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"Verfahren zur selektiven Ztlchtung bzw. Ver-
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edelung von Pflanzenzellenkulturen" Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur selektiven ZUchtung bzw. zur Veredelung von Pflanzenzellenkulturen bzw.
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von gezüchteten Pflanzenzellen, insbesondere ein Verfahren zur selektiven
Züchtung von Pflanzenzellen, die sich durch mindestens eine spezielle Eigenschaft
auszeichnen, aus Pflanzenzellenkulturen bzw. gezüchteten Pflanzenzellen.
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Zur selektiven Züchtung von Pflanzenzellen, die sich durch mindestens
eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, aus gezüchteten Pflanzenzellen bzw. Pflanzenzellenkulturen
bedient man sich gemäß der Literaturstelle "Plant Cell Tissue Culture11, Seite 50,
Herausgeber: Harada und Komamine, Rikogaku-sha, Tokio, Japan, einer Plattenkulturmethode.
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Hierbei wird die Plattenkulturmethode, die zur Reindarstellung von
Mikroorganismen bei der Mikroorganismenzüchtung dient, auf die Pflanzenzellenzüchtung
übertragen. Bei diesem Zuchtungsverfahren wird ein gezüchtetes Pflanzenzellenaggregat
zum Suspendieren von Zellenkulturen in einem flüssigen Medium geschüttelt, worauf
die erhaltene Zellensuspension mit Hilfe eines Filters eines Porendurch messers
von 200 µm oder darunter filtriert wird. Hierbei
erhält man ein
Filtrat mit Zellenaggregaten (Zellenzahl: etwa 1 bis 6) einer gegebenen Größe. Danach
wird das erhaltene Filtrat in einem gelösen Agarmedium dispergiert.
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Die erhaltene Dispersion wird auf einer Petrischale ausgestrichen
und anschließend inkubiert. Das geschilderte Verfahren ist nicht besonders gut geeignet,
da die eingebetteten Zellen im Falle einer zu niedrigen Zellenkonzentration sich
weder teilen noch wachsen und bestimmte Arten von Pflanzenzellenkulturen ungeachtet
der Zellenkonzentration überhaupt nicht wachsen. Allgemein gesagt, kann in einigen
Fällen die Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zellenarten zur Ausbildung einer
speziellen Eigenschaft (bei ihnen) führen. Selbst wenn bei der beschriebenen Plattenkulturmethode
Zellen mit der (bei ihnen) entwickelten speziellen Eigenschaft gewachsen sind, zeigen
diese Zellen die betreffende spezielle Eigenschaft nach ihrer Vermehrung nicht (mehr)
immer.
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Der Erfindung lag somit die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung der
geschilderten Nachteile des bekannten Züchtungsverfahrens für Pflanzenzellenkulturen
ein auf die selektive Züchtung sämtlicher Arten von Pflanzenzellenkulturen anwendbares
Verfahren zur Züchtung von Pflanzenzellen zu entwickeln, nach welchem eine selektive
Züchtung von Zellen ungeachtet der Zellenkonzentration und unter Berücksichtigung
der Wechselwirkung zwischen (einzelnen) Zellen möglich ist.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur selektiven Züchtung
von Pflanzenzellen, die sich durch mindestens eine spezielle Eigenschaft auszeichnen,
aus gezüchteten
Pflanzenzellen, die aus einer höheren Pflanze induziert
wurden, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man (a) ein gezüchtetes Pflanzenzellenaggregat
in Segmente einer nominalen Größe von 2 bis 10 mm unterteilt, (b) die erhaltenen
Segmente in einem statischen Kulturgefäß zu den entsprechenden Zellenaggregaten
wachsen und sich vermehren läßt und (c) aus den erhaltenen Zellenaggregaten diejenigen
Zellenaggregate auswählt, die sich durch mindestens eine der (gewünschten) speziellen
Eigenschaften auszeichnen.
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Unter der Definition "Segmente einer nominalen Größe von 2 bis 10
mm" sind Segmente in Form dreidimensionaler Gebilde, die sowohl regelmäßig als auch
unregelmäßig sein können, z.B. Würfel, Kugeln, Säulen, Prismen und ähnliche Formen
einer nominalen oder maximalen Größe von 2 bis 10 mm, zu verstehen.
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Das selektive Züchtungsverfahren gemäß der Erfindung ist wirksamer
als sämtliche bekannten Verfahren, da die Verfahrensmaßnahmen einfacher sind und
die Dauer der selektiven Züchtung kürzer ist. Darüber hinaus kann es auf die verschiedensten
Pflanzenzellenkulturen unterschiedlicher phytochemischer Eigenschaften angewandt
werden. Es eignet sich auch zur selektiven Züchtung von Pflanzenzellenkulturen mit
mehreren speziellen Eigenschaften.
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Die Erfindung wird anhand des in der Zeichnung schematisch dargestellten
und auf das später folgende Beispiel 2 Bezug nehmenden Selektionsschemas für Selektionsmaßnahmen
bei gezüchteten
Euphorbia millii-Zellenaggregaten beschrieben.
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Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbare Pflanzenzellenkulturen
erhält man entweder durch nach üblichen Verfahren durchgeführtes Induzieren von
Kallus aus einem beliebigen Organ oder Gewebe, z.B. Wurzeln, Stengeln, Blättern,
Blüten, Pollen und Wachstumspunkten oder deren Zellen, und anschließende sterile
Züchtung des betreffenden Kallus oder durch Beimpfen eines Pflanzenkörpers mit dem
Bakterium Agrobacterium tumefaciens" zur Induzierung von Tumorgewebe und anschließende
sterile Züchtung der betreffenden Gewebemasse.
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Unter den Ausdruck "spezielle Eigenschaft'! fallen physiologische,
biochemische und/oder morphologische Eigenschaften.
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Physiologische Eigenschaften sind beispielsweise verschiedene Arten
von Widerstandsfähigkeit, z.B. Widerstandsfähigkeit gegenüber hohen oder tiefen
Temperaturen, Salzbeständigkeit, Säure- und/oder Alkalienbeständigkeit und dergleichen,
oder fehlende Erfordernisse für (bestimmte) Nährstoffe, wie Vitamine, Aminosäuren
oder Auxine. Biologische Eigenschaften sind beispielsweise die Eigenschaft der Produktion
von primären oder sekundären Metaboliten oder die Eigenschaft zur Umwandlung organischer
Verbindungen in den Pflanzenkörper. Unter morphologische Eigenschaften fällt beispielsweise
die Aggregationseigenschaft.
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Wie bereits angedeutet, besteht die Erfindung in einer selektiven
Züchtung von Pflanzenzellen im Rahmen der noch im einzelnen zu beschreibenden Stufen
(a), (b) und (c). Diese Stufen werden nunmehr näher erläutert:
Stufe
(a) (Unterteilung eines gezüchteten Pflanzenzellenaggregats zu Segmenten) In dieser
Stufe wird ein auf einem festen Medium gewachsenes Pflanzenzellenkulturaggregat
in Segmente einer gewünschten sichtbaren Größe unterteilt, um die Größe der Segmente
gleichmäßig zu gestalten. Dies erfolgt zur Eliminierung des Einflusses der Größe
des Explantats auf das Wachstum der Pflanzenzellen u.dgl. sowie zur Erleichterung
des Wachstums und der Vermehrung der Segmente in der zweiten Stufe (b) und der Selektion
der Zellenaggregate in der dritten Stufe (c). In der folgenden Verfahrensstufe kann
man Segmente von Zellenaggregaten einer nominalen Größe von 2 bis 10 mm gut, solche
einer nominalen Größe von 2 bis 5 mm besonders gut wachsen lassen. Segmente einer
nominalen Größe von unter 2 mm eignen sich nicht, da sich Einzelzellen solcher Segmente
nicht aktiv teilen und die Wachstumsgeschwindigkeit in der nächsten Stufe zu gering
ist, was dazu führt, daß der Selektionsgrad sinkt. Andererseits eignen sich auch
Segmente einer nominalen Größe von über 10 mm nicht besonders, da die verminderte
Anzahl der Segmente eine Verunreinigung mit Zellen, bei denen die jeweils (gewünschte)
spezielle Eigenschaft nicht so deutlich ausgeprägt ist, zur Folge hat. Auch hier
sinkt somit der Selektionsgrad. In letzterem Falle sinkt, da die Zellenaggregate
großdimensioniert sind, auch der Wirkungsgrad des Verfahrens selbst.
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Ein Zellenaggregat läßt sich nach beliebigen üblichen Verfahren zur
künstlichen Teilung lebender Materialien zu Seg menten einer nominalen Größe innerhalb
des angegebenen Bereichs,
beispielsweise von 2 bis 10 mm, unterteilen.
Um die Segmentgröße möglichst gleichmäßig zu machen, wird das Zellenaggregat vorzugsweise
mit Hilfe eines scharfkantigen Werkzeugs, z.B. eines Skapells oder einer Rasierklinge,
geteilt.
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Stufe (b) (Wachstum und Vermehrung der Segmente in einem Kulturgefäß)
In dieser Stufe werden die in Stufe (a) erhaltenen Segmente in einem statischen
Kulturgefäß gezüchtet. Als Kulturgefäß eignet sich jedes üblicherweise zur Zellenzüchtung
verwendbare Kulturgefäß. Bevorzugt wird jedoch ein durchsichtiges flaches Gefäß,
beispielsweise eine Petrischale oder eine Mikrotitrationsplatte, da es bei Verwendung
eines solchen Gefäßes einfach ist, die Segmente zu numerieren und zu züchten, die
wachsenden Segmente derart in konstantem Abstand voneinander zu halten, daß sie
sich nicht mit einem anderen Segment mischen, und die Selektion in der nächsten
Stufe (c) wirksam durchzuführen.
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Im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung kann als Kulturmedium
ein anorganisches synthetisches Medium, z.B.
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White'sches Basalmedium, Murashige'- und Skoog'sches Basalmedium oder
Linsmaier'- und Skoog'sches Basalmedium, jeweils ergänzt durch eine Spur organischer
Verbindungen, z.B. Vitamine, Kohlenstofflieferanten, wie Rohrzucker und Glukose,
Phytohormone, wie Auxin und Cytokinin, und natürliche Extrakte, z.B. Malzextrakt
und Kokosnußmilch, und erforderlichenfalls durch sonstige Zusätze, verwendet werden.
Die Züchtungsbedingungen, z.B. Temperatur der Kultur, Lichteinwirkung und Dauer
der Züchtung (in d) lassen sich den
jeweiligen Gegebenheiten anpassen.
Die Ubertragung der Segmente der Zellenaggregate auf Agarmedium erfolgt im Hinblick
auf eine möglichst einfache Handhabung und die Wirksamkeit auf das Zellenwachstum
vorzugsweise durch bloßes Auftragen der Segmente auf die Oberfläche des Agarmediums.
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Stufe (c) (Selektion von Zellenaggregaten, die sich durch mindestens
eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, von den in Stufe (b) gewonnenen Segmenten
abstammenden Zellenaggregaten) Zum Zweck einer Selektion von Zellenaggregaten, die
sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, kann der Grad des Zellenwachstums
als Hinweis darauf dienen, wenn die spezielle Eigenschaft eine bestimmte Widerstandsfähig-.keit,
ein fehlendes Verlangen nach der Zufuhr bestimmter Stoffe und ein Aggregationsverhalten
ist. Wenn die spezielle Eigenschaft in der Bildung eines Metaboliten oder in der
Umwandlung einer organischen Verbindung in dem Pflanzenkörper ist, kann die Konzentration
des Metaboliten oder die Konzentration der organischen Verbindung als Hinweis oder
Anzeichen für die betreffende spezielle Eigenschaft herangezogen werden. Bei der
Selektion von Zellenaggregaten, die sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen,
mit Hilfe des Wachstumsgrades als Indikator für die betreffende Eigenschaft kann
man die Selektion der Zellenaggregate visuell bewerten. Vorzugsweise erfolgt jedoch
die Bewertung auf der Basis des Wachstumsindex während der Kulturdauer, da der Wachstumsindex
als numerischer Wert darstellbar ist. Bei der Selektion von Zellenaggregaten, die
sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, aufgrund der Konzentration einer
Verbindung als Indikator für
die betreffende Eigenschaft kann die
Selektion der Zellenaggregate - falls möglich (z.B. wenn die Zellen ein natUrliches
Pigment, z.B. ein Anthocyanin, Carotenoid oder Naphthochinon enthalten - ebenfalls
visuell bewertet oder überwacht werden. Vorzugsweise erfolgt jedoch auch hier die
Bewertung dadurch, daß man die Selektion auf einer Ermittlung der Konzentration
der betreffenden Verbindung in den vermehrten Zellenaggregaten basiert, da die Konzentration
als numerischer Wert wiedergegeben werden kann.
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Wenn Zellenaggregate selektiert werden, kann aus den erhaltenen Zellenaggregaten
ein einzelnes Zellenaggregat, bei dem die betreffende spezielle Eigenschaft am deutlichsten
ausgeprägt ist, selektiert werden. Andererseits kann man eine Mehrzahl von Zellenaggregaten,
die sich durch eine spezielle Eigenschaft auszeichnen, selektieren, indem man die
Häufigkeitsverteilung der Zellenaggregate mit unterschiedlichen numerischen Werten
des Indikators für die spezielle Eigenschaft aufstellt, einen Mittelwert und eine
Standardabweichung (d) ermittelt und dann diejenigen Zellenaggregate, die einen
Indikatorwert (Xi) zwischen dem maximalen Wert (Xmax) und dem nicht mehr als dreifachen
Wert der Standardabweichung, vorzugsweise dem nicht mehr als einfachen Wert der
Standardabweichung vom maximalen Wert aufnimmt. Der genannte Indikatorwert ergibt
sich aus der Gleichung: Xmax => Xi => Xmax X 3d.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
werden die derart selektierten Zellenaggregate
wiederholt unterteilt,
gezüchtet und selektiert, d.h. die Verfahrensstufen (a), (b) und (c) können beliebig
oft wiederholt werden. Hierbei erhält man stabile Zellenstämme, bei denen jeweils
mindestens eine spezielle Eigenschaft besonders deutlich ausgeprägt ist.
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Zur Herstellung von Zellenaggregaten im großtechnischen Maßstab können
die selektierten Zellenaggregate in entsprechender Weise wie Mikroorganismen, beispielsweise
in einer statischen oder flüssigen Kultur gezüchtet und vermehrt werden.
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Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.
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Beispiel 1 Junge Triebe von Euphorbia tirucalli werden gründlich mit
Wasser gewaschen und in etwa 5 cm lange Stücke zerschnitten.
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Danach werden die erhaltenen Stücke der jungen Triebe durch 5-minUtiges
Eintauchen in eine 7obige Ethanollösung und anschließendes 10-minütiges Eintauchen
in eine 1obige Chlorkalklösung sterilisiert. Die sterilisierten Stücke werden in
einem aseptischen Gefäß in steriles destilliertes Wasser getaucht und darin gewaschen,
um den Ethanol und Chlorkalk vollständig zu entfernen. Die derart behandelten Stücke
der jungen Triebe werden nun mit einem sterilisierten Skalpell zu 0,5 bis 1 cm langen
Segmenten zerschnitten. Die hierbei erhaltenen sterilen Segmente werden steril auf
synthetisches Agarmedium gelegt. Das verwendete synthetische Agarmedium erhält man
durch Zusatz von 3 , (w/v)
Rohrzucker, 0,2 46 (w/v) Malzextrakt,
1 ppm 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,1 ppm Thiaminhydrochlorid, 0,5 ppm Pyridoxinhydrochlorid,
0,5 ppm Nikotinsäure, 2 ppm Glycin und 100 ppm Inosit zu Murashige'- und Skoog'schem
Basalmedium, Einstellen des pH-Werts der Mischung mittels O,ln NaOH auf 6,0, Zusatz
von 0,8 % (w/v) Agar zu dem Gemisch und übliches bekanntes Sterilisieren.
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Die Segmente der auf das geschilderte synthetische Agarmedium gelegten
jungen Triebe werden bei einer Temperatur von 250C unter Licht einer Lichtstärke
von 2000 Lux gezüchtet. Nach etwa 1 Woche läßt sich in der Umgebung der Schnittfläche
der Segmente eine gelblich-weiße Kallusbildung feststellen.
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Nachdem der Kallus auf dem festen Medium 6 Monate lang vermehrt bzw.
verstärkt worden war, wird der vermehrte Kallus einer nominalen Größe von etwa 1
cm mit Hilfe eines sterilen Skalpells in 96 Segmente einer nominalen Größe von etwa
2 mm unterteilt. Diese 96 Segmente werden gewogen, von Nr. 1 bis 96 durchnumeriert
und auf drei Petrischalen eines Durchmessers von jeweils 9 cm mit jeweils 25 ml
des angegebenen, jedoch vitaminfreien synthetischen Agarmediums (d.h. Murashige'-
und Skoogsches Basalmedium, ergänzt durch 3 % (w/v) Rohrzucker, 0,2 % (w/v) Malzextrakt,
1 ppm 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 2 ppm Glycin, 100 ppm Inosit und 0,8 % (w/v)
Agar)transplantiert. Die Segmente werden auf dem Medium bei einer Temperatur von
280C unter Licht einer Lichtstärke von 2000 Lux gezüchtet. Nach 14 Tagen werden
die verschiedenen Zellenaggregate entnommen und gewogen, worauf der Wachstumsindex
des Zellenaggregats errechnet wird. Die erhaltenen Werte für den Wachstumsindex
werden,
wie die folgende Tabelle I ausweist, in eine Reihe gebracht, worauf die Anzahl der
Segmente in jeder Reihe gezählt und ihr Mittelwert und ihre Standardabweichung errechnet
werden. Zwei Zellenaggregate zeigen Wachstumsindizes in einem Bereich zwischen dem
maximalen Wert und dem nicht mehr als Einfachen der Standardabweichung vom maximalen
Wert, nämlich das Zellenaggregat Nr.75 (einer nominalen Große von etwa 8 mm) mit
einem Wachstumsindex von 2,98, und das Zellenaggregat Nr. 36 (einer nominalen Größe
von etwa 7 mm) mit einem Wachstumsindex von 2,55.
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Nun wird das Zellenaggregat Nr. 75 in 36 Segmente und das Zellenaggregat
Nr. 36 in 28 Segmente unterteilt, worauf diese Segmente in der geschilderten Weise
weitergezüchtet werden. Die Ergebnisse finden sich ebenfalls in Tabelle I. Die Unterteilung,
Züchtung und Selektion werden weitere dreimal in der geschilderten Weise wiederholt,
wobei die ebenfalls in Tabelle I aufgeführten Ergebnisse erhalten werden. Nach insgesamt
fünfmal wiederholter Unterteilung, Züchtung und Selektion beträgt der Mittelwert
des Wachstumsindex 5,42. Der Mittelwert für den Wachstumsindex der Vergleichszellenaggregate,
die auf dem vitaminhaltigen Medium gezüchtet wurden, liegt zwischen 5,28 und 5,81.
Dies zeigt, daß im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung Zellen, die keine Vitamine
benötigen und in gleichem Maße wachsen wie Zellen, die Vitamine benötigen, erfolgreich
gewonnen werden können.
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TABELLE I Nach der Nach der Nach der Nach der Nach der ersten zweiten
dritten vierten fünften Züchtung Züchtung Züchtung Züchtung Züchtung Anzahl der
Zellenaggregate 96 64 55 39 36 Wachstumsindex 0 - 0,50 0 0 0 0 0 0,51 -1,00 27 0
0 0 0 1,01 - 1,50 43 0 0 0 0 1,51 - 2,00 19 4 0 0 0 2,01 - 2,50 5 30 0 0 0 2,51
- 3,00 2 16 5 0 0 3,01 - 3,50 0 9 21 0 0 3,51 - 4,00 0 4 18 0 0 4,01 - 4,50 0 1
6 6 0 4,51 - 5,00 0 0 3 13 2 5,01 - 5,50 0 0 1 11 22 5,51 - 6,00 0 0 1 8 10 6,01
- 6,50 0 0 0 1 2 Mittelwert 1,30 2,61 3,64 5,06 5,42 Standardabweichung 0,47 0,54
0,61 0,53 0,33 selektierte Zellenaggregate Wachstumsindex 2,98 4,42 5,81 6,12**
(Zellenaggregat Nr.) (Nr.75) (Nr.3) (Nr.10) (Nr.18) [Anzahl der Segmente]*** [36]
[30] [39] [36] 2,55 3,98 (Nr.36) (Nr.28) [28] [25] Vergleichsversuch* 5,23 5,81
5,56 5,28 5,58
BEMERKUNGEN ZU TABELLE I: *Der Mittelwert des Wachstumsindex
der Zellenaggregate, die in ähnlicher Weise auf einem vitaminhaltigen Medium gezüchtet
wurden. (N = 30).
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**In diesem Fall wird lediglich das Zellenaggregat, dessen Wachstumsindex
am höchsten ist, selektiert.
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***Anzahl der Segmente, die bei der Unterteilung der selektierten
Zellenaggregate erhalten wurden.
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Beispiel 2 Ein gezüchtetes Euphorbia millii-Zellenaggregat P (einer
nominalen Größe von etwa 12 mm), das auf einem festen Medium wachsen gelassen worden
war, wird mit Hilfe eines sterilen Skalpells in 43 Segmente einer nominalen Größe
von etwa 3 mm unterteilt. Diese 43 Segmente werden von Nr. 1 bis Nr. 43 numeriert
und auf eine Petrischale eines Durchmessers von 9 cm mit 25 ml eines synthetischen
Agarmediums übertragen. Das verwendete synthetische Agarmedium erhält man durch
Zusatz von 2 % (w/v) Rohrzucker, 0,2 % Malzextrakt, 10 6M 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure,
0,1 ppm Thiaminhydrochlorid, 0,5 ppm Pyridoxinhydrochlorid, 0,5 ppm Nikotinsäure,
2 ppm Glycin und 100 ppm Inosit zu Murashige'- und Skoog'schem Basalmedium, Einstellen
des pH-Wertes des Gemischs mit O,ln NaOH auf 6,0, Zusatz von 0,8 % (w/v) Agar und
übliches Sterilisieren des Ganzen.
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Die 43 Segmente werden auf dem Medium bei einer Temperatur von 280C
unter Licht einer Lichtstärke von 3000 Lux gezüchtet. Nach 10 Tagen werden sämtliche
43 Zellenaggregate einer nominalen Größe von etwa 5 bis 8 mm, die durch Wachstum
und
Vermehrung aus den Segmenten erhalten wurden, entnommen und erneut mit Hilfe eines
sterilen Skalpells in Segmente einer nominalen Größe von etwa 3 mm unterteilt. Hierbei
wird jedes Zellenaggregat in etwa 4 bis 7 Segmente unterteilt. Jedes dieser 4 bis
7 Segmente wird aufgenommen, gewogen und 1 h lang in 5 ml einer 25'eigen methanolischen
Salzsäure eingeweicht, worauf die Absorption der methanolischen Lösung bei 530 nm
max des Pigments) gemessen wird. Das Pigmentgewicht und der Pigmentgehalt der 43
Segmente ergibt sich aus der Eichkurve.
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Hierauf werden aufgrund dieser Werte sechs von den ursprünglich 43
Zellenaggregaten (aus denen die sechs Segmente mit dem höchsten Pigmentgehalt herrühren),
d.h.
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die Zellenaggregate Nr. 6, 18, 30, 36, 40 und 43, entsprechend dem
in der Zeichnung dargestellten Selektionsschema und der folgenden Tabelle II selektiert.
Daraufhin werden von diesen sechs Zellenaggregaten herrührende 36 Segmente mit Nr.
1 bis Nr. 36 numeriert, in eine Petrischale eines Durchmessers von 9 cm mit 25 ml
desselben synthetischen Agarmediums, wie es auch für die erste Züchtung verwendet
wurde, übertragen und unter den auch bei der ersten Züchtung eingehaltenen Bedingungen
weitergezüchtet. Sämtliche 36 Zellenaggregate, die durch Wachstum und Vermehrung
aus den genannten 36 Segmenten erhalten wurden, werden in der geschilderten Weise
in Segmente einer nominalen Größe von etwa 3 mm unterteilt, worauf in der geschilderten
Weise der Pigmentgehalt irgendwelcher dieser Segmente colorimetrisch bestimmt wird.
Aufgrund der Pigmentgehaltwerte werden sechs Zellenaggregate von den ursprUnglich
36 Zellenaggregaten (aus denen die betreffenden sechs Segmente mit einem hohen Pigmentgehalt
herrühren), d.h. die
Zellenaggregate Nr. 5, 8, 10, 16, 26 und 30
selektiert.
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Das Ganze wird in entsprechender Weise noch viermal wiederholt (vgl.
das Selektionsschema und Tabelle II). Nach der dritten Züchtung werden sechs von
38 Zellenaggregaten selektiert, nach der vierten Züchtung werden fünf von 32 Zellenaggregaten
selektiert, nach der fünften Züchtung werden fünf von 26 Zellenaggregaten selektiert
und nach der sechsten Züchtung werden fünf von 28 Zellenaggregaten selektiert.
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TABELLE II Anzahl der Selektier- Pigmentgehalt Zellen- te Zellen-
(5'/g Frischgeaggregate aggregate wicht der Zel-Nr. lenaggregate) nach der ersten
43 6 0,0462 Züchtung 18 0,0440 30 0,0458 36 0,0433 40 0,0416 43 0,0428 nach der
zweiten 36 5 0,0653 Züchtung 8 0,0608 10 0,0609 16 0,0612 26 0,0593 30 0,0581 nach
der dritten 38 2 0,0982 Züchtung 6 0,0813 7 0,0996 19 0,0895 21 0,0790 32 0,0886
nach der vierten 32 1 0,143 Züchtung 4 0,130 16 0,148 21 0,131 32 0,115 nach der
fiinften 26 3 0,200 Züchtung 8 0,180 12 0,192 16 0,155 25 0,196 nach der sechsten
28 1 0,266 Züchtung 4 0,270 6 0,280 14 0,261 27 0,258
Aus Tabelle
II geht hervor, daß sich nach sechsmaliger Wiederholung der Unterteilung, Züchtung
und Selektion ein Zellenaggregat eines Pigmentgehalts von 0,280 % isolieren läßt.
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Sämtliche von dem Zellenaggregat Nr. 6 mit dem höchsten Pigmentgehalt
abgeleiteten und nach der sechsten Selektion erhaltenen Segmente werden in einen
100 ml Erlenmeyerkolben mit 50 ml eines einen pH-Wert von 6,0 aufweisenden flüssigen
Mediums in Form von Murashige'- und Skoog'schem Basalmedium, das durch 2 % (w/v)
Rohrzucker, 0,2 % (w/v) Malzextrakt, 106M 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 0,1 ppm
Thiaminhydrochlorid, 0,5 ppm Pyridoxinhydrochlorid, 0,5 ppm Nikotinsäure, 2 ppm
Glycin und 100 ppm Inosit ergänzt worden ist, gefüllt und unter den geschilderten
Bedingungen 14 Tage lang gezüchtet. Danach wird das Kulturgemisch in einen 1 Ltr.-Erlenmeyerkolben
mit 500 ml des beschriebenen flüssigen Mediums überführt, unter den geschilderten
Ziichtungsbedingungen inkubiert und danach filtriert. Hierbei erhält man 105 g gezüchteter
Zellenaggregate. Die erhaltenen Zellenaggregate werden in üblicher bekannter Weise
lyophilisiert, wobei 4,7 g Trockensubstanz erhalten werden.
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Die erhaltene Trockensubstanz wird in einem Mörser verrieben, 24 h
lang in der Kälte in ziege methanolische Salzsäure getaucht und schließlich filtriert.
Der nach dem Filtrieren erhaltene Extrakt wird durch Verdampfen des Methanols bei
einer Temperatur von 400C oder darunter auf etwa 50 ml eingeengt. Das hierbei erhaltene
Konzentrat wird in einen Scheidetrichter überführt, worauf in den
Scheidetrichter
100 ml Äther gegossen werden. Nach gründlichem Schütteln des Gemischs im Scheidetrichter
wird die Ätherphase at;,egossen. Nach mehrmals wiederholter Ätherwäsche wird das
gewaschene Konzentrat unter vermindertem Druck bei einer Temperatur von 40°C oder
weniger zur Trockene eingedampft. Der hierbei erhaltene Verdampfungsrückstand wird
in einer geringen Menge einer O,015'igen methanolischen Salzsäure gelöst. Die erhaltene
Lösung wird durch präparative Dünnschichtchromatographie auf einer dünnschichtchromatographischen
Zelluloseplatte (20 cm x 20 cm) unter Verwendung eines 5:1:5-Gemischs aus Salzsäure,
Essigsäure und Wasser als Entwickler aufgearbeitet.
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Nach der Entwicklung wird ein auf der Platte befindliches rotes Band
abgekratzt und in eine ziege methanolische Salzsäure getaucht. Hierbei erhält man
einen ein rotes Pigment enthaltenden Extrakt. Der erhaltene Extrakt wird unter vermindertem
Druck bei einer Temperatur von 400C oder weniger zur Trockene eingedampft, wobei
218 mg eines dunkelroten Pulvers erhalten werden (4,6 96, bezogen auf das Trockengewicht
der Zellenaggregate, 0,208 5', bezogen auf das Frischgewicht der Zellenaggregate).
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Das erhaltene rote Pigment wird auf einem handelsüblichen Chromatographierpapier
(Toyo Nr. 51) einer Papierchromatographie unterworfen. Chromatographiert wird mit
dem Lösungsmittelsystem: n-Butanol/Essigsäure/Wasser (4:1:5), obere Schicht; n-Butanol/Chlorwasserstoffsäure/Wasser
(5:1:4), obere Schicht; 1 % Chlorwasserstoffsäure, und Essigsäure/Chlorwasserstoffsäure/Wasser
(15:3:82). Danach werden die Rf-Werte des Pigments ermittelt. Die ermittelten Rf-Werte
sind mit den entsprechenden Rf-Werten
des authentischen Chrysanthemins,
das aus Delaware"Trauben extrahiert und isoliert worden war identisch. Es erfolgt
auch eine chemische Strukturbestimmung. Das UV-Spektrum des erhaltenen roten Pigments
entspricht ebenfalls dem W-Spektrum des authentischen Chrysanthemins.
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