JPH0866193A - イネｎａｄｈ依存性還元酵素遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 イネＮＡＤＨ依存性還元酵素をコードするＤ
ＮＡ配列を提供する。 【構成】 イネＮＡＤＨ依存性還元酵素をコードするＤ
ＮＡ配列は配列表の配列番号１で特定される。この遺伝
子は例えばイネ葯ｃＤＮＡライブラリーから、目的の遺
伝子をスクリーニングすることにより得ることができ
る。 【効果】 本発明のＮＡＤＨ依存性還元酵素遺伝子を植
物で発現するプロモーターに連結し、植物に遺伝子導
入、発現することにより、植物病害性菌の生産する毒
素、及びその周辺の代謝物の調節を行うことが可能であ
り、イネ等の植物に、病原性菌に対する抵抗性を付与す
ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、イネなどの植物に遺伝
子導入することにより植物病原性菌に対する抵抗性を付
与することを目的とした育種技術に利用できるＮＡＤＨ
依存性還元酵素遺伝子に関し、更にイネＮＡＤＨ依存性
還元酵素遺伝子を含むｃＤＮＡ遺伝子配列に関する。

【０００２】

【従来の技術】イネの栽培において、稲熱病等の植物病
原性菌による収量の低下は問題となっており、これまで
化学薬剤を中心とする防除が行われている。このような
化学薬剤による防除は一般に使用時期が病害発生直前と
制限され、病害発生後に処理した場合には効果は殆どな
く、このため植物病原性菌による被害は大きい。一方、
遺伝学的解析において、種々の病害抵抗性遺伝子の存在
が推定され、染色体地図と関連づけられている。このよ
うな種々病害抵抗性遺伝子を持つ品種の形質、すなわち
その抵抗性遺伝子を、交配育種によりイネ栽培品種に導
入することが望まれており、イネ品種育成において重要
な課題となっている。しかし、これら抵抗性遺伝子は多
数の存在が推定され、染色体地図上に関連づけられてい
るにもかかわらず、その遺伝子レベルで単離、解明され
たものは知られていない。

【０００３】一方、イネ以外の植物においてはキチナー
ゼ、β−１，３−グルカナーゼの両者の遺伝子をタバコ
等に遺伝子導入した例（Ｍ．Ｂ．Ｓｅｌａ−Ｂｕｕｒｌ
ｌａｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，１０１，８５７（１９９３））、タバコ野火病菌
の生産する毒素の解毒酵素遺伝子を導入した例（Ｖ．Ｎ
ｉｋｏｌａｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，
２９Ａ，３，Ｐｔ．２，８７Ａ（１９９３））等、病原
性菌に抵抗性を付与することに成功している。また、ト
ウモロコシにおいてその病原性菌Cochliobolus carbonu
mの生産するＨＣ毒素（Helminthosporium carbonum tox
in）を還元し解毒する酵素であるＨＣ毒素還元酵素の遺
伝子が単離され、染色体の抵抗性遺伝子座と一致するこ
とを証明した例（Ｇ．Ｓ．Ｊｏｈａｌ ｅｔ ａｌ．，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８，９８５（１９９２））があ
る。

【０００４】イネにおいては病害抵抗性遺伝子として単
離された遺伝子はキチナーゼ、β−グルカナーゼ、ファ
イトアレキシン合成酵素、パーオキシダーゼなどがある
が、これら遺伝子と病害抵抗性の間には何等相関が認め
られたという報告はない。また、イネに稲熱病菌が感染
する際の抵抗性機構についての研究が行われているが、
感染初期にイネの感染局部細胞での過敏細胞死による病
原性菌の生育を阻害する機構と、細胞膜の変化により感
染を阻害する機構の２種類の抵抗性機構が示唆されてい
るものの、その病害抵抗性に関与する遺伝子は未解明の
ままである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このようにイネの病害
発生と抵抗性に関する研究は行われているが、病原性菌
の感染機構と植物の抵抗性発現機構が非常に複雑である
こと、また、実験室レベルでの抵抗性と圃場抵抗性との
間でも相関が得られない等の事柄が研究を困難にしてお
り、遺伝子レベルでの進展はこれまでのところ報告され
ていない。

【０００６】しかし、病害抵抗性に関与する遺伝子とし
ては複数存在し、種々の抵抗性機構に関与すると考えら
れている。したがって、イネの稲熱病等の病害抵抗性遺
伝子は、その全長の遺伝子を単離し、単離遺伝子の構造
及びタンパク質の一次構造を明らかにすると共に、イネ
植物体で発現させ、その機能を詳細に検討する事は必要
であろう。本発明において病害抵抗性遺伝子の一つとし
て病原性菌の生産する毒素の解毒能を持つＮＡＤＨ依存
性還元酵素遺伝子を単離し、その構造解析するととも
に、植物へ遺伝子導入することができれば、病害抵抗性
をイネ等の植物に容易に付与することが可能となる。

【０００７】すなわち、イネＮＡＤＨ依存性還元酵素の
還元反応による植物病原性菌に対する抵抗性機能を応
用、利用することを目的に、この遺伝子を植物に導入し
ていくためにはその全長遺伝子を単離することが不可欠
である。従って本発明の目的はイネＮＡＤＨ依存性還元
酵素をコードするＤＮＡ配列を提供し、さらにその配列
を含み、かつ適当な植物発現ベクターに組み込むことの
できる全長ＮＡＤＨ依存性還元酵素遺伝子を提供するこ
とにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上述したト
ウモロコシから単離されているＨＣ毒素還元酵素と推定
される遺伝子から発現されたタンパク質がその病原性菌
Cochliobolus carbonumの生産するＨＣ毒素を還元し、
解毒することにより抵抗性を示す報告に注目し、イネ葯
ｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡのランダムシーク
エンシングにより、これらと相同性の高い部分配列を持
つｃＤＮＡクローンを単離した。さらに、これをプロー
ブとしてイネの葯からイネＮＡＤＨ依存性還元酵素全長
ｃＤＮＡを単離することに成功し、さらにこの遺伝子が
稲熱病抵抗性遺伝子座に関係することを明らかにし、本
発明を完成した。

【０００９】以下、本発明を具体的に説明する。本発明
のイネＮＡＤＨ依存性還元酵素をコードするＤＮＡ配列
は具体的には配列表の配列番号１に示されるごとく単一
のオープンリーディングフレームを含んでいることから
なる。このオープンリーディングフレームは５’末端は
塩基配列１０〜１２のＡＴＧから翻訳開始されその上流
に９塩基の非翻訳領域を含み、３’末端は塩基配列１０
９９〜１１０１のＴＧＡで終了し、さらに、その下流に
ポリ（Ａ）付加シグナルと推定される配列ＴＡＡＴＡＡ
が存在しているので、完全長を含んでいるといえる。ま
たこの単離したｃＤＮＡの塩基配列はプローブとして用
いたｃＤＮＡ断片の塩基配列を含んでおり、既に単離さ
れているトウモロコシの塩基配列とＮＡＤＨ結合領域と
その下流において相同性が高いことからイネＮＡＤＨ依
存性還元酵素をコードする全塩基配列を含むといえる。

【００１０】この塩基配列から推定されるアミノ酸配列
を同時に配列表の配列番号１に併記する。アミノ酸配列
から推定されるタンパク質は３６３アミノ残基よりな
り、推定される分子量は３９２３４ダルトンである。推
定されるタンパク質のアミノ酸配列を、これまでに明ら
かにされているトウモロコシ由来のＨＣ毒素還元酵素の
アミノ酸配列と比較したところ相同性は７３％であり、
ＮＡＤＨ結合領域と推定されている領域は保存されてい
た。

【００１１】注目すべき点はこのＮＡＤＨ依存性還元酵
素遺伝子は遺伝子マッピングにより、稲熱病抵抗性遺伝
子として推定されているＰｉ−ｉ遺伝子座に同定される
こと、すなわち今回単離したＮＡＤＨ依存性還元酵素が
稲熱病菌の生産する化合物もしくはイネに内在する抵抗
性に関与する化合物を還元する機構等により、イネ植物
体内で発現された場合、稲熱病に対し抵抗性を発現する
ことである。

【００１２】以上のようにイネＮＡＤＨ依存性還元酵素
のアミノ酸の一次配列とその機能的特徴から、本発明の
ＤＮＡ配列は特徴付けることができる。

【００１３】本発明のイネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺伝
子は例えばイネ葯からｍＲＮＡを調製し、次にｃＤＮＡ
を合成し、このｃＤＮＡライブラリーから、目的の遺伝
子をスクリーニングすることにより得ることができる。

【００１４】イネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺伝子のスク
リーニングとしては例えばプローブを作製し、例えばプ
ラークハイブリダイゼーションを行えば良い。スクリー
ニングに用いるプローブとしては目的タンパク質中の
一部のアミノ酸配列をもとに合成したオリゴＤＮＡを用
いるいる場合、目的タンパク質をコードする異種生物
のＤＮＡ断片を用いる場合、ｃＤＮＡライブラリーの
ランダムシークエンシングにより相同性の確認されたＤ
ＮＡ断片を用いる場合などがある。本遺伝子はＮＡＤＨ
と結合性を持つことから、ＮＡＤＨ依存性タンパク質の
保存性の高い領域として明らかにされている領域（配列
番号１に表す塩基配列番号５２〜１２３）を合成しプロ
ーブとして用いることができる。また、トウモロコシの
ＨＣ毒素還元酵素遺伝子と約８０％の相同性を示すこと
から、ＨＣ毒素還元酵素遺伝子中のタンパク質コーディ
ング領域に相当する領域のＤＮＡを合成するかＰＣＲ
（Polymerase chain reaction）法で増幅することによ
りプローブとして用いることができる。また、イネ葯ｃ
ＤＮＡライブラリーのランダムシークエンスで解析した
遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いたホモ
ロジー検索により、既に報告されている遺伝子と相同性
の高いクローンを単離することができる（Uchimiya, H.
ら、Plant J., 2(6), 1005-1009 ページ, 1992, 参
照）。これらの中から、トウモロコシのＨＣ毒素還元酵
素と相同性のある一部の遺伝子配列を含むクローンを単
離し、このＤＮＡ断片をプローブとして用いることがで
きる。

【００１５】一方、イネのカルスや葯等の植物組織から
ｍＲＮＡを抽出し、これを鋳型と逆転写酵素を用いてｃ
ＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ反応によって２本鎖化し
たものを市販のファージベクターあるいはプラスミドベ
クター等にクローニングし、大腸菌などに形質転換する
ことによりｃＤＮＡライブラリーを作製することができ
る。各種ｃＤＮＡ合成キットが市販されているのでこれ
らを使用しても良い。ライブラリーの作製に使用するベ
クターは、多数市販されておりこれらを使用することが
できる。さらに、上記で得た例えばｃＤＮＡランダムシ
ークエンシングにより得られた部分ＤＮＡ断片をプロー
ブとして用いプラークハイブリダイゼーションなどによ
り、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、プロー
ブと相補性を持つＤＮＡを含むクローンを選抜し、該ク
ローンよりＤＮＡを調製し、これを詳細に解析すること
により、イネＮＡＤＨ依存性還元酵素の全長遺伝子を含
むｃＤＮＡクローンを得ることができる。クローン化さ
れたｃＤＮＡの解析はダイデオキシ法などによりその塩
基配列を決定することができ、市販されているキット、
または蛍光シークエンサーも使用できる。本発明におい
て、ｃＤＮＡライブラリーを構築するための材料とする
植物組織及びその方法をなんら限定するものではない。

【００１６】単離されたイネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺
伝子は全長を含むことから、ｔａｃプロモーターやＰｌ
プロモーターなどに結合することにより、大腸菌などの
微生物で生産することが可能となり、この遺伝子のコー
ドするタンパク質を得ることが可能となる。本タンパク
質にはＮ末端付近にＮＡＤＨ依存性タンパク質の保存性
の高い領域（配列番号１に表す塩基配列番号５２〜１２
３）を持つために、この領域を除去した一部のタンパク
質、例えば制限酵素サイトＥｃｏＲＶ（配列番号１に表
す塩基配列番号４２６）で切断したＣ末端領域を大腸菌
などの微生物で生産したタンパク質や配列番号１に表す
アミノ酸配列の一部を合成したペプチド等を抗原とする
ことにより、特異性の高い抗体を作製することも可能で
ある。この全長または一部を含むイネＮＡＤＨ依存性還
元酵素タンパク質を大腸菌などの微生物を用いて生産
し、精製単離したタンパク質を抗原として抗体を作成す
ることは可能である。作製した抗体を、抗原抗体反応を
利用したウエスタンブロッティング法やＥＬＩＳＡ（Ｅ
ｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ
ｔ Ａｓｓａｙ）法などに利用することにより、容易に
イネ植物体でのイネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺伝子の発
現を調べることが可能となる。

【００１７】単離されたイネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺
伝子の染色体上の遺伝子座との関係を調べるためにはＲ
ＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ
Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｎｏｒｐｈｉｓｍ）を用いた遺
伝子マッピング法（ＭｃＣｏｕｃｈ Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ
（Ｙｕｏ Ｃ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），”２２１−２２
８，（１９９３））により特定できる。１００種類以上
のＲＦＬＰマーカーをプローブに用いて本遺伝子のサザ
ンハイブリダイゼーションによる連鎖分析した結果、第
６染色体上にある稲熱病抵抗性遺伝子座（Ｐｉ−ｉ）に
マッピングされ、イネ染色体上に１コピー存在すること
が明らかになった。

【００１８】さらに、このイネＮＡＤＨ依存性還元酵素
をコードする遺伝子は例えばカリフラワーモザイクウイ
ルス由来の３５Ｓプロモーターやトウモロコシ由来のユ
ビキチン遺伝子のプロモーターなどと連結し、植物体中
で本遺伝子が発現するよう構築したベクターを用いるこ
とにより、植物体中での発現系の構築が可能となる。構
築された発現ベクターを例えばタバコ、イネ、トウモロ
コシ、芝などの植物にアグロバクテリウムを利用した方
法やエレクトロポーレーション法、パーティクルガン法
などによって導入することが可能であり、得られる形質
転換体植物のイネＮＡＤＨ依存性還元酵素の生産量を増
大させることが可能となる。その結果として、稲熱病な
どの植物病原性菌に対する抵抗性を植物に付与すること
が可能となる。

【００１９】

【実施例１】以下、本発明を実施例によりさらに説明す
るが、これら実施例のみによって限定されるものではな
い。

【００２０】イネ葯ｍＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成 イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ ｃｖ． Ｈａｙａｙ
ｕｋｉ）の葯約１０００個を液体窒素で凍らせ、乳鉢で
破砕した。これを５ｍｌの１００ｍＭ ＬｉＣｌ、１０
０ｍＭ トリスーＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１％ＳＤＳ溶液と５ｍｌのフェノールを８０℃
に加熱しておいた溶液に加え、攪拌した後、さらに５ｍ
ｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（容量比２
４：１）を加え攪拌した後、１２０００ｒｐｍ、１５分
間遠心し、上清を回収した。これに当量の４Ｍ 塩化リ
チウム溶液を加え、−８０℃に１時間放置したのち、遠
心分離により沈澱を回収した。沈澱に１ｍｌ滅菌水を加
え溶解したのち、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液 １００μｌ
とエタノール ２ｍｌを加え、−８０℃に一晩放置し、
遠心分離により全ＲＮＡを沈澱として回収した。沈澱を
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、０．１％ＳＤＳのＲＮＡ溶解液 ５００μｌに
溶解し、オリゴ（ｄＴ）セルロース（ファルマシア社
製）を１００μｌ加え、６５℃で５分放置したのち、氷
上で急冷し、５Ｍ ＮａＣｌを６０μｌを加え、室温で
１０分間放置した後、遠心分離により沈澱を回収した。
沈澱にＲＮＡ溶解液を５００μｌ加え、６５℃で５分間
遠心し上清を回収した。上清に３Ｍ酢酸ナトリウム ５
０μｌとエタノール １ｍｌを加え−８０℃に１時間放
置し、遠心沈澱により約２μｇのｍＲＮＡを回収した。
ｍＲＮＡを滅菌水１０μｌに溶解し、この５μｌをｃＤ
ＮＡ合成に用いた。ｃＤＮＡ合成はＺＡＰ−ｃＤＮＡ
合成キット（東洋紡社製）を用い、１ｓｔストランド、
２ｎｄストランドｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡを平滑末
端化し、ＥｃｏＲＩアダプターを連結し、制限酵素Ｘｈ
ｏＩで切断し、Ｕｎｉ−ＺＡＰ^TMＸＲベクター（ストラ
タジーン社商標）に連結し、パッキング後、大腸菌ＰＬ
Ｋ−Ｆ’に感染させることによりｃＤＮＡライブラリー
を作製した。

【００２１】ＤＮＡプローブの作製 イネ葯から作製したファージｃＤＮＡライブラリーを大
腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ株に感染させ、in vitroエク
シジョンによりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）プ
ラスミドベクター中にｃＤＮＡを含むプラスミッドを持
つコロニーを作らせ、ＬＢ培地 ５ｍｌで培養した菌体
からプラスミッドＤＮＡを抽出した。それぞれのｃＤＮ
Ａクローンを蛍光シークエンサー（アプライドバイオシ
ステム社製）でランダムシークエンシングし、配列番号
１に表す塩基配列番号６０３以降の約６５０塩基対を含
むｃＤＮＡクローン（ＹＫ７５６）を得た。このｃＤＮ
Ａ断片の５’末端の約３００ベースのＤＮＡ塩基配列を
トウモロコシのＨＣ毒素還元酵素の遺伝子配列とホモロ
ジー比較した結果、約７８％の相同性があった。このク
ローンのプラスミッドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化し、アガロース電気泳動により約６５０塩基対からな
るＤＮＡ断片を回収し、ＤＩＧ ＤＮＡラベリングキッ
ト（ベーリンガーマンハイム社製）により標識すること
によりプローブとした。

【００２２】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング さらに、５’上流約６００ベースを含む全長ｃＤＮＡを
取得するためにＹＫ７５６クローンから調製したＤＮＡ
断片をプローブとして、プラークハイブリダイゼーショ
ン法によりスクリーニングした。イネ葯から作製したフ
ァージｃＤＮＡライブラリーを大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕ
ｅ株に感染し、プレート上に１０万個のプラークを作ら
せ、これにナイロン膜ＨｙｂｏｎｄＮ⁺（アマシャム社
製）を置き、１分間放置した。次にこの膜を０．５Ｍ
ＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ溶液で変性させ、０．５
Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液で中和させ、さらに２ｘＳＳＣ（０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）溶液で洗浄した
後、この膜を乾燥させた。この膜をハイブリダイゼーシ
ョン溶液中で４２℃で１時間放置し、ＤＩＧ標識したプ
ローブを含むハイブリダイゼーション溶液に交換し、４
２℃で１晩ゆっくり振盪した。この膜を２ｘＳＳＣ、
０．１％ ＳＤＳ溶液中で室温、５分間２回洗浄し、さ
らに０．１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ溶液中で６８
℃、１５分間２回洗浄した。この膜をＤＩＧ蛍光検出キ
ット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて陽性クロ
ーンを検出した。約４００ｘ１０⁴の組換え体から６個
の陽性クローンを得た。これらのクローンをin vitro
エクシジョンによりプラスミドベクターにした後、それ
ぞれのクローンからプラスミッドＤＮＡを抽出した。制
限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロース電気泳動により
挿入されているｃＤＮＡを調べ、最長の約１２００ベー
スのＤＮＡ断片を含むｃＤＮＡクローンＹＫ１を得た。

【００２３】ｃＤＮＡクローンのシークエンス クローニングしたｃＤＮＡクローンは制限酵素ＳａｃＩ
で２個のＤＮＡ断片に切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ（−）ベクターにサブクローンした。５’側約７
００ベースＤＮＡ断片はさらに制限酵素ＥｃｏＲＶ、Ｘ
ｈｏＩで切断し、小断片とした後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ ＳＫ（−）にサブクローンした。３’側約７００
ベースＤＮＡ断片はさらに制限酵素ＰｓｔＩで切断し、
小断片とした後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）
にサブクローンした。これらの得られたクローンをＴ７
プライマーとＴ３プライマー（東洋紡社製）を用いて、
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｈｉｇｈ Ｋｉｔ（東洋紡社
製）により、シークエンスし、塩基配列を決定した。得
られた塩基配列を配列表の配列番号１に示す。

【００２４】塩基配列とアミノ酸配列の解析 ＤＮＡとアミノ酸配列はＳＤＣ−ＧＥＮＥＴＹＸ（ＳＤ
Ｃソフトウエア開発社製）を用いて解析したところ、既
に単離されているトウモロコシのＨＣ毒素還元酵素との
み相同性が認められ、その程度は遺伝子レベルで約８０
％、アミノ酸レベルで約７３％であった。タンパク質の
Ｎ末端付近にＮＡＤＨの結合部位に保存されている配列
があり、この領域において他のペチュニアなどのＮＡＤ
Ｈ依存性のジヒドロフラボノール−４−還元酵素などと
相同性が認められ、本タンパク質がＮＡＤＨを補酵素と
することが明らかとなった。また、染色体上へのマッピ
ングはＲＦＬＰマーカーを用いたササンハイブリダイゼ
ーションによる連鎖分析の解析の結果から、第６染色体
上のＰｉ−ｉ遺伝子座上へマッピングされ、イネＮＡＤ
Ｈ依存性還元酵素遺伝子が稲熱病抵抗性遺伝子座の一つ
であるＰｉ−ｉであること、さらに本遺伝子が染色体上
に１コピー存在することが明らかとなった。

【実施例２】

【００２５】大腸菌でのイネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺
伝子の発現および発現タンパク質の精製 得られたｃＤＮＡクローンは制限酵素ＥｃｏＲＩで消化
し、タンパク質翻訳領域を含む約１．３ＫｂのＤＮＡ断
片として回収した。さらに、グルタチオン−Ｓ−トラン
スフェラーゼと融合タンパク質として大腸菌での発現ベ
クターｐＧＥＸ２Ｔ（ファルマシア社製）の制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩサイトに挿入した。構築したベクターで大腸菌
ＪＭ１０９株を形質転換し、５０ｐｐｍアンピシリン添
加のＬＢ培地で１５時間培養した後、１ｍＭ ＩＰＴＧ
（イソプロピル−β−チオガラクトシド）で誘導するこ
とにより、ＹＫ１融合タンパク質を発現誘導した。培養
後の菌体を１ｘＰＢＳバッファー中で超音波破砕し、遠
心分離により上清を回収した。上清中の融合タンパク質
はグルタチオンセファロースカラム（ファルマシア社
製）に吸着させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によ
り、分子量は約６万ダルトンであった。グルタチオンセ
ファロースカラムに吸着した融合タンパク質はトロンビ
ン切断溶液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂）中でトロンビンで切断することによりカラムから
ＹＫ１タンパク質が遊離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳
動で調べた結果、分子量約４万ダルトンであり、遺伝子
配列から推定されるアミノ酸配列からの計算値３９２３
４ダルトンとほぼ一致した。約７ｌの培養菌体から約５
ｍｇのＹＫ１タンパク質を回収した。

【００２６】さらに粗精製したＹＫ１タンパク質のＮＡ
ＤＨに対する結合性を調べるためにＣｉｂａｃｒｏｎ
Ｂｌｕｅ ３Ｇ−Ａをセルロファインカラムに固定した
ブルーセルロファイン（生化学工業社製）を用いて調べ
た。８ｍｌの５０ｍＭトリス−・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
溶液に溶解したＹＫ１タンパク質４．７ｍｇを１０ｍｌ
のブルーセルロファインカラムに付し、１００ｍｌ同溶
液で洗浄した後に５０ｍｌの５ｍＭ ＮＡＤを含む溶出
液で溶出し、溶出液を５ｍｌづつ分画することにより溶
出画分（フラクションＮｏ．１〜１０）を回収した。各
溶出画分のタンパク質含量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気
泳動パターンを調べた結果、ＹＫ１タンパク質はフラク
ションＮｏ．３〜６に溶出され、２．２ｍｇの均一のＹ
Ｋ１タンパク質を得た。回収率は４７％であった。精製
したイネＮＡＤＨ依存性還元酵素タンパク質を抗原とし
てウサギに注射することにより、その血清から抗体を得
ることができる。さらに、ブルーセファロースカラムに
吸着したＹＫ１タンパク質はＮＡＤにより特異的に溶出
されることから、ＹＫ１タンパク質が補酵素であるＮＡ
Ｄに結合する能力を持ち、ＮＡＤなどのニコチンアミド
ジヌクレオチド類化合物を補酵素とする反応を触媒する
ことが明らかにされた。

【実施例３】

【００２７】植物細胞での発現ベクターの構築 得られたｃＤＮＡクローンＹＫ１の３’下流に存在する
制限酵素ＨｉｎｄIIIサイトを切断した後、４ｄＮＴＰ
存在下、Ｋｌｅｎｏｗ酵素処理することにより平滑末端
化し、ＢａｍＨＩリンカー（東洋紡社製）を挿入した。
ＨｉｎｄIIIサイトをＢａｍＨＩサイトに変換したプラ
スミッドをＢａｍＨＩで切断することによりＹＫ１の全
長を含むｃＤＮＡ断片を単離した後、植物の発現ベクタ
ーｐＡＨＣ１７のユビキチンのプロモーターの下流に存
在するＢａｍＨＩサイトに挿入した。構築した発現ベク
ターはユビキチンのプロモーターにより発現制御され、
エレクトロポーレーション法、ポリエチレングリコール
法、パーティクルガン法などを用いることによりイネな
どの植物に形質転換することが可能であり、さらにイネ
ＮＡＤＨ依存性還元酵素を発現することが可能である。

【００２８】

【発明の効果】本発明によってイネＮＡＤＨ依存性還元
酵素をコードするＤＮＡ配列が提供される。これによっ
て、イネ等の植物体に形質転換することが可能になり、
さらに植物中での本酵素の関与する植物病害抵抗性反応
を調節することにより、植物の病害抵抗性の改善、代謝
系の調節等の植物育種の端緒が開ける。

【００２９】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：1272 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イネ（Oryza sativa） 細胞の種類：葯 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：10..1098 特徴を決定した方法：P GCGGCGGCA ATG GCG GAA GAG GGG AGG AGC GGC GGC GTC GCC GGA GAC GGC 51 Met Ala Glu Glu Gly Arg Ser Gly Gly Val Ala Gly Asp Gly 1 5 10 GTC CGG GTG TGC GTC ACC GGA GGC GCC GGC TTC ATC GCC TCG TGG CTC 99 Val Arg Val Cys Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Ala Ser Trp Leu 15 20 25 30 GTG AAG AAG CTC CTC GAG AGA GGC TGC ATC GTC CAT GCC ACG CTG CGA 147 Val Lys Lys Leu Leu Glu Arg Gly Cys Ile Val His Ala Thr Leu Arg 35 40 45 ACG ATG GGA GAT GAG GAG AAG GCC GGG CTG CTC CGG CGG CTC GTC CAC 195 Thr Met Gly Asp Glu Glu Lys Ala Gly Leu Leu Arg Arg Leu Val His 50 55 60 GGC GCG GCG GAG CGG CTG CGG CTG TTC GAG GCC GAT CTC TTC GAC GCC 243 Gly Ala Ala Glu Arg Leu Arg Leu Phe Glu Ala Asp Leu Phe Asp Ala 65 70 75 GCC ACC TTC GGG CCG GCG ATC GCC GGC TGC CAG TTC GTC TTC CTC ATC 291 Ala Thr Phe Gly Pro Ala Ile Ala Gly Cys Gln Phe Val Phe Leu Ile 80 85 90 GCC ACG CCG TAC GGG CTG GAG GCC TCC AAC TCC AAG TAC AAG AAC ACG 339 Ala Thr Pro Tyr Gly Leu Glu Ala Ser Asn Ser Lys Tyr Lys Asn Thr 95 100 105 110 GCG GAT GCG GCA GTG GAC GCG GTG CGC GAG ATC CTC CGG CAA TGC GCG 387 Ala Asp Ala Ala Val Glu Ala Val Arg Glu Ile Leu Arg Gln Cys Ala 115 120 125 GAA TCC AAG ACG GTG AAG CGC GTC ATC CAC ACC GCC TCG ATA TCC ACC 435 Glu Ser Lys Thr Val Lys Arg Val Ile His Thr Ala Ser Ile Ser Thr 130 135 140 GCC TCG CCG TTG ATC GAC GTC CCC GGC GCC GGC GTC GGC GCC GCC GGG 483 Ala Ser Pro Leu Ile Asp Val Pro Gly Ala Gly Val Gly Ala Ala Gly 145 150 155 TAC AGG GAC TTC ATC GAC GAG TCC TGC TGG ACT CCG CTC GAC GTC GAC 531 Tyr Arg Asp Phe Ile Asp Glu Ser Cys Trp Thr Pro Leu Asp Val Asp 160 165 170 TAC CCA CTC CGG AGC GCC CAC TTC GAC AAG TAC GTG CTG TCG AAG ATG 579 Tyr Pro Leu Arg Ser Ala His Phe Asp Lys Tyr Val Leu Ser Lys Met 175 180 185 190 ATG TCG GAG AAG GAG CTC CTG GGC TAC AAC GAC GGA GAG GGC CGG GAG 627 Met Ser Glu Lys Glu Leu Leu Gly Tyr Asn Asp Gly Glu Gly Arg Glu 195 200 205 TTC GAG GTG GTC ACC CTG CTG TGC GGC CTC GTG GCC GGC GAC ACG GTC 675 Phe Glu Val Val Thr Leu Leu Cys Gly Leu Val Ala Gly Asp Thr Val 210 215 220 CTC GGC CGC GCC CCG GAG ACG CTG GAG TAC GCC GTG TCG CCG GTG TCC 723 Leu Gly Arg Ala Pro Glu Thr Leu Glu Tyr Ala Val Ser Pro Val Ser 225 230 235 CGG AAC GAG CCG TCC TTC GGG TTC CTG AGG CTG CTG CAG AGG CTG GTC 771 Arg Asn Glu Pro Ser Phe Gly Phe Leu Arg Leu Leu Gln Arg Leu Val 240 245 250 GGG TCG GTG CCG CTG GTG CAC GCC GAC GAC GTC TGC GAC GCG CTC GTC 819 Gly Ser Val Pro Leu Val His Ala Asp Asp Val Cys Asp Ala Leu Val 255 260 265 270 TTC TGC ATG GAT CAG CCG TCG CTC GCC GGC CGC TTC CTC TGC TCC GCC 867 Phe Cys Met Asp Gln Pro Ser Leu Ala Gly Arg Phe Leu Cys Ser Ala 275 280 285 GCC TAC CCG ACC ATC CAC GAC ATC GTC GAA CAC TTC GCC GCC AAG TAC 915 Ala Tyr Pro Thr Ile His Asp Ile Val Glu His Phe Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 CCT CAC CTC GAC GTC CTC AAA GAG CCG GAG AGG GAG GTG GCG AGG GTG 963 Pro His Leu Asp Val Leu Lys Glu Pro Glu Arg Glu Val Ala Arg Val 305 310 315 CAG CCG GCG GCA GAC AAG CTG GGT GAG CTG GGC TTC AGG TAC AAG TAC 1011 Gln Pro Ala Ala Asp Lys Leu Gly Glu Leu Gly Phe Arg Tyr Lys Tyr 320 325 330 GGC ATG GAG GAG ATA CTC GAC GGC AGC GTC GGC TGC GCG GCG AGG CTG 1059 Gly Met Glu Glu Ile Leu Asp Gly Ser Val Gly Cys Ala Ala Arg Leu 335 340 345 350 GGT TAC ATC GAC GCA GCC AAG CTC AGG CCG CAG GAA GGA TGA 1101 Gly Tyr Ile Asp Ala Ala Lys Leu Arg Pro Gln Glu Gly *** 355 360 363 ATCTGCTACA GATTTGCAGG ATGAAGAAGA TGGATGATAT TTGTTCGGTT TTGAACAAGT 1161 TTTTGGTGTT TGTTTGTAAT CTCATGTGTT CTGAATACCT CTCTCATGTA TCACATGACG 1221 CATTTCTGCG TCAGAGAACG ATATTAATAA GTACTCCGTG GAGCTCGCTA A 1272

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田川 道人 埼玉県南埼玉郡白岡町大字白岡1470 日産 化学工業株式会社生物科学研究所内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１で表される塩基配列
   を有することを特徴とするイネＮＡＤＨ依存性還元酵素
   遺伝子。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号１で表され、全長及び
   その一部の配列をもつイネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺伝
   子。
3. 【請求項３】 以下のアミノ酸配列、すなわち Met Ala Glu Glu Gly Arg Ser Gly Gly Val Ala Gly Asp Gly Val Arg Val Cys Val Thr Gly Gly Ala Gly Phe Ile Ala Ser Trp Leu Val Lys Lys Leu Leu Glu Arg Gly Cys Ile Val His Ala Thr Leu Arg Thr Met Gly Asp Glu Glu Lys Ala Gly Leu Leu Arg Arg Leu Val His Gly Ala Ala Glu Arg Leu Arg Leu Phe Glu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Ala Thr Phe Gly Pro Ala Ile Ala Gly Cys Gln Phe Val Phe Leu Ile Ala Thr Pro Tyr Gly Leu Glu Ala Ser Asn Ser Lys Tyr Lys Asn Thr Ala Asp Ala Ala Val Glu Ala Val Arg Glu Ile Leu Arg Gln Cys Ala Glu Ser Lys Thr Val Lys Arg Val Ile His Thr Ala Ser Ile Ser Thr Ala Ser Pro Leu Ile Asp Val Pro Gly Ala Gly Val Gly Ala Ala Gly Tyr Arg Asp Phe Ile Asp Glu Ser Cys Trp Thr Pro Leu Asp Val Asp Tyr Pro Leu Arg Ser Ala His Phe Asp Lys Tyr Val Leu Ser Lys Met Met Ser Glu Lys Glu Leu Leu Gly Tyr Asn Asp Gly Glu Gly Arg Glu Phe Glu Val Val Thr Leu Leu Cys Gly Leu Val Ala Gly Asp Thr Val Leu Gly Arg Ala Pro Glu Thr Leu Glu Tyr Ala Val Ser Pro Val Ser Arg Asn Glu Pro Ser Phe Gly Phe Leu Arg Leu Leu Gln Arg Leu Val Gly Ser Val Pro Leu Val His Ala Asp Asp Val Cys Asp Ala Leu Val Phe Cys Met Asp Gln Pro Ser Leu Ala Gly Arg Phe Leu Cys Ser Ala Ala Tyr Pro Thr Ile His Asp Ile Val Glu His Phe Ala Ala Lys Tyr Pro His Leu Asp Val Leu Lys Glu Pro Glu Arg Glu Val Ala Arg Val Gln Pro Ala Ala Asp Lys Leu Gly Glu Leu Gly Phe Arg Tyr Lys Tyr Gly Met Glu Glu Ile Leu Asp Gly Ser Val Gly Cys Ala Ala Arg Leu Gly Tyr Ile Asp Ala Ala Lys Leu Arg Pro Gln Glu Gly を有するタンパク質。
4. 【請求項４】 配列表の配列番号１で示される塩基配列
   を有するイネＮＡＤＨ依存性還元酵素遺伝子の全部ある
   いは一部を大腸菌などの微生物、植物細胞などで発現す
   るために供するＤＮＡ。