KR101646991B1 - 외래 유전자의 비-광주기성 발현용 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 광(light) 조건 및 소광(dark) 조건이 반복되는 광주기 조건하에서, 광 조건인 경우 뿐만 아니라 소광 조건인 경우에도 작동적으로 연결된 외래 유전자의 지속적인 과발현을 유지하는 프로모터에 관한 것이다. 본 발명의 조성물을 사용함으로써 외래 유전자의 지속적 과발현이 가능한 형질전환 조류를 제조할 수 있고, 이를 이용하여 목적 단백질을 대량 생산 할 수 있다.

Description

외래 유전자의 비-광주기성 발현용 프로모터{Promoter for constitutive Expression of Foreign Genes}

본 발명은 광(light) 조건 및 소광(dark) 조건이 반복되는 광주기 조건하에서, 광 조건인 경우 뿐만 아니라 소광 조건인 경우에도 작동적으로 연결된 외래 유전자의 지속적인 과발현을 유지하는 프로모터에 관한 것이다.

새로운 유전적인 특성을 미세조류에 전달시켜 줄 수 있는 방법 중 하나인 유전공학적인 변형, 즉 형질전환 기술은 필수적이다. 현재 규조류인 패오닥틸럼 트리코누튬(Phaeodactylum tricornutum)에서 형질전환의 방법으로 개발된 형질전환 방법은 pPha-T1으로 명명된 형질전환용 벡터의 개발로 시작 되었다(Apt et al. 1996; Zaslavskaia et al., 2000). 이 벡터는 항생제 제오신(zeocin)에 내성을 갖는 Shble 유전자를 가지고 제오신 내성선발을 통해 선발할 수 있게 개발되었다. 이때 사용된 유전자의 발현을 위해서는 집광성 안테나 복합체(light-harvesting antennae complexes)의 주요 구성 요소인 푸코잔틴 클로로필 결합 단백질(fucoxanthin chlorophyll binding proteins) 유전자(fcp genes)의 프로모터(proFCPA 및 proFCPB)를 이용하여 Shble 유전자와 green fluorescence protein (gfp) 유전자발현을 유도하였다. 이렇게 개발된 형질전환용 벡터는 마이크로입자 유전자총 전달 시스템(microparticle bombardment deliverly system)을 이용하여 형질전환 하고 선별된 형질전환체들은 선발 유전자와 GFP 표지 유전자(reporter gene)의 발현을 확인할 수 있었다. 하지만 현재 이렇게 개발되고 이용되고 있는 형질전환체들의 도입 외래 유전자 발현 양상을 조사해 보면 다음의 그림에서와 같이 광(light)에 의해서 유전자의 발현이 유도되는 circadian 양상을 보여 주고 있다(Siaut et al., 2007). 또한 니트레이트 환원 효소(nitrate reductase, NR) 프로모터에 의해 니트레이트의 결핍조건에 의한 유도가능 발현(inducible expression) 양상을 보이는 프로모터가 개발되기도 하였다(Poulsen and Krㆆger, 2005). 그렇지만, 형질전환 방법을 통한 유전형질의 변환유도를 위해 발현 유도되는 유전자의 발현이 광의 유무 혹은 영양성분 변화 등에 따라 변화하는 양상이 아닌 지속적으로(constitutively) 발현되는 항시성 프로모터(constitutive promoter)의 제어를 받은 형질전환 벡터의 개발도 필수적으로 필요하다. 하지만 현재 이러한 조건의 프로모터를 갖는 형질전환용 벡터 시스템의 개발이 없는 상태였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 광(light) 조건 및 소광(dark) 조건이 교차되는 광주기 조건하에서, 광 조건인 경우 뿐만 아니라 소광 조건인 경우에도 작동적으로 연결된 외래 유전자의 지속적인 과발현을 유지하는 항시성 프로모터를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 패오닥틸럼 트리코누튬 유래의 신장 인자2(elongation factor2) 유전자의 프로모터를 이용하는 경우, 광주기 조건에 구애받지 않고, 프로모터에 작동적으로 연결된 외래 유전자를 지속적으로 과발현 시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 유전자의 비-광(light)주기성 과발현용 프로모터를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환 조류를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 조류에서의 비-광(light)주기성 외래 유전자 발현 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 유전자의 비-광(light)주기성 발현용 프로모터를 제공한다.

본 발명자들은 광(light) 조건 및 소광(dark) 조건이 교차되는 광주기 조건하에서, 광 조건인 경우 뿐만 아니라 소광 조건인 경우에도 작동적으로 연결된 외래 유전자의 지속적인 과발현을 유지하는 항시성 프로모터를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 패오닥틸럼 트리코누튬 유래의 신장 인자2(elongation factor2) 유전자의 프로모터를 이용하는 경우, 광주기 조건에 구애받지 않고, 프로모터에 작동적으로 연결된 외래 유전자를 지속적으로 과발현 시킬 수 있음을 규명하였다.

본 명세서 상의 용어 "비-광(light)주기성"은 광에 의해서 유전자의 발현이 유도되는 서캐디안(circadian) 양상을 보이지 않는 것을 의미하는 것으로 정의되고, 종래의 발현 벡터가 광(light) 조건에서 발현이 증가하고, 소광(dark) 조건에서 발현이 극적으로 감소하는데 반하여, 본 발명의 비-광(light)주기성 과발현용 프로모터는 소광(dark) 조건에 있어서도 유의한 유전자 발현을 가능케 한다.

본 명세서 상의 용어 "프로모터"는 특정한 숙주세포에서 작동 가능하게 연결된 외래 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 프로모터는 패오닥틸럼 트리코누튬으로부터 유래된 것이다. 패오닥틸럼 트리코누튬(Phaeodactylum tricornutum)은 규조류(diatom)에 속하며 패오닥틸럼 속에 속하는 유일한 종이다. 본 발명자들은 패오닥틸럼 트리코누튬 유래의 EF2 유전자 프로모터를 이용하면 패오닥틸럼 트리코누튬과 같은 규조류 뿐 아니라, 이속 생물 종, 예를 들어 클라미도모나스 레인하드티와 같은 녹조류에서도 외래 유전자의 발현을 크게 증가시킬 수 있음을 규명하였다. 본 발명의 EF2 프로모터는 서열목록 제1 서열로 표시된다. 본 발명의 "EF2 프로모터"는 EF2(Elongation Factor 2) 유전자에 포함되는 프로모터로서, 본 발명자들은 EF2 프로모터 영역 확인을 위해 5'-RACE(rapid amplification of cDNA end) 방법을 이용하여 전사 영역 중 5'-UTR(untranslated region)을 확인하고, 확보된 PCR 산물의 유전 정보를 시퀀싱하여, 유전자의 전사 시작 부위를 기준으로 상부 스트림(upstream) 영역을 프로모터 영역으로 정하였다. 서열목록 제1 서열은 PvuⅠ 및 NotⅠ 제한 효소 부위를 양 말단에 각각 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동적으로 결합된(operatively linked) 외래 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다. 본 명세서 상의 용어 "발현 컨스트럭트"는 세포내에서 단백질 발현을 위한 최소의 엘리먼트(elemnet)만을 포함하는 핵산분자를 의미하는 것으로 정의된다. 본 발명의 발현 컨스트럭트는 추가적으로 상기 프로모터 서열에 작동적으로 연결되도록 외래 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 클로닝할 수 있는 제한효소 인식 염기서열을 포함한다. 본 발명의 발현 컨스트럭트에 포함되는 제한효소 인식 염기 서열의 제한효소는 특정의 것으로 한정되지 않으며, 예를 들어 EcoRI, EcoRII, BamHI, HindIII, TaqI, NotI, HinfI, Sau3A, PovII, SmaI, HaeIII, HgaI, AluI, EcoRV, EcoP15I, KpnI, PstI, SacI, SalI, ScaI, SpeI, SphI, StuI, XbaI 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결된"핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다. 본 발명에서의 외래 단백질은 조류(algae)의 유익한 형질 변형을 위해 발현할 수 있는 모든 단백질을 포함하며, 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 발현 컨스트럭트에는 전사 종결 서열로서, 폴리 아데닐화 서열이 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 본 발명에서 일컫는 '발현벡터'는 숙주세포에서 목적으로 하는 외래 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 벡터를 의미한다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서와 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 상기 발현벡터는 종래 이용되던 모든 발현벡터에 상술한 본 발명의 비-광주기성 과발현용 프로모터를 도입하여 발현벡터를 종래 공지된 방법에 따라 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명의 발현벡터의 제조를 위한 벡터는 비-광주기성 과발현용 프로모터를 도입할 수 있는 것이라면 무엇이든 사용가능하고, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등 일 수 있다. 바람직하게 미세조류 내에서 안정하게 존재하고 카피수가 많은 벡터를 사용할 수 있다.

선택적으로, 본 발명의 벡터는 선택 표지로서 항생제(예컨대, 제오신, 네오마이신, 카베니실린, 카나마이신, 스펙티노마이신 또는 하이그로마이신 등) 내성 유전자(예컨대, Shble, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제(nptⅡ) 또는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라아제(hpt) 등)를 포함한다. 또한, 본 발명의 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 β-글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환 조류(algae)를 제공한다.

본 발명에서의 형질전환은 종래 공지된 형질전환 기술에 의해 당업자가 용이하게 수행할 수 있고, 상기 형질전환 기술은 Kindle(1990)에 의해 공지된 글라스 비드를 이용한 형질전환법, 칼슘/폴리에틸렌 글리콜법을 이용한 원형질체의 형질전환법, 전기천공법, 미량주사법, 유전자 총 방법(particle bombardment), 전기충격법(electrophration), 아그로박테리움을 매개로 한 방법 또는 물리적 도입법 등이 있다. 상기 형질전환 기술은 숙주세포의 종류 및 특성에 맞게 당업자가 적절히 선택하여 수행할 수 있는데, 구체적으로 예를 들면, 본 발명과 같이 조류의 형질전환을 위하여는 유전자 총 방법을 바람직하게 이용할 수 있다.

본 발명의 형질전환을 위한 조류는 특별히 한정되지 않으며 녹조류, 규조류, 남조류, 크립토조류, 황금색조류, 유글레나조류, 규조류, 갈조류, 홍조류, 녹조류 및 차축조류를 포함한다. 본 발명자들은 규조류에 포함되는 패오닥틸럼 트리코누튬 유래의 프로모터를 이용하여 패오닥틸럼 트리코누튬에 대해서는 물론이고, 이속이종 생물인 녹조류에 포함되는 클라미도모나스 레인하드티에 대하여 형질전환에 의해 외래 유전자를 도입하고, 비-광주기성 과발현을 가능케 함을 규명하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조류는 녹조류 또는 규조류이다. 녹조류 또는 규조류는 가장 흔한 조류의 구체적인 예이며, 본 발명에서 바람직하게 이용 가능하다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명의 발현벡터를 조류(algae) 세포에 도입시켜 배양하는 단계를 포함하는 조류에서의 비-광(light)주기성 외래 단백질 발현 방법을 제공한다.

본 발명의 일 양태는 상술한 본 발명의 다른 양태들인 발현벡터, 형질전환 조류 등을 이용하는 방법에 관한 것인바, 중복되는 내용을 모두 원용하며, 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 그 기재를 생략하도록 한다.

본 발명에 있어서 상술한 발현벡터를 조류 세포에 도입시키는 방법은 이미 "형질전환"에 대하여 설명하면서 언급한 방법들을 제한 없이 이용 가능하다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 조류는 녹조류 또는 규조류이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 유전자의 비-광(light)주기성 과발현용 프로모터를 제공한다.

(b) 본 발명은 상술한 프로모터를 포함하는 유전자 컨스트럭트를 제공한다.

(c) 본 발명은 상술한 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

(d) 본 발명은 상술한 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환 조류를 제공한다.

(e) 본 발명은 조류에서의 비-광(light)주기성 외래 유전자 발현 방법을 제공한다.

(f) 본 발명을 이용하면, 외래 유전자의 지속적 과발현이 가능한 형질전환 조류를 제조할 수 있고, 이를 이용하여 목적 단백질을 대량 생산 할 수 있다.

(g) 본 발명을 이용하면, 바이오매스, 유기산, 지질 생산이 증가된 조류의 생산을 가능케 할 수 있다.

도 1은 패오닥틸럼 트리코누튬 형질전환 벡터 pPhaT-FB-Luc 및 pPhaT-EF2-Luc의 구축의 개요를 나타낸다. fcpB 프로모터(pro fcpB) 및 EF2 프로모터(pro EF2)를 Luc 유전자의 앞에 위치시켰다. fcpF 프로모터(pro fcpE)를 제오신(Zeocin) 저항성 유전자(Shble)의 앞에 위치시켰다. 각각의 프로모터 카셋트(Luc 또는 Shble을 갖는)는 pBluescript KS+(Stratagene) 내에서 pfcpBp-Luc 및 pfcpFp-Shble을 각각 제조하기 위해 클로닝하였다. 그 후 pPhaT-FB-Luc 및 pPhaT-EF2-Luc를 실시예에 기재된 바에 따라 구축하였다.
도 2는 야생형(WT) 및 패오닥틸럼 트리코누튬 형질전환체 세포의 서던 블랏 분석 결과를 나타낸다. 세포를 pfcpB::Luc를 운반하는 pPhaT-FB-Luc 또는 pEF2::Luc를 운반하는 pPhaT-EF2-Luc를 가지고 형질전환시켰다. 정제한 지놈 DNA(5 μg)을 BamHI(b), EcoRV(EV) 및 HindⅢ(H)로 절단하였다. Luc 유전자의 부분적 DNA 절편(848 bp)으로 혼성화를 수행하였다. M은 분자량 마커를 나타낸다.
도 3은 Luc 및 Shble 유전자의 광/소광 주기 동안의 상대적인 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 △△CT 방법[16]을 이용하여 분석한 결과를 나타낸다. 발현 수준은 하우스키핑 유전자 Act2(A) 및 TBP(B)의 수준에 대하여 내부 레퍼런스(internal reference)를 이용하여 정규화시켰다. 패오닥틸럼 트리코누튬 세포를 12시간 광주기 하에서 배양시켰고, 매 4시간마다 회수하였다(n=3). 흰 막대는 광을 검은 막대는 소광을 나타낸다.
도 4는 형질전환체에서의 루시퍼라아제 단백질 발현을 항-Renilla 루시퍼라아제 항체 (A) 및 루시퍼라아제 활성 (B)을 이용하여 면역블랏팅에 의해 분석한 결과를 나타낸다. 단백질을, 표시된 시간 마다 야생형(WT) 세포 및 pPhaT-EF2-Luc (pEF2::Luc)로 형질전환시킨 세포의 총 추출물로부터 준비하였다. 모든 데이터는 3회의 독립 실험으로부터 평균±SD로 나타내었다. 흰 막대는 광, 검은 막대는 소광을 나타낸다.
도 5는 pPhaT-EF2-Luc를 제조하기 위해 이용한 EF2 유전자의 프로모터 영역의 시퀀스를 나타낸다. 5'-RACE에 의해 전사 시작 부위를 결정하였다. 제한 효소 부위(PvuI 및 NotI)는 밑줄로 표시하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 세포 배양

패오닥틸럼 트리코누튬 보린의 CCMP632 균주를 the Bigelow laboratory for Ocean Sciences의 National Center for Marine Algae and Microbiota(NCMA)로부터 구입하였다. 세포를 주행성의(diurnal) 12시간 광/소광(light/dark) 주기로(오전 9시부터 오후 9시까지 빛을 비춤), 20℃ 조건 f/2 배지상에서 무균 배양하였다; 형광램프에 의해 빛을 제공하였다(100 μmol/m²s). 야생형 및 형질전환된 세포를, 지수 성장 단계(exponential growth phase)에서의 유전자 발현분석에 이용하였다. 아가에서의 세포의 성장 또는 선택을 위해, 배양물은 제오신(100 μg/ml)을 갖거나 갖지않는 1.2% 아가를 함유하는 f/2 영양배지 상에서 배양하였다.

실시예 2: 플라스미드

플라스미드 pPhaT-FB-Luc 및 pPhaT-EF2-Luc를 몇 단계들에 의해 구축하였다(참조: 도 1). 모든 프라이머들은 표 1에 기재하였다. 제한효소 절단 부위는 밑줄로 표시하였다.

증폭된 절편	타겟 또는 이용방법	Fw or Rv	5'-시퀀스-3'	제한효소
fcpB promoter	pfcpBp-Luc	Fw Rv	gagctcAGTGAGGAAGGCACAGGATG gcggccgcCTTGACTTCTGGC	SacI NotI
fcpC 5′ UTR	pfcpBp-Luc	Fw Rv	gcggccgcTAATCTCTGTTAAAGTTTAC tctagaTTTGTCGAAATGTATATAT	NotI XbaI
Luc	pfcpBp-Luc	Fw Rv	tctagaATGGCCAGCAAGGTG actagtAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTA	XbaI SpeI
fcpA terminator	pfcpBp-Luc	Fw Rv	actagtTAACGTGCTATCGAACTCAACCA ggatccGTCCACTCCAACAATACGGC	SpeI BamHI
fcpF promoter	pfcpFp-Shble	Fw Rv	aagcttCTAACAGGATTAGTGCAATTC atcgatCTTGGTTAATTTTTCGA	HindIII ClaI
Shble	pfcpFp-Shble	Fw Rv	atcgatATGGCCAAGTTGACC gtcgacTTAGTCCTGCTCCTCGG	ClaI SalI
fcpA terminator	pfcpFp-Shble	Fw Rv	gtcgacCGTGCTATCGAACTCAACCA ctcgagGTCCACTCCAACAATACGGC	SalI XhoI
EF2 promoter	pPhaT-EF2-Luc	Fw Rv	cgatcgTCCATTTTGACATGTTTCCTAGC gcggccgcGTGTGTGGAGAGAACGAGCA	PvuI NotI
EF2-sp1 EF2-sp2	5′-RACE 5′-RACE		GTAATACCACGCTCGGCTTC GCTTCATCCGCTCGAGTATC
Act2	qRT-PCR	Fw Rv	CGGCCGTAGTGAGGACAAAT AGTGGCTGCAGGCTTACATT
TBP	qRT-PCR	Fw Rv	TTGCCAGTTACGAGCCAGAG CGCCAGGTCCATTTCCTTCT
Luc	qRT-PCR	Fw Rv	GATCGTGCGCAACTACAACG ACCTTCACGAACTCGGTGTC
Shble	qRT-PCR	Fw Rv	CGACGTGACCCTGTTCATCA GACACGACCTCCGACCACTC
Luc probe	Southern blot	Fw Rv	TCTAGAATGGCCAGCAAGGT ACCTTCACGAACTCGGTGTC
Hyg	pPhaT-EF2-Hyg	Fw Rv	actagtCCGCAAACATGACACAAGAA actagTTATCAGGCGCCGGGGGCGGT	SpeI SpeI
pb2-tubulin::Hyg	Transformation to C.reinhardtii	Fw Rv	CTGCGTTATCCCCTGATTCTGTG TCGCTGAGATAGGTGCCTCACTG
pEF2::Luc or pEF2::Hyg	Transformation to C. reinhardtii	Fw Rv	TAAAGGGAGCCCCCGATTTAGA TCCCTCCCAGCTGATGTCTTTC

첫째, fcpB 프로모터, fcpC 5'-비번역 영역, 및 fcpA 터미네이터를 패오닥틸럼 트리코누튬의 지놈 DNA로부터 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 이어서 PCR 산물을 pBluescript KS의 SacI-NotI,NotI-XbaI, 및 SpeI-BamHI 부위 내로 각각 용해시켰고, pBS-fcpBpAt를 생성시켰다. fcpB 프로모터 및 fcpA 터미네이터의 뉴클레오타이드 시퀀스는 pPha-T1과 일치한다[13]. Renilla 루시퍼라아제 리포터 유전자(Luc; GenBank AY004213)[14]를 PCR 증폭시켰고, pfcpBp-Luc를 생성하기 위해 pBS-fcpBpAt의 XbaI-SpeI 부위 내로 서브클로닝 하였다. 블레오마이신 저항 유전자(Shble)를 갖는 두 번째 플라스미드 pfcpFp-Shble을 다음과 같이 구축하였다. fcpF 프로모터 영역 및 fcpA 터미네이터 영역을 PCR로 증폭시켰고, 이어서 산물은 pBS-fcpFpAt를 생성시키고자 pBluscript KS의 HindⅢ-ClaI 및 SalI-XhoI 부위 내로 복제시켰다. 그런 뒤 Shble 유전자를 pcDNA3.1/Z대/CAT(Invitrogen 사)로부터 PCR 증폭시켰고, pBS-fcpFpAt의 ClaI-SalI 부위 내로 서브클로닝 하였으며, pfcpFp-Shble를 생성시켰다.

둘째, SacI 및 BamHI 처리한 pfcpBp-Luc로부터의 루시퍼라아제 카세트를 pfcpFp-Shble의 상응하는 부위 내로 삽입하였다. 얻어진 플라스미드는 pPhaT-FB-Luc로 지정되었다.

마지막으로 PvuI 및 NotI을 가지고 pPhaT-FB-Luc로부터 fcpB 프로모터를 삭제하고, 해당하는 제한 부위 내로 EF2 프로모터 영역의 PCR 절편을 삽입하는 것에 의해 신장 인자2(EF2) 프로모터 및 Renilla 루시퍼라아제(Luc) 사이의 융합을 구축하였다. 얻어진 플라스미드는 pPhaT-EF2-Luc로 지정되었다(참조: 도 1). 유전자-특이적 프라이머(참조: 표 1)를 가지고 제조자(Roche Applied Science 사)에 의해 추천된 cDNA 말단의 5'-급속 증폭(Rapid Amplification)(RACE)을 이용하여, EF2의 프로모터 영역을 확인하였다.

녹조류 C.reinhardtii 내로의 형질전환을 위해, C.reinhardtii 형질전환을 위한 β2-튜불린 프로모터에 의해 작동된 pChlamy_2/대조구 벡터로부터의 히그로마이신 저항 유전자(aph7, Hyg)를 PCR에 의해 증폭하였고, SpeI을 이용하여 절단한 후, XbaI과 SpeI을 이용하여 Luc 유전자가 제거된 pPhaT-EF2-Luc 내로 서브클로닝하여 pEF2::Hyg를 생성시켰다.

실시예 3: 형질전환 및 서던 블랏 분석

M17(직경 1.1 μm) 텅스텐 입자를 선형화된 플라스미드로 코팅하였다. 제조자에 의해 추천된 바에 따라 1550 psi 파열판을 갖는 Biolistic Particle Delivery System PDS-1000/He(Bio-Rad Laboratoties)를 이용하여, 패오닥틸럼 트리코누튬의 유전자총(particle bombardment)을 수행하였다. 유전자 전달을 "A. Falciatore et. al., Transformation of nonselectable reporter genes in marine diatoms. Mar. Biotechnol. 1 (1999) 239-251."에 기재된 바에 따라 수행하였다. 세포(10⁷개)를 100 μg/ml 제오신을 함유하는 f/2 배지 아가 플레이트 상에 도말하고, 2주 후 저항성 콜로니를 선별하였다. C. reinhardtii 형질전환을 위한 pB2-튜불린::Hyg 및 pEF2::Hyg 카세트를, 특이적 프라이머를 가지고 PCR로 증폭시켰다(참조: 표 1). 종래 기술된대로 글라스 비드를 이용하여 C. reinhardtii 형질전환을 수행하였다[15].

서던 블랏 분석을 위해, DNeasy Plant Mini Kit(Qiagen 사)를 이용하여 지놈 DNA를 추출하였다. BamHI, EcoRV 또는 HindⅢ로 처리한 지놈 DNA(5 μg)를 0.8% 아가로스 겔 상에서 분리하였고, Hybond-N+ 막(GE Healthcare 사) 상으로 이동시켰다. Luc 유전자(848 bp)를 Luc 프로브 프라이머(참조: 표 1)를 이용한 PCR에 의해 증폭시켰고, Amersham AlkPhos Direct Labelling Reagents(GE Healthcare 사)를 이용하여 표지화 및 혼성화시켰다. 검출을 위해, Amersham CDP-Star Detection Reagent(GE Healthcare)를 제조자의 지침에 따라 이용하였다.

실시예 4: 정량적 real-time PCR

RNA 분리를 위해 RNA purification kit Hybrid-R(GeneAll 사)를 이용하였다. High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems 사)를 이용하여 RNA를 cDNA로 전환시켰다. SYBR Pre-mix Ex Taq 및 Thermal Cycler Dice Real Time System TP 810(Takara Bio 사)을 이용하여 역 전사-정량 PCR(qRT-PCR)를 수행하였다. PCR 반응 조건은 다음과 같다: 95℃에서 30초; 95℃에서 5초, 58℃에서 30초의 40 사이클; 및 95℃에서 15초, 60℃에서 30초, 95℃에서 15초. 상대적인 유전자 발현량의 변화를, Thermal Cycler Dice Real Time System Software Ver. 5 (Takara Bio 사) 내에 구현된 △△CT 방법[16]을 이용하여 분석하였다. 모든 값은 독립적으로 준비된 생물학적 샘플(n=3) 각각에 대한 두 테크니컬 샘플의 평균으로써 표준 편차를 이용해 나타내었다. 액틴2(Act2, JGI 단백질 ID: 29136) 및 TATA box-결합 단백질(TBP, JGI 단백질 ID:10199) 유전자를 내부 대조구(internal control)로 종래 연구[12]에서 이용된 바와 같이 이용하였다. qRT-PCR을 위한 프라이머는 표 1에 나타내었다

실시예 5: 단백질 분석

패오닥틸럼 트리코누튬(야생형 및 형질전환체)에서의 루시퍼라아제 활성을 Renilla Luciferase Assay Kit(Promega 사)를 이용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. 발광을 GloMax 20/20(Promega 사)를 이용하여 "S. Park, Y. Lee, J.H. Lee, E. Jin,Expression of the high light-inducible Dunaliella LIP promoter in Chlamydomonas reinhardtii. Planta 238(2013)1147-1156."[15]에 기술된 바와 같이 측정하였고, 각각의 샘플에서의 세포 수에 대하여 정규화하였다. Luc에 대한 면역 블랏팅 분석을 항-Renilla 루시퍼라아제 폴리클로날 항체(MBL 사)를 이용하여 종래 기술된 바와 같이[15] 수행하였다.

실험결과

종래 연구들은 패오닥틸럼 트리코누튬에서의 관심있는 유전자의 과발현을 위한 fcp 프로모터의 이용에 대하여 보고하였다[8, 9]. 안정한 패오닥틸럼 트리코누튬 형질전환체에서의 이식 유전자(transgenes)의 발현 패턴을 시험하기 위해, 먼저 fcpB 및 fcpF 프로모터가 각각 Luc 유전자 및 Shble 유전자의 업스트림에 융합되고, fcpA 터미네이터가 양 유전자의 다운스트림에 위치한 규조류 발현 벡터 pPhaT-FB-Luc를 구축하였다(참조: 도 1).

패오닥틸럼 트리코누튬 형질전환 시스템을 위한 강한 구성 프로모터(constitutive promoter)의 이용을 알아보기 위해, fcp 프로모터보다 더 강력한 새로운 프로모터 후보를 발굴하고자 하였다. 16가지의 다른 조건들 하에서 성장한 패오닥틸럼 트리코누튬의 EST 데이터베이스의 조직적 분석(systematic analysis)은, EF2 유전자(JGI 단백질 ID: 35766)가 본질적으로 모든 시험된 배양 조건들에 걸쳐 발현되는 것을 나타낸다[7]. 그러므로 EF2 프로모터(pro EF2)를 구성 프로모터의 좋은 후보로서 고려하였다. EF2의 프로모터 영역을 결정하기 위해, 패오닥틸럼 트리코누튬 mRNA를 이용한 5'-RACE 실험에 의해, EF2 유전자의 추정상의 전사 시작 부위를 확인하였다(참조: 도 5). 그리고나서, 새로운 형질전환 벡터 pPhaT-EF2-Luc를 생성하기 위해, EF2 프로모터 영역을 포함하는 PCR 절편을, fcpB 프로모터 대신에 pPhaT-FB-Luc 내로 클로닝하였다(참조: 도 1). pPhaT-FB-Luc 및 pPhaT-EF2-Luc 모두 리포터(루시퍼라아제) 유전자를 포함하였고, 제오신-저항성 형질전환체의 선별을 가능케하였다; 상기 목적을 위해, 패오닥틸럼 트리코누튬으로부터의 fcpF 프로모터 및 fcpA 터미네이터의 사이에 위치한 Shble 유전자를 이용하였다. 두 플라스미드 컨스트럭트를, 코팅된 텅스텐 입자를 가지고 바이오리스틱 유전자총(biolistic bombardment)에 의해 패오닥틸럼 트리코누튬에 도입하였다. 형질전환체를 100 μg/ml 제오신이 보충된 아가 배지 상에서 선별하였다.

Luc 유전자가 선별된 형질전환체의 지놈 DNA에 위치하는 것을 확인하기 위해, 프로브로서 Luc 절편을 가지고 서던 블랏 분석을 수행하였다. 세 개의 다른 제한 효소(BamHI, EcoRV 및 HindIII)로 처리한 pPhaT-FB-Luc 및 pPhaT-EF2-Luc 형질전환체의 지놈 DNA에서, Luc 유전자의 적어도 두 카피 및 하나의 카피로 각각 혼성화 신호를 관찰하였다(참조: 도 2). 그러나 형질전환되지 않은 야생형 패오닥틸럼 트리코누튬 세포에서 특이적 혼성화 밴드가 없었다. 그 결과, 선별된 형질전환체의 지놈에서 Luc 유전자가 안정적으로 통합되는 것을 확인하였다.

Fcps의 발현은 24시간 주기 리듬(circadian rhythm)에 의해 제어되는 것으로 알려져 왔다[9, 12]. 그러므로 24시간 주기(diel cycle)에 걸친 안정한 pPhaT-FB-Luc 형질전환체에서의 fcpB 및 fcpF 프로모터의 제어 하에서, 이종 기원의 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해, 내부 대조구(internal controls)로서의 Act2 및 TBP 유전자와 관계된 Luc 및 Shble 유전자의 발현 프로파일을 얻고자 총 RNA를 매 4시간마다 준비하였고, qRT-PCR 분석을 수행하였다(참조: 도 3). Luc 및 Shble 유전자의 상대적인 mRNA 수준은 광 노출 5시간 후에서 최대였고, 그 후 극적으로 감소하였다. 밤 주기 동안, 각각의 유전자의 mRNA 발현은 광 조건 하에서보다 더욱 낮았다(참조: 도 3). 내인성(endogenous) fcpB mRNA 수준은 밤 동안 강력하게 감소하였기 때문에, fcpB mRNA는 짧은 반감기(half-life)를 갖는 것으로 나타났다[12]. 그러나 fcpB 프로모터에 의해 조절된 Luc mRNA 수준은 여전히 밤 동안 검출가능하고, fcpB mRNA 보다 Luc mRNA의 반감기가 더욱 길다는 것을 나타낸다. pPhaT-FB-Luc를 포함하는 형질전환체에서보다 pPhaT-EF2-Luc 컨스트럭트를 포함하는 안정한 형질전환체에서 Luc mRNA 수준은 더 높다(5 시간에서 1.2 배 내지 13 시간에서 6 배). 비록 EF2 프로모터에 의해 조절된 Luc 전사의 수준이 소광 주기의 시작시 약간 감소하더라도, 17시간 지점에서는 Act2와 유사하고, TBP보다 1.6배였다(참조: 도 3). 그러므로 EF2 프로모터는 패오닥틸럼 트리코누튬에서의 외래 유전자의 구성 발현(constitutive expression)에 대하여 매우 효율적이다.

비-형질전환 세포(WT)에서 신호가 검출되지 않은 반면, 루시퍼라아제 단백질(36-kDa)의 높은 수준이, 각 시간 지점에서 pPhaT-EF2-Luc 컨스트럭트를 포함하는 형질전환체의 면역 블랏 분석에 의해 검출되었다(참조: 도 4의 A). 용해성 추출물의 In vitro 루시퍼라아제 효소 분석에서, 세포 당 발광은 광/소광 주기에 걸쳐 유의하게 다르지 않았다(참조: 도 4의 B). 종합해보면, 이러한 결과들은 재조합 Renilla 루시퍼라아제 리포터 단백질이, 전사 수준에서 오직 작은 변화를 가짐에 따라, pPhaT-EF2-Luc를 포함하는 형질전환체에서 높게 발현되고, 상대적으로 높고 지속적인 효소 활성을 나타내는 것을 보여준다. 이러한 관점에서, 패오닥틸럼 트리코누튬 EF2 프로모터는 이종 기원의 유전자를 발현하는 패오닥틸럼 트리코누튬 형질전환체의 생성에 이용될 뛰어난 잠재력을 갖는다.

패오닥틸럼 트리코누튬 EF2 프로모터가 C. reinhardtii에서 이종기원 유전자의 발현을 작동시키고, 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는지를 확인하기 위해, pEF2::Hyg 또는 pEF2::Luc를 함유하는 PCR 절편을 C. reinhardtii 내로 형질전환시켰다. C. reinhardtii에서 형질전환체 콜로니의 선별에 상업적으로 이용되는 pβ2-튜불린::Hyg 카세트는 또한 양성 대조구로서 형질전환된다. 히그로마이신(50 μg/ml)을 함유하는 선별 배지에서 배양 1주 후, pEF2::Hyg 또는 pβ2-튜불린::Hyg 카세트를 갖는 선별된 형질전환체를 계수하였다(참조: 표 1). pEF2::Luc 카세트(음성 대조구)를 포함하는 형질전환체는 선별 배지에서 검출되지 않았다. 그러나 클라미도모나스 β2-튜불린 프로모터를 운반하는 36±19 형질전환체가 검출되었다. 흥미롭게도 패오닥틸럼 트리코누튬 EF2 프로모터를 함유하는 컨스트럭트를 갖는 C. reinhardtii 형질전환체는 더욱 높은 형질전환 빈도(90±35 형질전환체)의 결과를 야기했다. 이 결과는 패오닥틸럼 트리코누튬 EF2 프로모터가 C. reinhardtii에서 이종 기원의 유전자의 발현을 위해 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고자료

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Claims (8)

1. 서열목록 제1 서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진, 비-광(light)주기성 발현용 프로모터.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 프로모터는 패오닥틸럼 트리코누튬으로부터 유래된 것인 것을 특징으로 하는 프로모터.
   
3. (a) 제 1 항의 프로모터; 및 (b) 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된(operatively linked) 외래 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 컨스트럭트.
   
4. 제 3 항의 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터.
   
5. 제 4 항의 발현벡터에 의해 형질전환된 형질전환 조류(algae).
   
6. 제 5 항에 있어서, 상기 조류는 녹조류 또는 규조류인 것을 특징으로 하는 형질전환 조류.
   
7. 제 4 항의 발현벡터를 조류 세포에 도입시켜 배양하는 단계를 포함하는 조류에서의 비-광(light)주기성 외래 단백질 발현 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 조류는 녹조류 또는 규조류인 것을 특징으로 하는 방법.

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