DE60028201T2

DE60028201T2 - Überwachung von genexpression

Info

Publication number: DE60028201T2
Application number: DE60028201T
Authority: DE
Inventors: Eliora Z. Ron; Judith Rishpon; Israel Biran; Reuven Babai
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 1999-04-01
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2007-03-08
Anticipated expiration: 2020-04-01
Also published as: WO2000060110A1; DE60028201D1; EP1180163A4; US6391549B1; EP1180163B1; EP1180163A1; AU3574000A; ATE327343T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, ein System und einen Kit zur Verwendung bei der Überwachung von DNA-Expressionen in Zellen und zum Nachweis der Anwesenheit verschiedener Parameter oder Bakterienzellen in einem Medium.
STAND DER TECHNIK
Nachstehend befindet sich eine Liste von Literaturnachweisen, die einem besseren Verständnis des Hintergrunds der vorliegenden Erfindung dienen sollen:
LITERATUR

Groskreutz, D. and Schenborn, E. T., Reporter systems. In: Methods in molecular biology, Bd. 63: Recombinant protein protocols: detection and isolation. R. S. Tuan (Hg.), S. 173–218, Humana Press Inc., Totowa, NJ.
Jain, V. K. and Magrath, I. T., A chemiluminescent assay for quantitation of β-galactosidase in the fentogram range: application to quantitation of β-galactosidase in lacZ-transfected cells. Anal. Biochem., 199: 119–124 (1991).
Kulys, J., Razumas, V. and Malinauskas, A., Electrochemical oxidation of catechol and p-aminophenol esters in the prsence of hydrolase, J. Electroanal. Chem. [Bioelectrochem. Bioenerg. 7] 116: 11–24 (1980).
Masson, M., Liu, Z., Haruyama, T., Kobatake, E., Ikariyama, Y and Aizawa, M., Immunosensing with amperometric detection, using galactosidase as label and p-aminophenyl-β-D-galactopyranoside as substrate. Anal. Chim. Acta 304: 353–359 (1995).
Miler, J. H., A short course in bacterial genetics, S. 72–74, Cold Spring Harbor Press., Cold Spring Harbor, NY. (1992).
Rosen, I. und Rishpon, J., Alkaline phosphatase as a label for heterogeneous immunoelectrochemical sensor, J. Electroanal. Chem., 258: 27–39 (1989).
Silhavy, T. J. und Beckwith, J. R., Uses of lac fusions for the study of biological problems, Microbiol. Rev. 49: 398–418 (1985).
US-Patent No. 5,149,629.
Weichart, D., Lang, R., Henneberg, N., & Hengge-Aronis, R., Identification and characterization of stationary phase-inducible genes in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 10: 407–420 (1993).
Yim, H. H. und Villarejo, M., OsmY, a new hyperosmotically inducible gene, encodes a periplasmic protein in Escherichia coli., J. Bacteriol. 174: 3637–3644 (1992).

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Reportergen-Systeme werden in Genexpressionsstudien und für die Biosensorentwicklung verwendet. Verschiedene analytische Verfahren sind für die Überwachung des Proteins, das von einem Reportergen exprimiert wird, verfügbar. Diese Verfahren umfassen Photometrie, Radiometrie, Fluoreszenz, Kolorimetrie und Immuntests (Groskreutz, D. et al., 1997). Ebenso wurde ein lichtemittierendes Gen als Reportergen verwendet, und mehrere Techniken sind entwickelt worden, um die Lichtemission der Zellen zu überwachen (Legocki, R. P. et al., 1993).
Die vorwiegend verwendeten Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung der Reportergenprodukte in Zellkulturen beinhalten wiederholte Probenahmen der Kultur und einen Test für die Enzymaktivität, der häufig einen zusätzlichen Schritt der Lyse oder Permeabilisierung der Zelle umfasst und unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden muss. Diese Arbeitsabläufe stören die Kultur, sind gelegentlich zeitaufwändig und liefern die Ergebnisse erst nach mehreren Stunden.
Das lacZ-Gen, welches das Escherichia coli-Enzym β-Galactosidase codiert, ist eines der meist verwendeten Reportergene (Silhavy & Beckwith, 1985) und ist in kolorimetrischen Tests (Miler, 1992) oder in der Fluorometrie oder Chemiluminometrie (Jain & Magrath, 1991) verwendet worden. Diese Verfahren umfassen die Permeabilisierung der Zellen, gefolgt von einem mehrstufigen Arbeitsablauf.
Die Enzymaktivität der β-Galactosidase kann elektrochemisch durch die Verwendung des Substrats p-Aminophenyl-β-D-Galactopyranosid (PAPG) bestimmt werden. Das Produkt der enzymatischen Reaktion, p-Aminophenol (PAP), wird an einer Elektrode oxidiert.
Von mehreren elektroanalytischen Verfahren zum Nachweis von PAP ist berichtet worden (Kulys & Malinauskas, 1980; Masson et al., 1995). Ebenso wurde ein elektrochemischer Immuntest beschrieben, bei dem ein konstantes Potential an der Elektrode angelegt wird, und der durch die Oxidation von PAP erzeugte Strom gemessen wird (US-Patent Nr. 5,149,629).
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden neuartige Mittel für die Überwachung der Genexpression in Zellen bereitgestellt. Wie nachstehend ausführlich beschrieben, kann die Erfindung verwendet werden für die Bestimmung von Zellparametern in einer Zellkultur, für die zellbiologische Forschung, für die Bestimmung von Parametern oder Bedingungen einer Probe usw. sowie für die Biosensorentwicklung. Gemäß einem Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Wirtszellparameters, umfassend:

(a) Transfektion der Zelle mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz, welche in Korrelation mit dem Parameter induzierbar ist, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist;
(b) Platzierung der transfizierten Zellen in einer elektrochemischen Zelle; und
(c) Messung der Höhe des elektrischen Signals, wobei ein Signal über dem Schwellenwert die Anwesenheit des Parameters anzeigt.

Ferner liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Mediumparameters, umfassend:

(a) Bereitstellen von Zellen, welche mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz, welche in Korrelation mit dem Parameter induzierbar ist, transfiziert sind, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist;
(b) Platzierung der Zellen in dem Medium oder einer Probe davon; und
(c) Bereitstellen einer elektrochemischen Zelle und Messung der Höhe des elektrischen Signals, wobei die Höhe des Signals mit der Höhe des Parameters korreliert.

Des weiteren liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Überwachung eines Wachstumsstatusparameters, welcher charakteristisch ist für ein definiertes Wachstum- oder eine definierte Zellzyklusphase oder eine definierte Kulturphase einer Zellkultur, umfassend:

(a) Bereitstellen einer Zellkultur, in der zumindest einige der Zellen mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz, welche in Korrelation mit dem Wachstumsstatusparameter induzierbar ist, transfiziert sind, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist;
(b) in einer elektrochemischen Zelle kontinuierliches oder periodisches Messen des elektrischen Signals, welches indikativ für den Wachstumsstatusparameter ist.

In einem weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein System zur Überwachung der Expression eines Zielpromotors, umfassend:

(a) eine elektrochemische Zelle
(b) Zellen, welche mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle des Zielpromotors transfiziert sind, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist; und
(c) eine Apparatur zur Messung des elektrischen Signals.

In einem noch weiteren Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ferner einen Kit zur Verwendung für den Nachweis eines Wirtszellparameters, eines Mediumparameters oder eines Indikatorparameters des Stadiums des Zell- oder Zellkulturwachstums, umfassend:

(a) Wirtszellen, welche mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz, welche in Korrelation mit dem Parameter induzierbar ist, transfiziert sind, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist;
(b) eine elektrochemische Zelle, wobei die elektrochemische Zelle eingerichtet ist, um die Wirtszellen aufzunehmen und zu halten sowie um die elektrochemische Messung durchzuführen.

In einem anderen Aspekt der Erfindung (nachstehend der „Bakteriophagen-Aspekt") wird ein Verfahren geliefert zur Bestimmung der Anwesenheit von Bakterienzellen in dem Medium. Gemäß diesem Aspekt wird die exprimierbare DNA-Sequenz in einem Bakteriophagen stromabwärts an einen Promotor fusioniert. Wenn der Bakteriophage frei ist, wird der Promotor nicht induziert, und daher wird die exprimierbare DNA-Sequenz in dem freien Bakteriophagen nicht exprimiert. Nach Infektion der Wirtsbakterien wird die exprimierbare DNA-Sequenz induziert und ein elektrisches Signal wird nachgewiesen, das die Anwesenheit der Bakterien in dem Medium anzeigt. Die Bakteriophagen sind hoch spezifisch für eine bestimmte Bakteriengruppe oder einen bestimmten Bakterienstamm, und daher wird die DNA-Sequenz nur exprimiert, wenn die in dem Medium anwesenden Bakterienzellen von der spezifischen Gruppe oder dem spezifischen Stamm sind, den der bei dem Verfahren verwendete Bakteriophage infizieren kann.
Daher wird in einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitgestellt zum Nachweis der Anwesenheit von spezifischen Bakterienzellen in einem Medium, umfassend:

(a) Bereitstellen von Bakteriophagen, welche in der Lage sind, eine Zelle einer spezifischen Bakteriengruppe oder eines spezifischen Bakterienstammes zu infizieren, wobei die Bakteriophagen eine exprimierbare DNA-Sequenz unter der Kontrolle einer Promotorsequenz enthalten, wobei die Promotorsequenz durch die Infektion von Zellen der Bakteriengruppe oder des Bakterienstammes durch den Bakteriophagen induzierbar ist, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist;
(b) Platzierung der Bakteriophagen in dem Medium oder einer Probe davon unter Bedingungen, welche die Infektion der Bakterienzellen durch die Bakteriophagen erlauben; und
(c) Bereitstellen einer elektrochemischen Zelle und Messung der Höhe des elektrischen Signals, wobei ein Signal über einem Schwellenwert die Anwesenheit von Zellen der spezifischen Bakteriengruppe oder des spezifischen Bakterienstammes in dem Medium anzeigt.

In einer zweiten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung kann das Nachweisverfahren quantitativ verwendet werden, um die Anzahl der Bakterienzellen einer spezifischen Bakteriengruppe oder eines spezifischen Bakterienstammes zu bestimmen. Die Höhe des gemessenen elektrischen Signals korreliert direkt mit der Anzahl der Zellen einer spezifischen Bakteriengruppe oder eines spezifischen Bakterienstammes, den der Bakteriophage infizieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert des weiteren einen Kit zur Verwendung für den Nachweis von Zellen einer spezifischen Bakteriengruppe oder eines spezifischen Bakterienstammes in einem Medium, umfassend:

(a) Bakteriophagen, welche eine exprimierbare DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer Promotorsequenz enthalten, wobei die Promotorsequenz durch die Infektion von Zellen der spezifischen Gruppe oder des spezifischen Stammes durch die Bakteriophagen induzierbar ist, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist;
(b) eine elektrochemische Zelle, wobei die elektrochemische Zelle eingerichtet ist, um die Bakteriophagen und Bakterienzellen aufzunehmen und zu halten sowie um die elektrochemische Messung durchzuführen.

GLOSSAR
Nachstehend findet sich eine Erklärung von einigen vorstehend und nachstehend in der Beschreibund und den Ansprüchen verwendeten Ausdrücken.
Parameter – bezeichnet, angewandt auf eine Zelle, eine bestimmte Eigenschaft von Interesse innerhalb der Zelle, die eine bestimmte Phase des Zellzyklus, eine Antwort der Zelle auf Stimulantien des extrazellulären Mediums oder eine Änderung in der Expression eines Gens einschließen kann (zu solchen Stimulantien können ein bestimmter Umweltschadstoff, ein toxischer chemischer Nährstoff, das Vorliegen eines Stoffs, der die Zellaktivität oder das Zellwachstum reguliert, die Herstellung von bestimmten Stoffen innerhalb der Zelle usw. gehören). Bezeichnet, angewandt auf ein Medium, das Vorhandensein von Stoffen in dem Medium oder eine Bedingung (z.B. Temperatur, Ionenstärke usw.), die zelluläre Parameter in einer Wirtszelle beeinflussen. Bezeichnet, gemäß dem Bakteriophagen-Aspekt der Erfindung, die Anwesenheit von Bakterienzellen einer spezifischen Gruppe oder eines spezifischen Stammes in dem getesteten Medium, deren Anwesenheit Parameter in dem Bakteriophagen beeinflussen.
Wirtszelle – eine Zelle, die transfiziert ist mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt. Verschiedene Arten von Wirtszellen können, wie nachstehend beschrieben, verwendet werden.
Enzymatisch aktives Produkt – ein Produkt der Genexpression, das eine Enzymaktivität ausüben kann. Solch ein Produkt kann per se ein Enzym sein, das normalerweise in der Zelle aktiv ist, oder kann ein Enzym sein, das ein Signalpeptid oder -protein besitzt (z.B. ein Expressionsprodukt einer exprimierbaren DNA-Sequenz, die durch die Fusion einer Sequenz, die das Enzym codiert, an eine Sequenz, die das Signalpeptid oder -protein codiert, erhalten wurde).
Elektrochemische Messung – eine Messung, die unter Verwendung von Elektroden in einer Lösung, typischerweise in einer elektrochemischen Zelle, durchgeführt wird. Die Messung kann durchgeführt werden, zum Beispiel durch Chronoamperometrie, Chronopotentiometrie, zyklische Voltometrie, Chronocoulometrie oder Rechteckvoltammetrie. Ein Signal, das in solch einer Messung nachweisbar ist, unterscheidet sich in solch einer elektrochemischen Messung von einer Kontrolle.
Schwellenwert – ein Wert des gemessenen elektrischen Signals unter Kontrollbedingungen, z.B. in Wirtszellen, die nicht den Parameter enthalten, der den in den Zellen anwesenden Promotor induziert, oder in Medium, das nicht den Stoff oder den Parameter enthält, der den Promotor in den Zellen induzieren kann.
Demgemäß wird beim Bakteriophagen-Aspekt der Erfindung der Schwellenwert in einem Medium, das nicht die Bakterienzellen enthält, die der Bakteriophage infizieren kann, bestimmt.
Medium – jedes Medium, welches eine Flüssigkeit, ein Feststoff oder ein Gas sein kann, in dem eine bestimmte Qualität gemessen werden soll. Solch eine Qualität kann das Vorkommen eines bestimmten Stoffs oder von Zellen in dem Medium, eine Temperatur des Mediums usw. sein. Wenn das Medium eine wässrige Flüssigkeit ist, kann es als solches bei den Wirtszellen angewendet werden. Wenn das Medium ein Gas oder ein Feststoff ist, muss es zuerst mit einem flüssigen Medium gemischt werden, das dann bei den Wirtszellen angewendet wird. Alternativ kann ein Gasmedium durch ein flüssiges Medium, das eine Kultur der Wirtszellen enthält, hindurchgeperlt werden. In ähnlicher Weise kann ein festes Substrat wie Erde oder Nahrungsmittel einem Medium, das eine Kultur der getesteten Zellen enthält, beigemengt werden.
Korrelation/korreliert – bezieht sich auf die Korrelation zwischen dem gemessenen Signal und dem Parameter, der bestimmt werden soll. Solch eine Korrelation kann offenbar werden, durch entweder ein proportionales Ansteigen des Signals, linear zur Menge des Parameters, oder eine proportionale Abnahme des Signals, linear zu dem Parameter.
Wachstumsstatus – ein Begriff, der sich besonders auf eine Kultur von Zellen bezieht. Ein Wachstumsstatus kann eine algorithmische Wachstumsphase einer Kultur, eine stationäre Phase usw. sein.
Bestimmung/bestimmen – schließt eine qualitative Bestimmung der Anwesenheit oder der Nichtanwesenheit eines bestimmten Parameters oder einer bestimmten Bedingung sowie eine qualitative Bestimmung der Menge eines solchen Parameters oder einer solchen Bedingung ein. Der Parameter, der bestimmt wird, kann zum Beispiel das Vorkommen des bestimmten Stoffs in dem Medium oder der Zelle sein sowie die quantitative Bestimmung von dessen Menge. Gemäß dem Bakteriophagen-Aspekt ermöglicht es die Erfindung, die Anwesenheit von Bakterienzellen einer spezifischen Gruppe oder eines spezifischen Stammes in dem Medium nachzuweisen genauso wie die Anzahl der nachgewiesenen Bakterienzellen in dem Medium zu bestimmen.
Bedingungen, die die Infektion von Bakterienzellen durch den Bakteriophagen ermöglichen – diese hängen ab von dem verwendeten Bakteriophagen-Typ sowie von der Art der Bakterienzellen, die infiziert und nachgewiesen werden sollen. Im Allgemeinen ist die Infektion von Bakterienzellen möglich unter Bedingungen, die das Wachstum der Bakterien erlauben. Um schnell Ergebnisse zu erzielen, werden in einigen Fällen die getestete Probe und der Bakteriophage in reichhaltigem Wachstumsmedium (z.B. Luria-Brühe oder Nährbrühe) kultiviert, und das Gemisch wird bei 30°–37°C mit Belüftung inkubiert. Die in jedem Fall zu verwendenden Bedingungen können leicht von einer erfahrenen Fachkraft bestimmt werden.
Spezifische Bakterienzellen – Zellen einer bestimmten Gruppe oder eines bestimmten Stammes. Die Spezifität wird bestimmt durch die Verwendung von Bakteriophagen, die in der Lage sind, die spezifischen Bakterienzellen zu infizieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
Um die Erfindung besser zu verstehen, wird gelegentlich auf die anhängenden Abbildungen hingewiesen; in denen
1 eine schematische Darstellung eines computerisierten elektrochemischen Systems gemäß der Erfindung.
2 zeigt die on-line-Überwachung von β-Galactosidase, die in verschiedenen Konzentrationen dem Medium zugegeben wurde: (1) 100 U(Einheiten)/ml; 50 U(Einheiten)/ml; (3) 25 U(Einheiten)/ml; (4) 12 U(Einheiten)/ml, (5) 6 U(Einheiten)/ml; (6) keine Enzym wurde zugegeben.
3 zeigt die Überwachung der β-Galactosidaseaktivität von E. coli-Kulturen, die mit zunehmenden Konzentrationen von IPTG behandelt wurden: (a) kein IPTG; (b) 0,5 μM IPTG; (c) 5 μM IPTG; (d) 50 μM IPTG.
4 zeigt die amperometrische on-line-Überwachung der Expression der osmY – lacZ-Genfusion in (A) E. coli-Stamm RO151 (rpoS⁺) und (B) rpoS-mutierter E. coli RH99 (rpoS359::Tn10). Die Messung der optische Dichte wird gezeigt als Rechtecke und die amperometrische Überwachung als kontinuierliche Linie ohne Symbole.
5 zeigt das unter verschiedenen Cadmium-Konzentrationen mit einem Biosensor erhaltene Stromsignal.
6 zeigt die Ergebnisse der Cadmium-Konzentrationsbestimmung in Bodenproben, die Cadmium (3,8 ppm) enthalten, im Vergleich mit Kontrollproben aus reiner Erde: (A) zeigt das Ergebnis, wie es auf dem Computerbildschirm zu sehen ist; (B) zeigt die bearbeiteten Daten.
7 zeigt das, unter verschiedenen Quecksilber-Konzentrationen in Meerwasserproben mit einem Biosensor erhaltene Stromsignal.
8 zeigt die Überwachung der β-Galactosidaseaktivität in Hefezellen, die das lacZ-Reportergen tragen. Die Ergebnisse zeigen die β-Galactosidaseaktivität in Hefezellen, die ein Plasmid für eine positive (hohe β-Galactosidaseaktivität) und eine negative (niedrige β-Galactosidaseaktivität) Kontrolle tragen und Teil des Zwei-Hybrid-Systems sind.
9 zeigt die Überwachung der β-Galactosidaseaktivität in Gewebekulturen, die mit verschiedenen MOI eines rekombinanten MVA-Virus, das das lacZ-Reportergen exprimiert, infiziert sind.
10 zeigt die on-line-Überwachung der Alkalischen Phosphataseaktivität in rekombinanten E. coli-Kulturen, die ein Plasmid mit dem phoA-Reportergen unter dem Promotor das lacZ-Gens tragen. Die Kulturen wurden mit zunehmenden Konzentrationen von IPTG behandelt: (a) kein IPTG; (b) 1 mM IPTG; (c) 0,1 mM IPTG. Und die on-line-Überwachung der Alkalischen Phosphataseexpression wurde überwacht.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein neuer Ganzzell-Test bereitgestellt. Anders als in den Verfahren nach dem Stand der Technik ist es gemäß der Erfindung nicht erforderlich, die Integrität der in dem Test verwendeten Zellen vor der Messung zu zerstören, und vor der Ausführung des Tests sind keine vorbereitende Schritte nötig. Stattdessen wird erfindungsgemäß eine Zellprobe in einer elektrochemischen Zelle platziert, oder alternativ wird die elektrochemische Zelle in dem Kulturmedium selbst gebildet. Die Art des erfindungsgemäßen Ganzzell-Tests erlaubt es, die gewünschten Messungen in dem Zellmedium, in dem die Zellen regulär wachsen, durchzuführen, eher als in einem speziell angepassten Puffer, der in Verfahren nach dem Stand der Technik erforderlich ist.
Da bis zum Erhalt der Ergebnisse eine sehr kurze Inkubationszeit erforderlich ist, ist der Test gemäß der Erfindung auch sehr schnell.
Der erfindungsgemäße Test ist nützlich, um die Aktivität von nahezu jedem Typ von induzierbarem Promotor unter Verwendung einer Vielfalt von exprimierbaren DNA-Sequenzen als „Reportergene" zu bestimmen.
Gemäß der Erfindung werden Wirtszellen verwendet, die transfiziert sind mit einem DNA-Konstrukt, das die exprimierbare DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle eines Promotors enthält.
Gemäß dem Bakteriophagen-Aspekt der Erfindung enthält der Bakteriophage die exprimierbare DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle eines Bakteriophagen-Promotor, der nach der Infektion der Bakterienzelle durch den Bakteriophagen induzierbar ist. Der Bakteriophage kann spezifisch sein für eine Gruppe, z.B. Bakteriophagen, die in der Lage sind, Zellen jeglichen Typs von Salmonella zu infizieren, oder spezifisch sein für einen oder mehrere Stämme, z.B. solche, die in der Lage sind, nur S. enteritids oder S. typhi oder nur diese beiden Stämme und keinen anderen Salmonella-Stamm zu infizieren.
Die Wirtszelle kann jede Zelle sein, in der die exprimierbare DNA-Sequenz exprimiert werden kann. Wirtszellen können prokaryontische und eukaryontische Zellen sein, einschließlich zum Beispiel Bakterienzellen, Mykoplasma, Hefezellen, Protozoa, Insektenzellen, Säugerzellen, besonders menschliche Zellen usw..
Die Wirtszellen können in Suspension oder immobilisiert sein. Die Zellen können auch an ein Substrat fixiert sein, wie zum Beispiel verschiedene Gele, verschiedene feste Matrizen, die Elektrode selbst usw.. Die Zellen können frische Zellen sein oder können Zellen sein, die eingefroren und aufgetaut worden sind.
Die Transfektion der Zellen kann erreicht werden durch jede bekannte Transfektionstechnik. Solche Techniken können die Verwendung von viralen Vektoren wie zum Beispiel das Baculovirus-System für die Transfektion von Insektenzellen, das Adenovirus-System für die Transfektion von menschlichen Zellen, das Lambda-Bakterien-System für die Transfektion von Bakterien usw. umfassen. Zusätzlich kann eine Vielfalt von Transfektionstechniken, die die Verwendung von Plasmiden einbeziehen, für die Transfektion der Wirtszellen verwendet werden. Ein typisches Verfahren der Transfektion von Säugerzellen können die Calcium-Chlorid-Technik, ionophoretische Transfektionstechniken usw. sein (Sambrook, J., Fritsch, E. F., und Maniatis, T., Molecular cloning; a laboratory manual (zweite Auflage) Cold Spring Press. Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)). Es ist anerkannt, dass die Erfindung nicht beschränkt auf eine besondere Wirtszelle oder auf die Art des verwendeten Transfektionsverfahrens ist. Der Fachmann sollte keine Schwierigkeiten haben, eine bestimmte Wirtszelle für die Verwendung in einem speziellen Test auszusuchen und in jedem Fall die am besten geeignete Transfektionstechnik auszuwählen.
Gemäß dem Bakteriophagen-Aspekt der Erfindung kann die Transposition der exprimierbaren DNA-Sequenz und ihre Fusion stromabwärts an einen der Bakteriophagen-Promotoren mittels jedem auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden. Üblicherweise werden Bakterien, die ein an eine exprimierbare DNA-Sequenz fusioniertes Transposon tragen, mit dem Bakteriophagen infiziert und inkubiert, um die Lyse zu erzielen. Das Lysat wird dann auf einer mit Agar überlagerten Bakterienplatte und in einem Medium, das einen Indikator für die Anwesenheit der exprimierbaren DNA-Sequenz enthält, ausplattiert.
Der Promotor, der zu dem DNA-Konstrukt, mit dem die Zelle transfiziert wird, gehört, kann ausgewählt werden aus einer großen Vielzahl von bekannten Promotoren. Die Anforderung an den Promotor ist, dass er in der Wirtszelle nach dem Auftreten des Parameters, der bestimmt werden soll, induziert wird. Zum Beispiel kann der Promotor solch einer sein, der zu einer bestimmten Phase des Zellzyklus induzierbar ist, er kann in der Anwesenheit eines bestimmten Stoffs in der Zelle induzierbar sein, z.B. eines Nährstoffs oder eines regulatorischen Stoffs, eine externe toxische Chemikalie oder ein Schadstoff sein, er kann ein Promotor sein, der durch externe Kulturbedingungen, z.B. wenn die Kultur ein stationäres Wachstumsstadium erreicht, oder durch einen externen Faktor wie zum Beispiel eine toxische Chemikalie, ein Schadstoff induziert wird, usw..
Gemäß dem Bakteriophagen-Aspekt der Erfindung kann der Promotor irgendein Bakteriophagen-Promotor sein, der in dem freien Bakteriophagen nicht induzierbar ist, aber nach der Transfektion der Bakterienzelle durch den Bakteriophagen induzierbar ist.
Der verwendete Promotor kann ein autologer Promotor sein, und zwar ein Promotor, der natürlicherweise die Expression von der exprimierbaren DNA-Sequenz kontrolliert, oder kann ein heterologer Promotor sein, der an die exprimierbare DNA-Sequenz fusioniert wurde.
Die exprimierbare DNA-Sequenz codiert ein katalytisch aktives Expressionsprodukt. Gemäß einer Ausführungsform ist solch ein Expressionsprodukt ein Enzym, das eine Reaktion katalysiert, die zu einem Produkt führt, das permeabel ist oder das durch die Zellmembran transportiert werden kann und das sich dann an einer der Elektroden der elektrochemischen Zelle einer Redox-Reaktion unterzieht. Ein Beispiel für solch ein Enzym ist β-Galactosidase, die eine Reaktion katalysiert, in der das p-Aminophenyl-β-D-galactopyranosid (PAPG) in p-Aminophenol (PAP) umgewandelt wird. PAP kann durch die Zellmembran transportiert werden und dann an der Elektrode durch die nachstehende chemische Reaktion oxidiert werden:
Andere nicht beschränkende Bespiele für Enzyme und relevante Substrate schließen ein: das Enzym alkalische Phosphatase (AP) oder das Enzym sezernierte alkalische Phosphatase (SEAP) mit dem Substrat PAPP (p-Aminophenolphosphat) oder wenn das Enzym Glucose-Oxidase, immobilisiert an der Elektrode, verwendet wird, kann das Substrat Glucose-6-Phosphat sein, das Enzym Chloramphenicolacetyl-Transferase (CAT) und das Substrat Chloramphenicol, das Enzym β-Glucuronidase und irgendein Glycosaminoglycan oder andere Glyco-Konjugate, die nach der Entfernung des β-Glucuronsäurerests elektrochemisch aktiv werden.
Die exprimierbare DNA-Sequenz kann eine Sequenz sein, die ein Produkt codiert, das natürlich in der Wirtszelle exprimiert wird, oder kann ein zur Zelle heterologes Produkt sein.
Das Expressionsprodukt kann auch ein Enzymkonstrukt sein, das aus der Zelle transportiert wird und extrazellulär nach der Sekretion aktiv wird. Solch ein Expressionsprodukt kann zum Beispiel ein sezerniertes Protein sein, das an das „Markierungs"-Enzym alkalische Phosphatase fusioniert wurde (Manoil et el., 1990). Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das Reportergen mehrere Gene enthalten, von denen eines das Substrat oder eine Peptid, das in der Lage ist, das Substrat herzustellen, codiert, und ein anderes Gen codiert das Enzym, das in der Lage ist, an dem hergestellten Substrat eine Reaktion zu katalysieren. Mehrere Reportergene können von dem selben Promotor exprimiert werden, wobei eines der Reportergene das Substrat codiert. Auf diese Weise ist es nicht nötig, den Zellen ein Substrat zuzugeben, und eigentlich ist das endgültige Signal das Ergebnis einer Reihe von Proteinen in dem Komplex.
Gemäß einer anderen Ausführungsform besteht die gesamte Kultur aus den Wirtszellen, die sowohl einen Stoff von Interesse herstellen als auch in der Lage sind, ein exprimierbares Produkt zu exprimieren, was somit erlaubt, den Parameter zu überwachen. Gemäß einer noch weiteren Ausführungsform enthält die Kultur einen bestimmten Anteil von Wirtszellen, welche die Überwachung der Parameter erlauben. In solch einer Ausführungsform ist es nötig, sich fortlaufend zu vergewissern, dass ein festgelegtes Verhältnis zwischen den Wirtszellen und den Kulturzellen aufrechterhalten bleibt. Des weiteren ist es gemäß dieser Ausführungsform möglich, gelegentlich in der Kultur eine Anzahl verschiedener Wirtszellen, von denen jede ein anderes exprimierbares Produkt exprimiert, einzubringen, was erlaubt es, zwischen den verschiedenen Parametern zu unterscheiden.
Gemäß dem Bakteriophagen-Aspek können mehrer verschiedene Arten von Bakteriophagen verwendet werden, von denen jeder in der Lage ist, eine andere Gruppe oder einen anderen Stamm von Bakterienzellen zu infizieren. Jede Sorte von Bakteriophagen wird dann eine andere exprimierbare Sequenz enthalten, und durch die Zugabe von geeigneten unterschiedlichen Substraten ist es möglich, zwischen den von den Bakteriophagen erhaltenen Signalen zu unterscheiden und zu bestimmen, welche Gruppe oder welcher Stamm von Bakterienzellen im Medium anwesend ist.
Die Bestimmung der Parameter kann mittels einer Ausführungsform (die „on-line"-Ausführungsform) durchgeführt werden, in dem die elektrochemische Zelle innerhalb des Fermentationsgefäßes bebildet wird. Dies wird es erforderlich machen, in solch ein Gefäß typischerweise drei Elektronen einzubringen, eine Referenzelektrode, eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode.
Alternativ, besser als die Messung innerhalb der Kultur durchzuführen, ist es durch eine zusätzliche Ausführungsform (der „semi-on-line"-Ausführungsform) möglich, auch fortlaufend Proben zu entnehmen und solche Proben innerhalb der elektrochemischen Zellen zu platzieren. Für den Fall, dass die Kultur in jeder elektrochemischen Zelle verschiedene Wirtszellen enthält, ist es möglich ein anderes Substrat zuzugeben, um zwischen den Signalen von unterschiedlichen Typen von Wirtszellen zu unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung kann mannigfaltige Anwendungen haben. Einige Ausführungsformen werden nun etwas genauer beschrieben:
1. Überwachungsstatus einer Kultur
Eine große Anzahl von bakteriologischen Verfahren umfasst die Kultivierung von Zellen, um von den Zellen erzeugte Produkte zu erhalten. In solchen Fermentationsverfahren müssen verschiedene Bedingungen fortwährend bestimmt werden, dazu gehören die genaue Verfügbarkeit eines Nährstoffs im Fermenter, das Stadium der Kultur und zwar, ob es eine algorithmische Wachstumsphase oder eine stationäre Phase ist, und besonders die Konzentration des erforderlichen Fermentationsprodukts zu jeder gegebenen Zeit. Die vorliegende Erfindung liefert einen neuen Weg zur Überwachung solcher Parameter.
2. Untersuchung eines Testmediums
Das Testmedium kann ein biologischen Medium sein wie eine Körperflüssigkeit, z.B. Vollblut oder Plasma, kann eine Umweltprobe sein, z.B. eine von einem Wasserreservoir erhaltene Probe, kann eine Bodenprobe sein usw.. Wenn es zum Beispiel erwünscht ist, die Existenz eines bestimmten Stoffs in der Probe zu bestimmen, kann die Probe zuerst für die Extraktion solch eines Stoffs behandelt werden und die Fraktion, die den Stoff enthält, wird dann dem Kulturmedium, das die Wirtszellen enthält, beigemengt. Offensichtlich ist es auch möglich, die Probe direkt der Kultur beizumischen, was von Vorteil sein kann, besonders in Feldanwendungen, hinsichtlich Einfachkeit und Geschwindigkeit des Tests.
Wenn das Medium, das bestimmt werden soll, ein Gas ist, lässt man typischerweise in einer anfänglichen Phase das Gas durch das Kulturmedium, das die Wirtszellen enthält, hindurchperlen.
Eine potentielle Verwendung des Verfahrens ist die Bestimmung der Kontamination von verschiedenen Medien mit toxischen Stoffen, z.B. die Bestimmung der Kontamination von Bodenproben oder Wasserreservoiren mit Quecksilber oder Cadmium.
In jedem Fall werden die Wirtszellen derart entwickelt, dass der Stoff oder der Zustand von Interesse den Promotor induziert, wobei das exprimierbare Produkt von der Wirtszelle exprimiert wird. Gemäß dem Bakteriophagen-Aspekt wird der Bakteriophage derart ausgewählt und entwickelt, dass er die spezifische Gruppe oder den spezifischen Stamm von Bakterienzellen infiziert, wobei das exprimierbare Produkt in den infizierten Zellen exprimiert wird. Ein zugegebenes Substrat wird dann ein Produkt zur Folge haben, welches das elektrische Signal ergeben wird, das die Anwesenheit des Stoffs von Interesse in der Probe anzeigt.
Gemäß einer Ausführungsform ist es möglich eine Elektrodenanordnung zu verwenden, die eine Anzahl von Elektroden auf einem sehr kleinen Bereich umfasst. Jede Elektrode kann eine andere Wirtszelle enthalten, so dass jede Wirtszelle der Anordnung in der Lage ist, auf einen anderen getesteten Parameter zu reagieren. Die verschiedenen Wirtszellen können unterschiedliche Promotoren enthalten, sie können unterschiedliche Reportergene enthalten, verschiedene Substrate können verwendet werden oder es kann eine Kombination jedes vorstehend genannten sein. Auf diese Weise kann durch die Verwendung einer miniaturisierten Elektrodenanordnung eine große Anzahl von Messungen simultan an einer oder mehreren getesteten Proben ausgeführt werden
3. Testvorrichtung und Technik
Wie in 1 gezeigt, umfasst jede elektrochemische Zelle 100 ein Gefäß 102, eine Messelektrode 104, eine Rückelektrode 106 und eine Referenzelektrode 108. Die Zellen werden üblicherweise auf einer Rüttelplatte 110 platziert, um den Inhalt der Zellen stetig und sorgfältig zu vermengen.
Die Arbeitselektrode 104 kann verschiedenster Art sein, zum Beispiel kann sie aus Kohle gefertigt sein (einschließlich Glaskohlenstoff, Aktivkohlegewebeelektrode, Kohlefilz, platiniertes Kohlegewebe, Reinkohlegewebe), kann aus Gold, Platin oder Silber hergestellt sein. Die Gegenelektrode kann auch aus dem gleichen Material hergestellt sein wie die Arbeitselektrode. Die Referenzelektrode kann zum Beispiel eine gesättigte Kalomelelektrode oder eine Ag/AgCl-Elektrode sein. Des weiteren können die Elektroden eine Siebdruck-Elektrode 114 sein, die in ein Zellkulturgefäß 116 eingebracht werden können, ohne die Notwendigkeit, eine Probe zu entnehmen und sie in eine separate elektrochemische Zelle zu überführen.
Die elektrochemische Zelle 100, die in 1 gezeigt wird, ist eine Drei-Elektrodenzelle. Man ist sich bewusst, dass es möglich ist, ebenso eine Zwei-Elektrodenzelle zu verwenden.
Die elektrochemischen Zellen werden üblicherweise als eine Anordnung 120 angeboten und enthalten eine Vielzahl solcher Zellen.
Ferner umfasst die Vorrichtung ein Kontrollmodul, welches ein Computer 130 sein kann, ein Potentiostat 132 und ein Multiplexermodul 134, welches im Falle einer typischen Ausführungsform zur simultanen Messung einer Vielzahl von elektrochemischen Zellen benötigt wird.
Die in der Zelle durchgeführte elektrochemische Messung wird nun mit Bezug auf das chronoamperometrische Verfahren beschrieben. Man ist sich bewusst, dass sie mutatis mutandis ebenso auf die anderen vorstehend erwähnten elektrochemischen Messungsverfahren angewendet werden kann. Des weiteren wird die Beschreibung hinsichtlich der Verwendung einer Multi-Elektrodenvorrichtung (die Vorrichtung enthält eine Gruppe von Elektroden) gemacht, und es ist klar, dass sie ebenso auf eine Vorrichtung, die eine einzelne Zelle enthält, anwendbar ist.
Zu Beginn der elektrochemischen Messung arbeiten alle Elektroden zusammen. Der Computer tastet alle Elektroden über die parallele Schnittstelle ab, und die Hintergrundreaktion jeder Elektrode auf das Anlegen eines Potentials wird von dem Computer aufgezeichnet. Die gesamte elektrochemische Messfolge kann über eine lange Zeitspanne durchgeführt werden, währenddessen die aus den Änderungen der Produktkonzentration erhaltenen Ströme gemessen werden. Für den Fall, dass die Elektrodenoberflächen aufgrund der natürlichen Variabilität nicht identisch sind, kann das System durch Messung der Oxidation oder Reduktion einer elektroaktiven Spezies, üblicherweise der gleiche Spezies, die das Produkt der enzymatischen Reaktion in der elektrochemischen Zelle ist, und Vergleich der Ergebnisse aller Elektroden kalibriert werden.
Bei der Durchführung des Tests können die Elektroden an den Potentiostat angeschlossen werden und zur gleichen Zeit auch über den Multiplexer an eine parallele Schnittstelle des Mikrocomputers gesammelt werden.
Jede Elektrode wird in eine elektrochemische Zelle, welche eine Referenzelektrode und eine Gegenelektrode enthält, die auch an den Potentiostaten angeschlossen sind, eingesetzt. Ein bestimmtes Potential wird durch den Potentiostat an die Elektroden angelegt (welches für alle Elektroden das gleiche sein kann oder für jede Elektrode ein anderes Potential sein kann), und der Strom in jeder Elektrode wird nachgewiesen. Die elektrischen Signale werden in Echtzeit auf dem Computerbildschirm sichtbar gemacht.
4. Elektroden
Die Elektroden in dem System der erfindungsgemäßen Vorrichtung können wiederverwendbare Elektroden oder Elektroden zum einmaligen Gebrauch sein. Die wiederverwendbaren Elektroden können zum Beispiel Elektroden sein, die scheiben- oder stabförmig aus Glaskohlenstoff hergestellt und in Teflon eingebettet sind. Einwegelektroden können zum Beispiel Elektroden sein in der Form von Kohlepapier, Kohlegewebe, Kohlefilz oder Siebdruck-Elektroden von der vorstehend vermerkten Art.
5. Kits
Die erfindungsgemäß verwendeten Kits umfassen Wirtszellen, die mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz transfiziert sind, oder Bakteriophagen, die eine exprimierbare DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle eines induzierbaren Promotors enthalten, wie vorstehend beschrieben. Die verwendete Promotorsequenz wird von dem bei der Verwendung des Kits zu bestimmenden Parameter abhängen. Wenn also zum Beispiel der Kit für den Nachweis von Umweltschadstoffen in Form von Schwermetallen wie Cadmium verwendet wird, wird der Kit Zellen umfassen, die mit einem Promotor transfiziert sind, der in der Anwesenheit von geringen Cadmiumkonzentrationen induzierbar ist. Wenn der Kit für den Nachweis von Bakterienzellen in dem Medium vorgesehen ist, wird er Bakteriophagen umfassen, die einen Promoter enthalten, der nach der Infektion der Bakterienzellen durch den Bakteriophagen induziert wird. Die exprimierbare DNA-Sequenz in den Zellen kann jede Sequenz sein, die ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysiert, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist. Für die elektrochemische Messung enthält der Kit auch Elektroden, optimalerweise in einer elektrochemischen Zelle. Wenn das Substrat des enzymatisch aktiven Produktes, das in den Zellen des Kits anwesend ist, nicht endogen in den Zellen vorkommt, wird der Kit auch ein Substrat enthalten, das enzymatisch von den Enzymen umgesetzt wird, um das Reaktionsprodukt zu erhalten, das die Redox-Reaktion an einer Elektrode der elektrochemischen Zelle hervorruft.
Der Kit enthält auch eine elektrochemische Zelle, die eingerichtet ist, um die Wirtszellen aufzunehmen und zu halten sowie um die elektrochemische Messung durchzuführen. Eine Komponente ist üblicherweise zumindest ein Trägermaterial, um die Zellen zu halten. Solch ein Trägermaterial kann eine messende elektrochemische Elektrode der Zelle sein oder kann ein Trägermaterial zur Platzierung in der elektrochemischen Zelle sein usw.. Zusätzlich kann der Kit gelegentlich alle Zellkomponenten entweder schon in einer Weise angeordnet enthalten, um für die Durchführung der Messung den sofortigen Gebrauch der elektrochemischen Zelle zu erlauben, oder gelegentlich können die Zellkomponenten zerlegt vorhanden sein.
Gemäß einer Ausführungsform kann der Kit eine Anordnung von Elektroden enthalten; dabei hält jede eine andersartig transfizierte Wirtszelle und ist daher geeignet, einen anderen Parameter nachzuweisen, wie zum Beispiel die vorstehend beschriebene Anordnung.
Wenn der Kit für eine on-line- oder in situ-Überwachung der Parameter verwendet wird, vor allem eines Umweltparameters, sind die Wirtszellen und die elektrochemischen Zellen vorzugsweise in Form einer kleinen tragbaren Vorrichtung, die einfach zu handhaben ist und leicht an den Ort gebracht werden kann, an dem der Parameter bestimmt wird.
Die vorstehenden Kits können leicht an Hilfsmittel angeschlossen werden, die das gemessene Signal aufzeichnen, und wenn gewünscht die Ergebnisse bearbeiten (z.B. ein Minicomputer, wie vorstehend beschrieben).
BEISPIELE
Die Beispiele werden nun veranschaulicht durch die nachstehenden nicht-einschränkenden Beispiele mit gelegentlicher Bezugnahme auf die anhängenden Abbildungen.
MATERIAL UND VERFAHREN
Bakterienstämme und Bakterienwachstum. E. coli-K-12-Stamm K10 (Hfr, tonA22, ompF626, relA1, pit-10, spoT1, T2^R CGSC [Coli Genetic Stock Center, New Haven, CT] 4234) war von der Laborsammlung. Die Stämme E. coli RO151 (MC4100 ϕ(csi-5::lacZ) und E. coli RH99 (RO151 rpoS359::Tn10) wurden früher beschrieben (Weichart et al., 1993). Alle Kulturen wurden aerob bei 37°C unter kräftigem Schütteln in LB-Medium (Miller, 1992) angereichert, wenn erforderlich mit 5 μg/ml Tetracyclin oder 25 g/ml Kanamycin, ergänzt.
Herstellung der Bakteriophagen. Das allgemeine Verfahren, um geeignete Bakteriophagen herzustellen, wird vorstehend beschrieben. Zur Herstellung des Bakteriophagen Lambda, der die exprimierbare Tn5-lac-DNA-Sequenz (codiert das LacZ-Enzym) enthält, werden Bakterien, die ein an ein Tn5-lac-Gen fusioniertes Transposon tragen, mit dem Bakteriophagen Lambda infiziert und inkubiert, um die Lyse zu erhalten. Das Lysat wird dann auf eine Kultur von Wirtsbakterien plattiert, die auf Weichagar (0,7%), der X-Gal enthält, oder auf McConkey-Agarplatten ausplattiert sind. Die Platten werden dann auf blaue Plaques (wenn X-Gal verwendet wird) oder auf roten Plaques (wenn McConkey-Platten verwendet werden) durchmustert und die entsprechenden Lysate, die die gewünschten Bakteriophagen enthalten, ausgewählt.
Enzyme und Chemikalien. p-Aminophenyl-β-D-galactopyranosid (PAPG), Isopropyl-β-D-thiogalctopyranosid (IPTG) und β-Galactosidase (β-D-Galactosid-galactohydrolase, EC 3.2.1.23) wurden erhalten von Sigma Chemicals Company (St Louis, MO).
Der amperometrische Test. Elektrochemische Messungen wurden unter Verwendung einer Drei-Elektrodenzelle für den einmaligen Gebrauch durchgeführt, basierend auf einer Siebdruck-Elektrode (Gesamtvolumen von 0,3 ml). Die elektrochemischen Zellen wurden aus Polystyrolröhrchen hergestellt (1). Graphit-Tinte wurde als Gegenelektrode und Ag/AgCl-Tinte als Referenzelektrode verwendet. Einweg-Graphitelektroden in zylindrischer Form (aus Bleistiftminen hergestellt, HB 0,9 mm) wurden als Arbeitselektroden verwendet. Der Test wurde direkt in den elektrochemischen Zellen durchgeführt, die geschüttelt wurden, um eine Vermischung zu erreichen. Die gleiche Siebdruck-Elektroden und Graphit-Arbeitselektrode wurden auch für die direkten Messungen in den Kulturen verwendet. In diesem Fall wurden die Elektroden innerhalb des Erlenmeyer-Kolbens, wie in 1 gezeigt, platziert, und das Mischen wurde durch Luftdurchperlung erreicht. Die Graphitelektrode wurde gegenüber der Referenzelektrode bei 220 mV gehalten und die Konzentration des Substrats PAPG war 0,4 mg/ml.
Die Versuchsanordnung. Die elektrochemischen Messungen wurden unter Verwendung eines PAR-VersaStat-Potentiostaten durchgeführt, der an einen 8-Kanal-PAR-314-Model-Multiplexer (EG&G Princeton Applied Research, Princeton, NJ) angeschlossen war. Dieses System erlaubt die simultane Messung von acht Proben mit elektrochemischen Zellen für den einmaligen Gebrauch. Die Messungen wurden durch eine LAbVIEW-basierte Software unter Verwendung eines Windows 95-Betriebssystems gesteuert. Der elektrische Strom, durch die Aktivität der β-Galactosidase, wurde simultan in allen acht Proben in Echtzeit auf dem Computerbildschirm sichtbar gemacht (2 und 3).
ERGEBNISSE
Beispiel 1: Konfiguration und Optimierung des amperometrischen LacZ (β-Galactosidase) Überwachungssystems
Eine elektrochemische Vorrichtung für mehrere Zellen, wie vorstehend beschrieben, wurde verwendet, um den Nachweis der β-Galactosidaseaktivität zu optimieren. Die Ergebnisse in 2A zeigen die Verwendung der Mehrzell-Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von gereinigter β-Galactosidase unter Verwendung von PAPG als Substrat. Die Ergebnisse werden dargestellt, wie sie auf dem Computerbildschirm sichtbar sind und entsprechen den Signalen von der enzymatischen Reaktion in sechs elektrochemischen Zellen, die zunehmende Konzentrationen des Enzyms enthalten, wie in 2B zu sehen ist. In der Eichkurve, die aus diesen und zusätzlichen Daten erstellt wurde, wurde eine lineare Korrelation im Bereich von 3 bis 100 U/ml beobachtet, und die Nachweisgrenze war 1 Einheit/ml β-Galactosidase.
Beispiel 2: On-line-Überwachung des lacZ-Reportergenprodukts β-Galactosidase in intakten Bakterien
Ein elektroanalytischer on-line-Test für β-Galactosidase wurde verwendet, bei dem die Enzymaktivität nach der Induktion mit IPTG bestimmt wurde. Zunehmende Konzentrationen des Induktors wurden zu einer E. coli K10-Kultur (Annette & Anthony, 1987) zugegeben, und das Stromsignal wurde on-line in allen Kulturen simultan überwacht (3A). Wie in 3B gesehen werden kann, war die Steigung der Stromsignale mit der Zeit proportional zur Konzentration des zugegebenen IPTG (von 0,5 μM IPTG).
Beispiel 3: Überwachung des Eintritts in die stationären Phase bei Escherichia coli.
Als Modell zur Überwachung der Genexpression verwendeten wir Escherichia coli, das eine chromosomale lacZ-Fusion an den osmY-Promotor trägt, welcher durch den Transkriptionsfaktor RpoS (σ^S) positiv reguliert wird und daher nur in der stationären Phase exprimiert wird (Weichart et al., 1993; Yim & Villarejo, 1992). Als Kontrolle verwendeten wir einen isogenen Stamm, der eine Unterbrechung der rpoS-Gene trägt (Weichart et al., 1993). Bei diesem Experiment wurden Siebdruck-Elektroden und Graphit-Arbeitselektroden, wie vorstehend beschrieben, innerhalb des Erlenmeyerkolbens platziert (siehe 1), und die Expression von lacZ wurde fortlaufend gemessen. Wie in 4A gezeigt, wurde die signifikante Zunahme des Stromsignals beim Übergang der Zellen in die stationäre Phase erhalten. Wie in 4B zu sehen ist, wurde solch ein Signal in der Kultur des rpoS-Mutantenstammes nicht erhalten. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit vorherigen Ergebnissen, die mit einem kolorimetrischen Test erhalten wurden (Weichart et al., 1993).
Beispiel 4: On-line-Überwachung von Schwermetallen unter Verwendung von intakten Bakterien, die einen auf Schwermetalle ansprechenden Promotor tragen, der an das lacZ-Reportergen, welches das Enzym β-Galactosidase codiert, fusioniert ist
Ein elektroanalytischer on-line-Test für β-Galactosidase wurde verwendet, um on-line die Anwesenheit von Schwermetallen zu überwachen. Die Expression des Reportergens β-Galactosidase, das an ein auf Schwermetalle ansprechendes Gen fusioniert war, war proportional zur Schwermetallkonzentration. Wir waren in der Lage, unter Verwendung einer Einwegelektrode acht verschiedene Proben simultan zu überwachen. 5 zeigt die Antwort des Sensors auf erhöhte (5 ppm, 10 ppm, 50 ppm) CdCl₂-Konzentrationen.
Mittels in vivo-Genfusion wurde unter Verwendung des λplacMu-Systems, wie früher beschrieben (Sambrook et al., 1989), das schadstoffinduzierbare Reporterbakterium hergestellt. Hierfür wurde E. coli K12 Mc4100 verwendet, und die Identifikation der auf Schadstoffe ansprechenden Mutanten erfolgte durch Ausstreichen von jedem Transposant auf MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)-Minimalplatten, die mit 0,2% Glucose und 2 mg/ml Thiamin angereichert waren und 50 mg/ml Kanamycin, und 40 mg/ml X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und verschiedene Schadstoffkonzentrationen enthielten. Die blauen Kolonien wurden für die weitere Untersuchung mittels spektralphotometrischen Test auf β-Galactosidase isoliert (Sambroet et al., 1989).
Die elektrochemischen Messungen wurden durchgeführt unter Verwendung einer Drei-Elektrodenzelle zum einmaligen Gebrauch, die aus Polystyrolröhrchen hergestellt war und auf einer Siebdruck-Elektrode (Gesamtvolumen 0,3 ml) basierte. Der Test wurde direkt in den elektrochemischen Zellen, die zur Vermischung geschüttelt wurden, durchgeführt. Dieses System erlaubt simultane Messungen von acht Proben unter Verwendung eines Potentiostaten, der an einen 8-Kanal-Multiplexer angeschlossen ist. Der elektrische Strom, der in allen 8 Kulturen durch die Aktivität der β-Galactosidase entsteht, wurde in Echtzeit auf dem Computerbildschirm sichtbar gemacht. Die on-line-Überwachung wurde folgendermaßen durchgeführt:

(a) Die Bakterienkultur wurde in LB-Medium bis zu einer Dichte von 40 K. U. kultiviert.
(b) Die Kultur wurde zur Mehrzellvorrichtung gegeben, gefolgt von der Zugabe des β-Galactosidasesubstrats p-Aminophenyl-β-D-galactopyranosid (PAPG).
(c) Ein Potential von 220 mV gegenüber der Ag/AgCl-Referenzelektrode wurde durch das elektrochemische Meßsystem angelegt und der elektroanalytische Test für β-Galactosidase wurde durchgeführt, wie in Beispiel 4 beschrieben.
(d) Schwermetallproben wurden zugegeben und die Stromsignale in jeder elektrochemischen Zelle wurden auf dem Computerbildschirm sichtbar gemacht und stellen die Signale der enzymatischen Reaktionen dar. Das Stromsignal wurde simultan in allen Kulturen überwacht

Wie in 5 zu sehen, war die Steigung der Stromsignale mit der Zeit proportional zu der Konzentration des zu der Kultur gegebenen Cadmiums.
Beispiel 5: On-line-Überwachung von Cadmium in Bodenproben
Das gleiche Testverfahren wurde verwendet, um Cadmium in Bodenproben nachzuweisen. Die Erde wurde direkt zu den auf Siebdruckelektroden basierten elektrochemischen Zellen gegeben, welche die Bakterienkultur, wie vorstehend beschrieben, enthielten. Acht Bodenproben wurden mittels des Systems simultan überwacht. Die Ergebnisse, wie sie auf dem Computerbildschirm sichtbar gemacht wurden, sind in 6A zu sehen. Zwei Duplikate von Bodenproben, die 3,8 ppm Cadmium (durch das Atomabsorptionsverfahren gemessen) enthielten, wurden mit zwei Duplikaten von Reinerdeproben verglichen. Die Stromsignale, die in den Bodenproben erhalten wurden, welche 3,8 ppm Cadmium enthielten, waren beträchtlich höher als die Stromsignale, die in den Reinerdeproben erhalten wurden. Dies kann auch klar in 6B gesehen werden, welche die Mittelwerte von mehreren Versuchen diesen Typs zeigt. In diesen Bodenproben wurden so geringe Mengen wie 0,5 ppm Cadmium nachgewiesen.
Beispiel 6: On-line-Überwachung von Quecksilber in Wasser- und Meerwasserproben
Das gleiche Verfahren, wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde verwendet, um Quecksilber in Wasser- und Meerwasserproben zu überwachen. 7 zeigt die on-line-Antwort des Sensors auf ansteigende (10 ppm, 50 ppm, 100 ppm und 500 ppm) Konzentrationen von HgCl₂, welche dem Meerwasser zugegeben wurden. Die erhaltenen Stromsignale waren proportional zu den Quecksilberkonzentrationen und es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Wasser- und Meerwasserproben nachgewiesen.
Beispiel 7: Überwachung des lacZ-Reportergenprodukts β-Galactosidase in intakten Hefezellen
Der gleiche Test, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde verwendet, um die Expression des Reportergens LacZ in Hefezellen zu überwachen. Die Positivkontrolle des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (Groskreutz et al., 1997) wurde als Model verwendet. Zwei Kulturen von Saccharomyces cerevisae-Hefezellen Stamm EGY48 wurden mit zwei Hybridplasmiden kotransfiziert. Ein Plasmid (pSH18-34 8lexA operator+LacZreporter) war für beide Kulturen gleich. Das zweite Plasmid war anders, eine Kultur wurde mit dem Plasmid pSH17-4 kotransformiert, welches LexA-GAL4 codiert (eine Positivkontrolle für die Aktivierung und Expression von β-Galactosidase), und die zweite Kultur war mit dem Plasmid pRFHM-1 transformiert, welches LexA-bicoid codiert (eine Negativkontrolle für die Aktivierung und Expression von β-Galactosidase). Die Kulturen wurden auf YNB(+GAL, –HIS, –URA)-Medium für 6 Stunden kultiviert.
Von beiden Kulturen wurden Proben genommen und in die elektrochemischen Zellen platziert. Wie in 8 gezeigt, wurde aufgrund der unterschiedlichen Expressionsmenge von β-Galactosidase ein signifikanter Unterschied im Stromsignal erhalten. Der Stamm, der das Plasmid pRFHM-1 trägt, exprimiert wie erwartet eine größere Menge des Enzyms.
Beispiel 8: Überwachung des lacZ-Reportergenprodukts β-Galactosidase in Gewebekulturen
Ein elektroanalytischer on-line-Test auf β-Galactosidase wurde verwendet, um die Expression des Reportergens in Gewebekultur zu überwachen.
Die Kultur (menschliche k562-Erythroleukämiezelllinie) wurde in 4 Kulturen aufgeteilt und jede mit einer ansteigenden M. O. I. (Infektionsmultiplizität; multiplicity of infection) (0, 1 und 2) des rekombinanten Vaccinia-Virus Stamm MVA, der das LacZ-Gen exprimiert, transfiziert. Alle 4 Gewebekulturen wurden für 8 Stunden auf der selben 6-Lochplatte unter Standardbedingungen (CO₂ 37°C) kultiviert. Die Elektroden (Siebdruck und die Arbeitsgraphit) wurden dann in die Löcher mit den Gewebekulturen platziert. Die elektrochemische Überwachung wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Wie in 9 gezeigt, waren die erhaltenen Stromsignale proportional zur M. O. I..
Beispiel 9: Überwachung des phoA-Reportergenprodukts alkalische Phosphatase (AP) in intakten Bakterien
Für die Expression des Enzyms AP wurde ein Plasmid mit mehreren Kopien hergestellt. Für die Konstruktion des Plasmids koppelten wir ein promotorloses phoA-Gen an den Promotor des lacZ-Gens. Die Verwendung eines Plasmids mit mehreren Kopien als Vektor für induzierbare Gene erfordert ein streng reprimierendes System, um eine konstitutive Expression zu vermeiden. Daher verwendeten wir ein Plasmid, welches das lacI^q-Gen, das einen starken lacZ-Repressor codiert, trägt. Das Plasmid wurde so gestaltet, dass eine korrekte Fusion zwischen dem lacZ-Promotor und dem phoA-Gen entsteht. Die Bakterien, die dieses Plasmid tragen, können immobilisiert werden und verwendet werden, um die AP mittels elektrochemischer Messungen ihrer Aktivität zu überwachen. Nach der Konstruktion des Plasmids maßen wir eine AP-Aktivität einer Zellsuspension als Reaktion auf das Auftreten von IPTG.
Der E. coli-Stamm K-12 7118 [F' lacI^q Δ(LacZ)M15 proA+B+/Δ(lac-proAB) thi supE] wurde für alle Klonierungsverfahren, die Plasmidvermehrung und -herstellung verwendet. Die AP-Produktion der Zellen, die das pUC-PhoA-Plasmid trugen, wurde on-line durch die elektroanalytische Technik, die wir für die β-Galactosidase verwendet haben, wie in Beispiel 2 gemessen. Wie in 10 gezeigt, wurde die enzymatische Aktivität nach der Induktion mit ansteigenden Konzentrationen von IPTG (0 mM, 1 mM und 0,1 mM) bestimmt. Durch den Vergleich der AP-Aktivität in den elektrochemischen Zellen können wir sehen, dass die Stromsignale proportional zu den IPTG-Konzentrationen sind.
Beispiel 10: Nachweis von E. coli K-12-Bakterienzellen im Trinkwasser unter Verwendung des Bakteriophagen Lamda, der mit Tn5-lac transponiert wurde
Der Bakteriophage Lamda, welcher spezifisch ist für E. coli K-12-Bakterien, wurde durch die Fusion der exprimierbaren Tn5-lac-Sequenz stromabwärts an einen seiner Promotoren hergestellt. Der Bakteriophage wurde zu bakterienfreiem Trinkwasser gegeben und das Substrat für β-Galactosidase wurde hinzugefügt. Kein Strom wurde nachgewiesen. Sobald dem Trinkwasser E. coli K-12-Zellen beigegeben wurden, wurde 30 Minuten nach der Zugabe der Bakterienzellen zum Wasser (in Anwesenheit des Substrats) ein Strom gemessen. In jedem Versuch wurde eine andere Anzahl von Bakterienzellen dem Wasser zugegeben und die Höhe des elektrischen Signals war direkt proportional zur Anzahl der Bakterienzellen, die dem Wasser zugegeben wurden.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Wirtszellparameters, umfassend: (a) Transfektion der Zelle mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz, welche in Korrelation mit dem Parameter induzierbar ist, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist; (b) Platzierung der transfizierten Zellen in einer elektrochemischen Zelle; und (c) Messung der Höhe des elektrischen Signals, wobei ein Signal über dem Schwellenwert die Anwesenheit des Parameters anzeigt.
Verfahren zum Nachweis eines Mediumparameters, umfassend: (a) Bereitstellen von Zellen, welche mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz, welche in Korrelation mit dem Parameter induzierbar ist, transfiziert sind, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist; (b) Platzierung der Zellen in dem Medium oder einer Probe davon; und (c) Bereitstellen einer elektrochemischen Zelle und Messung der Höhe des elektrischen Signals, wobei die Höhe des Signals mit der Höhe des Parameters korreliert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor heterolog zur exprimierbaren DNA-Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor autolog zur exprimierbaren DNA-Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Promotor autolog zur Wirtszelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das enzymatisch aktive Produkt ein intrazellulär agierendes Enzym ist, das eine Reaktion katalysieren kann, in welcher ein Substrat in ein Zellmembran-permeables Produkt umgesetzt wird, das an einer Elektrode der chemischen Zelle eine Redox-Reaktion eingehen kann, um das elektrische Signal zu erzeugen, und wobei Schritt (c) den Zusatz des Substrates zu den Wirtszellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Substrat den Wirtszellen zugesetzt wird, während sie sich in der elektrochemischen Zelle befinden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das enzymatisch aktive Produkt aus der Zelle heraustransportiert wird und dort eine Reaktion katalysieren kann, in welcher ein Substrat in ein Reaktionsprodukt umgesetzt wird, das an einer Elektrode der chemischen Zelle eine Redox-Reaktion eingehen kann, um das elektrische Signal zu erzeugen, und wobei Schritt (c) den Zusatz des Substrates zu den Wirtszellen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Substrat den Wirtszellen zugesetzt wird, während sie sich in der elektrochemischen Zelle befindet.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die elektrochemische Zelle in situ in der Zellkultur gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 2, umfassend zwischen Schritt (a) und (b): (a1) das periodische Entnehmen von mindestens einer Probe aus der Kultur und die Platzierung dieser mindestens einen Probe in mindestens einer elektrochemischen Zelle.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die exprimierbare Sequenz mindestens zwei Expressionsprodukte besitzt, von denen mindestens eines das Substrat oder ein Peptid oder Protein ist, welches in der Lage ist, das Substrat zu produzieren.
Vorrichtung zum Überwachen der Expression eines Zielpromotors, umfassend: (a) eine elektrochemische Zelle; (b) Zellen, welche mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle des Zielpromotors transfiziert sind, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist; und (c) eine Apparatur zur Messung des elektrischen Signals.
Vorrichtung nach Anspruch 13, umfassend eine Vielzahl von elektrochemischen Zellen und eine Multiplex-Anordnung für eine im Wesentlichen simultane Messung des elektrischen Signals aus einigen oder allen Zellen.
Vorrichtung nach Anspruch 14, welche eine Elektrodenanordnung umfasst, worin jede Elektrode eine unterschiedliche Wirtszelle enthält und jede Wirtszelle einen Promotor umfasst, welcher in Korrelation mit einem unterschiedlichen Parameter induzierbar ist.
Kit zur Verwendung für den Nachweis eines Wirtszellparameters, eines Mediumparameters oder eines Indikatorparameters des Stadiums des Zell- oder Zellkulturwachstums, umfassend: (a) Wirtszellen, welche mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer induzierbaren Promotorsequenz, welche in Korrelation mit dem Parameter induzierbar ist, transfiziert sind, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist; (b) eine elektrochemische Zelle, wobei die elektrochemische Zelle eingerichtet ist, um die Wirtszellen aufzunehmen und zu halten sowie die elektrochemische Messung durchzuführen.
Kit nach Anspruch 16, umfassend: (c) ein Substrat, welches enzymatisch durch das Enzym umgesetzt wird, um ein Reaktionsprodukt zu erzeugen, welches eine Redox-Reaktion an einer Elektrode einer elektrochemischen Zelle eingeht.
Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit spezifischer Bakterienzellen in einem Medium, umfassend: (a) Bereitstellen von Bakteriophagen, welche in der Lage sind, eine Zelle einer spezifischen Bakteriengruppe oder eines spezifischen Bakterienstammes zu infizieren, wobei die Bakteriophagen eine exprimierbare DNA-Sequenz unter der Kontrolle einer Promotorsequenz enthalten, wobei die Promotorsequenz durch die Infektion von Zellen der Bakteriengruppe oder des Bakterienstammes durch den Bakteriophagen induzierbar ist, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektrisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist; (b) Platzierung der Bakteriophagen in dem Medium oder einer Probe davon unter Bedingungen, welche die Infektion der Bakterienzellen durch die Bakteriophagen erlauben; und (c) Bereitstellen einer elektrochemischen Zelle und Messung der Höhe des elektrischen Signals, wobei ein Signal über dem Schwellenwert die Anwesenheit von Zellen der spezifischen Bakteriengruppe oder des spezifischen Bakterienstammes in dem Medium anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei sich die Höhe des gemessenen elektrischen Signals proportional zu der Anzahl der spezifischen Bakterienzellen in dem Medium verhält und wobei nach Schritt (c) die Anzahl der spezifischen Bakterienzellen in dem Medium errechnet wird.
Kit zur Verwendung für den Nachweis von Zellen einer spezifischen Bakteriengruppe oder eines spezifischen Bakterienstammes in einem Medium, umfassend: (a) Bakteriophagen, welche eine exprimierbare DNA-Sequenz unter der Expressionskontrolle einer Promotorsequenz enthalten, wobei die Promotorsequenz durch die Infektion der Zellen der spezifischen Bakteriengruppe oder des spezifischen Bakterienstammes durch die Bakteriophagen induzierbar ist, wobei die exprimierbare Sequenz ein enzymatisch aktives Produkt codiert, das eine Reaktion katalysieren kann, welche ein elektronisches Signal erzeugt, das in einer elektrochemischen Messung nachweisbar ist; (b) eine elektrochemische Zelle, wobei die elektrochemische Zelle eingerichtet ist, um die Bakteriophagen und Bakterienzellen aufzunehmen und zu halten sowie um die elektrochemische Messung durchzuführen.