JPH11508138A - 試験サンプル中の生物学的材料の同定および識別のための試験培地、ならびにその定量的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 複数の異なる生物学的材料を含む試験サンプル中の生物学的材料を定量的に同定かつ識別するための試験方法および培地。サンプル中の第一の生物学的材料は、第一の色素原基質に対する酵素特異性を有し、第二の生物学的材料は、第二の色素原基質に対する酵素特異性を有し、第三の生物学的材料は、色素原基質の一つに対する酵素特異性を有する。色素原基質は、生物学的材料からの特異的酵素と反応すると、それぞれの第一および第二の色の水不溶性化合物を形成する。第一および第二の生物学的材料は、糖を発酵させることができ、第三の生物学的材料は、糖を発酵させない。試験培地は、糖の発酵による試験培地の一部の酸性化の際にpH指示薬の色の変化に導くpHに調整し、この色の変化は、糖を発酵させる生物学的材料の水不溶性化合物の周囲での着色帯域の形成を生じ、着色帯域は、水不溶性化合物の色から識別することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 試験サンプル中の生物学的材料の同定および識別のための試験培地、 ならびにその定量的方法 ［発明の背景］ 本発明は、複数の異なる生物学的材料を含有するサンプル中の生物学的材料の 定量的な同定および識別の方法、ならびに該方法に用いるための試験培地に関す る。 本発明は、更に、混合微生物サンプル中のEscherichia coli（E．coli）のそ の他の菌株、一般大腸菌型（coliform）、および非大腸菌型腸内細菌科の菌（En terobacteriaceae）を同時に定量的に検出かつ同定しつつ、E．coli Ｏ１５７株 を検出かつ同定する定量的方法にも関する。 細菌、その他の微生物、ならびに他の生物の細胞および組織のような有害な物 質の存在について、肉、乳製品、水その他の食品サンプルをスクリーニングする 目下の必要性が存在している。この必要性は、１９８０年代初期の腸管病原性の E.coli Ｏ１５７の発見の結果として、更なる重要性を帯びるに至った。それは 、不充分に調理された牛挽肉の摂取による疾病および死亡という、より最近の事 例における公然たる悪評によって、更に拍車がかけられた。その結果、食品、乳 製品、飲料および水のような生物学的材料はもとより、医学および獣医学的試験 材料中のそのような有害物質の存在や量を決定する試験方法の開発に多大な力点 が置かれている。このことは、材料中の潜在的な危険の特定と、診断上の目的と の双方のために重要である。 試験サンプル中のE．coli Ｏ１５７の存在や量を決定する上記の必要性に加え 、製品の質や安全性に影響することが公知である、他の多くの生物学的材料の試 験サンプル中での存在を決定するための、より迅速で、より信頼性に富む試験方 法に対する目下の必要性が存在し続けている。そのような生物学的材料の存否の 決定は、それに基づいて様々な物質の品質や安全性が評価され得る追加的な根拠 を与える。 製品または試験サンプルの質を決定する根拠としてのバイオテクノロジー、診 断化学、微生物学、分子生物学および関連分野での指標細菌の利用は周知である 。 例えば、水中に存在するE．coliその他の大腸菌型の量、すなわち計数は、その 水の清浄度および安全性の重要な指標であるとされる。同様に、食品および乳製 品中のE．coliその他の大腸菌型の存在は、これらの製品の品質の重要な指標と される。また、医学の試験サンプル中の特定のものの迅速かつ正確な同定は、疾 病状態の診断に重要である。そのような細菌型を効果的に同定、分離かつ計数す るための改良された試験方法が必要とされ、この領域での、より速く、より正確 で、より汎用性に富む試験方法が継続的に探求されている。 無数の試験方法が、１種類またはそれ以上の指標生物を同定、識別かつ計数す るのに利用されている。これらの試験方法のうちいくつかは、微生物の存否のみ を示すにすぎないが、他のものは、試験サンプル中の特定の生物のうち１種類ま たはそれ以上を定量することも試みている。例えば、存在／不在(またはＰ／Ａ) 試験と呼ばれる試験は、試験サンプル中の大腸菌型やE．coliの存否を決定する のに用い得る。β−ガラクトシダーゼ基質であるＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ− ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）と、β−グルクロニダーゼ基質である４−メチ ルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）とを含む試験培地に試験 サンプルを接種する。一般大腸菌型をE．coliから識別するために、この試験は 、概してすべての大腸菌型がβ−ガラクトシダーゼを産生するのに対し、E．col iのみは、β−ガラクトシダーゼに加えてβ−グルクロニダーゼも産生するとい う事実に依拠する。（E．coliを包含する）何らかの大腸菌型が存在するならば 、ブロス培地は、ＯＮＰＧという物質に対するガラクトシダーゼという酵素の、 拡散し得る黄色色素を遊離させる活性のために、黄色に変色する。E.coliが存在 するならば、ブロス培地は、紫外線を照射したときに、グルクロニダーゼという 酵素の産生によって生じた蛍光発現性染料の遊離を伴うＭＵＧという試薬の分解 のために、青色蛍光を示すことになる。これらの反応は、非常に特異的であり、 大腸菌型一般はもとより、E．coliの存在も単一のサンプルで同定するのを可能 にする。この試験の短所は、両試薬とも、拡散し得る色素を生成することから、 いずれの細菌型についても直ちに定量的ではないことである。該試験は、紫外線 を発生させるための特定の機器も必要とする。更に、この試験は、大腸菌型およ びE.coliを検出するためにのみ用い得るにすぎない。他の重要な微生物、 例えばグルクロニダーゼ陰性であるE．coli Ｏ１５７という菌株も、他の非ガラ クトシダーゼ−グルクロニダーゼ産生性微生物も検出されることがない。 バイオレットレッド胆汁寒天（ＶＲＢＡ）法は、試験サンプル中の大腸菌型と E．coliとの双方の量を決定するのに用いられている。この方法に用いられる試 験培地は、胆汁酸塩（非大腸菌型を阻害するため）、乳糖、およびpH指示薬であ るニュートラルレッドを含む。大腸菌型（E．coliを包含する）が培地で増殖す るにつれて、乳糖が発酵して酸が生成され、細菌コロニーの部域のニュートラル レッドは、赤レンガ色になる。この試験の結果は、解釈するのが必ずしも容易で はなく、E．coliの存在を決定するためには、確認のための追跡試験、例えば、 ブリリアントグリーン乳糖ブロス発酵、４４．５℃のＥＣブロスでの増殖、およ びエオジンメチレンブルー寒天(ＥＭＢＡ)での画線を実施しなければならない。 メンブランフィルター（ＭＦ）法は、細菌がフィルターの表面に保持されるよ うに試料を通過させる微細孔フィルターを利用する。この方法は、細菌集団が非 常に小さいときに最も多用され、適切な数を得るには大量のサンプルを要する。 そうして、フィルターを選ばれた培地の表面に定置し、インキュベーションし、 そしてメンブランフィルター表面で増殖する細菌コロニーを計数かつ評価する。 この方法は、広汎に用いられ、適正な試薬および培地と併用したときには、良好 な結果を与える。この方法の短所は、それが高価であり、時間がかかることであ る。また、固体のサンプル、または高コロニー数の微生物を有するサンプルでは 充分に機能しない。ＭＦ法は、本願に記載の本発明の方法と結合して用いること ができる。 試薬の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ ド（Ｘ−ｇａｌ）は、大腸菌型を同定するための公知の試験化合物である。大腸 菌型が産生するβ−ガラクトシダーゼという酵素が作用すると、Ｘ−ｇａｌは、 不溶性の藍色の沈澱を形成する。Ｘ−ｇａｌは、寒天平板のような栄養培地に配 合することができ、大腸菌型を含有するサンプルが存在するならば、大腸菌型は 、藍色のコロニーとして増殖することになる。Ｘ−ｇａｌは、拡散し得る化合物 ではなくて水に不溶である沈澱を形成し、そのため、固化した培地の中または上 に試験サンプルを配合したとき、大腸菌型の定量的決定を実施するのを可能にす る 点で、上記の化合物ＯＮＰＧにまさる利点を有する。 類似の化合物５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニ ド（Ｘ−ｇｌｕｃ）は、E．coliを同定するための公知の試験化合物である。ほ とんどのE．coliが産生するβ−グルクロニダーゼという酵素が作用すると、Ｘ −ｇｌｕｃは、不溶性の藍色の沈澱を形成する。Ｘ−ｇｌｕｃは、拡散し得る化 合物ではなくて水に不溶である沈澱を形成し、そのため、固化した培地の中また は上に試験サンプルを配合したとき、E．coliの定量的決定を実施するのを可能 にする点で、上記の化合物ＭＵＧにまさる利点を有する。更に、紫外光の使用を 必要としない。Ｘ−ｇｌｕｃと、それがE.coliを同定できることとは、Watkins ，et al.，Appl．Environ．Microbiol．54:1874-1875(1988)に記載されている。 類似の化合物インドキシル−β−Ｄ−グルクロニドは、やはりE．coliの鮮青色 のコロニーを形成するが、その化合物は、Ley，et al.，Can．J．Microbiol．34 :690-693(1987)に記載された。 Ｘ−ｇａｌとＸ−ｇｌｕｃとは、それぞれ、大腸菌型（Ｘ−ｇａｌ）またはE ．coli（Ｘ−ｇｌｕｃ）のいずれかの定量的決定に別個に役立つが、これらの指 標化合物は、同じ色素原をそれぞれ含有するという短所を有する。そのため、単 一のサンプルによる単一の試験でE．coliと一般大腸菌型との双方を同定かつ識 別するのに、それらをともに用いることはできない。それらはともに、同一の色 相を有する藍色のコロニーを発生するからである。両試薬を併用する者は、Ｘ− ｇａｌを単独で用いた場合と同じく、大腸菌型の総数を定量的に同定できると思 われるが、コロニーのいずれがE．coliであり、いずれがE．coli以外の大腸菌型 であるのかを示すことはできないと思われる。 試験サンプル中の一般大腸菌型とE．coliとを定量的に同定かつ識別するため の最近開発された試験方法は、本明細書で被譲渡人に譲渡された米国特許第5,21 0,022号明細書に記載されている。この方法は、単一サンプル中の一般大腸菌型 とE．coliとの定量的同定を可能にすることによって、先行技術の方法を改良す る。追加の確認試験は不要である。β−ガラクトシダーゼ基質、例えば６−クロ ロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、およびβ−グルクロニダーゼ基質、例え ば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド (Ｘ−ｇｌｕｃ)を含有する培地に、試験サンプルを加える。β−ガラクトシダー ゼ基質は、β−ガラクトシダーゼと反応すると、第一の色の水不溶性沈澱を形成 することができ、β−グルクロニダーゼ基質は、β−グルクロニダーゼと反応す ると、第一の色とは対照的な第二の色の水不溶性沈澱を形成することができる。 その結果、一般大腸菌型は、第一の色のコロニー（β−ガラクトシダーゼ活性を 有する）を数えることによって定量してよく、E．coliは、第二の色のコロニー （β−ガラクトシダーゼとβ−グルクロニダーゼとの双方の活性を有する）を数 えることによって定量してよい。該特許に記載された方法は、一般大腸菌型とE ．coliとの識別および同定について優れた結果を与えるが、E．coli Ｏ１５７と いう菌株や、非大腸菌型腸内細菌科の存在を確定かつ定量することはできない。 一定の微生物を同定かつ識別するためのその他の公知の方法は、一定の炭水化 物、例えば糖であるソルビトールを発酵させ得るそれらの能力の面で微生物が示 す相違に基づく。例えば、一般大腸菌型と、E．coliのほとんどの菌株とは、ソ ルビトールを発酵させ得る能力を有することが公知である。E．coli Ｏ１５７、 およびほとんどの非大腸菌型腸内細菌科は、ソルビトールを発酵させない。その 結果、ソルビトールを唯一の炭素源として含有する発酵可能培地、例えばマッコ ンキー（MacConkey）ソルビトール寒天に、ニュートラルレッドのような適切なp H指示薬の存在下で試験サンプルを加えたとき、一般大腸菌型、およびほとんど のE．coli株は、ソルビトール発酵からの酸産生のため、赤色のコロニーとして 増殖する。E．coli Ｏ１５７のような非ソルビトール発酵菌は、この培地では無 色のコロニーとして増殖する。しかし、非ソルビトール発酵性の腸内細菌科も多 数存在することから、この培地では、何らかの確実性をもってE．coli Ｏ１５７ を同定することは、事実上不可能である。加えて、この試験は、一般大腸菌型か らE．coliを区別することができない。 したがって、混合集団を含むサンプルにおいて、既存の方法で達成し得るより 多様な生物学的材料を識別するのに効果的である試験方法を提供する必要性が存 在する。更に、この必要性は、従来の方法より速く、より簡単で、より汎用性に 富む方法に対して存在する。 ［発明の要約］ 本発明は、複数の異なる生物学的材料を有する試験サンプル中の生物学的材料 を定量的に同定かつ識別する試験方法、ならびに該試験方法に用いるための培地 を提供することによって、先行技術の方法の短所を克服する。 本発明は、その一形態では、複数の異なる生物学的材料を含む試験サンプル中 の特定の生物学的材料の存在を検出し、それを定量的に同定かつ識別する方法で あって、第一の生物学的材料が、第一の色素原基質に対する酵素特異性を有し、 第二の生物学的材料が、第二の色素原基質に対する酵素特異性を有し、またそれ らの生物学的材料のうち少なくともいくつかは、炭水化物、例えば糖を発酵させ 得る方法を含む。試験サンプルによってマトリックスまたは固体表面を形成でき る、試験培地が提供される。該試験培地は、第一色素原基質、第二色素原基質、 特定の糖のような発酵できる炭素源、pH指示薬、および栄養基礎培地を含む。第 一色素原基質は、第一の生物学的材料から生成されるか、またはその中に存在す る酵素と反応すると、第一の色の水不溶性化合物を形成することができ、第二色 素原基質は、第二の生物学的材料から生成されるか、またはその中に存在する酵 素と反応すると、第一の色とは対照的な色の水不溶性化合物を形成することがで きる。発酵できる炭素源は、発酵すると、試験サンプルの糖を発酵させる成分に よって培地の一部を酸性化することができる。pH指示薬は、酸性化への反応に際 して第三の色を形成させるが、該第三の色は、糖発酵性成分の周囲の着色帯域を 構成し、培地の全体的背景色とは視覚的に区別できる。栄養性基礎培地は、好ま しくは、固体、ゲルまたは固体を形成するための溶液を含む。試験培地のpHは、 培地の酸性化の際にpH指示薬の色の変化へと導く範囲に調整し、その後、試験サ ンプルを試験培地に接種する。そうして、接種された試験サンプルを含有する試 験培地を、生物学的材料のコロニーの成長へと導く条件下でインキュベーション する。次いで、インキュベーションした試験サンプルを、第一の色を有し、その 周囲に視覚的に認識かつ識別できる第三の着色帯域を有する、第一の生物学的材 料の糖発酵性コロニーを表すコロニーの存在と；第二の色を有し、その周囲に視 覚的に認識かつ識別できる第三の着色帯域を有する、第二の生物学的材料の糖発 酵性コロニーを表すコロニーの存在と；第一の色を有し、それによって認識 かつ識別できる第二の色または第三の着色帯域を有しない、第三の生物学的材料 のコロニーを表すようなコロニーの存在と；第三の着色帯域を伴うか、または伴 わない該第一および第二の色のいずれをも有しない、少なくとも第四の生物学的 材料のコロニーであるようなコロニーの存在と；第三の着色帯域を伴うか、また は伴わない第四の色を有する、少なくとも第五の生物学的材料のコロニーである ようなコロニーの存在とについて調べてよい。次いで、それぞれのコロニーを、 それぞれ数えて、試験サンプル中に存在する指定された生物学的材料の各々のコ ロニー数を与える。 本発明は、そのもう一つの形態では、試験サンプル中のE．coli Ｏ１５７、E ．coli Ｏ１５７を包含しないその他のE．coli株、一般大腸菌型、および非大腸 菌型腸内細菌科の存在を検出し、それを定量的に同定かつ識別する方法を含む。 試験サンプルによってマトリックスまたは固体表面を形成できる、試験培地が提 供される。該試験培地は、β−ガラクトシダーゼと反応する際に第一の色の水不 溶性化合物を形成できる色素原のβ−ガラクトシダーゼ基質と、β−グルクロニ ダーゼと反応する際に第一の色とは視覚的に対照的な色の第二の水不溶性成分を 形成できる色素原のβ−グルクロニダーゼ基質と、発酵し得る唯一の炭素源とし てのソルビトールと、ソルビトールの発酵の結果として生じる酸性化の際に第三 の色を形成させるためのpH指示薬と、ソルビトール発酵成分の周囲の、培地の正 常な背景色とは対照的である着色帯域を構成する第三の色と、栄養基礎培地とを 含む。試験培地のpHは、培地の酸性化の際にpH指示薬の変色へと導く範囲に調整 し、その後、サンプルを試験培地に接種する。サンプルを含有する試験培地は、 一般大腸菌型、E．coli、E．coli Ｏ１５７、および非大腸菌型腸内細菌科の増 殖へと導き、そのため、該コロニーに対応する第一および第二の着色沈澱を形成 する条件下でインキュベーションする。次いで、試験培地を、第一の色、および その周囲の視覚的に認識かつ識別できる第三の着色帯域を有する、β−ガラクト シダーゼ活性を有するが、β−グルクロニダーゼ活性は有しない、ソルビトール 発酵菌である一般大腸菌型のコロニーであるコロニーの存在と；第二の色、およ びその周囲の視覚的に認識かつ識別できる第三の着色帯域を有する、β−グルク ロニダーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を有する、ソルビトール発酵 菌であるE．coliのコロニーであるようなコロニーの存在と；第一の色を有し、 第二の色、またはそれによって認識かつ識別できる第三の着色帯域を有しない、 β−ガラクトシダーゼ活性を有するがβ−グルクロニダーゼ活性は有しない、ソ ルビトール非発酵菌であるE．coli Ｏ１５７のコロニーであるようなコロニーの 存在と；第三の着色帯域を伴うか、または伴わない第一および第二の色のいずれ をも有しない、ソルビトールを発酵させ得る能力があるか、またはない、β−ガ ラクトシダーゼ活性もβ−グルクロニダーゼ活性も有しない非大腸菌型腸内細菌 科であるようなコロニーの存在と；第三の着色帯域を伴うか、または伴わない第 四の色を有する、ソルビトールを発酵させ得る能力があるか、またはない、β− ガラクトシダーゼを有しないが、β−グルクロニダーゼは有するサルモネラSalm onellaまたはシゲラShigellaのようないくつかの属の一定の菌株を表すようなコ ロニーの存在とについて調べてよい。次いで、コロニーのそれぞれを数えて、選 ばれた微生物のそれぞれのコロニー数を与えてよい。代替的には、特定の試験サ ンプル中の問題の特定のコロニーのみを数える必要がある。 本発明は、その更にもう一つの形態では、試験サンプル中の生物学的材料の存 在を検出するための試験培地を含む。該試験培地は、第一色素原基質、第二色素 原基質、糖のような発酵できる炭素源、pH指示薬、および栄養基礎培地を含む。 第一色素原基質は、該第一生物学的材料からの酵素と反応すると、第一の色の水 不溶性化合物を形成することができ、第二色素原基質は、第二生物学的材料から の酵素と反応すると、第一の色とは対照的な色の水不溶性化合物を形成すること ができる。発酵できる炭素源は、発酵すると、試験サンプルの糖を発酵させる成 分によって培地の一部を酸性化することができる。pH指示薬は、酸性化への反応 に際して第三の色を形成させるが、該第三の色は、糖発酵性成分の周囲の着色帯 域を含む。栄養性基礎培地は、固体、ゲルまたは固体を形成するための溶液を含 んでよい。 本発明の方法および培地は、単一のペトリ皿の試験培地に配合したサンプルか らの生物学的物質、例えば、腸内細菌科という科の一般的なE.coli株、E.coli Ｏ１５７、その他の大腸菌型、および非大腸菌型メンバーの同時の増殖、単離、 定量および同定を可能にする。サンプルの事前の増菌は、全く不要であるが、所 望ならば、事前増菌を利用してもよい。試験結果は、２４〜４８時間以内に入手 でき、試験は、基本的には、平板の培地への試験サンプルの単なる添加、試験培 地のインキュベーション、および試験サンプル中のそれぞれのコロニーの計数を 含む。他のほとんどの試験は、より多くの工程を必要とし、一般的には、試験結 果を得るための、より長い期間を必要とする。加えて、本発明の方法は、一つの 注意深く管理されるインキュベーション温度に依存しない。 ［発明の詳細な説明］ 本発明の方法および培地は、生物学的材料の混合集団のサンプル中の様々な選 ばれた生物学的材料の、同時の定量的同定および識別を可能にする。 本発明の方法および培地は、混合した微生物サンプル中のE．coli Ｏ１５７を 、E．coliのその他の菌株、一般大腸菌型、および非大腸菌型腸内細菌科を同時 に定量的に同定かつ識別しつつ、定量的に同定かつ識別するのに特に役立つ。 β−ガラクトシダーゼ活性を有する微生物は、「大腸菌型」の名称によって一 般的に公知であるものを包含する。「大腸菌型」の様々な定義があるが、一般的 に受容されているのは、腸内細菌科のメンバーであり、乳糖という糖を、気体お よび酸を放出しつつ発酵させ得る能力を有する細菌を包含する。 β−ガラクトシダーゼ活性に加えてβ−グルクロニダーゼ活性を有する微生物 は、主として、E．coli Ｏ１５７を除くE．coliという種の大腸菌型のほとんど の菌株を包含する。E．coli Ｏ１５７は、β−ガラクトシダーゼ活性を示すが、 β−グルクロニダーゼ活性は示さないE．coli株の約３％のうちの一つである。 本願に用いられる限りで、用語「一般大腸菌型」とは、E．coliの様々な菌株 以外の大腸菌型を意味する。これらの「一般大腸菌型」は、グラム陰性であり、 β−ガラクトシダーゼ活性を有する（すなわち乳糖発酵菌である）が、β−グル クロニダーゼ活性は有せず、ソルビトールという糖を発酵させ得る能力を有する 非芽胞性微生物である。 本願に用いられる限りで、用語「非大腸菌型腸内細菌科」とは、β−ガラクト シダーゼ活性を有しない腸内細菌科という科の微生物を意味する。 本願に用いられる限りで、用語「β−ガラクトシダーゼ基質」とは、基質に対 するβ−ガラクトシダーゼの作用によって遊離されると、不溶性の着色沈澱を形 成する置換体にβ−結合によって結合されたガラクトースを含むβ−ガラクトシ ドを意味する。 本願に用いられる限りで、用語「β−グルクロニダーゼ基質」とは、基質に対 するβ−グルクロニダーゼの作用によって遊離されると、不溶性の着色沈澱を形 成する置換体にβ−結合によって結合されたグルクロン酸を含むβ−グルクロニ ドを意味する。 β−ガラクトシダーゼ基質、および「ガラクトシド」として本明細書に記載さ れた化合物、ならびにβ−グルクロニダーゼ基質、および「グルクロニド」とし て本明細書に記載された化合物は、それぞれ、適切な塩基と、適切なガラクトシ ダーゼ、またはグルクロン酸のカルボキシル基との反応によって形成されるカル ボン酸の塩を含んでよい。適切な塩基は、アルカリ金属もしくはアルカリ土類金 属の水酸化物または炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化 カルシウム、水酸化マグネシウム、および対応する炭酸塩や；アンモニアのよう な窒素塩基、ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミンおよびシクロヘキシ ルアミンのようなアルキルアミンを包含する。 本発明の方法は、一定の微生物に見出される顕著な特徴を利用した結果、微生 物が定量的に同定され、相互に識別されるように設定されている。本方法は、前 記の微生物の異なる分類群、すなわち一般大腸菌型、E．coli、E．coli Ｏ１５ ７、および非大腸菌型腸内細菌科の定量的な同定と識別とに特に適している。本 発明の方法は、上記の微生物に特に適しているものの、これらの特定の微生物の 定量的同定および識別に限られないが、それは、この手法が、非常に様々な生物 学的材料の定量的同定および識別に向けての用途を有するからである。 他のE.coli株からのE.coli Ｏ１５７の分離および同定には、すべてのE.coli 株が共通する多くの特徴を共有するため、特に問題が多い。しかし、E．coli Ｏ １５７を他のE．coli株から区別させることになる根拠を与える三つの主要な相 違が存在する。４２℃を超える温度でのE．coli Ｏ１５７の不活発な増殖、E.co li Ｏ１５７が酵素のグルクロニダーゼを産生できないこと、およびE.coli Ｏ１ ５７が糖のソルビトールを発酵させ得ないことである。これらの相違は、E.coli の二つの型を同定かつ分離するのに用いるための一般的背景を与えるが、 追加の要因が、この同定および分離を複雑化する。 自然界に見出される微生物の混合集団、例えばE．coliとE．coli Ｏ１５７と の双方を包含するそれでは、正常には、近縁の多くの微生物が他にも存在する。 これらの微生物の多くは、E．coli株と同一または類似の条件下で生息かつ代謝 することができる。近縁微生物のほとんどは、E．coliのすべての種がそうであ るとおり、腸内細菌科という科のメンバーである。腸内細菌科は、グラム陰性、 非芽胞性の桿状細菌である。最も周知の属のいくつかは、シトロバクターCitrob acter、エドワージエラ Edwardsiella、エンテロバクターEnterobacter、エシェ リキア Escherichia、クレブシエラ Klebsiella、プロテウス Proteus、サルモ ネラ Salmonella、シゲラ Shigellaおよびエルシニア Yersiniaである。この科 の中には、大腸菌型の細菌と総称される属がある。大腸菌型の細菌は、全般的な 属の特徴を保持するが、加えて、酵素ガラクトシダーゼを産生し、それが、乳糖 という糖の発酵の際の手段となる。大腸菌型の属エシェリキアも、酵素ガラクト シダーゼを産生し、加えて、この属のほとんどの菌株は、酵素グルクロニダーゼ も産生する。しかし、E．coli株のＯ１５７株は、グルクロニダーゼ産生能を有 しないわずか約３％のE．coli株の一つである。 これらの近縁の細菌の特徴的な類似性のため、E．coli Ｏ１５７を腸内細菌科 のその他のメンバーから同定かつ分離することは困難であると判明している。そ の結果、この同定および分離を達成するための判定かつ配合しやすい試験培地が 入手できず、一般的には、抗原−抗体マッチングまたはＤＮＡプローブを利用し て混合微生物集団中のE．coli Ｏ１５７の存在を決定する、複雑で高価な方法を 採用することが必要となっている。そのような手法は、高価で時間がかかるばか りでなく、偽陽性または偽陰性の結果を示すことも多い。 本明細書中に参考として援用される、米国特許第5,210,022号明細書に記載の 方法は、一般大腸菌型とE．coliとの定量的同定および識別を可能にする。これ ら２種類の微生物の識別は、一般大腸菌型がガラクトシダーゼを産生し、それに よってβ−ガラクトシドとの反応の際に、第一の色の水不溶性沈澱を形成できる 特徴的な能力と、E．coliがガラクトシダーゼに加えてグルクロニダーゼも産生 し、それによってβ−グルクロニドとの反応の際に、第一の色とは対照的な色の 水不溶性沈澱を形成できる特徴的な能力とに基づく。 本発明は、米国特許第5,210,022号明細書に教示された方法を凌駕する。本発 明の方法によれば、定量的同定および識別は、該特許でのように一般大腸菌型と E.coliとになし得るばかりでなく、腸管病原性のE.coli Ｏ１５７はもとより、 非大腸菌型腸内細菌科の様々な種にもなし得る。試験培地には、ソルビトールお よび適切なpH指示薬を発色剤とともに配合する。E．coli Ｏ１５７とその他のE ．coliとの相違の一つは、E．coli Ｏ１５７が糖のソルビトールを代謝できない ことであることから、試験培地にソルビトールを用いることは、これら二つのE ．coli株を区別する手段を与える。発色剤は、β−ガラクトシダーゼ活性を有す る大腸菌型の、β−グルクロニダーゼ活性に加えてβ−ガラクトシダーゼ活性を 有するこれらのE．coli株からの定量的識別の根拠を与えるように選ぶ。培地に ソルビトールおよびpH指示薬を含ませることは、E．coliからの大腸菌型のこの 定量的識別には影響せずに、一般大腸菌型、およびほとんどのその他のE．coli からのE．coli Ｏ１５７と非大腸菌型腸内細菌科との定量的検出および識別を追 加的に可能にする。E．coli Ｏ１５７は、非大腸菌型腸内細菌科には存在しない 、E．coli Ｏ１５７のβ−ガラクトシダーゼ活性のために、非大腸菌型腸内細菌 科から区別され得る。 本試験培地に用いる特定のβ−ガラクトシダーゼ基質（β−ガラクトシド）と 特定のβ−グルクロニダーゼ基質（β−グルクロニド）とは、それぞれの基質が 形成する沈澱が、対照的な色のものであり、そのため一般大腸菌型をE．coliか ら区別する手段を与えるように選ぶ。その結果、β−ガラクトシダーゼ活性は有 するが、β−グルクロニダーゼ活性は有しない微生物のコロニーと、β−グルク ロニダーゼ活性のみを有するか、またはβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルク ロニダーゼ活性をともに有するかのいずれかの微生物のコロニーとを視覚的に区 別することができる。それぞれの形式の微生物コロニーの正確な色は、それぞれ の形式が区別できる限り、重大ではない。沈澱は、それぞれの沈澱を生成する微 生物のコロニーが視覚的に計数できるよう、試験培地に不溶でなければならない 。更に、β−ガラクトシドとβ−グルクロニドとは、β−ガラクトシダーゼとβ −グルクロニダーゼとの作用によって生成される着色した不溶性沈澱の検出に干 渉 しないよう、ほぼ無色であるか、または濃い色ではない化合物でなければならな い。β−ガラクトシドとβ−グルクロニドとは、試験培地に可溶にさせ得る化合 物でなければならない。 与えられたβ−ガラクトシドまたはβ−グルクロニドが試験培地中で機能でき るか否かの決定は、簡単な試験によってなし得る。β−ガラクトシドまたはβ− グルクロニドを固体の試験培地に配合し、次いで、一般大腸菌型またはE．coli をこれに接種する。着色したコロニーが試験培地に増殖するならば、この特定の β−ガラクトシドまたはβ−グルクロニドは、下記の試験を条件に、用いてよい 。与えられたβ−ガラクトシドまたはβ−グルクロニドをともに用いることがで きるか否かの決定は、固体培地に二化合物をともに配合し、次いで、一般大腸菌 型とE．coliとの双方の混合物をこれに接種し、適切な温度でインキュベーショ ンすることによってなし得る。E.coliのコロニーと一般大腸菌型のコロニーとが 、それぞれの形式のコロニーの色での対比によって視覚的に識別できるならば、 β−ガラクトシドとβ−グルクロニドとの特定の組み合わせは適切である。 本発明の方法の実施に適した色素原化合物は、５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）である。Ｘ−ｇａｌは 、商業的に入手できるβ−ガラクトシダーゼ基質であって、β−ガラクトシダー ゼで反応させたときに、ほぼ藍色の色を有する不溶性沈澱を生成する。Ｘ−ｇａ ｌとともに用い得る、許容され得るβ−グルクロニドは、藍色とは対照的であり 、藍色によって完全には遮蔽されない赤色または黄色のような色を有する、不溶 性沈澱を生じる化合物を包含する。そのような一例は、６−クロロインドリル− β−Ｄ−グルクロニドという化合物である。この化合物は、藍色とは対照的で、 視覚的に区別できる紫紅色の色を有する不溶性沈澱を生じる。この化合物、およ びここに用いるのに適したその他の化合物の調製は、参考として援用される前記 の米国特許第5,210,022号明細書に記載されている。 本方法の実施に適したもう一つの色素原化合物は、５−ブロモ−４−クロロ− ３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド（Ｘ−ｇｌｕｃ）である。Ｘ−ｇｌｕｃ は、商業的に入手できるβ−グルクロニドであって、β−グルクロニダーゼで反 応させたときに、ほぼ藍色の色を有する不溶性沈澱を生成する。インドキシル− β−Ｄ−グルクロニドは、類似の化合物であって、その沈澱は、その開示を参考 として本明細書に援用する、Can．J．Microbiol.のLeyらによる前記の論文に記 載されている。Ｘ−ｇｌｕｃまたはインドキシル−β−Ｄ−グルクロニドととも に用い得る、許容され得るβ−ガラクトシドは、藍色とは対照的である、赤色ま たは黄色のような色を有する不溶性沈澱を生じる基質を包含する。適切なβ−ガ ラクトシドの例は、６−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシドという化合物 である。この化合物は、藍色とは対照的で、視覚的に区別できる紫紅色の色を有 する不溶性沈澱を生じる。この化合物の調製は、前記の米国特許第5,210,022号 明細書に記載されている。その他の適切な色素原化合物も、該特許に指定されて いる。 β−ガラクトシドおよびβ−グルクロニドは、β−ガラクトシドが生成する不 溶性沈澱より暗い色の不溶性沈殿をβ−グルクロニドが生成するように選ぶのが 好ましい。これは、E．coliのコロニーでβ−グルクロニドが生成した沈澱が、 β−ガラクトシドが生成した沈澱を遮蔽するのを可能にし、E．coliのコロニー が一般大腸菌型のコロニーと区別されるのを容易にする。これに代えて、より多 くのβ−グルクロニドと、より少ないβ−ガラクトシドとを用いることによって 、β−ガラクトシドが生成した沈澱を遮蔽してもよい。好適な実施態様では、６ −クロロ−３−インドリルガラクトシドをβ−ガラクトシドとして用い、５−ブ ロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニドをβ−グルクロニドとして用い る。これらの基質を培地に用いたとき、大腸菌型は、酵素ガラクトシダーゼの存 在のために形成された赤色のコロニーの存在によって同定される。E.coliは、E. coliのこれらの菌株におけるガラクトシダーゼ（赤色のコロニーを形成）とグル クロニダーゼ（青色のコロニーを形成）との双方の存在のために形成された、紫 色（赤＋青）のコロニーの形成によって同定される。 利用してよいその他のβ−ガラクトシドおよびβ−グルクロニドは、置換され たインドリルβ−ガラクトシドおよびβ−グルクロニドの一般的範疇に属するも のを包含する。本発明をいかなる特定の理論または機序に限定しようとするので はないが、置換インドリルの置換基を有するβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グ ルクロニダーゼ基質をそれらのそれぞれの酵素によって反応させたとき、酵素の 作用によって遊離された置換インドリルの置換基は、不溶性のインジゴ類似体へ とin situで転換すると考えられる。例えば、６−クロロインドリル−β−Ｄ− ガラクトシドにβ−ガラクトシダーゼが作用したときは、遊離される６−クロロ インドリルは、それ自体と反応し、紫紅色の沈澱である６，６′−ジクロロイン ジゴを形成する。このことは、６−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシドま たは６−クロロインドリル−β−Ｄ−グルクロニドに類似する他の化合物を、６ ，６′−ジクロロインジゴに類似する色を有する対称的インジゴ類似体に基づい て製造かつ利用できる可能性があることを示唆する。対称的クロロインジゴの合 成および吸収スペクトルは、Sadler et al.，JACS 78，1251-1255(1956)によっ て報告されており、その開示を参考として本明細書に援用する。そこには、化合 物４，４′，６，６′テトラクロロインジゴ、６，６′，７，７′テトラクロロ インジゴおよび４，４′，６，６′，７，７′ヘキサクロロインジゴは、６，６ ′−ジクロロインジゴと色が似ていることが記載されている。したがって、それ ぞれのβ−ガラクトシド、すなわち４，６−ジクロロインドリル−β−Ｄ−ガラ クトシド、６，７−ジクロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、および４，６ ，７−トリクロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、ならびにそれらの塩は、 ６−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシドと同じようにして製造かつβ−ガ ラクトシダーゼ基質として使用できると思われる。帯赤色の沈澱を形成するため に本発明に用いるのに適したその他のガラクトシダーゼ基質は、５−ブロモ−６ −クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドおよび６−クロロ−３−イン ドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを包含する。一定のナフチル置換ガラクトシド、 例えば２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトシドも、これらのナフチル置換化合物が 、本発明の方法に指定された条件下で赤色の沈澱を形成することから、ガラクト シダーゼ基質として利用してよい。 同様に、それぞれのβ−グルクロニド、すなわち４，６−ジクロロインドリル −β−Ｄ−グルクロニド、６，７−ジクロロインドリル−β−Ｄ−グルクロニド 、および４，６，７−トリクロロインドリル−β−Ｄ−グルクロニド、ならびに それらの塩はもとより、ナフトール−ＡＳ−ＢＡ−β−Ｄ−グルクロニドのよう なナフチル置換グルクロニドも、６−クロロインドリル−β−Ｄ−グルクロニド と 同じようにして、β−グルクロニダーゼ基質として製造かつ使用できると思われ る。帯赤色の沈澱を形成する他の適切なグルクロニダーゼ基質は、５−ブロモ− ６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニドおよび６−クロロ−３−イ ンドリル−β−Ｄ−グルクロニドを包含する。しかし、実際上は、上に挙げたグ ルクロニドは、それぞれ、同じ色素原を有することから、それぞれの基質がそれ ぞれ形成する着色沈澱は、容易に区別できないため、列挙されたガラクトシドと ともに用いられることはないと思われる。むしろ、ガラクトシダーゼ基質によっ て帯赤色沈澱が形成されるそのような場合は、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリル−β−Ｄ−グルクロニド、インドキシル−β−Ｄ−グルクロニド、４− クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−３−インドリル −β−Ｄ−グルクロニドおよびＮ−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロ ニドのようなグルクロニド、ならびにそれらの塩を利用してよいが、それは、こ れらの基質が形成する沈澱が、これらのガラクトシドが形成する色（概して帯赤 色）と対照的である色（概して青または緑）のものだからである。 同様に、帯赤色の沈澱を形成する上に特定したグルクロニドを利用するならば 、選ばれるガラクトシドは、グルクロニダーセ基質が形成する沈澱の色とは区別 できる色を有する沈澱を形成するものであろう。この場合、適切なガラクトシド は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４−ク ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、５−ブロモ−３−インドリル− β−Ｄ−グルクロニドおよびＮ−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシ ド、ならびにそれらの塩を包含する。上に挙げた化合物のほとんど、またはそれ らの塩は、Horsham，PAのInalco Pharmaceuticals，Inc.およびOxford，CTのDia gnostic Chemicals Limitedのような商業的供給源から入手してよい。 試験培地には、適切な炭素源、および適切なpH指示薬も配合する。好適な実施 態様では、糖ソルビトールを炭素源として利用して、非ソルビトール発酵微生物 、例えばE．coli Ｏ１５７やいくつかの非大腸菌型腸内細菌科からのソルビトー ル発酵微生物、例えば一般大腸菌型やE．coliの識別を可能にする。好適な実施 態様ではソルビトールを利用するものの、複合炭水化物、その他の糖、タンパク 質および長鎖脂質のような他の炭素源も、適切な条件下で、また適切なpH 指示薬とともに用いて、有機酸を生成するために基質と生化学的に反応させてよ く、したがって、本発明の範囲内に属する。 pH指示薬は、酸を産生しつつソルビトールを発酵するこれらのコロニーの周囲 に着色帯域を形成させる。この帯域は、ソルビトールを発酵しないコロニーの周 囲には全く形成されない。pHは、pH指示薬が培地を望みの色に転じさせるような それでなければならないため、最終培地のpHは、本方法の有効性に対して決定的 に重要である。様々なpH指示薬を用いてよいが、本方法をE．coli Ｏ１５７を上 記に指定した微生物から同定かつ識別するのに利用するときは、フェノールレッ ドが好適な指示薬である。フェノールレッドをpH指示薬として用いるときは、pH を、約７．０〜７．６、好ましくは約７．２の範囲内に調整しなければならない 。このpHでのフェノールレッドの使用により、発酵の際の酸の産生のために、黄 色の帯域がソルビトール発酵菌の周囲に形成される。非ソルビトール発酵菌の周 囲の部域は、無色のままであるか、ある場合には、ガラクトシダーゼの存在のた めに形成された沈澱からの少量の色の漏洩によって赤色となる。ブロムチモール ブルー(ＢＴＢ)のような他の指示薬も、E.coliからE.coli Ｏ１５７を検出かつ 識別するために用いられている。その他のpH指示薬を利用するときは、選んだ特 定の指示薬に適したpHへと反応条件を、調整しなければならない。加えて、pH指 示薬を選ぶときは、酸性化またはアルカリ化の際に、試験培地に用いた特定の色 素原の色から区別できる色を生じる指示薬を選ぶことが重要である。 培地に配合する糖の量を制御することが、重要である。例えば、ソルビトール のあまりにも高い濃度は、過剰な酸の産生を招くことになる。そのような場合、 比較的少数の酸産生コロニーが、ペトリ平板全体の培地を黄色に変化させ、その ため、ソルビトールを用いないコロニーを遮蔽することがある。好ましくは、ソ ルビトールの量は、培地１リットルあたり約２〜７ｇ、最も好ましくは約５g/l でなければならない。 加えて、最良の結果のためには、重層培地をサンプルにかぶせて、細菌を培地 のマトリックスに閉じ込めなければならない。空気と接した培地表面上で増殖す るコロニーは、培地に埋め込まれたそれと全く同じようには応答し得ないことか ら、重層培地の添加は、より一貫した、より正確な試験結果を与える。試験培地の調製 混合微生物サンプル中のE．coli、一般大腸菌型、および非大腸菌型腸内細菌 科を同時に定量的に検出かつ同定しつつ、E．coli Ｏ１５７を定量的に同定かつ 識別するのに用いるための、試験培地の調製を記載する。 試験培地は、選択した色素原、すなわちβ−ガラクトシドおよびβ−グルクロ ニド、ソルビトール、ならびにpH指示薬を栄養基礎培地と組み合わせることによ って形成する。ソルビトールは、本試験方法が識別過程の一つとしてのソルビト ールの発酵または不発酵に依存するため、培地に加えるべき唯一の糖である。フ ェノールレッドをpH指示薬として用いるとき、この指示薬は、中性またはアルカ リ性の条件では赤色であり、ソルビトールの発酵の際に形成される酸性の条件で は黄色である。好適な実施態様では、胆汁酸塩も培地に加えて、腸内細菌科のメ ンバー以外の多くの細菌の増殖を阻害し、それによって試験をより選択的にする 。 栄養基礎培地は、微生物を増殖させるための当該分野に公知の、多くの培養培 地のいずれか一つであってよい。一般に、そのような培地は、成長栄養素、緩衝 剤、水およびゲル化剤を含む。可能なゲル化剤は、とりわけ、寒天、ペクチン、 カラギーナン、アルギン酸塩、ローカストビーン（locust bean）、キサンチン 、グアール（guar）およびゲレン（gellen）を含む。 下記の例は、本発明に用いるのに適した試験培地の調製を記載する。列挙した それぞれの成分の量は、試験培地１リットルあたりの量である： ペプトン（カゼイン消化物） １０ｇ 酵母エキス ５ｇ 塩化ナトリウム ３ｇ 胆汁酸塩 １ｇ ソルビトール ５ｇ フェノールレッド ２５mg ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニド ７５mg ６−クロロ−３−インドリルガラクトシド １５０mg 細菌学用品質の寒天 １７ｇ 上記の成分を、９０〜１００℃に加熱した脱イオン水約１リットル中で混合す る。次いで、溶液のpHをＮａＯＨまたは酒石酸（１０％溶液）で約７．２に調整 する。培地を１２１℃、および約６．８kg（１５ポンド）の圧力で１５分間滅菌 し、４５℃に冷却し、無菌のペトリ平板に注入して（２０ml/平板）用いる。 ペクチンを基にした試験培地は、固化剤として低級メトキシルペクチン２５mg を寒天ガムに代えて用いる以外は、上記と同じ段階を用いて調製することができ る。この培地を、固体のゲルを形成するためにペクチンと結合するカルシウムイ オンを含む、ゲル薄層を有するペトリ平板に室温で注入する。適切なペクチン培 養培地は、米国特許第4,241,186号および米国特許第4,282,317号明細書に記載さ れており、これらの開示は、参考として本明細書に組み込まれる。ペクチンを基 にした培地は、使用者にとっての簡便性および温度独立性という利点を有するた め、標準的な寒天培地より好ましい。ペクチン培地の使用は、文献中に充分記載 されており、ＡＯＡＣの共同研究はもとより、他の刊行された調査、および組織 内調査の結果として受容されている。本発明の方法に用いるのに適したペクチン 培地は、インジアナ州GoshenのRCR Scientific，Inc.より商業的に入手可能であ る。 本方法は、その好適実施態様では固体のペクチンまたは寒天培地を利用すると して説明されているが、培地は、必ずしも固体形態である必要はない。例えば、 ペトリ皿に吸収性パッドを敷いてもよく、前記の必要な栄養素および試薬のすべ てを含有する液体培地を、そのパッドに吸収されるようにして加える。吸収性パ ッドは、微生物が、寒天その他の固化剤で固化した培地に発生するのと類似の離 散したコロニー形成単位としてその上で増殖する、固体表面を与える。試験培地へのサンプルの接種 試験培地には、微生物を含有するサンプルを培地に接種するための当該分野に 公知のいかなる方法によっても、試験しようとするサンプルを接種することがで きる。例えば、試験しようとするサンプルをペトリ平板に加えてから培地を加え てもよく、あるいはサンプルを未固化培地に加えてから平板に注入してもよい( 混釈平板の手法)。混釈平板の手法を利用するときは、培地が平板で固化した後 に、 重層する層を加える。あるいは、平板が冷却かつ固化した後に、試験サンプルを 平板の表面に塗布し、次いで、重層する層で被覆してもよい（スワブまたは画線 平板の手法）。 本発明の方法は、上記のメンブランフィルター（ＭＦ）法と併用してもよい。 この方法では、同定しようとする生物学的材料を含有する水溶液をほとんどの場 合に含むサンプルを、微細孔フィルター越しに濾過する結果、生物学的材料は、 フィルターの表面で捕捉される。次いで、フィルターをペトリ皿内の培地の表面 に置いてインキュベーションして、表面上の生物学的材料が視認できるコロニー へと増殖するのを可能にする。ペトリ皿内の培地は、予め固化した寒天またはペ クチンを基にした培地であってよく、あるいは、必要な栄養素および試薬を含有 する液体培地に浸漬した吸収性パッドであってもよい。この後者の方法は、培地 中の別個の固化剤を伴わずに、本発明の方法を用いるのを可能にするが、それで も、生物学的材料が発育する固い表面を与える結果、寒天その他の薬剤で固化し た培地で発育するのと類似する明確な、離散したコロニー形成単位として増殖す ることができる。試験培地のインキュベーション 接種した試験培地は、サンプル中に存在する個々の微生物が、検出できるコロ ニーへと増殖するのを可能にするのに充分な期間、および充分な温度でインキュ ベーションする。培地中の微生物を増殖させるのに適したインキュベーション条 件は、当該分野で周知である。好ましくは、記載のとおりのE．coli Ｏ１５７の 定量的同定および識別の際は、試験培地を約３０〜４０℃の温度で約２４〜４８ 時間インキュベーションする。 所望ならば、本方法の選択性を、インキュベーション温度を３０〜４０℃では なく４２℃に制御することによって、更に改良してよい。E．coli（Ｏ１５７株 を含む）は、４２℃で充分に増殖するが、この温度は、他の多くの近縁微生物の 増殖に対して阻害的である。この、より高い温度を利用することは、選択性を向 上させることによって、特定の微生物についての向上した結果を与え得るが、同 時に、その他の特定の微生物の種類の存在の正確な表示を与えないことから、一 般的な培地の全体的な汎用性を減じることになる。 一般的な微生物集団の阻害剤を用いない限り、（非大腸菌型腸内細菌科、一般 大腸菌型、E．coliおよびE．coli Ｏ１５７に加えて）一般的な微生物集団も、 インキーベーションした試験培地中で増殖することになる。一般大腸菌型や様々 なE．coli株以外の微生物は、β−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダー ゼを滅多に産生しないので、一般的な微生物集団のほとんどは、通常、標準的な 寒天混釈平板では白色または無色のコロニーとして現れることになる。試験培地の検査、および微生物の計数 一般大腸菌型は、β−ガラクトシダーゼを産生し、それが試験培地中のβ−ガ ラクトシドに作用して、β−ガラクトシドが、用いた特定のβ−ガラクトシドに 応じた色を有する不溶性の沈澱を形成するようにする。形成された沈澱は、試験 培地に不溶であるため、β−ガラクトシダーゼを産生する微生物のごく近辺に残 存する。これらの微生物が繁殖してコロニーを形成するにつれて、コロニーは、 β−ガラクトシドが生成した色を有する。 E．coliのほとんどの菌株もβ−ガラクトシダーゼおよびβ−グルクロニダー ゼを産生することから、それぞれの酵素の作用によって、β−ガラクトシドとβ −グルクロニドの両方の不溶性沈澱が形成される。E．coliのコロニーは、β− グルクロニドの対照的に着色した不溶性沈澱の存在のために、一般大腸菌型のコ ロニーの色とは異なり、かつそれと対照的な色を有するコロニーとして現れる。 E．coli Ｏ１５７は、グルクロニダーゼ陰性であるE．coliの３％の菌株の一つ であることから、一般大腸菌型と同様に反応し、一般大腸菌型が形成する沈澱と 同じ色を有する不溶性沈澱の形成を生じる。 ソルビトール発酵菌であるこれらの微生物のコロニーは、ソルビトール発酵か ら生成された酸の結果として、更に改変される。これらのソルビトール発酵コロ ニーの周囲には、利用した特定のpH指示薬と、反応媒体のpHに従って着色された 帯域が形成される。ソルビトールを発酵させないコロニー、例えばE．coli Ｏ１ ５７の周囲には、帯域は全く形成されない。 特定の色素原、すなわちβ−ガラクトシドおよびβ−グルクロニド、ならびに 特定のpH指示薬は、インキュベーションの結果生じる色が、視認できる対比を与 えるように選ばれることから、存在する各タイプの微生物のコロニーを、視覚 的に識別することができる。したがって、例えば、６−クロロ−３−インドリル ガラクトシドをβ−ガラクトシドとして用い、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルグルクロニドをβ−グルクロニドとして用い、フェノールレッドをpH指 示薬として試験培地に用いるならば、E.coli Ｏ１５７のコロニーは、インキュ ベーションした培地では、コロニーの周囲の顕著に赤味を帯びた曇りに囲まれた 、赤いコロニー（ＣＦＵ）として出現する。これらのコロニーの周囲の帯赤色の 曇りは、コロニーを囲む培地への少量の酵素の、コロニーの周囲にやや着色した 赤い「ハロー」を生成する漏洩によって生じ、pH指示薬の変色の結果としては形 成されない。他のE．coliコロニーは、発酵の際に生成された酸に対するpH指示 薬の反応のために形成された黄色の帯域に囲まれた、（赤色および青色のコロニ ーの組み合わせの結果として生じる）紫色のコロニー（ＣＦＵ）として出現する 。一般大腸菌型は、黄色の帯域に囲まれた赤色コロニー（ＣＦＵ）として出現す る。ほとんどのサルモネラ属の菌株のようないくつかの非大腸菌型腸内細菌科は 、黄色の帯域に囲まれた無色または白色のコロニー（ＣＦＵ）として出現するが 、それは、ほとんどのサルモネラ属は、ソルビトールを発酵させて酸を産生する が、ガラクトシダーゼまたはグルクロニダーゼのいずれをも産生しないからであ る。サルモネラまたはシゲラのようないくつかの属の特定の菌株は、グルクロニ ダーゼ(しかしガラクトシダーゼではない)の産生のために、明青色のコロニーと して増殖する。プロテウス属のようなその他の腸内細菌科は、酵素産生、または ソルビトールの酸発酵のいずれをも欠くために、これらのコロニーを囲むいかな る帯域も伴わない無色のコロニーとして出現する。 次いで、微生物の各種のコロニーを、それぞれの色の組み合わせのコロニーの 計数、または他の、試験平板上の微生物を数えるための当該分野で公知の方法に よって数える。各種のコロニーの数は、インキュベーション前のサンプル中に本 来存在した各種の微生物の数を示す。本発明の方法の汎用性は、特定の試験サン プル中の目的とされ得る限り多くの生物学的材料の定量的同定および識別を可能 にする。例えば、一般大腸菌型、E．coliおよびE．coli Ｏ１５７のみが特定の サンプルで目的とされるならば、これらの細菌を表すコロニーを数えてよく、こ の場合、他の生物学的材料、例えばサルモネラ属、シゲラ属およびプロテウス属 のコロニーも数えることは必要ない。 したがって、記載されたような本発明は、単一の試験サンプル中の複数の型の 微生物を、該微生物が関与する制御された反応の結果として形成される、様々な 色の組み合わせを単に区別するだけで、定量的に同定かつ識別するのに用いてよ い。任意の成分 本発明の方法は、阻害剤を必要としない。しかし、説明したとおり、一般大腸 菌型、E．coliおよびE．coli Ｏ１５７のような生物学的材料の同定および識別 に用いるときは、一般的な微生物集団には阻害的であるが、大腸菌型に対しては ほとんどまたは全く影響がないことが公知である、様々な化合物の添加によって 培地をより選択的にしてよい。例えば、胆汁、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオ キシコール酸塩および／またはポリグリコールエーテルのような物質を培地に配 合して、特定の試験の目的ではない細菌の増殖を阻害してよい。これらの化合物 の培地１リットルあたりの示唆される濃度は：（ａ）胆汁酸塩、約１．０g/リッ トル、（ｂ）ラウリル硫酸ナトリウム、約０．２g/リットル、（ｃ）デスオキシ コール酸ナトリウム、約０．２g/リットル、（ｄ）ポリグリコールエーテル、約 ０．１ml/リットルである。これらの化合物のうち１種類またはそれ以上の添加 は、存在するバックグラウンド（非腸内細菌科）微生物を減少させ、それによっ て、より整然とした平板を形成させ、サンプル中の腸内細菌科でない生物による 阻害または干渉の可能性を低下させ得る。アクリフラビンのような化学薬品、お よび／またはセフスロジン、セフォキシム、ノボビオシンのような抗生物質や、 当該分野に公知の類似の阻害性化合物の添加によって、何らかのE．coliではな い腸内細菌科および／または大腸菌型の存在を排除することも可能である。しか し、上記の阻害剤による限り、この方法は、培地が、これらの材料によって阻害 または排除された微生物をスクリーニングし定量できる能力を低下させる。 培地配合物への非常に少量の酵素誘導物質の添加によって、一般大腸菌型の酵 素産生を高めることも可能である。例えば、β−ガラクトシダーゼに特異的な誘 導物質は、市販されており、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ ＩＰＴＧ）として化学的に公知である。培地１リットルあたり約１５０mgの ＩＰＴＧの添加は、大腸菌型のいくつかの種については酵素産生の速度に対して 肯定的で注目すべき効果を有する。実施例 上記に与えた処方に列挙した成分を含有するが、ゲル化剤としての寒天をペク チンに置き換えた試験平板を調製した。下記の表に示したとおりのそれぞれの細 菌を培地に接種した。 この表は、上記の例に記載した試験培地を用いたときに、E．coli Ｏ１５７、 一般大腸菌型、E．coli、ならびに非大腸菌型腸内細菌科であるプロテウス属お よびサルモネラ属が区別され得る様式を説明する。表に示したとおり、一般大腸 菌型またはE．coliと、非大腸菌型腸内細菌科であるプロテウス属およびサルモ ネラ属とを含有するサンプル中のE．coli Ｏ１５７の同定もしくは識別のための 試験に、本発明の試験培地を用いる場合、視覚的区別は、それぞれの微生物の特 定のコロニーの各々について認識し得る。本発明の方法の汎用性は、表に記載さ れたその他の試験培地では不可能である。 （１） 上記に与えた培地の処方。 （２） 上記に与えた培地の処方から、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ルグルクロニドを除く。 （３） 上記に与えた培地の処方から、６−クロロ−３−インドリルガラクトシ ドを除く。 （４） マッコンキーソルビトールの標準処方物 （５） マッコンキーソルビトールに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ルガラクトシドを追加。 （６） マッコンキーソルビトールに、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリ ルグルクロニドを追加。 本発明は、主として、その好適な実施態様の形で説明されているが、当業者は 、本発明を本開示の精神および範囲内で更に改変して、混合集団のサンプル中に 存在するその他の生物学的材料の同定および識別を可能にできることを認識する であろう。したがって、本願は、その全般的原理を用いて、発明のいかなるバリ エーション、使用または適応も網羅するものとする。例えば、本発明の手法は、 幅広い種々の生物学的材料のいずれをも、これらの生物学的材料が、酵素特異性 の相違を示し、該生物学的材料の少なくともいくつかが、選ばれたpHでの使用に 適したpH指示薬の存在下で、該pHで種々の炭水化物を発酵させ得るそれぞれの能 力の相違を示す限り、定量的に同定かつ識別するのに用いてよい。本発明の実施 の際は、視覚的な識別に利用しようとする特定の色素原が、それぞれの酵素と反 応して区別できる色を生じるのを決定し、pH指示薬に関する適切な反応条件下で 炭水化物が発酵すると、更にもう一つの視覚的に区別できる色が生じるように、 適切な炭水化物およびpH指示薬を選ぶことのみが必要とされるにすぎない。 前記に加え、本願は、本発明が属し、添付の請求項の限界内に属する当技術で の公知または慣用の実施の範囲内にあるような、本開示からの逸脱を網羅するも のとする。

【手続補正書】 【提出日】１９９８年１０月２８日 【補正内容】 請求の範囲 １．複数の異なる生物学的材料を含む試験サンプル中の特定の生物学的材料を定 量的に同定かつ識別するための、該生物学的材料のうち第一のものが、第一の色 素原基質に対する酵素特異性を有し、該生物学的材料のうち第二のものが、第二 の色素原基質に対する酵素特異性を有し、そして該試験サンプル中の該生物学的 材料のうち少なくともいくつかは、炭水化物を発酵させ得る方法であって： 該試験サンプルによってマトリックスまたは固体表面を形成できる、該第一の 色素原基質および該第二の色素原基質（ここで、該第一の色素原基質は、該第一 の生物学的材料からの酵素と反応すると、第一の色の水不溶性化合物を形成する ことができ、該第二の色素原基質は、該第二の生物学的材料からの酵素と反応す ると、該第一の色とは対照的な色の水不溶性化合物を形成することができる）; 該試験サンプルの炭水化物を発酵させる成分によって生じる発酵の際に、培地の 一部を酸性化できる、炭水化物を含む発酵させ得る成分；該酸性化への反応の際 に、該炭水化物を発酵させる成分の周囲の着色した帯域を構成する第三の色を形 成させるpH指示薬；ならびに栄養基礎培地を含む試験培地を与える工程； 培地の該一部の酸性化の際に、pH指示薬の色の変化へと導く範囲に該試験培地 のpHを調整する工程； 該試験培地に該試験サンプルを接種する工程； 該試験培地を、該生物学的材料のコロニーの成長、または活性へと導く条件下 でインキュベーションして、それによって該対照的な色の水不溶性化合物を産生 する工程； 該第一の色を有し、その周囲に認識かつ識別できる該第三の着色帯域を有する 、該第一の生物学的材料のコロニーであり、炭水化物発酵菌であるコロニーの存 在；該第一の色とは対照的な第二の色を有し、その周囲に認識かつ識別できる第 三の着色帯域を有する、該第二の生物学的材料のコロニーであり、炭水化物発酵 菌であるようなコロニーの存在；および該第一の色を有し、それによって認識か つ識別できる該第二の色または該第三の着色帯域を有しない、第三の生物学的材 料のコロニーであるようなコロニーの存在について該試験培地を検査する工程； および 該コロニーのそれぞれを数える工程 を含む方法。 ２．該第三の着色帯域を伴うか、もしくは伴わない該第一および第二の色以外の 色を有するか、または無色である、少なくとも第四の生物学的材料のコロニーで あるようなコロニーの存在について該試験培地を更に検査する工程を含む請求項 １記載の方法。 ３．該第三の着色帯域を伴うか、もしくは伴わない該第一および第二の色のいず れをも有しない、少なくとも第四の生物学的材料のコロニーであるようなコロニ ーの存在；および該第三の着色帯域を伴うか、または伴わない第四の色を有する 、少なくとも第五の生物学的材料のコロニーであるようなコロニーの存在につい て該試験培地を更に検査する工程を含む請求項１記載の方法。 ４．該第一の色素原基質が６−クロロ−３−インドリルガラクトシドを含み、該 第二の色素原基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニドを含 み、該炭水化物がソルビトールを含み、そして該pH指示薬がフェノールレッドを 含む請求項１記載の方法。 ５．試験培地が、少なくとも一つの成長阻害剤を更に含む請求項１記載の方法。 ６．該少なくとも一つの成長阻害剤が、胆汁、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオ キシコール酸ナトリウムまたはポリグリコールエーテルを含む請求項５記載の方 法。 ７．試験培地が、アクリフラビンおよび抗生物質の少なくとも一つを更に含む請 求項１記載の方法。 ８．試験培地が、反応誘導物質を更に含む請求項１記載の方法。 ９．該反応が、３０〜４０℃のインキュベーション温度で行われ、該インキュベ ーションが２４〜４８時間継続し、試験培地の該pHが約７．２である請求項１記 載の方法。 １０．複数の異なる生物学的材料を含む試験サンプル中の特定の生物学的材料の 存在を検出するための試験培地であって： 栄養基礎培地； 第一の生物学的材料からの酵素と反応すると、第一の色の水不溶性化合物を形 成することができる第一の色素原基質； 第二の生物学的材料からの酵素と反応すると、該第一の色とは対照的な色の水 不溶性化合物を形成することができる第二の色素原基質； 該試験サンプル中の炭水化物を発酵させる生物学的材料によって生じる発酵の 際に、試験培地の一部を酸性化することができる、炭水化物を含む発酵させ得る 成分；および 該酸性化への反応の際に、該炭水化物を発酵させる生物学的材料の周囲の着色 帯域を構成する第三の色を生じさせるためのpH指示薬 を含む試験培地。 １１．該栄養基礎培地が、固体、ゲル、固体を形成するための溶液、またはそれ に栄養素を吸収させる吸収性基質を含む請求項１０記載の試験培地。 １２．該栄養基礎培地が、寒天、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸塩、ロー カストビーン、キサンチン、グアールおよびゲレンよりなる群から選ばれるゲル 化剤を含む請求項１０記載の試験培地。 １３．該試験培地が、酵素誘導物質を更に含む請求項１０記載の試験培地。 １４．該試験培地が、成長阻害剤を含む請求項１０記載の試験培地。 １５.該第一の色素原基質がβ−ガラクトシドを含み、該第二の色素原基質がβ −グルクロニドを含み、該発酵させ得る成分がソルビトールを含み、該pH指示薬 がフェノールレッドを含む請求項１０記載の試験培地。 １６．該栄養基礎培地がペプトンを含む請求項１０記載の試験培地。 １７．試験サンプル中のE．coli Ｏ１５７、E．coli Ｏ１５７を包含しないその 他のE.coli株、一般大腸菌型、および非大腸菌型腸内細菌科の存在を検出し、定 量的に同定かつ識別する方法であって： 該試験サンプルによってマトリックスまたは固体表面を形成できる試験培地で あって、β−ガラクトシダーゼと反応すると第一の色の水不溶性化合物を形成で きる色素原β−ガラクトシド；β−グルクロニダーゼと反応すると第一の色とは 対照的な色の第二の水不溶性化合物を形成できる色素原β−グルクロニド；ソル ビトールと該試験サンプルのソルビトールを発酵させる成分の作用によって生じ る発酵の際に、培地の一部を酸性化できる、ソルビトールを含む発行させ得る成 分；該酸性化に応答して、該ソルビトールを発酵させる成分の周囲の着色した帯 域を構成する第三の色を生じることができるpH指示薬；および栄養基礎培地を与 える工程； 培地の該一部の酸性化の際に、pH指示薬の色の変化へと導く範囲に該試験培地 のpHを調整する工程； 該試験培地に該試験サンプルを接種する工程； 該試験培地を、β−ガラクトシダーゼ活性を有するが、β−グルクロニダーゼ 活性は有しない一般大腸菌型のコロニー、β−グルクロニダーゼ活性とβ−ガラ クトシダーゼ活性とをともに有するE．coliのコロニー、β−ガラクトシダーゼ 活性を有するが、β−グルクロニダーゼ活性は有しないE．coli Ｏ１５７のコロ ニー、および非大腸菌型腸内細菌科のコロニーのコロニー成長へと導く条件下で 該試験培地をインキュベーションして、該活性に対応する対照的に着色した沈澱 を産生させる工程； 該第一の色を有し、その周囲に視覚的に認識かつ識別できる該第三の着色帯域 を有する、β−ガラクトシダーゼ活性を有するが、β−グルクロニダーゼ活性は 有しない一般大腸菌型のコロニーであり、ソルビトール発酵菌であるコロニーの 存在；第二の色を有し、その周囲に認識かつ識別できる第三の着色帯域を有する 、β−グルクロニダーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性をともに有するE．col iのコロニーであり、ソルビトール発酵菌であるコロニーの存在；該第一の色を 有し、それとともに認識かつ識別できる該第二の色または該第三の着色帯域を有 しない、β−ガラクトシダーゼ活性を有するが、β−グルクロニダーゼ活性は有 しないE．coli Ｏ１５７のコロニーであり、非ソルビトール発酵菌であるコロニ ーの存在；その周囲に認識かつ識別できる該第三の着色帯域を伴うか、もしくは 伴わない該第一および第二の色のいずれをも有しない、β−ガラクトシダーゼ活 性もβ−グルクロニダーゼ活性も有しない、非大腸菌型腸内細菌科であるコロニ ーの存在について該試験培地を検査する工程；および 該コロニーのそれぞれを数える工程 を含む方法。 １８．β−ガラクトシダーゼ活性もβ−グルクロニダーゼ活性も有しない、該非 大腸菌型腸内細菌科のコロニーを、その周囲の認識かつ識別できる該第三の着色 帯域の存在によって別に数え、その周囲に該第三の着色帯域を有する該コロニー が実質的にサルモネラ属のコロニーであり、その周囲に該第三の着色帯域を有し ない該コロニーが実質的にプロテウス属のコロニーである請求項１７記載の方法 。 １９．その周囲に認識かつ識別できる該第三の着色帯域を伴うか、または伴わな い、第四の色の、実質的にシゲラ属、およびサルモネラ属のいくつかの菌株であ るコロニーの存在について該試験培地を更に検査する請求項１８記載の方法。 ２０．該色素原β−ガラクトシダーゼ基質が、６−クロロ−３−インドリルガラ クトシドを含む請求項１７記載の方法。 ２１．該色素原β−グルクロニダーゼ基質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルグルクロニドを含む請求項１７記載の方法。 ２２．該pH指示薬がフェノールレッドであり、培地を約７．２のpHに調整する請 求項１７記載の方法。 ２３．試験培地が、成長阻害剤を更に含む請求項１７記載の方法。 ２４．該阻害剤が、胆汁、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオキシコール酸ナトリ ウムまたはポリグリコールエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１メンバ ーを含む請求項２３記載の方法。 ２５．試験培地が、アクリフラビンおよび抗生物質の少なくとも一つを更に含む 請求項１７記載の方法。 ２６．該試験培地が、反応誘導物質を更に含む請求項１７記載の方法。 ２７．該反応誘導物質が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含 む請求項２６記載の方法。 ２８．該反応が、３０〜４０℃の温度で行われ、該インキュベーションが２４〜 ４８時間継続し、該試験培地のpHが約７．２である請求項２２記載の方法。 ２９．該栄養培地が、固体、ゲルまたは固体を形成するための溶液を含む請求項 １７記載の方法。 ３０．栄養培地が、寒天およびペクチンよりなる群から選ばれるゲル化剤からの 固体支持体を形成する請求項２９記載の方法。 ３１．試験サンプル中のE．coli Ｏ１５７、E．coli Ｏ１５７を包含しないその 他のE．coli株、一般大腸菌型、および非大腸菌型腸内細菌科の存在を検出する ための試験培地であって： 固体、ゲルまたは固体を形成するための溶液を含む、栄養基礎培地； β−ガラクトシダーゼと反応すると、第一の色の水不溶性成分を形成すること ができる、６−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、５−ブロモ−６−ク ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル− β−Ｄ−ガラクトシド、４，６−ジクロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、 ６，７−ジクロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４，６，７−トリクロロ インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトシド、お よびそれらの塩よりなる群から選ばれる色素原β−ガラクトシダーゼ基質； β−グルクロニダーゼと反応すると、該第一の色とは対照的な色の水不溶性成 分を形成することができる、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ −グルクロニド、インドキシル−β−Ｄ−グルクロニド、４−クロロ−３−イン ドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルク ロニドおよびＮ−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、ならびにそ れらの塩よりなる群から選ばれる色素原β−グルクロニダーゼ基質； pH指示薬；および ソルビトール を含む試験培地。 ３２．該栄養基礎培地が、寒天、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸塩、ロー カストビーン、キサンチン、グアールおよびゲレンよりなる群から選ばれるゲル 化剤を含む請求項３１記載の試験培地。 ３３．該試験培地が、酵素誘導物質を更に含む請求項３１記載の試験培地。 ３４．該酵素誘導物質が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含 む請求項３３記載の試験培地。 ３５．該pH指示薬がフェノールレッドである請求項３１記載の試験培地。 ３６．該培地が、胆汁酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオキシコール酸ナト リウム、ポリグリコールエーテル、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれ る阻害剤を含む請求項３１記載の試験培地。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｑ 1/18 1/22 1/22 1/54 1/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ， ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ボントラジャー，ゴードン・エル アメリカ合衆国、インディアナ 46614、 サウス・ベンド、デンスロウ・ドライブ 1947

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複数の異なる生物学的材料を含む試験サンプル中の特定の生物学的材料を定 量的に同定かつ識別するための、該生物学的材料のうち第一のものが、第一の色 素原基質に対する酵素特異性を有し、該生物学的材料のうち第二のものが、第二 の色素原基質に対する酵素特異性を有し、そして該試験サンプル中の該生物学的 材料のうち少なくともいくつかは、炭水化物を発酵させ得る方法であって： 該試験サンプルによってマトリックスまたは固体表面を形成できる、該第一の 色素原基質および該第二の色素原基質（ここで、該第一の色素原基質は、該第一 の生物学的材料からの酵素と反応すると、第一の色の水不溶性化合物を形成する ことができ、該第二の色素原基質は、該第二の生物学的材料からの酵素と反応す ると、該第一の色とは対照的な色の水不溶性化合物を形成することができる）； 該試験サンプルの炭水化物を発酵させる成分によって生じる発酵の際に、培地の 一部を酸性化できる、炭水化物を含む発酵させ得る成分；該酸性化への反応の際 に、該炭水化物を発酵させる成分の周囲の着色した帯域を構成する第三の色を形 成させるpH指示薬;ならびに栄養基礎培地を含む試験培地を与える工程； 培地の該一部の酸性化の際に、pH指示薬の色の変化へと導く範囲に該試験培地 のpHを調整する工程； 該試験培地に該試験サンプルを接種する工程； 該試験培地を、該生物学的材料のコロニーの成長、または活性へと導く条件下 でインキュベーションして、それによって該対照的な色の水不溶性化合物を産生 する工程； 該第一の色を有し、その周囲に認識かつ識別できる該第三の着色帯域を有する 、該第一の生物学的材料のコロニーであり、炭水化物発酵菌であるコロニーの存 在；該第一の色とは対照的な第二の色を有し、その周囲に認識かつ識別できる第 三の着色帯域を有する、該第二の生物学的材料のコロニーであり、炭水化物発酵 菌であるようなコロニーの存在；および該第一の色を有し、それによって認識か つ識別できる該第二の色または該第三の着色帯域を有しない、第三の生物学的材 料のコロニーであるようなコロニーの存在について該試験培地を検査する工程； および 該コロニーのそれぞれを数える工程 を含む方法。 ２．該第三の着色帯域を伴うか、もしくは伴わない該第一および第二の色以外の 色を有するか、または無色である、少なくとも第四の生物学的材料のコロニーで あるようなコロニーの存在について該試験培地を更に検査する工程を含む請求項 １記載の方法。 ３．該第三の着色帯域を伴うか、もしくは伴わない該第一および第二の色のいず れをも有しない、少なくとも第四の生物学的材料のコロニーであるようなコロニ ーの存在；および該第三の着色帯域を伴うか、または伴わない第四の色を有する 、少なくとも第五の生物学的材料のコロニーであるようなコロニーの存在につい て該試験培地を更に検査する工程を含む請求項１記載の方法。 ４．該第一の色素原基質が６−クロロ−３−インドリルガラクトシダーゼを含み 、該第二の色素原基質が５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニダ ーゼを含み、該炭水化物がソルビトールを含み、そして該pH指示薬がフェノール レッドを含む請求項１記載の方法。 ５．試験培地が、少なくとも一つの成長阻害剤を更に含む請求項１記載の方法。 ６．該少なくとも一つの成長阻害剤が、胆汁、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオ キシコール酸ナトリウムまたはポリグリコールエーテルを含む請求項５記載の方 法。 ７．試験培地が、アクリフラビンおよび抗生物質の少なくとも一つを更に含む請 求項１記載の方法。 ８．試験培地が、反応誘導物質を更に含む請求項１記載の方法。 ９．該反応が、３０〜４０℃のインキュベーション温度で行われ、該インキュベ ーションが２４〜４８時間継続し、試験培地の該pHが約７．２である請求項１記 載の方法。 １０．複数の異なる生物学的材料を含む試験サンプル中の特定の生物学的材料の 存在を検出するための試験培地であって： 栄養基礎培地； 第一の生物学的材料からの酵素と反応すると、第一の色の水不溶性化合物を形 成することができる第一の色素原基質； 第二の生物学的材料からの酵素と反応すると、該第一の色とは対照的な色の水 不溶性化合物を形成することができる第二の色素原基質； 該試験サンプル中の炭水化物を発酵させる生物学的材料によって生じる発酵の 際に、試験培地の一部を酸性化することができる、炭水化物を含む発酵させ得る 成分；および 該酸性化への反応の際に、該炭水化物を発酵させる生物学的材料の周囲の着色 帯域を構成する第三の色を生じさせるためのpH指示薬 を含む試験培地。 １１．該栄養基礎培地が、固体、ゲル、固体を形成するための溶液、またはそれ に栄養素を吸収させる吸収性基質を含む請求項１０記載の試験培地。 １２．該栄養基礎培地が、寒天、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸塩、ロー カストビーン、キサンチン、グアールおよびゲレンよりなる群から選ばれるゲル 化剤を含む請求項１０記載の試験培地。 １３．該試験培地が、酵素誘導物質を更に含む請求項１０記載の試験培地。 １４．該試験培地が、成長阻害剤を含む請求項１０記載の試験培地。 １５．該第一の色素原基質がβ−ガラクトシドを含み、該第二の色素原基質がβ −グルクロニドを含み、該発酵させ得る成分がソルビトールを含み、該pH指示薬 がフェノールレッドを含む請求項１０記載の試験培地。 １６．該栄養基礎培地がペプトンを含む請求項１０記載の試験培地。 １７．試験サンプル中のE．coli Ｏ１５７、E．coli Ｏ１５７を包含しないその 他のE.coli株、一般大腸菌型、および非大腸菌型腸内細菌科の存在を検出し、定 量的に同定かつ識別する方法であって： 該試験サンプルによってマトリックスまたは固体表面を形成できる試験培地で あって、β−ガラクトシダーゼと反応すると第一の色の水不溶性化合物を形成で きる色素原β−ガラクトシド；β−グルクロニダーゼと反応すると第一の色とは 対照的な色の第二の水不溶性化合物を形成できる色素原β−グルクロニド；ソル ビトールと該試験サンプルのソルビトールを発酵させる成分の作用によって生じ る発酵の際に、培地の一部を酸性化できる、ソルビトールを含む発行させ得る成 分；該酸性化に応答して、該ソルビトールを発酵させる成分の周囲の着色した帯 域を構成する第三の色を生じることができるpH指示薬；および栄養基礎培地を与 える工程； 培地の該一部の酸性化の際に、pH指示薬の色の変化へと導く範囲に該試験培地 のpHを調整する工程； 該試験培地に該試験サンプルを接種する工程； 該試験培地を、β−ガラクトシダーゼ活性を有するが、β−グルクロニダーゼ 活性は有しない一般大腸菌型のコロニー、β−グルクロニダーゼ活性とβ−ガラ クトシダーゼ活性とをともに有するE．coliのコロニー、β−ガラクトシダーゼ 活性を有するが、β−グルクロニダーゼ活性は有しないE．coli Ｏ１５７のコロ ニー、および非大腸菌型腸内細菌科のコロニーのコロニー成長へと導く条件下で 該試験培地をインキュベーションして、該活性に対応する対照的に着色した沈澱 を産生させる工程； 該第一の色を有し、その周囲に視覚的に認識かつ識別できる該第三の着色帯域 を有する、β−ガラクトシダーゼ活性を有するが、β−グルクロニダーゼ活性は 有しない一般大腸菌型のコロニーであり、ソルビトール発酵菌であるコロニーの 存在;第二の色を有し、その周囲に認識かつ識別できる第三の着色帯域を有する 、β−グルクロニダーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性をともに有するE．col iのコロニーであり、ソルビトール発酵菌であるコロニーの存在；該第一の色を 有し、それとともに認識かつ識別できる該第二の色または該第三の着色帯域を有 しない、β−ガラクトシダーゼ活性を有するが、β−グルクロニダーゼ活性は有 しないE．coli Ｏ１５７のコロニーであり、非ソルビトール発酵菌であるコロニ ーの存在；その周囲に認識かつ識別できる該第三の着色帯域を伴うか、もしくは 伴わない該第一および第二の色のいずれをも有しない、β−ガラクトシダーゼ活 性もβ−グルクロニダーゼ活性も有しない、非大腸菌型腸内細菌科であるコロニ ーの存在について該試験培地を検査する工程；および 該コロニーのそれぞれを数える工程 を含む方法。 １８．β−ガラクトシダーゼ活性もβ−グルクロニダーゼ活性も有しない、該非 大腸菌型腸内細菌科のコロニーを、その周囲の認識かつ識別できる該第三の着色 帯域の存在によって別に数え、その周囲に該第三の着色帯域を有する該コロニー が実質的にサルモネラ属のコロニーであり、その周囲に該第三の着色帯域を有し ない該コロニーが実質的にプロテウス属のコロニーである請求項１７記載の方法 。 １９．その周囲に認識かつ識別できる該第三の着色帯域を伴うか、または伴わな い、第四の色の、実質的にシゲラ属、およびサルモネラ属のいくつかの菌株であ るコロニーの存在について該試験培地を更に検査する請求項１８記載の方法。 ２０．該色素原β−ガラクトシダーゼ基質が、６−クロロ−３−インドリルガラ クトシダーゼを含む請求項１７記載の方法。 ２１．該色素原β−グルクロニダーゼ基質が、５−ブロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルグルクロニダーゼを含む請求項１７記載の方法。 ２２．該pH指示薬がフェノールレッドであり、培地を約７．２のpHに調整する請 求項１７記載の方法。 ２３．試験培地が、成長阻害剤を更に含む請求項１７記載の方法。 ２４．該阻害剤が、胆汁、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオキシコール酸ナトリ ウムまたはポリグリコールエーテルよりなる群から選ばれる少なくとも１メンバ ーを含む請求項２３記載の方法。 ２５．試験培地が、アクリフラビンおよび抗生物質の少なくとも一つを更に含む 請求項１７記載の方法。 ２６．該試験培地が、反応誘導物質を更に含む請求項１７記載の方法。 ２７．該反応誘導物質が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含 む請求項２６記載の方法。 ２８．該反応が、３０〜４０℃の温度で行われ、該インキュベーションが２４〜 ４８時間継続し、該試験培地のpHが約７．２である請求項２２記載の方法。 ２９．該栄養培地が、固体、ゲルまたは固体を形成するための溶液を含む請求項 １７記載の方法。 ３０．栄養培地が、寒天およびペクチンよりなる群から選ばれるゲル化剤からの 固体支持体を形成する請求項２９記載の方法。 ３１．試験サンプル中のE．coli Ｏ１５７、E．coli Ｏ１５７を包含しないそ の他のE．coli株、一般大腸菌型、および非大腸菌型腸内細菌科の存在を検出す るための試験培地であって： 固体、ゲルまたは固体を形成するための溶液を含む、栄養基礎培地； β−ガラクトシダーゼと反応すると、第一の色の水不溶性成分を形成すること ができる、６−クロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、５−ブロモ−６−ク ロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、６−クロロ−３−インドリル− β−Ｄ−ガラクトシド、４，６−ジクロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、 ６，７−ジクロロインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、４，６，７−トリクロロ インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド、２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトシド、お よびそれらの塩よりなる群から選ばれる色素原β−ガラクトシダーゼ基質； β−グルクロニダーゼと反応すると、該第一の色とは対照的な色の水不溶性成 分を形成することができる、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ −グルクロニド、インドキシル−β−Ｄ−グルクロニド、４−クロロ−３−イン ドリル−β−Ｄ−グルクロニド、５−ブロモ−３−インドリル−β−Ｄ−グルク ロニドおよびＮ−メチル−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド、ならびにそ れらの塩よりなる群から選ばれる色素原β−グルクロニダーゼ基質； pH指示薬；および ソルビトール を含む試験培地。 ３２．該栄養基礎培地が、寒天、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸塩、ロー カストビーン、キサンチン、グアールおよびゲレンよりなる群から選ばれるゲル 化剤を含む請求項３１記載の試験培地。 ３３．該試験培地が、酵素誘導物質を更に含む請求項３１記載の試験培地。 ３４．該酵素誘導物質が、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含 む請求項３３記載の試験培地。 ３５．該pH指示薬がフェノールレッドである請求項３１記載の試験培地。 ３６．該培地が、胆汁酸塩、ラウリル硫酸ナトリウム、デスオキシコール酸ナト リウム、ポリグリコールエーテル、およびそれらの混合物よりなる群から選ばれ る阻害剤を含む請求項３１記載の試験培地。