하이드로겔은 강력한 항균 활성을 나타낸다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (12)

  1. 기탁번호 MN535798로 기탁된 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 녹농균 YUSA1 (Pseudomonas aeruginosa YUSA1) 배양물의 추출물을 유효성분으로 함유하며,
    상기 녹농균 YUSA1 배양물의 추출물은 상기 배양물을 4℃에서 20분 동안 3200×g로 원심분리하여 수득한 무세포 상층액을 에틸 아세테이트와 1:1의 부피비로 혼합한 후 상부층을 50℃에서 감압 농축하여 메탄올에 현탁시킨 것을 특징으로 하는, 메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA) 또는 다제내성 황색포도상구균(multiple drug-resistant S. aureus, MDRSA)에서 선택된 항생제 내성균에 대한 항균 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 항균 조성물은,
    항생제 내성균의 피부 섬유아세포로의 부착 또는 침습을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항균 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 항균 조성물은,
    항생제 내성균의 생물막(biofilm)의 형성을 억제하거나 상기 생물막에서의 대사 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 항균 조성물.
  8. 제 1 항, 제 6 항 및 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 항균 조성물 및 생분해성 고분자를 포함하여 제조되며,
    상기 항균 조성물은 200 내지 400 μg/mL 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 필름.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 생분해성 고분자는,
    폴리비닐알콜(poly vinyl alcohol, PVA) 폴리락트산(poly(lactic acid), PLA), 폴리카프로락톤(poly(caprolactone), PCL) 및 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 필름.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 필름은,
    식품 포장용인 것을 특징으로 하는, 하이드로겔 필름.
  11. 기탁번호 MN535798로 기탁된 16S rRNA 유전자 염기서열을 가지는 녹농균 YUSA1 (Pseudomonas aeruginosa YUSA1)을 배양하여 배양물을 생성하는 단계;
    상기 생성된 배양물을 4℃에서 20분 동안 3200×g로 원심분리하여 수득한 무세포 상층액을 에틸 아세테이트와 1 : 1의 부피비로 혼합하는 단계; 및
    상기 혼합물의 상부층을 50℃에서 감압 농축한 후, 메탄올에 현탁시키는 단계;를 포함하며,
    메티실린 내성 황색포도상구균(Methicillin-resistant S. aureus, MRSA) 또는 다제내성 황색포도상구균(multiple drug-resistant S. aureus, MDRSA)에서 선택된 항생제 내성균에 대한 항균 활성을 가지는 녹농균 배양물의 추출물 제조방법.
  12. 삭제
KR1020220001299A 2021-01-05 2022-01-05 녹농균 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도 KR102650835B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210000747 2021-01-05
KR20210000747 2021-01-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220099102A KR20220099102A (ko) 2022-07-12
KR102650835B1 true KR102650835B1 (ko) 2024-03-26

Family

ID=82419852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020220001299A KR102650835B1 (ko) 2021-01-05 2022-01-05 녹농균 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102650835B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011012221A (ja) 2009-07-06 2011-01-20 Taiyo Kagaku Co Ltd 抗菌性樹脂組成物
CN111073188A (zh) * 2019-12-25 2020-04-28 大连工业大学 一种鲜食水产品抗菌复合膜的制备方法和应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110117922A (ko) 2010-04-22 2011-10-28 주식회사 케이씨아이 혼합 균 배양을 통한 배양물을 포함하는 천연 항균제, 이를 포함하는 식품, 화장료 및 사료 조성물
KR101295662B1 (ko) * 2010-12-23 2013-08-13 중앙대학교 산학협력단 항균활성을 갖는 신규 슈도모나스속 세균 ｃａｕ 104866과 ｃａｕ 104867 및 이의 용도
KR20120110292A (ko) * 2011-03-29 2012-10-10 창원대학교 산학협력단 메티실린 내성 황색포도상구균에 대해 유효한 항생물질을 생산하는 슈도모나스 애루기노사 ｋａｃｃ９１５９２ｐ 균주

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011012221A (ja) 2009-07-06 2011-01-20 Taiyo Kagaku Co Ltd 抗菌性樹脂組成物
CN111073188A (zh) * 2019-12-25 2020-04-28 大连工业大学 一种鲜食水产品抗菌复合膜的制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Fish Aquat Sci 16(2). 79-84. 2013*
Int J Med Sci 2017; 14(13):1368-1374
NCBI GenBank: MN535798.1*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220099102A (ko) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2013265070B2 (en) Therapeutic for treating Clostridium difficile infection
EP2575833B1 (en) Therapeutic amoeba and uses thereof
JP2006528166A5 (ko)
Liu et al. Synergistic antibacterial mechanism of Bi2Te3 nanoparticles combined with the ineffective β-lactam antibiotic cefotaxime against methicillin-resistant Staphylococcus aureus
US12064464B2 (en) Plantaricin NC8 alpha beta markedly enhances the effects of antibiotics
Agrawal Antimicrobial Activity of Nostoc calcicola (Cyanobacteria) isolated from central India against human pathogens
Jain et al. Hydrothermal assisted biological synthesis of silver nanoparticles by using honey and gomutra (Cow Urine) for qualitative determination of its antibacterial efficacy against Pseudomonas sp. isolated from contact lenses
Zhao et al. A novel plantaricin 827 effectively inhibits Staphylococcus aureus and extends shelf life of skim milk
Narayanan et al. Biocompatible, antibacterial, polymeric hydrogels active against multidrug-resistant Staphylococcus aureus strains for food packaging applications
Vijayakumar et al. Quebrachitol inhibits biofilm formation and virulence production against methicillin-resistant Staphylococcus aureus
US20140056850A1 (en) Dictyostelid amoeba and biocontrol uses thereof
Lv et al. Lactobacillus plantarum CY 1-1: A novel quorum quenching bacteria and anti-biofilm agent against Aeromonas sobria
Skočibušić et al. Evaluation of antimicrobial potential of the marine Cyanobacterium, Rivularia mesenterica
Huang et al. Octenidine dihydrochloride treatment of a meticillin-resistant Staphylococcus aureus biofilm-infected mouse wound
Mikaelyan et al. Tartaric acid synthetic derivatives effect on phytopathogenic bacteria
KR20120067096A (ko) 녹농균 및 황색포도상구균을 사멸시키는 박테리오파지
Zhang et al. An antibacterial and biocompatible piperazine polymer
KR102650835B1 (ko) 녹농균 배양물 또는 이의 추출물을 포함하는 항균 조성물 및 이의 용도
Ramesh et al. Antibacterial activity of wild Xylaria sp. strain R005 (Ascomycetes) against multidrug-resistant Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa
Trafny et al. Adhesion of Pseudomonas aeruginosa to collagen biomaterials: effect of amikacin and ciprofloxacin on the colonization and survival of the adherent organisms
Murad et al. Antimicrobial effect of Tetraspanin CD9 Peptides on Pseudomonas aeruginosa.
Krishnani et al. Bactericidal activity of nanopolymers against shrimp pathogenic bacterium Vibrio harveyi
Manavathu et al. The functional resistance of biofilms
RU2405821C1 (ru) Штамм бактерий bacillus pumilus &#34;пашков&#34; - продуцент биологически активных веществ, обладающих антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов и вирусов
KR101717533B1 (ko) 정유를 유효성분으로 포함하는 바이오필름 억제용 조성물 및 억제방법

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant