SK60999A3 - Polynucleotide encoding resistance or tolerance to herbicides, vector and plant comprising a polynucleotide, method of selective weed control and use of polynucleotide - Google Patents

Polynucleotide encoding resistance or tolerance to herbicides, vector and plant comprising a polynucleotide, method of selective weed control and use of polynucleotide Download PDF

Info

Publication number
SK60999A3
SK60999A3 SK609-99A SK60999A SK60999A3 SK 60999 A3 SK60999 A3 SK 60999A3 SK 60999 A SK60999 A SK 60999A SK 60999 A3 SK60999 A3 SK 60999A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
polynucleotide
herbicide
encoding
plants
crop
Prior art date
Application number
SK609-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Paul A Thompson
Mary E Knight
Ian Jepson
Paul G Thomas
Timothy R Hawkes
Original Assignee
Zeneca Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9623248.3A external-priority patent/GB9623248D0/en
Priority claimed from GBGB9625957.7A external-priority patent/GB9625957D0/en
Priority claimed from GBGB9703855.8A external-priority patent/GB9703855D0/en
Application filed by Zeneca Ltd filed Critical Zeneca Ltd
Publication of SK60999A3 publication Critical patent/SK60999A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8275—Glyphosate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8277—Phosphinotricin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0089—Oxidoreductases (1.) acting on superoxide as acceptor (1.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Catching Or Destruction (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Polynukleotid kódujúci rezistenciu alebo toleranciu na herbicídy, vektor a rastlina obsahujúce polynukleotid, spôsob selektívneho ničenia buriny a použitie polynukleotidu
Oblasť techniky
Predložený vynález sa týka technológie rekombinantnej DNA, konkrétne prípravy transgénnych rastlín, ktoré vykazujú podstatnú rezistenciu alebo podstatnú toleranciu na herbicídy v porovnaní s obdobnými netransgénnymi rastlinami.
Doterajší stav techniky
Rastliny, ktoré sú podstatne tolerantné na herbicíd, keď sú vystavené jeho účinku, majú krivku závislosti odpovede na dávku posunutú doprava v porovnaní s netolerantnými rastlinami vystavenými rovnakým podmienkam. Takáto krivka závislosti odpovede na dávku vyzerá tak, že na osi x je znázornená dávka a na osi y je znázornené percento uhynutia alebo herbicídny účinok. Tolerantné rastliny vyžadujú viac herbicídu ako obdobné netolerantné rastliny na dosiahnutie rovnakého herbicídneho účinku. Rastliny, ktoré sú v podstate rezistentné na herbicíd vykazujú len malé, ak vôbec, nekrotické, lytické alebo chlorotické lézie, keď sú vystavené herbicídu v takej koncentrácii a miere, ktorá je podlá typických agrochemických opatrení využívaná na ničenie buriny na poli. Rastliny, ktoré sú rezistentné na herbicíd, sú k nemu tiež tolerantné. V rámci predloženej prihlášky je potrebné chápať termíny rezistentný a tolerantný ako tolerantný a/alebo rezistentný.
Podstata vynálezu
Predložený vynález poskytuje polynukleotid, ktorý obsahuje aspoň prvý úsek kódujúci prvý polynukeotid schopný poskytnúť rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú, rezistenciu alebo toleranciu na prvý herbicíd, a druhý úsek kódujúci druhý proteín podobne schopný poskytnúť rastline rezistenciu na druhý herbicíd, a to za podmienok, že (i) polynukleotid nekóduje fúzny proteín obsahujúci len 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a gluta.tión-S-transferázu (GST) , (ii) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-S-transferázu (GST) a (iii) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce GST fosfinotricinacetyltransferázu (PAT).
Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu je expresia každého úseku obsiahnutého v polynukleotide riadená promótorom a terminátorom aktívnym v rastlinách. Takéto promótory a , terminátory sú odborníkovi známe, a ten ich môže vybrať podľa konkrétnej potreby. Tak napríklad k vhodným promótorom patria promótory 35 S CAMV alebo FMV, a tiež ubikvitinové promótory z Arabodopsis alebo kukurice. Výhodne sa použijú konštitutívne promótory. To eliminuje potrebu externej indukcie a znamená to, že rastlina je potom trvalo tolerantná alebo rezistentná ku každému zo zodpovedajúcich herbicídov.
DNA kódujúca gény rezistencie na herbicíd sa môže vložiť do rastlinného transformačného vektora, kde je jej expresia riadená indukovateľným promótorom, čim sa do transgénnej rastliny vnesie, indukovatelná rezistencia na herbicíd. K takýmto promótorom patria napríklad chemicky indukovateľný promótor G-27, pomocou ktorého sa dá zapnúť rezistencia aplikáciou vhodného induktora (ako je napríklad chemická zabezpečovacia látka, safener). Za určitých okolnosti môže byť výhodná schopnosť exprimovať, prípadne zvýšiť rezistenciu na herbicíd, len keď je to potrebné. Napríklad pri striedaní plodín môžu rastliny predchádzajúcej plodiny rásť v nasledujúcom roku, kedy sa pole používa na druhú plodinu. Herbicíd sa potom môže použiť na zničenie neindukovaných a teda citlivých rastlín prvej plodiny. Indukcia expresie génov rezistencie na herbicíd len v prípade keď je rezistencia na herbicíd potrebná, práve pred použitím herbicídu) môže byť za omnoho účinnejšia, lebo určitých rastliny okolností tiež metabolický tiež produkujú polypeptidy rezistencie len keď je to potrebné. K vhodným indukovatelným promótorom ďalej patrí promótor indukovateľný tetracyklínom, bakteriálny represorový/operátorový glukokortikoidový receptor indukovatelné meďou alebo založené na medzinárodnej ekdyzónovom patentovej spoločne s kyselinou receptore, prihláške systém dexametazónom, salicylovou, ktoré boli génu lac, promótory promótory opísané v
PCT/GB96/01195, a tiež takzvaný promótor génu Ale, ktorý bol opísaný v medzinárodnej patentovej publikácii WO93/21334.
Vo zvlášť výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu obsahuje aspoň jeden z úsekov polypeptid poskytujúci rezistenciu na pre-emergentný herbicíd a aspoň jeden z úsekov poskytuje rezistenciu na post-emergentný herbicíd. Odborníkovi sú definície termínov pre-emergentný a post-emergentný jasné, kvôli presnosti uvádzame, že pre-emergentný tu znamená aplikáciu v období pred tým, ako sa výhonky klíčiacich semien objavia nad povrchom pôdy, t. j. pred tým, ako je akákoľvek časť rastliny viditeľná na povrchu. Post emergentný znamená aplikáciu v období, kedy sú semenáčiky už viditeľné nad povrchom pôdy.
Pre-emergentné herbicídy sa môžu obsahujúcej dinitroanilínové herbicídy, vybrať zo skupiny brómacyl, flupoxam, pikloram, fluorochloridón, tetrazolinóny, vrátane N-karbamoyltetrazolínov opísaných v EP A 612 735, sulkatrión, norflurazon,
RP201772, atrazín a iné triazíny, iminotiadozol, diflufenikón, sulfonylmočovinu, imidazolinón, tiokarbamát, traizín, uracyl, močovinu, triketón, izoxazol, aktanilid, oxadiazol, fosfosulfonátové herbicídy opísané v EP sulfonanilid, amid, oxyacetamidy flutiamidu, anilidu a trazolinónu.
A 511 826, triazinón, ako sú herbicídy typu Ako príklad triketónových herbicídov je možné uviesť:
2-(2-nitro-4-trifluorometylbenzoyl)-cyklohexan-1, 3-dión,
2-(2-chlór-4-metánsulfonylbenzoyl)-cyklohexan-1,3-dión,
2-(2-2nitro-4-metánsulfonylbenzoyl)-cyklohexan-1, 3-dión,
5-cyklopropyl-4-(2-metylsulfonylbenzoyl-4-trifluorometylbenzoyl)izoxazol a podobne.
Aby neboli žiadne pochybnosti, termín triketónové herbicídy označuje akúkoľvek zlúčeninu schopnú inhibovať 4-hydroxyfenylpyruvátdioxygenázu (HPPD) . V texte predloženého vynálezu sú termíny 4-hydroxyfenylpyruvát-dioxygenáza alebo dioxygenáza kyseliny 4-hydroxyfenyl-pyrohroznovej (4-HPPD) a phydroxyfenylpyruvátdioxygenáza alebo dioxygenáza kyseliny phydroxyfenylhroznovej (p-OHPP) používané ako synonymá.
Post emergentné herbicídy sa môžu vybrať zo skupiny obsahujúcej glyfozát a jeho soli, glufozinát, difenyléter, azulam, bentazon, bialafos, brómacyl, setoxydim a ďalšie cyklohexandióny, dikamba, fozamin, flupoxam, fenoxyprionát, quizalofop a ďalšie aryloxyfenoxypropanoáty, pikloram, fluormetrón, atrazín a ďalšie triazíny, metribuzín, chlorimurón, chlórsulforón, flumetzulam, halosulfurón, sulfometrón, imazaquin, imazetapyr, izoxaben, imazamox, metosulam, pyritrobak, rimsulfurón, benzosulfurón, nikosulfurón, fomesafén, fluoroglykofén, KIH9201, ET751, karfentrazón, ZA1296, ICIA0051, RP201772, fluórchloridón, norflurazón, paraquat, diquat, bromoxynyl a fenoxaprop.
Zvlášť výhodné kombinácie týchto herbicídov, na ktoré poskytuje vynálezu rezistenciu (alebo na predloženého vynálezu rezistentné polynukleotid predloženého ktoré sú rastliny podlá alebo tolerantné), sú: (i) glyfozát a difenyléter alebo herbicídy acetanilidového typu, (ii) glyfozát a/alebo glufozinát a herbicíd anilidového a/alebo triazolinónového typu, (iii) triketóny a glyfozát a/alebo glufozinát, (iv) glyfozát a/alebo glufozinát a herbicídy triketónového a anilidového typu, (v) glyfozát a/alebo glufozinát a inhibítor PDS (ako sú napríklad zlúčeniny podlá vzorcov I až III uvedených ďalej).
Proteíny kódované uvedenými úsekmi polynukleotidu sa môžu vybrať zo skupiny obsahujúcej glyfozátoxidoreduktázu (GOX), 5enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS), fosfionotricinacetyltransferázu (PAT), hydroxyfenylpyruvát-dioxygenázu (HPPD), glutatión-S-transferázu (GST), cytochróm P450, acetylkoenzým-Akarboxylázu (ACC), acetolaktátsyntázu (ALS), protoporfyrinogén oxidázu (protox), dihydropteroátsyntázu, transportné proteíny polyamínov, superoxiddismutázu (SOD), bromoxynilnitrilázu (BNX), fytoendesaturázu (PDS), produkt génu tfdk, ktorý sa dá získať z Alcaligenes eutrophus a mutované alebo inak modifikované varianty uvedených proteínov. Produkt génu tfdk je dioxygenáza, ktorá je schopná oxidovať fenoxykarboxylové kyseliny, ako je napríklad 2,4-D, na zodpovedajúci fenol. Enzým EPSPS môže byť takzvaná EPSPS II triedy, ako je opísaný v Európskom patente číslo 546 090. Alternatívne a/alebo dodatočne môže byť mutovaný tak, aby obsahoval substitúcie aminokyselín v určitých pozíciách o ktorých sa vie, že vedú k zvýšenej rezistencii na glyfozát (a jeho agrochemicky prijatelné soli). Tak napríklad EPSPS môže mať aspoň aminokyselinové zvyšky Thr, Pro, Gly a Ala v pozíciách zodpovedajúcim polohám 174, 178, 173 a 264 v EPSPS zobrazenom tu ako SEQ ID NO: 9 zmenené nasledujúcim spôsobom:
(i) Thrl74 - íle (ii) Prol78 - Ser (iii) Glyl73 - Ala (iv) Ala264 - Thr pričom (i) Thr 174 leží v súvislej sekvencii Ala-Gly-Thr-AlaMet, (ii) Pro 178 leží v súvislej sekvencii Met-Arg-Pro-Leu-Thr, (iii) Gly 173 leží v súvislej sekvencii Asn-Ala-Gly-Thr-Ala a (iv) Ala 264 leží v súvislej sekvencii Pro-Leu-Ala-Leu-Gly. Naviac koncový zvyšok Gly, nachádzajúci sa v sekvenčnom motíve Glu-Arg-Pro-AAl-AA2~Leu-Val-AA3-AA4-Le-AA5-AA6-AA7-Gly v úseku enzýmu EPSPS zodpovedajúcom pozíciám 192 až 232 podľa SEQ ID NO: 9, môže byť nahradený buď Asp alebo Asn.
V jednom uskutočnení predloženého vynálezu úsek polynukleotidu kódujúci enzým HPPD má sekvenciu tu uvedenú ako SEQ ID NO: 1 alebo 3, prípadne je komplementárny k jednej z nich, pokial sa inkubuje pri teplote medzi 60 a 65°C v soľnom roztoku so silou 0,3 pufrovanom citrátom obsahujúcim 0,1% SDS a po opláchnutí v soľnom roztoku so silou 0,3 pufrovanom citrátom obsahujúcim 0,1% SDS pri rovnakej teplote ešte stále hybridizuje so sekvenciou tu uvedenou ako SEQ ID NO: 1 alebo 3.
Ak testovacie sekvencie a sekvencie podlá predloženého vynálezu sú dvojvláknové, má testovacia sekvencia hodnotu TM (teplotu topenia) v rozmedzí 15°C od TM SEQ ID NO: 1. V prípade, že testovacia sekvencia a SEQ ID NO: 1 (alebo testovacia a SEQ ID NO: 3) sú pomiešané a denaturované súčasne, hodnoty ich TM ležia v rozmedzí 5°C. Výhodne je hybridizácia uskutočnená pri relatívne stringentných podmienkach, ktoré sú priaznivé buď pre testovaciu sekvenciu alebo pre sekvenciu podľa vynálezu. Takže buď testovacia sekvencia alebo sekvencia podľa predloženého vynálezu sa prvá viaže na nosič a hybridizácia sa uskutočnení v určitom čase pri teplote medzi 60 a 65°C v soľnom roztoku so silou 0,3 pufrovanom citrátom obsahujúcim 0,1% SDS a nosič sa potom opláchne v soľnom roztoku so silou 0,1 pufrovanom citrátom pri rovnakej teplote. Ak sa hybridizácie zúčastní fragment sekvencie podľa predloženého vynálezu, potom môžu byť podmienky hybridizácie menej stringentné, ako je zrejmé odborníkovi.
Ak polynukleotid obsahuje gén HPPD poskytujúci rezistenciu na triketónové herbicídy, rastlinný materiál transformovaný týmto génom sa vystaví pôsobeniu triketónového herbicídu a potom sa vizuálne selektuje na základe farebných rozdielov medzi transformovaným a netransformovaným materiálom, ktorý bol vystavený rovnakému herbicídu. Netransformovaný materiál vybledne a ostane biely, ak je podrobený selekčnému procesu, zatiaľ čo transformovaný materiál vybledne, ale neskôr zase zozelenie, alebo ostane zelený.
Polynukleotid podľa ďalšieho uskutočnenia predloženého vynálezu obsahuje ďalší úsek kódujúci proteín schopný poskytnúť rastline rezistenciu alebo toleranciu na hmyz, vysychanie a/alebo hubové, bakteriálne alebo vírusové infekcie. Proteíny kódované takýmito úsekmi sú odborníkovi známe a patrí k nim napríklad endotoxín delta z Bacillus thuringiensis a napríklad obalové proteíny vírusov.
Polynukleotid predloženého vynálezu môže obsahovať 5'7 koncové sekvencie susediace s uvedenými úsekmi, ktoré kódujú (i) peptid schopný nasmerovať translačné produkty úsekov do plastidov ako napríklad chloroplastov, mitochondrií, iných organel alebo bunkovej steny a/alebo (ii) netranslatované sekvencie zosilňujúce transláciu. Vhodné smerovacie sekvencie kódujú chloroplastové tranzitné peptidy, zvlášť v prípade, kedy úsek poskytujúci rezistenciu na herbicíd umiestnený downstream (v smere transkripcie) je enzým EPSP alebo GOX. Translácia/expresia proteínu kódovaného sekveciou obsiahnutou v polynukleotide môže byť zvýšená vložením známej netranslatovanej sekvencie zosilňujúcej transláciu na 5' koniec uvedeného úseku kódujúceho proteín. Také zosilňujúce sekvencie sú odborníkovi známe, patria sem napríklad sekvencie odvodené z TMV známe ako omega, omega prime, a tiež sekvencie, ktoré sa dajú odvodiť z 5'-koncových úsekov sekvencii kódujúcich vírusové obalové proteiny, napríklad vírusu škvrnitosti tabaku a ďalších. Z hľadiska požiadavky exprimovať nukleotidové sekvencie ín planta môže byť vhodné modifikovať sekvencie kódujúce známe proteiny schopné poskytovať rezistenciu na herbicíd. Predmetom vynálezu sú teda už uvedené polynukleotidy, ktoré sú modifikované tak, že sú odstránené motívy nestability mRNA a/alebo náhodné miesta zostrihu alebo sú použité kodóny uprednostňované rastlinami, takže expresia takto modifikovaných polynukleotidov v rastlinách vedie k produkcii podstatne podobných proteínov s podstatne podobnou aktivitou/funkciou tým proteínom, ktoré sa získali expresiou nemodifikovaných polynukleotidov v organizme, v ktorom sú úseky nemodifikovaného polynukleotidu kódujúce proteín endogénne za predpokladu, že ak takto modifikovaný polynukleotid obsahuje kodóny prednostne využívané rastlinami, stupeň identity medzi úsekmi kódujúcimi proteín v modifikovanom polynukleotide a obdobnými úsekmi kódujúcimi proteín endogénne obsiahnutými v danej rastline a kódujúcimi v podstate identický proteín je menší než asi 70%.
Predmetom vynálezu je ďalej vektor obsahujúci uvedený polynukleotid.
Predložený vynález ďalej poskytuje rastliny, ktoré obsahujú aspoň dve nukleotidové sekvencie kódujúce proteiny schopné poskytnúť rezistenciu aspoň na dva herbicídy, a ktoré boli regenerované z materiálu, ktorý bol transformovaný polynukleotidom alebo vektorom podľa predloženého vynálezu.
Spôsoby transformácie sú odborníkovi známe transformácia sprostredkovaná (prípadne rastlinného patria k nim transformácia protoplastov sonifikácia sprostredkovaná mikročasticami,
Agrobacterium, transformácia prítomnosti polyetylénglykolu), pletiva, buniek alebo protoplastov v médiu polynukleotid, mikroinzercia rastlinného materiálu obsahuj úcom totipotentného využívajúcim techniky mikrovlákien transformácia elektroporáciou a podobne, podľa predloženého technické plodiny plantážové plodiny bavlník, tabak, polynukleotidu do (prípadne spôsobom karbidu kremíka),
Transformované rastliny vynálezu patria medzi obilniny, produkujúce vlákno, zeleninu, a stromy. Zvlášť výhodné rastliny cukrová repa, repka olejná, kanola, olejniny, ovocie, sú sója, ľan, slnečnica, zemiak, rajčina, lucerna, hlávkový šalát, kukurica, pšenica, cirok, raž, banánovník, jačmeň, ovos, trávnikové trávy, kŕmne trávy, cukrová trstina, hrach, fazuľa, ryža, borovica, topoľ, jabloň, grapefruit, citrus a orech, a tiež potomstvo, semená alebo časti takýchto rastlín.
Predložený vynález ďalej poskytuje rastlinný materiál, ktorý obsahuje úseky kódujúce sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje aspoň dva proteiny schopné poskytnúť danému materiálu rezistenciu aspoň na dva herbicídy, a to za podmienok, že (i) materiál neobsahuje polynukleotid kódujúci fúzny proteín obsahujúci len 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutatión-S-transferázu (GST), (ii) materiál neobsahuje polynukleotid obsahujúci len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-S-transferázu (GST), (iii) materiál neobsahuje polynukleotid obsahujúci len úseky kódujúce GST a fosfinotricínacetyltransferázu (PAT) a (iv) že pokial je rastlinou, z ktorej pochádza materiál, cukrová repa, gény poskytujúce rezistenciu alebo toleranciu k herbicídu, ktoré obsahuje, nie sú len EPSPS a PAT.
Materiál je možné spôsobmi známymi odborníkovi regenerovať do celých morfologicky normálnych fertilných rastlín. V materiále podlá výhodného uskutočnenia predloženého vynálezu aspoň jeden z úsekov kóduje protein poskytujúci rezistenciu na pre-emergentný herbicíd a aspoň jeden z úsekov kóduje protein poskytujúci rezistenciu na post-emergentný herbicíd. Úseky kódujúce takéto proteiny a herbicídy sa už spomenuli. Odborníkovi je zrejmé, že úseky poskytujúce viacnásobnú rezistenciu na herbicíd môžu byť prítomné v rastlinách (alebo ich častiach) v dôsledku kríženia prvej rastliny, ktorá obsahuje polynukleotid kódujúci prvý protein schopný poskytnúť rezistenciu na prvý herbicíd, s druhou rastlinou, ktorá obsahuje polynukleotid kódujúci druhý protein poskytujúci rezistenciu na druhý herbicíd (pozri tiež príklady v tejto prihláške). Výhodné kombinácie génov rezistencie na herbicídy sú (i) gén HPPD a gén EPSPS alebo GOX, (ii) gén HPPD a PAT, (iii) gén GST a gén EPSPS/GOX, (iv) gén EPSPS/GOX a PAT, (v) gén HPPD, gén GOX a/alebo gén EPSPS a gén PAT, (vi) gén ACC a gén PAT a/alebo EPSPS, (vii) gén PDS a PAT a/alebo EPSPS a/alebo GOX, (viii) gén tfdA, ktorý sa dá získať z Alcaligenes eutrophu's a gén EPSPS a/alebo GOX a/alebo PAT a/alebo PDS. Okrem toho v každej z týchto kombinácií môže byť jeden alebo viac génov rezistencie na herbicíd nahradený génom pre SOD, protox a/alebo ALS. Také rastliny sú v tejto prihláške uvádzané ako rastliny podlá vynálezu.
Ďalším predmetom vynálezu je spôsob selektívneho ničenia buriny na poli, na ktorom rastie plodina a burina, pričom plodina obsahuje (i) polynukleotid obsahujúci aspoň prvý úsek kódujúci prvý protein schopný poskytnúť rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú, rezistenciu alebo toleranciu na prvý herbicíd, a druhý úsek kódujúci druhý protein schopný poskytnúť obdobne rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú rezistenciu alebo toleranciu na druhý herbicíd, a to za podmienok, že (i) polynukleotid nekóduje fúzny proteín obsahujúci len 5enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutatión-Stransferázu (GST), (ii) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-S-transferázu (GST), (iii) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce GST a fosfinotricínacetyltransferázu (PAT) a (iv) že pokiaľ je plodinou cukrová repa, gény poskytujúce rezistenciu alebo toleranciu na herbicíd, gény ktoré obsahuje, nie sú len EPSPS a PAT, alebo (ii) polynukleotid obsahujúci aspoň prvý úsek kódujúci prvý proteín schopný poskytnúť rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú, rezistenciu alebo toleranciu na prvý herbicíd, a polynukleotid kódujúci druhý proteín schopný poskytnúť obdobne rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú, rezistenciu alebo toleranciu na druhý herbicíd, a to za podmienok, že (i) polynukleotid nekóduje fúzny proteín obsahujúci len 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutatión-S-transferázu (GST), (ii) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-S-transferázu (GST), (iii) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce GST a fosfinotricínacetyltransferázu (PAT) a (iv) že pokiaľ je plodinou cukrová repa, gény poskytujúce rezistenciu alebo toleranciu na herbicíd, gény ktoré obsahuje, nie sú len EPSPS a PAT, pričom spôsob zahŕňa aplikáciu aspoň jedného z uvedených herbicídov na pole v množstve postačujúcom na ničenie buriny bez podstatného účinku na plodinu.
Gény poskytujúce rezistenciu na herbicíd pritom môžu byť na samostatných polynukleotidoch v rámci rastliny. Vo výhodnom spôsobe rastlina/plodina obsahuje gény kódujúce enzýmy EPSPS a/alebo GOX a enzým HPPD, pričom spôsob obsahuje aplikáciu glyfozátových a triketónových herbicídov na pole v množstve postačujúcom na ničenie buriny bez toho aby to malo podstatný účinok na plodiny. V ďalšom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu plodiny obsahujú gény kódujúce enzýmy EPSPS a/alebo GOX a fosfinotricínacetyltransferázu, pričom spôsob obsahuje aplikáciu glyfozátu a glufozinátu na pole. V ďalšom uskutočnení spôsobu plodiny obsahujú gény kódujúce enzýmy EPSPS fosfinotricínacetyltransferázu a enzým obsahuje
HPPD, aplikáciu glyfozátu a glufozinátu a na pole. V ďalšom uskutočnení spôsobu obsahujú gény kódujúce enzýmy EPSPS glutatiónglyfozátu napríklad podľa vynálezu a/alebo GOX a pričom spôsob triketónových herbicídov podľa vynálezu plodiny a/alebo GOX a/alebo fosfinotricínacetyltransferázu a S-transferázu, pričom spôsob obsahuje aplikáciu a/alebo glufozinátu a anilidových herbicídov, ako je acetochlór, na pole.
V ďalšom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu obsahujú gény kódujúce enzýmy ACC a PAT a/alebo EPSPS, spôsob obsahuje aplikáciu herbicídov typu fluazifopu a glyfozátu a/alebo glufozinátu na pole.
plodiny pričom
V ďalšom uskutočnení kódujúce kodónmi), spôsobu produkt ktorý sa podľa vynálezu génu tfdA dá získať z plodiny (prípadne s Alcaligenes a/alebo PDS, obsahujú gény optimalizovanými eutrophus a enzýmy EPSPS a/alebo GOX a/alebo PAT pričom spôsob obsahuje aplikáciu 2,4D a glyfozátu a/alebo glufozinátu a/alebo herbicídneho inhibítora fytoendesaturázy na pole. Okrem toho v alebo niekoľko každej z týchto kombinácií môže byť jeden ( génov rezistencie na herbicíd nahradených génom a/alebo ALS.
pre SOD, protox
Vo zvlášť pesticídne je insekticídov, antivírusových aplikácii jedného alebo niekoľkých výhodnom uskutočnení spôsobu podľa účinné množstvo jedného baktericídov, na pole herbicídov.
fungicídov, látok aplikované vynálezu alebo niekoľkých nematicídov alebo buď pred alebo po spôsob prípravy rastlín, ktoré voči dvom
Predložený vynález poskytuje sú podstatne tolerantné alebo podstatne rezistentné alebo viacerým herbicídom, tento spôsob spočíva v tom, že obsahuje kroky, kedy:
(i) rastlinný materiál alebo vektorom podľa sa transformuje polynukleotidom vynálezu, materiál sa selektuje a (iii) takto selektovaný materiál sa regeneruje do morfologicky normálnych fertilných rastlín.
Rastliny podlá vynálezu sa môžu prípadne získať spôsobom, ktorý zahŕňa transformáciu prvého rastlinného materiálu sekvenciou poskytujúcou rezistenciu na prvý herbicíd a druhý rastlinný materiál sa transformuje sekvenciou poskytujúcou rezistenciu na druhý herbicíd, regeneráciu takto transformovaného materiálu do celých fertilných rastlín a vzájomné opelenie týchto rastlín, ktoré vedie k potomstvu obsahujúcemu obidva uvedené gény rezistencie na prvý a druhý herbicíd. Prípadne prvý a/alebo druhý rastlinný materiál môže byť dopredu transformovaný polynukleotidom obsahujúcim úseky kódujúce jeden alebo niekoľko proteínov poskytujúcich rezistenciu na herbicíd, insekticídnych proteínov, proteínov s protihubovým alebo protivírusovým účinkom a/alebo proteínov schopných poskytnúť rastline lepšiu odolnosť proti vysychaniu.
Predložený vynález ďalej poskytuje použitie polynukleotidu alebo vektora podľa vynálezu na prípravu rastlinného pletiva a/alebo celých morfologicky normálnych fertilných rastlín, ktoré sú podstatne tolerantné alebo podstatne rezistentné na jeden alebo niekoľko herbicídov. Predložený vynález ďalej poskytuje použitie polynukleotidu alebo vektora podľa vynálezu na prípravu herbicídneho cieľa na veľkokapacitný in vitro skríning potenciálnych herbicídov. Úseky polynukleotidu kódujúce proteín môžu byť heterológne exprimované v E. coli alebo kvasinkách.
Predmetom predloženého vynálezu je ďalej rastlinné pletivo transformované polynukleotidom obsahujúcim sekvenciu tu uvedenú ako SEQ ID NO: 1 a kódujúcu dioxygenázu. To môže byť jediný gén rezistencie na herbicíd v materiále. Materiál potom môže byť spôsobmi známymi odborníkovi regenerovaný na morfologicky normálnu fertilnú rastlinu. Vo zvlášť výhodnom uskutočnení transformovaného pletiva podľa vynálezu, polynukleotid kódujúci proteín s podstatne podobnou aktivitou proteínu kódovaného SEQ ID NO: 1 je komplementárny so sekvenciou, ktorá keď sa inkubuje pri teplote 60 až 65°C v citrátom pufrovanom soľnom roztoku so silou 0,3 obsahujúcom 0,1% SDS a potom sa opláchne pri rovnakej teplote v citrátom pufrovanom soľnom roztoku so silou 0,3 obsahujúcom 0,1% SDS stále ešte hybridizuje so SEQ ID NO: 1.
Predložený vynález bude ešte podrobnejšie vysvetlený pomocou nasledujúceho opisu sprevádzaného obrázkami a zoznamom sekvencii.
Opis sekvencii
SEQ ID NO: 1 ukazuje sekvenciu DNA, ktorá bola izolovaná zo Synechocystis sp.r a ktorá kóduje enzým (uvedený ako SEQ ID NO:
2) , ktorý má aktivitu dioxygenázy kyseliny p-hydroxyfenylpyrohroznovej.
SEQ ID NO: 3 ukazuje sekvenciu DNA, ktorá bola izolovaná z Pseudomonas ssp. 87/79, v ktorej nukleotidy 1217 až 2290 kódujú enzým (uvedený ako SEQ ID NO: 4), ktorý má aktivitu dioxygenázy p-hydroxyfenylpyruvátu.
SEQ ID NO: 5 a 6 ukazujú jednu formu syntetických PCR primérov s minimálnou redundanciou (pozri odkazy na HPPD-P4 a HPPD-REV1 ďalej), ktoré boli použité na izoláciu SEQ ID NO: 3 z. bakteriálneho genómu.
SEQ ID NO: 7 a 8 sú tiež syntetické PCR priméry, ktoré boli použité na modifikáciu SEQ ID NO: 3 tak, aby mohla byť vložená do vektora na transformáciu rastlín.
SEQ ID NO: 9 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu enzýmu EPSPS (vrátane chloroplastového signálneho peptidu) z petúnie.
SEQ ID NO: 10 až 32 sú PCR priméry alebo polylinkery, ktoré sú vložené do plazmidov, aby bolo možné vytvárať konštrukty, ktoré obsahujú viac génov rezistencie na herbicídy.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 je schematický diagram klonu obsahujúceho SEQ ID NO: 3, kde sa identifikovali tri otvorené čítacie rámce: prvý začína nukleotidom 15 a konči nukleotidom 968, druhý začína nukleotidom 215 a končí nukleotidom 1066 a tretí začína nukleotidom 1217 a končí nukleotidom 2290 podľa SEQ ID NO: 3. Obrázok tiež ukazuje reštrikčné miesta nachádzajúce sa v sekvencii, ktoré sú manipulované pomocou primárov uvedených ako SEQ ID NO: 7 a 8.
Obrázok 2 schematicky znázorňuje prípravu expresnej kazety, ktorá obsahuje 4-HPPD, kde fragment DNA z obrázku 1 je upravený pomocou PCR, naštiepený Ncol a KpnI a ligovaný do vektora (pMJBl) tiež naštiepeného Ncol a KpnI.
Obrázok 3 je schéma úprav uskutočnených na binárnom rastlinnom transformačnom vektore pBinl9, aby obsahoval expresnú kazetu 4-HPPD podľa obrázku 2.
Obrázok 4 je schematický diagram klonu obsahujúceho SEQ ID NO: 1.
Obrázok 5 znázorňuje prípravu rastlinnej expresnej kazety obsahujúcej 4-HPPD, kde je fragment DNA uvedený na obrázku 4 upravený pomocou PCR, naštiepený enzýmami Ncol a KpnI a potom ligovaný do vektora (pMJBl) tiež naštiepeného Ncol a KpnI.
Obrázok 6 znázorňuje schematicky konštrukciu plazmidového vektora, použitého na transformáciu Agrobacterium tumefaciens, a tiež ukazuje mapy plazmidu pJRIRi a pGSAT-27Bin.
Obrázok 7 ukazuje aktivitu GST v transformovanom tabaku po aplikácii 4 herbicídov.
Obrázok 8 je grafické porovnanie poškodenia rastlín divého typu a rastlín línie GST-27 po ošetrení metolachlórom v dávke 1400 g/ha po troch týždňoch.
Obrázok 9 je mapa plazmidu pDV3-puc.
Obrázok 10 je mapa plazmidu pDV6-Bin.
Obrázok 11 je mapa plazmidu pUB-1, ktorý obsahuje fragment ubikvitínového promótora získaného pomocou PCR z kukurice, tento fragment s veľkosťou 2 kb bol klonovaný do plazmidu pUC19 a miesta spojov boli sekvenované na overenie prítomnosti promótora.
Obrázok 12 je mapa plazmidu pIE98.
Obrázok 13 je mapa plazmidu pIGPAT.
Obrázok 14 je mapa plazmidu pCATlO.
Obrázok 15 je mapa plazmidu pCATll.
Obrázok 16 je mapa plazmidu pPG6.
Obrázok 17 zobrazuje časť plazmidu pMVl.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Klonovanie génu 4-HPPD z Pseudomonas ssp., transformácia génu do rastlinného materiálu a príprava rastlín rezistentných na triketónové herbicídy.
Aminokyselinová sekvencia purifikovaného 4-HPPD z Pseudomonas fluorescens PJ-874, pestovaného na tyrozine ako výlučnom zdroji uhlíka, je známa (Ruetschi et al., Eur. J. Biochem. 1992, 202(2): 459-466. Na základe tejto sekvencie boli navrhnuté minimálne redundantné priméry pre PCR, a pomocou týchto primárov bol amplifikovaný veľký, ale nekompletný, fragment génu 4-HPPD z genómovej DNA rôznych bakteriálnych kmeňov {Pseudomonas fluorescens PJ-874). Odborníkovi je známy význam termínu minimálne redundantné priméry, v ďalej uvedenej sekvencii je redundancia označená hranatými zátvorkami. Ako jeden príklad každého z príslušných primérov (zodpovedajúcich lokalizácii na 5'-konci a 3'-konci génu 4-HPPD) sú tu uvedené SEQ ID NO: 3 a 4.
Primér číslo 1 (SEQ ID NO: 5), čo je 17-mér, je založený na znalosti sekvencie aminokyselín 4 až 9 publikovanej proteínovej sekvencie (pozri vyššie) a primér číslo 2 (SEQ ID NO: 6), čo je tiež 17-mér, je založený na znalosti aminokyselinových zvyškov 334 a 339. Primér číslo 1 (4-HPPD) má sekvenciu:
' TA [T/C] GA [G/A] AA [T/C] CC [T/C/G/A] ATGGG a primér 2 (HPPD-REV1) má sekvenciu:
5' GC[T/C]TT[G/A]AA[G/A]TT[T/C/G/A]CC[T/C]TC.
Pódia štandardného protokolu sa pripravilo 100 ng genómovej DNA z Pseudomonas fluorescens PJ-874 a zmiešaných so 100 pmol každého priméru. Zmes sa amplifikovalsa v PCR (35 cyklov) s Taq polymerázou a ďalšími štandardnými reagenciami v podmienkach syntézy a disociácie DNA: 94°C 1,5 minút, 55°C 2 minúty a 74°C 3 minúty. Amplifikovaný fragment obsahoval úsek obsahujúci tri kodóny z 5'-konca a asi 30 kodónov z 3'-konca kódujúceho úseku génu 4-HPPD. Produkt PCR s tupými koncami bol štandardným spôsobom ligovaný do (housekeeping) vektora pGEM3Z-f(+).
Čiastočné sekvenovanie potvrdilo, že fragment PCR je špecifický pre 4-HPPD. Určené aminokyselinové sekvencie obsahovali niekoiko nezrovnalostí oproti sekvencii enzýmu z Pseudomonas fluorescens PJ-874. Tento čiastočný fragment 4-HPPD dáva negatívny signál pri Southernovej hybridizácii s rastlinnou genómovou DNA pri málo prísnych podmienkach hybridizácie a premývania. Fragment EcoRI/EcoRI s veľkosťou 900 bp bol vyštiepený zo stredu predtým klonovaného čiastočného génu a tento fragment sa použil ako sonda. Uskutočnila sa Southernovahybridizácia genómovej DNA naštiepenej rôznymi enzýmami s týmto rádioaktívne značeným fragmentom.
DNA naštiepená Beli poskytla jediný pozitívny pás s veľkosťou približne 2,5 kb, ktorý je dostatočne veľký na to, aby obsahoval celý gén aj so susednými netranslatovanými úsekmi. Genómová DNA bola naštiepená Beli a rozdelená elektroforézou na preparativnom agarózovom géle. Oblasť obsahujúca fragmenty s veľkosťou 2 a 3 kb naštiepenej DNA bola vyrezaná a DNA z nej bola extrahovaná elektroelúciou. Takto získaná DNA bola kľonovaná do BamHI miesta (ktoré je kompatibilné s Beli) v plazmide pUC18. Otlačky kolónií boli potom testované so sondou, ktorou bol uvedený fragment s veľkosťou 900 bp a 12 pozitívnych kolónii bolo vyizolovaných. Minipreparáciou izolovaná DNA z týchto kolónií bola naštiepená EcoRI s cieľom nájsť diagnostický pás s veľkosťou 900 bp. Z 12 testovaných kolónii 7 vytváralo hnedý pigment, keď boli pestované cez noc na LB médiu pre minipreparáciu, 5 z nich bolo pozitívnych na fragment 900 bp, ostatných 5 bolo negatívnych a nevytváralo hnedý pigment. Vytváranie hnedého pigmentu je spojené s heterológnou expresiou génu 4-HPPD.
Reštrikčná analýza ukázala, že klonovaný inzert bol dlhý 2,5 kb s úsekom asi 1,2 kb upstream od génu 4-HPPD a asi 400 bp úsekom downstream. Konce génu boli sekvenované pomocou vhodných primárov a tiež primárov pre pUC18„ Toto sekvenovanie preukázalo, že gén bol intaktný a existoval v oboch orientáciách vzhľadom na klonovacie miesta v pUC18.
lyzátu bakteriálnych buniek s veľkosťou asi 40 kDa, čo extraktoch z bol prítomný v
SDS-PAGE elektroforéza prítomnosť nového proteínu zodpovedá 4-HPPD. Tento pás ktoré mali gén vložený v prvej orientácii, bol proteín exprimovaný z promótora lac nebol viditeľný v lyzátoch buniek, kde orientácii, aj keď obidva klony produkovali lebo v tomto ukázala správne buniek, prípade vektora. Žiadny pás bol gén v opačnej hnedý pigment, čo by zodpovedalo existencii aktívneho proteínu v oboch typoch buniek. Rekombinantný proteín s veľkosťou 40 kDa skôr v rozpustnej ako v nerozpustnej proteínovej frakcii. Klony, v ktorých je gén v druhej orientácii, boli sekvenované pomocou automatického sekvenátora DNA a bola tak identifikovaná SEQ ID NO: 3. Sekvencia bola potom upravená tak, že do nej bolo vložených niekoľko reštrikčných miest, aby sa umožnilo jej vloženie do vektora vhodného na transformáciu rastlín. Oligonukleotidy použité na tieto úpravy, tu uvedené ako SEQ ID NO: 7 a 8, sú primér číslo 3 (HPPDSYN1):
5'-GTTAGGTACCAGTCTAGACTGACCATGGCCGACCAATACGAAAAACC-3' a primér číslo 4 (HPPDSYN2):
' -TAGCGGTACCTGATCACCCGGGTTATTAGTCGGTGGTCAGTAC-3'.
Expresia génu 4-HPPD z Pseudomonas v transgénnom tabaku
DNA fragment upravený pomocou PCR bol naštiepený enzýmami Ncol a KpnI, potom ligovaný do vektora (pMBJl) tiež naštiepeného Ncol a KpnI. Vektor pMBJl je plazmid odvodený z plazmidu pUC19 obsahujúci dvojitý promótor CaMV 35S, zosilňovač (enhancer) TMV omega a transkripčný terminátor NOS. Schéma výsledného plazmidu je uvedená na obrázku 2. Všetky manipulácie s DNA sa uskutočnili štandardným, odborníkovi v odbore molekulárna biológia známym, spôsobom.
Izolovala sa celková DNA a expresná kazeta 4-HPPD (t.j. v rozsahu od 2x35S až po nos 3'-terminátor) sa vyštiepila čiastočným štiepením EcoRI a potom úplným štiepením HindlII. Tento postup bol zvolený preto, aby sa zabránilo rozštiepeniu EcoRI miesta vo vnútri génu 4-HPPD. Po preparatívnej elektroforéze na agarózovom gél sa požadovaný fragment izoloval elektroelúciou.
Expresná kazeta 4-HPPD sa potom ligovala do vektora pBinl9 naštiepeného HindlII a EcoRI. Výsledný plazmid je schematicky znázornený na obrázok 3.
DNA sa izolovala a použila na transformáciu Agrobacteriuni tumefaciens LBA4404 na rezistenciu na kanamycín, opäť štandardnými metódami v odbore. Prostredníctvom Agrobacterium tumefaciens sa potom štandardným postupom transformovali listové terčíky/prúžky Nicotiana plumbaginifólia cv. Samsun. Transformované výhonky sa regenerovali z kalusov rezistentných na kanamycín. Výhonky sa zakorenili v agarovom médiu MS s kanamycínom. Zakorenené rastlinky, ktoré prežili, sa presadili a znovu zakorenili, čo nakoniec poskytlo asi 80 transformovaných rastliniek tabaku rezistentných na kanamycín. Prítomnosť génu 4HPPD sa overila pomocou PCR (a síce s už existujúcimi primérmi EDÍT). V PCR bolo pozitívnych 60 rastlín.
Explantáty (t.j. list so segmentom stonky obsahujúcej axilárny púčik) sa umiestnili na MS agar (+3% sacharóza) obsahujúci rôzne koncentrácie ZA1206 (triketónový herbicíd) od
0,02 do 2 ppm. Netransformované rastliny tabaku úplne zbeleli pri koncentrácii 0,02 ppm. Pritom pri predĺženej expozícii herbicídu sa nikdy nezotavili. V tomto konkrétnom pokuse zbeleli len výhonky, ktoré sa vyvinuli z puku, pôvodný list explantátu ostal zelený.
Približne 30 transformovaných a v PCR pozitívnych rastlín tolerovalo koncentráciu ZA1296 0,1 ppm (asi 5x vyššiu ako koncentrácia spôsobujúca' symptómy u divých, t. j.
netransformovaných, rastlín) bez známok zbelenia.
Zakorenili normálne a fenotypovo sú na nerozoznanie od netransformovaných rastlín. Skupina transformovaných rastlín bola tolerantná ku koncentrácii 0,2 ppm a niekoľko transformovaných rastlín tolerovalo dokonca koncentráciu 0,5 až 1 ppm. Tieto rastliny opäť vyzerali normálne a dobre sa zakoreňovali v prítomnosti herbicídu. Niektoré transformované rastliny na začiatku zbeleli po vystavení herbicídu pri vyššie uvedených koncentráciách, ale po predĺženej expozícii herbicídu progresívne zozeleneli a výrazne sa zotavovali.
Skupina spomínaných na herbicíd rezistentných rastlín bola ošetrená známym herbicídom Izoxaflutolom (t.j. 5-cyklopropyl-4I (2-metylsulfonyl-4-trifluormetylbenzoyl)izoxazol alebo RPA 210772) . Tieto rastliny sú dokonca viac rezistentné na tento herbicíd ako na pôvodný ZA1296, čo jasne ukazuje, že rastliny sú krížovo rezistentné na niekoľko tried inhibítorov 4-HPPD.
Príklad 2
Klonovanie génu 4-HPPD zo Synechocystis sp. do rastlinného materiálu a regenerácia materiálu na rastliny rezistentné na triketónový herbicíd
Genóm Synechocystis sp. PCC6803 bol sekvenovaný. Aby bolo možné vniesť do neho vhodné reštrikčné miesta na uľahčenie vloženia do vektora na rastlinnú transformáciu, zo Synechocystis sp. sa pripravilo 100 ng genómovej DNA štandardným postupom a zmiešalo sa so 100 pmol dvoch primérov vhodných na PCR amplifikáciu (v 35 cykloch) sekvencie, tu uvedenej ako SEQ ID NO: 1, použitím termostabilnej DNA polymerázy s výhodnou reparačnou aktivitou (proof reading activity) a ďalších štandardných reagencií v podmienkach vhodných na disociáciu a syntézu DNA, pričom typické boli nasledujúce podmienky: 94°C 1,5 minúty, 55°C 2 minúty a 74°C 3 minúty. Amplifikovaný fragment obsahuje kódujúci úsek génu 4-HPPD. Produkt PCR sa klonoval (s tupými koncami) do štandardného vektora ako je napríklad pGEM3Zf( + ). Vytváranie hnedého pigmentu je spojené s heterológnou expresiou génu 4-HPPD (Denoya et al. 1994, J. Bacteriol. 176: 5312-5319).
SDS-PAGE elektroforéza lyzátov bakteriálnych buniek ukázala, že bunky obsahovali nový proteín s očakávanou molekulovou hmotnosťou génového produktu 4-HPPD. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je rekombinantný proteín buď prítomný, skôr v rozpustnej ako v nerozpustnej proteínovej frakcii, alebo je upravený tak, aby v nej bol prítomný. Kloň sa podrobil automatickému sekvenovaniu DNA, aby sa potvrdilo, že nie sú prítomné žiadne artefakty vnesené PCR.
Heterológna expresia génu 4-HPPD Synechocystis sp. PCC6803 v E.coli
DNA fragment upravený pomocou PCR sa naštiepil vhodnými enzýmami ako napríklad enzýmami Ncol a KpnI, potom sa ligoval do expresného vektora E. coli (ako sú napríklad vektory série pET) tiež vhodne naštiepeného. Všetky manipulácie s DNA sa urobili štandardným, odborníkovi v odbore molekulárna biológia známym spôsobom.
Vhodný hostiteľský kmeň ako napríklad BL21(DE3) alebo iný lyzogénny kmeň typu DE3 nesúci gén 4-HPPD exprimuje množstvo HPPD dostatočné na to, aby bol vhodný na uskutočnenie vysokokapacitného skríningu na identifikáciu alternatívneho inhibitora 4-HPPD. HPPD purifikovaný z takéhoto transformovaného hostiteľského kmeňa sa môže využiť na získanie antiséra na analýzy rastlín transformovaných polynukleotidom kódujúcim 4HPPD.
Heterológna expresia génu 4-HPPD Synechocystis sp. PCC6803 v transgénnych rastlinách
DNA fragment upravený pomocou PCR sa naštiepil napríklad enzýmami ako Ncol a KpnI, potom sa ligoval do vhodného udržiavacieho vektora ako napríklad pMBJl, na vytvorenie expresnej kazety, ktorá obsahuje príslušný v rastline aktívny promótor a terminátor. Vektor pMBJl je plazmid odvodený z plazmidu pUC19, obsahujúci dvojitý promótor CaMV 35S, zosilňovač (enhancer) TMV omega a transkripčný terminátor NOS. Schéma výsledného plazmidu je uvedená na obrázku 4.
Expresná kazeta 4-HPPD sa potom ligovala do vektora pBinl9 naštiepeného HindlII a EcoRI. Výsledný plazmid je schematicky znázornený na obrázku 5.
DNA sa izolovala a použila na transformáciu Ägrobacterium tumefaciens LBA4404, aby sa opäť využila rezistencia na kanamycín štandardnými metódami. Prostredníctvom Ägrobacterium tumefaciens sa potom štandardným postupom transformovali rajčiak a zemiak. Transformované výhonky sa regenerovali z kalusov rezistentných na kanamycín. Výhonky sa zakorenili v agarovom médiu MS s kanamycínom. Zakorenené rastlinky, ktoré prežili sa presadili a znovu zakorenili, čo nakoniec poskytlo asi 80 transformovaných rastliniek tabaku rezistentných na kanamycín. Prítomnosť génu 4-HPPD sa overila pomocou PCR (a síce s už existujúcimi primármi EDÍT). Značný počet PCR pozitívnych rastlín sa odobral na ďalšie analýzy.
Explantáty (t.j. list so segmentom stonky obsahujúcej axilárny puk) sa umiestnili na MS agar (+3% sacharóza) obsahujúci rôzne koncentrácie ZA1206 (triketónový herbicíd) od 0,02 do 2 ppm. Netransformované rastliny úplne zbeleli pri koncentrácii 0,02 ppm. Pričom pri predĺženej expozícii herbicídu sa nikdy nezotavili. V tomto konkrétnom pokuse zbeleli len výhonky, ktoré sa vyvinuli z puku, pôvodný list explantátu ostal zelený.
Približne 30 transformovaných a v PCR pozitívnych rastlín tolerovalo koncentráciu ZA1296 0,1 ppm (asi 5x vyššiu, ako koncentráciu spôsobujúcu symptómy u divých typov, t.j. netransformovaných rastlín) bez akýchkoľvek známok belenia. Zakorenili sa normálne a fenotypovo sú na nerozoznanie od netransformovaných rastlín. Skupina transformovaných rastlín bola tolerantná ku koncentrácii 0,2 ppm a niekoľko transformovaných rastlín tolerovalo dokonca 0,5 až 1 ppm. Tieto rastliny opäť vyzerali normálne a dobre sa zakoreňovali v prítomnosti herbicídu. Niektoré transformované rastliny na začiatku zbeleli po vystavení herbicídu pri už spomenutých koncentráciách, ale po predĺženej expozícii herbicídu progresívne zozeleneli a výrazne sa zotavovali.
Skupina spomenutých na herbicíd rezistentných rastlín sa ošetrila známym herbicídom Izoxaflutolom (t.j. 5-cyklopropyl-4(2-metylsulfonyl-4-trifluormetylbenzoyl)izoxazol alebo RPA 210772. Tieto rastliny sú rezistentné na tento herbicíd, čo jasne ukazuje, že rastliny sú krížovo rezistentné na niekoľko, tried inhibítorov 4-HPPD.
Príklad 3
Klonovanie génu GST do rastlinného materiálu a regenerácia rastlín rezistentných na herbicídy anilidového a difenyléterového typu
Rastliny
Rastliny tabaku Nicotiana plumbaginifolia cv. Samsun sa pestovali na médiu podľa Murashige a Skoog (MS médium: MS soli 4,6 g/1 doplnené 3% sacharózy a 0,8% baktoagaru, pH 5,9). Tieto rastliny, explantáty na zakoreňovacie pokusy a klíčiace semená sa pestovali v kultivačnej miestnosti pri 25°C s 16 hodinovou svetelnou periódou. Pri pestovaní v skleníku sa rastliny prenesli do kompostu (John Innes kompost číslo 3, Minster Brand Produkts).
Bakteriálne kmene
E.coli kmeň DH5a (Gibco BRL.) bol: F“, 80dlacZ M15, (lacZYAargF)U169, deoR, recAl, endAl, hsdR17 (rK_, mK+) , supE44, ’thi-gyrA96 relAl. Agrobacterium tumefaciens použitý na transformáciu rastlín tabaku bol kmeň LBA 4404.
Plazmidy
DNA z GST-27 sa vložila do fagemidu pBluescript® II SK+ s veľkosťou 2,961 kb a označená pIJ21-3A (Jepson et al., 1994). pJRIRi je plazmid s veľkosťou 12,6 kb. Plazmid pJRIRi obsahuje bakteriálny gén rezistencie na kanamycin (Kan). Má dve repetitivne sekvencie s veľkosťou 25 bp: takzvanú ľavú (LB) a pravú (RB) hraničnú sekvenciu. T-DNA obsahuje markerový gén rezistencie na kanamycin riadený promótorom NOS. Expresia sekvencie kódujúcej GST-27 je riadená CaMV 35S promótorom.
Štandardy (markery) veľkostí kb rebríček od firmy Bethesda Research Laboratories Life Technologies, Inc. sa použil ako marker veľkostí pri kontrole štiepení a produktov PCR (polymerázová reťazová reakcia) na agarózovom géli. Pre westernové analýzy sa na polyakrylamidový gél naniesol marker molekulovej hmotnosti proteínov Rainbow (Amersham) , čo je všetko odborníkovi známe.
Ostatné chemikálie
Aktívne zlúčeniny ako acetochlór, alachlór a metolachlór boli produkty firmy ZENECA Agrochemicals (UK), Jealloťs Hill Research Station. Technické zlúčeniny sa rozpúšťali v etanole a testovali sa pomocou HPLC, zakoreňovacích testov a testov klíčenia (pozri ďalej).
Konštrukcia plazmidu
Plazmid pIJ21-3A obsahujúci DNA génu GST-27 sa naštiepil reštrikčným enzýmom EcoRI (Pharmacia) v lx Tris-acetátovom (TA) pufri. Štiepenie sa overilo na 0,8% agarózovom géli. EcoRI fragmenty sa ligovali do Smal (Pharmacia) miesta plazmidu pJRIRi (obrázok 6) po doplnení prečnievajúcich koncov Klenowou DNA polymerázou (Pharmacia). Ošetrenie enzýmom teľacou alkalickou fosfatázou (CAP) zabránilo znovuspojeniu ' (selfligácii) pJRIRi pred ligovanim génu GST. Kompetentné baktérie E. coli (DH5a) sa tansformovali plazmidom metódou tepelného šoku a potom sa pestovali na agarových platniach a kanamycínom. Pozitívne kolónie sa testovali buď pomocou PCR alebo hybridizáciou cez noc na 42 °C s rádioaktívne značenou sondou (a-32P dNTP). Teplota topenia (Tm) sondy sa určila súčtom 2°C pre každú bázu A alebo T a 4°C pre každú G alebo C. Reakcia potom prebiehala pri najnižšej teplote Tm-5°C s taq polymerázou (Ampli-Taq DNA Polymerase, Perkin Elmer Cetus) podľa protokolu výrobcu.' Podmienky pre PCR s 35 cyklami sa nastavili nasledovne: denaturácia DNA pri 94 °C 48 sekúnd, nasadnutie primárov pri najnižšej Tm 1 minútu a predlžovanie pri 72°C 2,5 minúty. Pred prvým cyklom sa reakcia zahájila pri 85°C.
Vybralo sa 8 pozitívnych kolónii a tie sa pestovali pri 37°C cez noc v trepanej kultúre v LB médiu s kanamycínom. DNA z týchto bunkových kultúr sa extrahovala a purifikovala ultracentrifugáciou pri 50 000 rpm na gradiente CsCl.
Orientácia inzertu v pJRIRi sa overila sekvenovaním úseku medzi 35S promótorom a génom GST Sangerovou metódou pomocou Sequenase® (verzia 2.0, United States Biochemical, corporation) podľa protokolu výrobcu. Výsledný plazmid (pGST-27Bin) (pozri obrázok 6) sa vniesol do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens metódou mrznutia/topenia, ktorú publikovali Hostlers et al.
1987.
Transformácia listov pomocou Agrobacterium tumefaciens
Transformácia pGST-27Bin do tabaku bola uskutočnená postupom, ktorý publikoval Bevan 1984. Na transformáciu sa použili 3 až 4 týždne staré kultúry tabaku (Nicotiana tabaccum cv. Samsun) pestované na médiu MS. Listy sa 1 deň inkubovali na médiu NBM (t.j. médium MS doplnené + mg/ml benzylaminopurinom (6-BAP), 0,1 mg/ml naftalacetovou kyselinou (NAA)) s kanamycinom. Toto médium podporuje rast výhonkov z listov. Ďalší deň sa okraje listu odrezali a list sa rozrezal na kúsky. Tieto kúsky sa potom spoločne inkubovali so suspenziou buniek Agrobacterium tumefaciens (kmeň LBA4404) transformovaných plazmidom pJRIRi s inzertom (pGST-27Bin). Potom sa kúsky opäť vrátili na médium NBM. Po dvoch dňoch sa explantáty preniesli do kultivačných nádob obsahujúcich NBM médium s karbenicilínom (500 mg/ml) a kanamycinom (100 mg/ml) . Po piatich týždňoch sa 1 výhonok z každého kúsku listu preniesol na NBM médium s karbenicilínom (200 mg/ml) a kanamycinom (100 mg/ml). Po ďalších 2 až 3 týždňoch boli výhonky s koreňmi prenesené do i čerstvého média . Dva kúsky z každého výhonku boli umiestnené do samostatných kultivačných nádobiek. Jeden sa udržiaval ako zásobná pletivová kultúra a druhý sa po zakorenení presadil do pôdy v skleníku. Do skleníka sa tak preneslo 42 nezávislých transformantov nesúcich konštrukt GST-27.
Extrakcia listovej DNA pre PCR
Prítomnosť transgénu v predpokladaných transformovaných rastlinách (transformantoch) sa overovala pomocou PCR. Z 3 až 4 týždne starých rastlín pestovaných v sterilných podmienkach sa odobrali vzorky listov. Listové terčíky s priemerom 5 mm sa. rozdrvili 30 sekúnd v 200 μΐ extrakčného pufra (0,5% dodecylsulfát sodný (SDS), 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH
8,0). Vzorky sa 5 minút centrifugovali pri 13 000 rpm a potom sa pridalo 150 μΐ izopropanolu k rovnakému objemu hornej fázy. Vzorky sa nechali 5 minút na ľade a potom sa centrifugôvali 10 minút pri 13 000 rpm a nechali sa vyschnúť. Potom sa rozsuspendovali v 100 μΐ deionizovanej vody a 15 μΐ vzorky sa potom použilo na PCR. PCR sa uskutočnila v rovnakých podmienkach ako opísali Jepson et al. (1991). Rastliny transformované DNA GST-27 sa analyzovali pomocou priméru GST II/7 (AACAAGGTGGCGCAGTT, SEQ ID NO: 10) špecifického pre 3'-koniec úseku GST-27 a priméru NOS3 (CATCGCAAGACCGGCAACAG, SEQ ID NO: 11) špecifického pre NOS terminátor. 39 zo 42 primárnych transformantov poskytlo v PCR produkt s veľkosťou 310 bp.
Analýza westernovým prenosom
Na overenie heterológnej expresie GST-27 v tabaku sa uskutočnila analýza westernovým prenosom. 120 mg listového pletiva z 3 až 4 týždne starých rastlín pestovaných v sterilných podmienkach sa rozdrvilo pri 4°C v 0,06 g polyvinylpyrolidónu PVP), ktorý absorboval fenolické zlúčeniny, a 0,5 ml extrakčného pufra (1 M Tris-HCl, 0,5 M EDTA (etylendiamíntetraacetát) , 5 mM DDT (ditiotreitol), pH 7,8). Potom sa pridalo ďalších 200 μϊ extrakčného pufra. Vzorky sa premiešali a centrifugôvali 15 minút v 4°C. Supernatant sa odstránil, koncentrácia proteínu sa stanovila Bradfordovým testom pomocou BSA ako štandardu. Vzorky sa až do ďalšieho použitia uskladnili na -70°C.
Vzorky 5 μς proteínu s 33% (objem.) Laemmliho farbiaceho roztoku (97,5% Laemmliho pufor (62,6 mM Tris-HCl, 10% (hmotnosť/objem) sacharózy, 2% (hmotnosť/objem) SDS, pH 6,8), 1,5% pyronin a 1% merkaptoetanol) sa naniesli na SDSpolyakrylamidový gél (17,7%, 30:0, 174 akrylamid:bisakrylamid) po 2 minútach varenia. Proteínové extrakty sa separovali elektroforézou v pufri (14,4% (hmotnosť/objem) glycín, 1% (hmotnosť/objem) SDS, 3% (hmotnosť/objem) TrisBase). Potom sa preniesli na nitrocelolózovú membránu (Hybond-C, Amersham) pomocou elektroblotovacieho zariadenia (Biorad Unit) v pufri (14,4% (hmotnosť/objem) glycin, 3% (hmotnosť/objem) TrisBase, 2% (hmotnosť/objem) . SDS, 20% (objemových) metanol) pri 40 mV cez noc. Či bolo nanesené rovnaké množstvo proteínu vo všetkých vzorkách sa kontrolovalo farbením čerstvo prenesených vzoriek na membráne v roztoku 0,05% CPTS (sodná soľ meďftalokianíntetrasulfónovej kyseliny) a 12 mM HC1. Membrána bola potom odfarbená oplachovaním 2x až 3x v 12 mM HC1 a nadbytok farby sa odstránil premývaním v roztoku 0,5 M NaHCO3 5 až 10 minút a potom opláchnutím deionizovanou vodou. Membrány sa potom blokovali 1 hodinu v TBS-Tween (2,24% (hmotnosť/objem) Tris-HCl, 8% (hmotnosť/objem) NaCl, 5% Tween 20 (polyxyetylénsorbitanmonolaurát), pH 7,6 obsahujúcom 5%' (hmotnosť/objem) BSA. Potom sa premývali 20 minút v TBS-Tween s 2% (hmotnosť/objem) BSA. Nepriama imunodetekcia sa uskutočnila s ovčím antisérom GST-27 v riedení 1:2000 ako prvou protilátkou a králičím antiovčim antisérom v riedení 1:1000 ako druhou protilátkou, spojenou s chrenovou peroxidázou (HRP). Akýkoľvek nadbytok antiséra bol opláchnutý TBS-Tween s 2% (hmotnosť/objem) BSA. Detekcia pomocou ECL (enhanced chemiluminiscence) sa uskutočňovala postupom podľa výrobcu (Amersham). Akékoľvek pozadie sa odstránilo dodatočným premývaním membrány v roztoku,· spomenutom vyššie.
Stanovenie úrovne expresie génu GST sa uskutočnilo pomocou laserového denzitomentra LKB 2222-020 Ultroscan XL (Pharmacia). Westernová analýza viedla k identifikácii 8 primárnych transformantov pozitívnych v PCR, ktorí nevykazovali žiadnu expresiu GST-27. Zostávajúcich 31 transformantov vykazovalo úroveň expresie, ktorá bola v rozmedzí od sotva detegovateľnej až po veľmi vysokú v rozsahu 1% celkového rozpustného proteínu, čo bolo stanovené porovnaním so signálom detegovaným vo vzorke čistého GST II z kukurice.
Analýza Southernovým prenosom
Vzorec integrácie transgénu sa overil Southernovou analýzou. Z rastlín tabaku pestovaných v skleníku sa odobralo
2,5 g pletiva z listu, a umiestnilo sa do plastického sáčku obsahujúceho extrakčný pufor (0,35 M sorbit, 0,1 M Tris-HCl, 0,005 M EDTA, 0,02 M disíričitan sodný, pH 7,5)a vytlačilo sa pomocou strojčeka, na cestoviny. Takto získané extrakty sa potom centrifugovali 5 minút pri 6000 rpm pri izbovej teplote. Po zliati supernatantu sa pelet rozsuspendoval v 300 μΐ jadrového lyzovacieho pufra (2% (hmotnosť/objem) CTAB, 0,2 M Tris-HCl, 0,05 M EDTA, 2 M NaCl, pH 7,5) . Potom sa pridalo 120 μΐ 5% sarkozylu a vzorky sa vložili na 15 minút do vodného kúpeľa s teplotou 65°C. Extrakty sa po pridaní 600 ml zmesi chloroform:izoamylalkohol 24:1 centrifugovali 5 minút pri 6000 rpm. 700 μΐ izopropanolu sa potom pridalo k rovnakému objemu supernatantu a centrifugovalo sa ďalších 10 minút pri 13 000 rpm. Pelet sa opláchol 70% etanolom a usušil na vzduchu. Potom sa nechal cez noc rozpúšťať v 4°C v 30 μΐ TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) a rozsuspendoval sa. Vzorky boli až do ďalšieho použitia uskladnené pri - 20°C.
Celková listová DNA z extraktov rastlín obsahujúcich gén
GST-27 sa štiepila 6 hodín pri 37°C reštrikčnými enzýmami Sací a
Xbal v pufri lx Phor-one-all (20 horečnatý, rozdelila
100 mM súčasného na 0,8% jemného octan draselný, agarózovom géli, trepania v neutralizoval 75 minút trepaním mM Tris-octan, 20
Pharmacia). DNA denaturovaná 30 sa potom minút za
0,5
M NaCl a potom sa gél v 0,5 M Tris-HCl a 1,5 M NaCl.
DNA sa preniesla na nylonovú membránu Hybond-N (Amersham) pomocou kapilárneho prenosu v 20x SSC (3 M NaCl, 0,3 M citrát sodný). DNA sa fixovala na membránu kombináciou UV žiarenia (UV Stratalinker, Stratagene) a pečenia 20 minút pri 80 °C. Sondy sa vyštiepili pomocou EcoRI z plazmidu použitého na transformáciu Agrobacterium tumefaciens obsahujúceho gén GST-27. Sonda bola označená oc-32P dNTP (3000Ci/mM) pomocou kitu Prime-a-Gen (Promega) postupom náhodných primérov podľa Feinberga a Vogelsteina. Pozitívna kontrola sa pripravila štiepením pIJ21-3A enzýmami Sací a EcoRI.
Prehybridizácia prebiehala v 5x SSPE (0,9 M NaCl, 0,05 M fosforečnan sodný, 0,005 M EDTA, pH 7,7), 0,5% SDS, 1% (hmotnosť/objem) Marvel (sušené mlieko v prášku), 200 μς/πιΐ DNA z lososových spermii denaturovaná 3 až 4 hodiny pri 65°C. Hybridizácia prebiehala v rovnakom pufri s vynechanou poslednou zložkou. Membrány sa potom premývali 30 minút pri 65°C v 3x SSC, 0,5% SDS a dva krát 20 minút v lx SSC, 0,1% SDS predtým, ako sa uskutočnila autorádiografia pri -70°C.
Analýza HPLC
Na overenie toho, či transgénne rastliny exprimujúce GST-27 majú GST aktivitu proti herbicidovým substrátom, sa uskutočnili testy in vitro pomocou HPLC. Z 3 až 4 mesiacov starých kvitnúcich rastlín tabaku pestovaných v skleníku sa odobral 1 g listového pletiva, rozdrvený v kvapalnom dusíku a 7 ml extrakčného pufru (50 mM glycylglycín, 0,5 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7,5). Extrakty sa preniesli do centrifugačnej skúmavky obsahujúcej 0,1 g PVP a potom centrifugované 30 minút pri 16 500 rpm pri 4°C. 2,5 ml supernatantu sa nanieslo na kolónku (PD10) so Sefadexom G-25 (Pharmacia) a eluované 3,5 ml pufru sí fosforečnanom sodným (50 mM, pH 7,0) obsahujúcim 1 mM EDTA a lmM DTT. Stanovenie proteínu sa uskutočnilo Bradfordovou metódou s BSA ako štandardom. Extrakty sa rozdelili na alikvotné časti a uschovali sa až do ďalšieho použitia pri -70°C.
Analýzy HPLC sa uskutočnili na kolónach Spherisorb 5μ ODS2 (25 cm x 4,6 mm vnútorný priemer, výrobca Hichrom) zmesou acetonitril: 1% vodná kyselina fosforečná 65:35 ako mobilné fázy pri rýchlosti 1,5 ml/min. Zlúčeniny boli detegované UV detektorom LC-6A Schimadzu (vlnová dĺžka 200 nm) .
Reakcie sa uskutočňovali v 0,8 ml HPLC fiolkách pri izbovej teplote (20 až 25°C). 15 až 94% (objemových) rastlinného extraktu sa pridalo k fosfátovému pufru (pH 7,0) s 5 mM glutatiónom alebo homoglutatiónom a 2 až 20 ppm príslušnej zlúčeniny (2 ppm fluordifénu alebo 20 ppm acetochlóru, alachlóru a metolachlóru). Kontroly sa pripravili s rovnakými pomermi až na to, že rastlinné extrakty boli nahradené fosfátovým pufrom. Reakcia bola zahájená pridaním herbicídu použitého ako substrát. Reaktivita zlúčeniny bola sledovaná v čase 9 až 19 hodín. Špecifický retenčný čas a plochy vrcholov boli počítané pomocou programu JCL 6000 chromatography data systém package na spracovanie chomatografických dát (Jonesova chromatografia) . Pre každú zlúčeninu sa merala plocha vrcholu HPLC vs. časový profil na základe 7 až 11 časových bodov. Polčas a rýchlostná konštanta pseudoprvého rádu boli získané z exponenciálnych preložení bodov korigovanej plochy vrcholov vs. čas. Tieto údaje sa spracovali programovým balíkom FIT verzia 2.01.
Pomocou tohto opísaného postupu sa hodnotila aktivita GST transformovaných rastlín proti rôznym herbicídom ako substrátu. Testované herbicídy boli 3 dichlóracetanilidy (acetochlór, alachlór a metolachlór) a difenyléter (fluordifén). Tieto látky sú známe tým, že sú konjugované s glutatiónom, zvlášť dichlóracetanilidy. Extrakcia sa uskutočňovala v prítomnosti PVPP a pri nízkej teplote, aby sa obmedzila denaturácia proteínov. Štúdie stability GST ukázali, že aktivita GST kukurice sa znížila o 73% v hrubom extrakte, keď bol uchovávaný' pri -20°C. Preto sa extrakty rozdelili do alikvotných častí a až do použitia sa uchovávali pri -70°C. Každá vzorka bola rozmrazená len raz, a to cez noc a na lade. Všetky testy sa uskutočnili do 2 týždňov od prípravy extraktov.
Koncentrácia herbicídov v HPLC fiolkách sa nastavila pódia ich rozpustnosti. Acetochlór, alachlór a metolachlór boli testované pri 20 ppm a fluordifén pri 2 ppm. Test prebiehal 9 až 19 hodín v závislosti na reaktivite herbicídu. Metolachlór bol testovaný dlhší čas, pretože má v týchto podmienkach vysoký polčas. Detekcia zlúčenín sa uskutočňovala UV detektorom pri 200 nm. Špecifický retenčný čas a plochy vrcholov sa merali pre každý herbicíd. Aktivita GST sa určovala na základe 7 až 11 časových bodov. Po exponenciálnom znížení krivky nasledovala enzymatická konjugácia. Zníženie plochy vrcholu testovaného herbicídu sa použilo na výpočet aktivity GST. Tiež sa vypočítali hodnoty polčasu a rýchlostné konštanty prvého rádu.
Testovalo sa päť línií tabaku vrátane divého typu (negatívna kontrola), 4 línie GST-27 označované 5, 6, 12 a 17. Tieto línie sa vybrali na základe výsledkov westernovej analýzy ukazujúcich na ich vysokú expresiu. Aby sa zabránilo rýchlej konjugácii ešte pred vlastným sledovaním, bol herbicíd pridaný ako posledný. GST-27 línia číslo 17 bola testovaná tiež na konjugáciu acetochlóru a homoglutatiónu. Výsledky sú uvedené na obrázku 7 a ukazujú, že rastliny exprimujúce GST-27 majú aktivitu proti chloracetanilidovým herbicídom in vitro.
Stručne sa dá zhrnúť, že transgénne rastliny tabaku exprimujú proteín GST-27 a tieto rastliny je možné odlíšiť na základe ich relatívnej aktivity in vitro proti herbicídovému substrátu.
Analýzy in vivo - zakoreňovacie testy
U línií GST-27 sa preukázala významná aktivita proti najmenej trom chlóracetanilidom. Ale väčšina herbicídov tejto triedy je známa tým, že inhibuje predlžovanie koreňov. Bolo preto rozhodnuté uskutočniť zakoreňovacie testy pre acetochlór, alachlór a metolachlór.
Pripravila sa úvodná štúdia k tomu, aby sa zistili najúčinnejšie koncentrácie. Bol vybratý rozsah koncentrácií 0,1, 1, 5, 10, 20, 40 a 100 ppm. Dve transformované línie (GST-27 číslo 6 a 17) a tabak divého typu boli testované s alachlórom. Línie 6 a 17 boli vybraté preto, že predstavujú rastliny s najnižšou a najvyššou expresiou, ako sa dá súdiť na základe westernovej analýzy. Tri explantáty, pozostávajúce z listu a kúska výhonku, sa preniesli na médium MS doplnené herbicídom. Rast koreňov bol pozorovaný dva týždne (obrázok 8). Všeobecne sa dá účinok herbicídu pozorovať na rastline divého typu už od koncentrácie 1 ppm, lebo listy sú menšie a žltšie. So zvyšujúcou sa koncentráciou je účinok zreteľnejší a znižuje sa počet nových listov. Od koncentrácie 10 ppm rastliny nevytvárajú vôbec nové listy. Oproti tomu na transformované línie je účinok herbicídu pozorovateľný až od koncentrácie 20 ppm pre líniu 2 a od 40 ppm pre líniu 6. V rozmedzí týchto koncentrácií sú listy menšie a ich počet je znížený, ale sú stále zelené. Na druhej strane, rastliny divého typu vytvárajú aspoň nejaké korene do koncentrácie 5 ppm, ale už v rozmedzí 0 až 5 ppm sa dramaticky znižuje ich dĺžka. Pokiaľ ide o línie 2 a 6, tie vytvárajú korene až do koncentrácie 10 ppm (línia 2) a 20 ppm (6), pričom sa znižuje ich dĺžka. Za týchto podmienok po 2 týždňoch sledovania je možné pozorovať, že koncentrácie obmedzujúce zakoreňovanie sú medzi 20 a 40 ppm pre najlepšiu líniu testovanú v tomto štádiu pokusu.
Nasledujúci pokus sa pripravil pre rastliny divého typu (kontrola), 4 línie GST-27 (línie číslo 5, 6, 12 a 17). Tieto rastliny sa testovali na acetochlóre, alachlóre a metolachlóre v koncentráciách 0, 10, 20 a 40 ppm pre acetochlór a metolachlór a 0, 10, 40 a 100 ppm pre alachlór. Tieto koncentrácie boli vybraté preto, že pri analýze HPLC rastliny vykazovali najnižšiu aktivitu proti acetochlóru a metolachlóru. Inak pokus prebiehal v rovnakých podmienkach: 3 explantáty pre každú líniu a pré každú koncentráciu sa preniesli na médium MS s herbicídom. Pozorovanie koreňov prebiehalo tri týždne od zahájenia pokusu.
Čo sa týka úvodnej štúdie, odpoveď explantátov v každej nádobe bola všeobecne uniformná. Na acetochlóre explantáty divého typu nejavili žiadne zakoreňovanie ani nevytvárali nové listy v prítomnosti herbicídu. Ale línie 6 a 17 vytvorili niekoľko koreňov a tiež malé listy pri koncentráciách 10 a 20 ppm. Línie 5 a 12 neboli tak rezistentné ako predchádzajúce dve línie. Na alachlóre explantáty divého typu nevytvárali pri testovaných koncentráciách žiadne korene, ale pri koncentrácii 20 ppm vytvorili niekoľko listov. Línie 6 a 17 vytvárali korene až do koncentrácie 40 ppm, pričom korene boli úplne neovplyvnené herbicídom. Počet koreňov sa zdal nižší s rastúcou koncentráciou herbicídu. Pre tieto línie bola za daných podmienok koncentrácia obmedzujúca zakoreňovanie medzi 40 a 100 ppm po troch týždňoch. Línie 9 a 16 nevytvárali žiadne korene a len velmi malé lístky na 20 a 40 ppm herbicídu. Na metolachlóre rastliny divého typu vytvárali len niekoľko malých korienkov v koncentrácii 10 a 20 ppm. Línie 6 a 17 vytvárali krátke korene, ale nie toľko, koľko vytvárali na alachlóre. Pre tento herbicíd bola koncentrácia obmedzujúca zakoreňovanie medzi 20 a 40 ppm pre líniu 6 a viac ako 40 ppm pre líniu 17.
Ošetrenie rastlín herbicídom
Na ukážku toho, že transgénne rastliny exprimujúce GST-27 nesú rezistenciu na pôsobenie herbicídu, boli v skleníku uskutočnené pokusy s pre-emergentným a post-emergentným ošetrením herbicídom.
Pre-emergentné testy boli zahájené vysiatím asi 50 semien z každej línie pre každú testovanú koncentráciu herbicídu do piesku (25% preosiatej hliny, 75% hrubého piesku, pomaly sa uvoľňujúce hnojivo). Pre každú koncentráciu sa uskutočnili 4 opakovania. Herbicíd (0,300 a 350 g/ha) formulovaný v 5% JF5969 (905,6 g/1 cyklohexanón, 33,33 g/1 synperonic NPE 1800 a 16,7' g/1 Tween 85) sa aplikoval pomocou rozprašovača na vodorovnú plochu s osivom. Osivo bolo ponechané v skleníku a klíčenie bolo hodnotené po troch týždňoch. Výsledky pre alachlór ukázali, že transgénne rastliny sú rezistentné na pre-emergentnú aplikáciu herbicídu. Podobné výsledky sa získali pre acetochlór, metolachlór a EPTC (12 000 g/ha).
Post-emergentné testy sa uskutočnili vysiatím 28 semien pre každú líniu a pre každý herbicíd do kompostovej pôdy. Po 16 dňoch boli tabakové rastlinky (asi 1 cm vysoké) postriekané alachlórom formulovaným v 5%
JF5969 pomocou postrekovača.
Poškodenie rastlín bolo hodnotené 3 herbicídu postrekom, týždne po a síce bola hodnotená velkosť aplikácii výskyt nekróz, stav rastového vrcholu a morfológia rastliny, listov v porovnaní s neošetrenou kontrolou. Vo výslednom hodnotení skóre
100% znamená, že rastlina je herbicídom úplne zničená, a skóre 0% znamená, že rastlina je podobná neošetrenej kontrole. Postemergentné výsledky pre alachlór ukázali, že transgénne rastliny sú rezistentné na tento herbicíd. Miera poškodenia rastlín divého typu a segregujúce línie GST-27 po aplikácii metolachlóru v dávke 1400 g/ha je graficky znázornená na obrázku 9. Obdobné štúdie sa uskutočnili tiež s acetochlórom v dávke 2000 g/ha a viedli k podobným výsledkom..
Príklad 4
Klonovanie génu rezistencie na glyfozát do'rastlinného materiálu a príprava rastlín rezistentných na glyfozát
Prehľad kaziet a špecifických konštruktov na transformáciu rastlín je uvedený na obrázkoch v Európskej patentovej prihláške EP Al 536330.
Vektor číslo 1 pre dvojklíčne rastliny
Vektor číslo 1 je konštitutívny kontrolný plazmid obsahujúci gén glyfozátoxidázy (GOX) fúzovaný s chloroplastovou' (CTP) tranzitnou sekvenciou 1 génu pre Rubisco z Arabidopsis thaliana riadený zosilneným promótorom CaMV 35S. Konštrukt obsahuje translačný zosilňovač (enhancer) Omega z 5'-konca kódujúcej sekvencie CTP. Vektor číslo 1 má terminátor NOS. Konštrukt CTP-GOX je syntetizovaný podľa sekvencie opísanej v prihláške vynálezu WO 92/00377 s tým, že sú doplnené ďalšie reštrikčné miesta pre Ncol v mieste translačného počiatku ATG a miesto KpnI na 3'-konci. Vnútorné miesta Sphl a Ncol boli počas syntézy odstránené, bez toho, aby došlo k zmene sekvencie proteínu. Sekvencia CTP-GOX sa izolovala ako Ncol-KpnI fragment a ligovala použitím štandardných, v odbore známych, metód do plazmidu pMJBl naštiepeného Ncol a KpnI, čo je plazmid založený na plazmide pITB211 obsahujúcom CaMV 35S promótor so zdvojeným enhancerom napojeným na zosilňovaciu translačnú sekvenciu z vírusu tabakovej mozaiky, ktorá nahrádza netranslatovanú 5' koncovú vedúcu sekvenciu vírusu škvrnitosti tabaku, a je ukončený terminátorom NOS.
Kazeta obsahujúca konštrukt zosilnený promótor CaMV 35S zosilňovač Omega ' - CTP-GOX - NOS sa izolovala ako fragment HindlII-EcoRI a ligovala do plazmidu pJRIRi, transformačného vektora odvodeného z pBinl9, naštiepeného HinlII a EcoRI.
Vektor číslo 2 pre dvojklíčne rastliny
Gén CP4-EPSPS (čo je EPSPS II triedy) fúzovaný s chloroplastovým tranzitným peptidom z petúnie sa pripravil podľa sekvencie opísanej v prihláške vynálezu WO92/04449 s miestom Ncol v počiatku translácie ATG. Vnútorné miesto Sphľ je zrušené bez toho, aby došlo k zmene sekvencie proteínu. Fragment obsahujúci syntetickú sekvenciu CTP-EPSPS sa izoloval ako NcolSacľ fragmnet a ligoval sa do pMJBl. Sekvencia sa vložila do plazmidu tak, že jej expresia je riadená zosilneným promótorom CaMV 35S a terminátorom NOS s Omega fragmentom umiestneným na 5'-konci proteín kódujúceho úseku, a izolovala sa ako EcoRIHindlII fragment, ktorý sa potom klonoval do pJRIRi, čím vznikol vektor číslo 2. 1
Vektor číslo 3 pre dvojklíčne rastliny
Kontrolný vektor s génmi EPSPS a GOX sa konštruoval tak, že sa vektor číslo 2 pre dvojklíčne rastliny naštiepil EcoRI a vložil sa do neho linker (spojovací člen) EcoRI-Sphl-EcoRI. Tento vektor sa potom štiepil Sphl, aby sa uvoľnila kazeta (B), ktorá sa klonovala do miesta Sphl vektora číslo 1 smerom k 5'-koncu od promótora, čím vznikol vektor pDV3puc (obrázok 9). Kódujúce úseky, vrátane promótorov a terminátorov odvodených z vektorov číslo 1 a 2 sa potom vyštiepili z pDV3puc ako HindlIIEcoRI fragment a klonovali sa do pJRIRi.
Plazmid pDV3 v binárnom vektore pJRIRi sa vniesol do tabaku prostredníctvom transformácie sprostredkovanej Agrobacterium tumefaciens v odbore známym spôsobom. Z kalusov z takto transformovaného materiálu bolo získaných 270 výhonkov a z nich 77 zakorenilo. Na potvrdenie prítomnosti génov EPSPS a GOX v zakorenených výhonkoch sa extrakty DNA z rastlín transformovaných pDV3 analyzovali pomocou PCR s nasledujúcimi primérmi:
3'-koniec génu EPSPS:
GATCGCTACTAGCTTCCCA (SEQ ID NO: 12, EPSPS2)
5'-koniec génu GOX:
AATCAAGGTAACCTTGAATCCA (SEQ ID NO: 13, GOX1)
PCR reakcia poskytla pás s veľkosťou 101 kb, pokiaľ boli obidva gény prítomné. Na overenie funkčnosti génu tolerancie ku glyfozátu v pDV3 sa explantáty preniesli na MS médium obsahujúce 0,01 mM a 0,05 mM glyfozát. Rastliny sa hodnotili po dvoch týždňoch od prenesenia na médium s glyfozátom. Rezistentné línie, ktoré úspešne rástli na médiu obsahujúcom herbicíd, sa analyzovali pomocou westernového prenosu použitím králičieho antiséra proti purifikovaným GOX a EPSPS.
Z každého primárneho transformantu sa extrahovala listová,· DNA a použila sa v PCR reakcii na overenie prítomnosti vektora. Westernová analýza sa uskutočnila na každej pDV3 rastline pozitívnej v PCR, aby sa potvrdila heterológna expresia GOX a EPSPS, a síce metódou už opísanou v predchádzajúcom texte. Rastliny s vysokou hladinou expresie boli samoopelené a semená sa potom podrobili skríningu na kanamycínových platniach. Rastliny s jedným lokusom sa uchovali na prípravu homozygotov. Údaje potvrdzujúce, že rastliny transformované konštruktom pDV3 sú rezistentné na glyfozát, sú uvedené v príklade 8.
Príklad 5
Príprava rastlín rezistentných na herbicídy anilidového typu a na glyfozát
Peľ heterozygotných a homozygotných línií tabaku exprimujúcich GOX a EPSPS sa preniesol na homozygotné línie tabaku exprimujúce GST-27. Semená, ktoré vznikli z tohto kríženia sa vysiali a listový materiál sa potom použil na westernovú analýzu, ako už bolo opísané. Proteínové extrakty z rastlín pozitívnych vo westernovej analýze sa potom testovali protilátkami GOX/EPSPS, aby sa selektovala línia exprimujúca ako GST-27, GOX tak aj EPSPS. Tieto línie sa potom použili na preemergentné postreky acetochlórom, alachlórom a metolachlórom a EPTC. Následne sa rastliny postriekali post-emergentne formulovaným glyfozátom.
Príklad 6
Príprava rastlín, ktoré sú rezistentné na herbicídy ako anilidového tak aj glyfozátového typu, spôsobom bez kríženia opelením
Vektor pDV3puc sa štiepil EcoRI, extrahoval chloroformom a precipitoval. Linker EcoRI-HindlII-EcoRI MK0L3 (5' AATTACGGAAGCTTCCCGT 3', SEQ ID NO: 14) sa zahrial na 70°C a nechal sa vychladnúť na izbovú teplotu, aby došlo k samospojeniu. Spojený (t.j. dvojreťazcový) linker bol ligovaný' do pDV3puc naštiepeného EcoRI. Údajné rekombinanty sa testovali s koncovo značeným oligonukleotidom MKOL3. Plazmidová DNA sa izolovala z pozitívne hybridizujúcich kolónií. Reštrikčné štiepenie HindlII viedlo k uvoľneniu fragmentu s veľkosťou 5,4 kb obsahujúceho konštrukt Omega-CTP2-EPSPS-NOS, ktorého expresia je riadená CaMV 35S promótorom a konštrukt Omega-CTPl-GOX-NOS, ktorého expresia je riadená CaMV 35S promótorom. Tento fragment sa klonoval do plazmidu pGST-27Bin štiepeného HindlII a defosforylovaného CIP. Rekombinanty sa selektovali pomocou sondy z inzertu. Výsledný vektor pDV6-Bin (obrázok 10) sa overil vhodným sekvenovaním. Výsledný plazmid sa transformoval do tabaku prostredníctvom Ägrobacterium tumefaciens známym spôsobom. Po transformácii sa získalo 270 výhonkov, z nich 80 zakorenilo. Z každého primárneho transformantu sa extrahovala listová DNA a použila sa na PCR reakciu na dôkaz prítomnosti proteínu kódujúceho úseku vektora. Na PCR sa použili už uvedené priméry (SEQ ID NO: 12 a 13) . Na dôkaz funkčnosti transgénu sa primárne transformanty pDV6 hodnotili na médiu obsahujúcom 0, 0,01 mM a 0,05 mM glyfozát a 10 ppm a 40 ppm alachlóru. Značný počet transgénnych rastlín úspešne rástol na oboch médiách v podmienkach, kedy kontrola divého typu nerástla. Westernová analýza sa uskutočnila na každej pDV3 rastline pozitívnej v PCR, aby sa potvrdila heterológna expresia GOX, EPSPS a GST-27, a síce metódou už opísanou v predchádzajúcom texte. Tieto línie sa potom použili na pre-emergentné postreky acetochlórom, alachlórom a metolachlórom a EPTC. Následne sa rastliny postriekali post-emergentne formulovaným glyfozátom.
. Tabuľka 1 uvedená ďalej ukazuje údaje o pre- a postherbicídnom ošetrení rastlín pDV6, t.j. rastlín exprimujúcich ako gén rezistencie ku glyfozátu, tak aj GST. Horná časť tabuľky ukazuje dávky, v ktorých bol herbicíd aplikovaný pre-emergentne a následný pokračujúci stav bez post-emergentnej aplikácie herbicídu. Dolná polovica tabuľky ukazuje poškodenie spôsobené po aplikácii glyfozátu v dávke 800 g/ha. Spodná tabuľka ukazuje opakované skóre poškodení vplyvom post-emergentnej aplikácie glyfozátu na rastlinách, ktoré neboli vystavené pre-emergentnému ošetreniu. Všetky opakovania na rastlinách divého typu dávali zhodné výsledky, zatiaľ čo výsledky opakovaní s transgénnymi rastlinami odrážali skutočnosť, že išlo o segregujúcu populáciu, t.j. azygotné rastliny, ktoré neexprimovali transgén, boli schopné prejsť testom post-emergentného postreku.
Tabuľka 1
Priemerné hodnoty pre post-emergentnú aplikáciu herbicídu
Post-emergentná aplikácia Pre-emergentná aplikácia % fytotoxicity
Látka Dávka Látka Dávka pDV6 Č.2 pDV6 č.71 Divý typ
Žiadna Žiadna - 0 0 0
Acetochlór 50 0 0 -
Metolachlór 300 0 0 -
Alachlór 400 0 0
Dimetamid 50 0 0 —
Cykloát 5000 0 0 -
EPTC 5000 0 0 -
Bayer FOE 5043 50 0 0 -
Tetrazolinón 200 - 0
glyfozát 800 Žiadna - 18,75 48,75 86,25
360 g/1 Acetochlór 50 0 0 -
Metolachlór 300 0 0 -
Alachlór 400 0 0 —
Dimetamid 50 0 0 -
Dimetamid 5000 0 0 -
EPTC 5000 0 0 -
Bayer FOE 5043 50 0 0
Tetrazolinón 200 - 0 -
Post-emergentná aplikácia Pre-emergentná aplikácia
Látka Dávka Látka a b c d
glyfozát 800 75 0 0 0
100 0 0 95
90 90 90 75
FOE5043 je oxyacetamid známy ako flutiamid.
Príklad 7
Príprava kukurice rezistentnej na herbicídy anilidového a glyfozátového typu
Vektor na transformáciu jednoklíčnych rastlín (kukurica, pšenica), ktorý obsahuje gén GST-27 poskytujúci rezistenciu na pre-emergentné herbicídy a fosfinotricín-acetyltransferázu (PAT) poskytujúcu rezistenciu na post-emergentný herbicíd glufozinát, bol pripravený nasledovným spôsobom:
1. krok: pUB (vektor odvodený z pUC obsahujúci ubikvitínový promótor a intrón z kukurice) bol štiepený (pozri obrázok 11) HindlII. Do takto vzniknutej medzery bol vložený linker HindlIIAgel-HindlII (5' AGCTTGTACACCGGTGTACA 3', SSEQ ID NO: 15). Výsledkom bol rekombinantný vektor označený pUB2.
2. krok: cDNA pre GST-27 bola vyštiepená z pIJ21-3A pomocou KpnI a BamHI a klonovaná do pUB2 štiepeného KpnI a BamHI, čím vznikol pUB3.
3. krok: Linker KpnI-PacI-KpnI (5' CGGACAATTAATTGTCCGGTAC 3', SEQ ID NO: 16) bol sám spojený (t. j. vytvoril dvoj reťazcovú DNA) a potom bol klonovaný do p(JB3 naštiepeného KpnI, čím sa vytvoril pUB4.
4. krok: Terminátor NOS bol izolovaný ako Smal fragment z pIE987 (obrázok 12) a s tupými koncami klonovaný do pUB4 naštiepeného EcoRV, čím vznikol pUB5. Orientácia terminátora NOS v pUB5 bola overená pomocou EcoRI a BamHI. Všetky miesta spojov boli sekvenované na overenie správneho vloženia jednotlivých zložiek konštruktu.
5. krok: Kazeta ubikvitín-GST-27-NOS prítomná v pUB5 bola vybratá štiepením Agel a PacI a klonovaná do ampicilin mínus vektora pIGPAT (obrázok 13), ktorý obsahuje gén PAT riadený promótorom CaMV 35S. Rekombinanty sa detegovali hybridizáciou kolónií s EcoRI cDNA inzertom z pIJ21-3A. Rekombinanty boli orientované pomocou štiepenia Ncol a bol tak vytvorený vektor pCATlO (obrázok 14).
6. krok: Kazeta 35S-PAT-NOS bola odstránená štiepením AscI a kazeta AscI ubikvitin-PAT-NOS z pPUN14 bola vložená, čím vznikol pCATll (obrázok 15) . pCATll bol transformovaný do pšenice a kukurice odborníkovi známymi metódami pomocou mikrovláken a ostreľovaním mikročasticami. Bunky boli potom prenesené do média obsahujúceho bialofos na selekciu kalusov, ktoré exprimujú. gén PAT. Kalusy rastúce na médiu obsahujúcom tento herbicíd boli potom, testované pomocou PCR s použitím nasledovných primérov (SEQ ID NO: 33 a 34) na dôkaz prítomnosti génu GST-27 v kaluse:
5' CCAACAAGGTGGCGCAGTTCA 3' (SEQ ID NO: 33)
5' CATCGCAAGACCGGCAACAG 3' (SEQ ID NO: 34)
Kalusy obsahujúce expresnú kazetu GST-27 sa preniesli na regeneračné médium, kde sa získali rastliny kukurice. Transformované rastliny kukurice sa overovali, a síce westernovou analýzou celkového proteínu, že konštitutívne exprimujú vysokú hladinu GST. Peľ týchto rastlín sa preniesol na elitnú inbrednú líniu kukurice a z tohto kríženia sa získali semená. Na dôkaz zvýšenej tolerancie rastlín na herbicíd acetochlór boli uvedené semená vysiate do pôdy, do ktorej sa; aplikovalo medzi 2000 a 8000 g/ha herbicídu. Po vyklíčení a po 7 týždňoch rastu boli vzorky semenáčikov hodnotené, aké majú (ak vôbec) poškodenia v dôsledku herbicídov porovnaní so vyrastenými
Transgénne pestované z netransgénneho osiva za rovnakých semenáčiky a netransgénne kontrolné v pôde ošetrenej herbicídom a zabezpečovacou látkou vykazujú semenáčikmi veľmi malé poškodenie, podmienok. semenáčiky príslušnou ak vôbec, kým netransgénne semenáčiky pestované v pôde obsahujúcej herbicíd bez zabezpečovacej látky vykazujú veľmi podstatné poškodenie. Semenáčiky, ktoré prežili prvú aplikáciu herbicídu, sa nechali rásť ďalších 20 dní a potom bola na ne postrekom aplikovaná komerčná zmes glufozinátu v rôznych koncentráciách obsahujúcich od 0,1 do 1% aktívnej látky. Semenáčiky obsahujúce gén PAT (ktorého expresia sa určila metódou, ktorú publikovali DeBlock, M. et al., EMBO J. 6(9) 2513-2518, 1987) boli buď úplne rezistentné na glufozinát, alebo boli relatívne tolerantné na herbicíd, čo záviselo od aplikovanej koncentrácie, v porovnaní so semnenáčikmi, ktoré neobsahovali uvedený gén.
Príklad 8
Príprava rastlín (jednoklíčnych a dvojklíčnych) rezistentných na glyfozát a glufozinát
Tento príklad ukazuje prípravu rastlín, ktoré sú rezistentné ako na glyfozát, tak' aj na glufozinát. Táto viacpočetná rezistencia na herbicídy je výsledkom kríženia prvej rastliny, ktorá bola geneticky upravená tak, že je rezistentná na glufozinát, s druhou rastlinou, ktorá bola geneticky upravená tak, že je rezistentná na glyfozát.
Príprava konštruktu pPG6 nesúceho rezistenciu na glufozinát
Vektor pPG6, založený na vektore Binl9 a odvodený z vektora pBinl9RiPAT, obsahuje kazetu obsahujúcu promótor CaMV 35S riadiaci gén GUS. Medzi promótor a gén GUS je vložený druhý intrón génu ST-LS1. Táto sekvencia je dlhá 189 bp, má obsah A/T' 80% a obsahuje typické zostrihové miesta a stop-kodóny vo všetkých troch čítacích rámcoch. Prítomnosť intrónu zabraňuje expresii GUS v Agrobacterium tumefaciens, lebo u prokaryot nedochádza k zostrihu. Obsahuje tiež kazetu nesúcu promótor CaMV 35S riadiaci expresiu PAT génu. Mapa pPG6 je na obrázku 16.
Konštrukty nesúce rezistenciu na glyfozát
Vektory vhodné pre dvojklíčne rastliny sa už opísali v príklade 4.
Vektor číslo 1 pre jednoklíčne rastliny
Vektor číslo 1 vhodný pre jednoklíčne rastliny je plazmid odvodený z plazmidu pUC, ktorý obsahuje ako CTP1 GOX, tak aj
CTP2 EPSPS, v oboch prípadoch riadené polyubikvitinovým promótorom z kukurice zosilneným polyubikvitinovým intrónom 1 z kukurice. Obsahuje tiež kazetu nesúcu rezistenciu na fosfinotricín.
Plazmid číslo 1: Vektor pUBl sa naštiepil KpnI a bol doň vložený linker KpnI-Notl-KpnI (5' CATTTGCGGCCGCAAATGGTA 3', SEQ ID NO: 17). Linker EcoRI-Notl-EcoRI (5' AATTCATTTGCGGCCGCAAATG 3', SEQ ID NO: 18) bol vložený do EcoRI miesta plazmidu DVl-pUC. Výsledný plazmid sa naštiepil Ncol a 5'-prečnievajúci koniec bol doplnený pomocou Klenowho fragmentu DNA polymerázy I. Lineárny vektor sa potom štiepil Nôti a izoloval sa fragment Nôti s tupými koncami. Tento fragment obsahujúci sekvencie CTP1-GOX a NOS sa ligoval do modifikovaného pUBl naštiepeného Smal a Nôti. Linker HindlII-Notl-HindlII (5'AGCTTGCAGCGGCCGCTGCA 3', SEQ ID NO: 19) sa vložil do plazmidu a vznikol tak plazmid číslo 1.
Plazmid číslo 2: Do EcoRI miesta plazmidu DV2-pUC (bol izolovaný aj druhý kloň neobsahujúci opísaný linker, umožňujúci túto klonovaciu stratégiu) sa vložil linker EcoRI-Notl-EcoRI (5'AATTCATTTGCGGCCGCAAATG 3 , SEQ ID NO: 20). Výsledný plazmid sa naštiepil Ncol a 5'-prečnievajúci koniec sa doplnil pomocou Klenowho fragmentu DNA polymerázy I. Lineárny vektor sa potom štiepil Nôti a výsledný fragment sa klonoval do rovnakého vektora (modifikovaný pUBl), ktorý už bol opísaný, čím vznikol plazmid číslo 2. Kazeta so obsahujúca promótor CaMV fosfinotricínacetyltransferázu vyštiepila z pIE108 a klonovala 2, čim vznikla kazeta číslo 2. sa použila na overenie toho, orientácii ako kazeta CTP2 EPSPS selektovateľným markerom PAT 35S, intrón Adhl, gén (PAT) a terminátor NOS sa do miesta HindlII plazmidu číslo Diagnostická, reštrikčná analýza že kazeta PAT je v rovnakej
Kazeta nesúca polyubikvitínový promótor a intrón, CTP1 GOX a terminátor NOS bola vyštiepená z plazmidu číslo 1 ako fragment Nôti a ligovaná do kazety číslo 2 štiepenej Nôti, čím vznikol vektor číslo 1, pomenovaný pMVl (obrázok 17), vhodný pre jednoklíčne rastliny.
Transformácia tabaku
Plazmidy na transformáciu dvojklíčnych rastlín sa vniesli do kmeňa LBA4404 Agrobacterium tumefaciens metódou mrznutia/topenia, ktorú publikovali Holsters et al.(1978). Rastliny tabaku Nicotiana tabaccum cv. Samsun sa transformovali metódou listových terčíkov, ktorú opísali Bevan et al. (1984). Výhonky sa regenerovali na médiu obsahujúcom 100 mg/1 kanamycínu. Po zakorenení a selekcii sa rastliny preniesli do skleníka a ďalej pestovali pri svetelnom režime 16 hodín svetlo/8 hodín tma. Transformanty pPG6 sa označili ako línie 35S-PAT.
Transformácia kukurice
Transformácia kukurice sa uskutočnila metódou ostreľovania mikročasticami, ktorú opísali Klein et al. (1988). Selekcia transformovaného materiálu prebiehala na 1 mg/1 bialofosu.
Analýzy rastlín
Polymerázová reťazová reakcia (PCR)
Táto analýza sa uskutočnila na všetkých líniách tabaku, ktoré zakoreňovali v pletivovej kultúre a tiež na všetkých kalusoch kukurice. DNA sa na tento účel extrahovala odborníkovi známym spôsobom. Primárne transformanty sa analyzovali pomocou nasledujúcich oligonukleotidov:
pDVl TMV1 + GOX1 GOX3 + nosí
pDV2 TMV1 + EPSPS1 EPSPS1 + nosí
pDV3 EPSPS3 + GOX3
pPG6 35S + BARJAP2R
pMVl GOX4 + GOX5 EPSPS + EPSPS5 35S + BARJAP2R
Sekvencie týchto oligonukleotidov sú nasledujúce:
TMV1 5'-CTCGAGTATTTTTACAACAATTACCAAC (SEQ ID NO: 21)
GOX1 5'-ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA (SEQ ID NO: 22)
G0X3 5'-ACCACCAACGGTGTTCTTGCTGTTGA (SEQ ID NO: 23)
nosí 5'-GCATTACATGTTAATTATTACATGCTT (SEQ ID NO: 24)
EPSPS1 5'-GATATACGAGTTTCACCGCTAGCGAGAC (SEQ ID NO: 25)
EPSPS3 5'-TACCTTGCGTGGACCAAAGACTCC (SEQ ID NO: 26)
EPSPS4 5'-ATGGCTTCCGCTCAAGTGAAGTCC (SEQ ID NO: 27)
EPSPS5 5'-CGAGACCCATAACGAGGAAGCTCA (SEQ ID NO: 28)
G0X4 5'-ATTGCGTGATTTCGATCCTAACTT (SEQ ID NO: 29)
G0X5 5'-GAGAGATGTCGATAGAGGTCTTCT (SEQ ID NO: 30)
35S 5'-GGTGGAGCACGACACACTTGTCTA (SEQ ID NO: 31)
BARJAP2R 5'-GTCTCAATGTAATGGTTA (SEQ ID NO: 32)
Rastliny pozitívne v PCR sa vybrali na ďalšie analýzy.
Selekcia na glyfozáte
Pre tabak v pletivovej kultúre na médiu obsahujúcom glyfozát bola skonštruovaná krivka úhynu. To bolo uskutočnené tak, že stonkový segment dlhý asi 6 mm nesúci jednu listovú uzlinu bol vložený do média MS, ktoré obsahovalo rôzne koncentrácie glyfozátizopropylamínu. Pre každú koncentráciu bolo' použitých asi 4 až 5 segmentov. Po dvoch týždňoch boli vyhodnotené výsledky, ktoré sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2
Krivka úhynu tabaku divého typu na glyfozáte
Koncentrácia izopropylamínglyfozátu (mM) Rast explantátov
0 Dobrý rast stonky, 4-5 nových listov, korene - 5 cm
0,005 Žiadny orgán nerástol
0,011 W
0,0275
0,055 w
0,1 w
Primárne transformanty pDVl, 2 a 3 boli selektované rastom na médiu obsahujúcom 0,01 a 0,05 mM glyfozátizopropylamínovej soli. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 3.
Tabuľka 3
Selekcia línii tolerantných na glyfozát v pletivovej kultúre
' pDVl pDV2 pDV3
Testované s herbicídom 50 25 50
Tolerantné línie 25 18 20
Selekcia na PAT
Regenerované kalusy sa testovali tak, že sa pestovali na 1 mg/1 bialofosu.
Westernová analýza
Nadmerná expresia proteínov GOX a EPSPS a príprava protilátok sa uskutočnila odborníkovi známymi metódami. Primárne transfomanty tabaku sa testovali nasledovným spôsobom: približne 100 mg PVPP sa dalo na dno mikroskúmavky Eppendorf. Listové pletivo (4 listové terčíky vyrezané viečkom skúmavky) sa vložilo do 0,5 ml extrakčného pufra (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 1 mM sodná soľ EDTA, 3 mM DTT) a pridali sa 2 μΐ 100 mM PMSF. Vzorky sa rozdrvili v chladnej miestnosti pomocou elektrického drviča. Drvenie prebiehalo 10 sekúnd, potom bol nerozdrvený materiál stlačený späť do skúmavky a drvenie mohlo pokračovať ďalších 10 až 15 sekúnd, pokiaľ materiál nebol úplne homogénny. Skúmavky sa potom centrifúgovali 15 minút v chladnej miestnosti, supernatanty sa preniesli do čistých skúmaviek a až do použitia uchovávali zmrazené pri -70°C. Koncentrácia proteínov sa stanovila Bradfordovou metódou. 25 gg proteínu sa rozdelilo na SDS-PAGE elektroforéze a prenieslo blotovacou metódou cez noc pri 40 mA na membránu Hybond-N. Filter bol vybratý z blotovacieho zariadenia a vložený do 100 ml roztoku lx Trissol, 5% Marvel (sušené mlieko) a inkuboval sa za súčasného trepania pri izbovej teplote 45 minút. Potom sa filter opláchol trepaním pri izbovej teplote v lx Tris-soľ, 0,1% Tween 20, prvé premývanie 5 minút a druhé premývanie 20 minút. Membrána sa potom inkubovala 2 hodiny pri izbovej teplote alebo cez noc pri teplote 4°C s primárnou protilátkou. Potom sa membrána premývala pri izbovej teplote v lx T/S, 1% Tween 10 minút až 1 hodinu. Druhá protilátka (konjugát anti-králičieho IgG a peroxidázy) sa použila v riedení 1:10000 a inkubovala sa s membránou 1 hodinu pri izbovej teplote. Premývanie bolo rovnaké ako predchádzajúce. Detekcia sa uskutočnila pomocou detekčnej súpravy ECL Amersham. Výsledky westernovej analýzy ukázali celé rozmedzie úrovne expresie u línií pDVl a pDV2. Úroveň expresie GOX a EPSPS u línie pDV3 javila len malú variabilitu v prípade expresie GOX, ale zvýšenú variabilitu v množstve EPSPS. Pre ďalšie analýzy boli vybraté línie exprimujúce oba gény.
Kalusy kukurice sa analyzovali rovnakými spôsobom, kalusy exprimujúce GOX a EPSPS sa regenerovali na celé rastliny a listové pletivo sa potom testovalo na expresiu oboch génov.
í
Test aktivity fosfinotricínacetyltransferázy
Aktivita PAT sa merala pomocou rádioaktívne (14C) značeného' acetylkoenzýmu A (AcetylCoA) . V listových extraktoch je pri tejto metóde vďaka aktivite PAT značená acetylová skupina prenesená na substrát fosfinotricín (PPT). Acetylovaný PPT a 14C migrujú odlišne na doštičke TLC a dajú sa vizualizovať autorádiograficky. Pripravil sa listový extrakčný puf or nasledovného zloženia: lOx T50Eio pufor (TE), t. j. 50 ml IM TrisHC1, pH 7,5, 4 ml 0,5M EDTA a 46 ml vody. Leupeptín sa rozpustil v 1 x TE v koncentrácii 15 mg/ml. Zásobný roztok PMSF s koncentráciou 30 mg/ml sa pripravil v metanole. Zásobný roztok BSA bol 30 mg/ml v TE a použitý DTT bol 1 M. PPT sa použil ako 1 mM roztok v TE. Aktivita značeného AcetylCoA bola 58,1 Ci/mmol (Amersham). Extrakčný pufor sa pripravil zmiešaním 4315 μΐ dvakrát destilovanej vody, 500 μΐ ΙΟχ TE, 50 μΐ zásobného roztoku leupeptínu, 25 μΐ zásobného roztoku PMSF, 100 μΐ zásobného roztoku BSA a 10 μΐ zásobného roztoku DTT (celkový objem 5000 μΐ). Listové vzorky odobraté pomocou viečka skúmavky sa preniesli do mikroskúmavky Eppendorf. Vzorky (3 listové terčíky) sa rozdrvili v 100 μΐ extrakčného pufru pomocou elektrického drviča v chladnej miestnosti. Vzorky sa potom 10 minút centrifugovali a 50 μΐ sa odobralo do čistej skúmavky na ľade. Až do ďalšieho použitia sa vzorky skladovali pri -70°C. Na kvantifikáciu proteínov vo vzorkách sa použila Bradfordova metóda. Substrátový roztok sa pripravil zmiešaním 5 objemov značeného AcetylCoA s 3 objemami 1 mM roztoku PPT. K vzorke obsahujúcej približne 25 μg celkového listového proteínu (približne 2 μς/μΐ) sa pridali 2 μΐ substrátového roztoku a zmes sa inkubovala 30 minút pri 37 ’C, potom sa premiestnila na ľad a tým sa zastavila reakcia. Vzorky s veľkosťou 6 μΐ sa potom naniesli na silikagélovú doštičku pre TLC (Sigma T-6770). Vertikálna chromatografia sa uskutočnila v zmesi 3:2 izopropanolu a 25¾ amoniaku 3 hodiny. Doštičky sa potom zabalili do plastovej fólie a exponovali cez noc na film Kodak XAR-5. Pri všetkých 26 primárnych transformantoch sa hodnotila aktivita PAT touto analytickou metódou. Nasledujúca tabulka 4 uvádza podrobne výsledky tejto analýzy.
Tabulka 4
Prehľadné údaje o aktivite PAT
Aktivita PAT Línie pPG6
Vysoká 1,9,11,12,14,21,22,24,25,27,28,30,32
Stredná 5,7,10,15,19,20
Nízka 6,2,8
Test potieraním listov herbicídom
Primárne transformanty 35S-PAT s celým rozsahom aktivity PAT spoločne s kontrolnými rastlinami sa testovali tak, že jednotlivé listy sa potreli látkou Challenge. Obe strany označených listov sa potreli 1% alebo 0,2% roztokom zásobného roztoku (150 g/1) . Po 48 hodinách a po 1 týždni sa listy hodnotili a odobrali sa vzorky na testoxranie aktivity PAT. Výsledky potierania listov herbicídom ukazuje tabulka 5.
Tabulka 5
Výsledky potierania listov herbicídom
Expresia Rastlinná línia 0,2% 0,2% 1% 1%
48 hodín 1 týždeň .48 hodín 1 týždeň
Vysoká 24,1,14 bez poškodenia bez poškodenia bez poškodenia bez poškodenia
Nízka 6,10 bez poškodenia odumretý odumretý odumretý
Divý typ odumretý odumretý odumretý odumretý
Test postrekom herbicídu
Glufozinát (Challenge alebo Bašta)
Pre rastliny tabaku divého typu sa pripravila krivka závislosti odpovede od dávky Challenge. Na každú aplikáciu sa použilo 5 rastlín a hodnotenie sa uskutočnilo po 14 dňoch. Potom, čo bola k dispozícii táto krivka, uskutočnil sa test postrekom Challenge s vybratými líniami 35SPAT použitím rovnakých dávok. Tabulka 6 ukazuje tieto údaje pre dve línie číslo 12 a 27. Transgénne rastliny neprejavovali pri týchto dávkach žiadne poškodenie.
Tabuľka 6
Výsledky testu postrekom na primárne transformanty 35S
dávka Bašta divý typ 35SPAT číslo 12 35SPAT číslo 27
% poškodenia % poškodenia % poškodenia
200 g/ha 30 0 0
400 g/ha 40 0 0
600 g/ha 40 0 0
900 g/ha 80 0 0
Krivka úhynu sa pripravila pre účinok glyfozátu na tabak divého typu. Rastliny tabaku divého typu pestované v pletivovej kultúre sa subkultivovali odobratím segmentov stonky a prenesením do čerstvého média, čím sa získalo 20 nových rastlín. Tie sa pestovali jeden mesiac v pletivovej kultúre a potom sa preniesli do kvetináčov (7,6 cm) s kompostom John Innes číslo 3. Spočiatku sa pre ochranu prikryli vlnou. Po odkrytí sa nechali 4 dni aklimatizovať predtým, ako sa aplikoval postrek. Po postreku sa zalievanie uskutočňovalo len do podložných misiek, t.j. žiadna voda sa nedotkla listu 5 dní. Hodnotenie prebehlo 8 dni a 28 dní po aplikácii. Tabuľka 7 znázorňuje priemerné percento poškodenia (každé ošetrenie bolo v troch opakovaniach) v celom rozsahu použitých koncentrácií.
Potom, čo sa skonštruovala krivka úhynu pre glyfozát, množstvo línií pDVl, 2 a 3 sa podrobilo tiež postrekovému testu s príslušnými dávkami glyfozátu. Tabuľka 8 znázorňuje výsledky pre pDV3, pričom výsledky pre pDVl a pDV2 boli veľmi podobné týmto uvedeným pre pDV3.
Tabulka 7
Závislosť odpovede od dávky pre glyfozát aplikovaný na tabak divého typu
Aplikácia č. Zlúčenina Dávka g/ha Adjuvans Tabak divého typu
1 Roundup Ultra (USA) 100 Frigate 73
2 480 g/1 izopropylamín- 200 (K30512) 90
3 glyfozátu 400 99
4 (a.e. 360 g/1) 800 100
5 LDJW010017 1200 100
6 1600 100
Tabulka 8
Odpoveď na dávku pri primárnych transformantoch pDV3 ošetrených glyfozátom
1 2 3 4 5 6 7
Dávka g/ha 12,33 37 100 300 1000 3000 9000
Divý typ 2 3 20 80 93 — -
pDV3 č.11 - - 0 0 ' 25 70 80
č. 14 - - 7 22 13 33 76
č. 19 - - 0 0 0 35 80
č.21 - - 0 5 0 24 78
č.31 - - 12 0 4 26 78
č.34 - - 0 0 6 30 63
č. 36 - - 0 0 0 0 0
č.37 - - 0 0 9 24 72
č. 43 - - 0 0 0 6 73
č. 44 - - 0 40 45 78 85
č. 45 - - 0 0 3 9 70
č.47 - - 5 0 0 11 72
č. 60 - - 0 0 0 19 63
č. 64 - - 0 5 0 12 63
Segregačná analýza
Semená z každého z primárnych transformantov (pPG6, pDVl, pDV2 a pDV3) sa sterilizovali v 10% Domestose 10 minút. Po niekoľkonásobnom opláchnutí destilovanou vodou bolo 100 semien pre každý samoopelený transformant vysiatych na médium 0,5x MS (2,3 g/1 MS soli, 1,5% sacharóza, 0,8% baktoagar, pH 5,9) obsahujúce 100 mg/1 kanamycínu. Semenáčiky sa hodnotili po troch týždňoch rastu pri 26°C a svetelnom režime 16 hodín svetlo/8 hodín tma. Línie segregujúce v pomere 3:1 niesli pravdepodobne vložený jeden transgén. V prípade línií pPG6 línie číslo 12, 20 a 27 segregovali v požadovanom pomere. Línie pDV3 číslo 14, 19,
21, 31, 34 43 a 45 segregovali v požadovanom pomere.
Príprava homozygotných línií
Zo segregačných testov sa 10 semenáčikov, ktoré nevybledli (heterozygotných alebo homozygotných) preniesli na čerstvé médium v nádobkách a pestovaných ďalšie dva až tri týždne. Po tomto čase sa preniesli do kompostu JI číslo 3 v 31 nádobách a pestované až do kvitnutia. Semená sa potom znovu testovali na médiu 0,5x MS obsahujúcom kanamycín na identifikáciu' homozygotných línií.
Kríženie línií tabaku
Homozygotné línie obsahujúce pDVl, pDV2 a pDV3, t.j. explantáty exprimujúce gény GOX, EPSPS a GOX/EPSPS sa použili na opelenie homozygotnéj línie pPG6 číslo 27 exprimujúcej gén PAT. Línia pPG6 sa použila tiež ako samčia línia.
Analýza transgénnych línií kukurice
Regenerované kalusy sa testovali pomocou PCR s opísanými oligonukleotidmi, t.j. 35S-AlcR, AlcA-GOXl a vnútornými oligonukleotidmi pre GOX a EPSPS. Na kalusoch pozitívnych v PCR sa uskutočnila tiež westernová analýza, aby bolo možné selektovať kalusy exprimujúce GOX a EPSPS. Tieto kalusy sa potom regenerovali a výsledné rastliny sa znovu testovali pomocou PCR. Rastliny sa potom spätne krížili a tiež samoopelili.
Analýza potomstva pri tabaku
Expresia GOX, EPSPS a PAT
Všetko potomstvo bolo homozygotné pre obidva gény. Semená z každého kríženia a od každého rodičovského homozygota sa vysiali a listové pletivo sa potom odobralo a podrobilo analýzam. Proteínové extrakty sa analyzovali westerovým prenosom a aktivita PAT bola meraná ako sa už opísalo. Zistilo sa, že hladiny expresie GOX a EPSPS a aktivita PAT si boli navzájom velmi podobné v rámci konkrétneho kríženia a tiež sa podobali hodnotám homozygotného rodiča. Rastliny sa potom hodnotili z hľadiska vzhľadu, výšky, životaschopnosti, rastu atď..
Aplikácia herbicídov
Pripravili sa tri rozsiahle experimenty:
1. 35S-PAT, pDVl, pDVl-PAT
2. 35S-PAT, pDV2, pDV2-PAT
3. 35S-PAT, pDV3, pDV3-PAT
Na línie 35S-PAT sa aplikoval rozsah koncentrácií glufozinátu a
stanovila sa dávka, kedy bol identifikovaný konkrétny stupeň poškodenia, v rôznych okamihoch. Línie DV sa ošetrili glyfozátom v rozsahu koncentrácií a identifikovala sa miera poškodenia. Línie DV-PAT sa potom ošetrili zmesou obidvoch herbicídov s rôznym pomerom a vyhodnotila sa miera poškodenia. Každá z populácií sa ošetrila v štádiu 5 až 6 listov (5 opakovaní pre každé ošetrenie).
Rezistencia na napadnutie patogénom
Línie 35S-PAT, DV1, 2 a 3 a DV-PAT exprimujúce vysoké hladiny každého proteínu a prejavujúce dobrú toleranciu na herbicíd sa vystavili radu hubových patogénov a potom sa vyhodnotila a porovnala miera infekcie.
Analýza potomstva kukurice
Semená z krížení primárnych transformantov sa použili na získanie rastlín, z ktorých sa vybrali línie s najlepšou expresiou. To sa uskutočnilo pomocou westernovej analýzy hladín expresie GOX a EPSPS a meraním aktivity PAT, ako sa už opísalo. Tiež sa urobili obdobné pokusy na stanovenie tolerancie na herbicíd glyfozát a glufozinát, či už aplikovaným jednotlivo alebo v rôznych zmesiach.
Príklad 9
Príprava rastlín tolerantných na pre-emergentné herbicídy spôsobujúce blednutie, t. j. fluorochloridón, norfluorazón, fluridon, flurtamon a didiflufenicán a na glyfozát.
Inhibítory desaturázy fytoénu (PDS), t.j. fluorochloridón a norfluorazón, predstavujú skupinu herbicídov, ktoré blokujú syntézu karotenoidov a vytvárajú preto symptómy blednutia. Gén PDFS (crtl) sa klonoval z Erwinia uredovora, nezelenej patogénnej baktérie spôsobujúcej nekrózy a exprimovaný v transgénnom tabaku (a rajčiaku) pomocou plazmidu obsahujúceho promótor CaMV 35S a chloroplastový tranzitný peptid (pYPIET4) (Misawwa et al., 1993). Homozygotné semená z línie tabaku ET4208, ktorá nadmerne exprimuje gén crtl sa získali rovnako ako rastliny rajčiaka obsahujúce ten istý konštrukt.
Testy rezistencie na herbicíd
Testovali sa zlúčeniny podlá vzorcov I, II a III (uvedené ďalej). Semená transgénnych rastlín a kontrolných rajčiakov (cv. Ailsa Craig) sa vysiali do nádob (7,6 cm) s JIP3, vždy tri semená v nádobe. Každá zlúčenina sa formulovala v 4% JF5969 (okrem zlúčeniny I, čo je komerčný prostriedok) a postrek v dávke 200 1/ha sa aplikoval postrekovačom. Test bol vyhodnotený v 13., 20. a 27. dni po ošetrení (DAT) . Existuje tu jasná závislosť od dávky pri všetkých ošetreniach na rajčiaku divého typu, kedy najvyššie dávky prejavili 87 až 100% fytotoxicitu. Transgénne rajčiaky sú vysoko tolerantné na všetky testované inhibítory PDS, prinajmenšom až do 1 kg/ha pri zlúčeninách II a III a až do 9 kg/ha pri zlúčenine I (pozri tabuľku 9) . Obdobné výsledky sa získali pre transgénny tabak.
Peľ z línie DV3 číslo 43B (línia rezistentná na glyfozát obsahujúca gény EPSPS a GOX, pozri príklad 4) bol zvyčajným spôsobom prenesený na homozygotnú líniu ET4-208 a naopak. Semená sa zobrali a použili sa v testoch s herbicídmi podobne ako už bolo opísané. Semená tabaku sa vysiali do riadkov v malých jednotkách deň pred ošetrením. Každá zlúčenina sa formulovala v 4% JF5969 (okrem prostriedku Racer, ktorý je komerčne dostupný) a postrek v dávke 200 1/ha bol na jednotky aplikovaný riadkovým postrekovačom. Test bol vyhodnocovaný v 13., 20. a 27. dni pó ošetrení (DAT). Semenáčiky, ktoré boli tolerantné na herbicídy spôsobujúce blednutie, boli po poslednom hodnotení prenesené do nových nádob (7,6 cm) s kompostom John Innes 111. Po dvoch týždňoch sa aplikoval glyfozátový herbicíd v dávkach 500 a 800 g/ha. Hodnotenie účinku prebehlo 14 a 28 dní po aplikácii (DAT). Výsledné rastliny boli rezistentné na obidve triedy herbicídov a rezistencia sa dedila Mendelovým spôsobom.
Tabuľka 9
Fytotoxicita 27. deň po ošetrení (27 DAT)
Rajčiak
Látka Dávka (g/ha) Divý typ Transgénny
Zlúčenina II 37 3,3
111 13,3 3,3
333 20 0
1000 100 3,3
3000 0
Zlúčenina III 37 0
111 8,3 0
333 56,7 0
100 100 10
3000 3,3
Zlúčenina I 333 0 0
1000 23,3 0
3000 100 0
9000 100 0
Zlúčenina podľa vzorca I: f
F 1 (I)
X 'X W
F
a
(II)
Zlúčenina podlá vzorca II:
Zlúčenina podlá vzorca III:
(III)
Príklad 10
Príprava rastlín tolerantných na triketón, acetanilid a lyfozát
Pel z pDV6 číslo 71G a pDV3 číslo 19J sa preniesol na homozygotnú líniu tolerantnú na triketón a naopak. Semená z týchto krížení sa odobrali a použili v pokusoch s herbicídmi. Semená tabaku získané z krížení DV6/HPPD sa vysiali do riadkov v malých jednotkách deň pred ošetrením. Niektoré jednotky sa potom ošetrili acetochlórom (75g/ha), iné alachlórom (300 g/ha) a ďalšie ZA1296 (100 a 300 g/ha). Hodnotenie účinku prebiehalo 21. deň po aplikácii herbicídu (21 DAT). Výsledky hodnotenia sú uvedené v nasledujúcej tabuľke, kde je uvedený fytotoxický účinok 21. deň.
Divý typ Divý typ DV6/HPPD DV6/HPPD
Látka Dávka (g/ha) opakovanie a opakovanie b opakovanie c opakovanie d
Acetochlór 75 40 100 0 0
Alachlór 300 80 90 0 0
ZA1296 100 90 95 10 0
300 100 100 0 0
Semenáčiky, ktoré prežili ošetrenie ZA1296 v dávke 300 g/ha sa ošetrili postrekom glyfozátu v dávke . 800 g/ha a prejavili toleranciu aj na túto aplikáciu.
ZOZNAM SEKVENCIÍ (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 1020 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Synechocystis sp. PCC6803 (i) ZNAKY:
(I) MENO/OZNAČENIE: CDS (j) POZÍCIA: 1..1020 (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 1:
GAA Glu TTC Phe GAC Asp TAT Tyr 5 CTT Leu CAT His TTA Leu TAC Tyr GTT Val 10 GAC Asp GAT Asp TAT Tyr CAG Gin TCA Ser 15 GCT Ala 48
CGT Arg TGT Cys TAT Tyr 20 CAA Gin CGT Arg CAA Gin TGG Trp Gua Gly 25 TTC Phe ACT Thr TGC Cys GTA Val AAT Asn 30 AAA Lys ΆΤΤ íle 96
288
55 60
ccc CCC GGC GTA GGT GAA GTC GCT TGG CAG GTG GCC
Pro Pro Gly Val Gly Glu Val Ala Trp Gin Val Ala
70 75 80
ATT CAG CAT CAA TTA TCA GAA TTA CAG ATA GAA ACC
íle Gin His Gin Leu Ser Glu Leu Gin íle Glu Thr
85 90 95
ACA CCA GTT ATT CAT CCT CTG ACT AAA GCA GAA GGA TTA ACT • to 1 TTG
Pro Val Zle His ®=o Leu Thr Lys Ala Glu Gly Leu Thr Phe Leu
100 105 110
CTC Λ·/·*L GGrt GAT GTG CAC CAT AGC to Λ- L TAT CCT. GTT CtoJ 1 TCT GAG CTA
Leu Trp Glv Asp Val His His Ser íle Tyr Pro Val Arg Ser Glu Leu
11 = 120 125
AAT CAG AAT AAA AGA TTG CAT GGT GTT GGT TTA ACG ACC ATC GAC CAT
Asn Gin 130 Asn Lys Thr Leu His Gly Val 135 Gly Leu Thr 140 Thr 7 2, ô Asp His
GTG GTG CTA AAC ATT GCC GCC GAT CÄA TTT ACC CAG GCT TCC CAA TGG 480
Val Val Leu Asn Zle Ala Ala Asp Gin Phe Thr Gin Ala Ser Gin T=
145 150 155 ieô
TAT CAA CAG GTG TTT GGk. TGG TCG GTG CAG CAG AGT TTT ACT GTC AAT =28
Tyr Gin Gin Val Phe Gly Trp Ser Val Gin Gin Ser Phe Thr Val Asn
1S5 170 175
ACG CCC /“•to m Ô.A1 TCT GGT CTG TAT AGC GAA GCC CTG GCC AGT. GCC AAT GGG =76
Thr Pro His Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Ala Leu Ala Ser Ala Asn Gly
180 185 190
AAA GTC CAA TTT AAC CTC AAT TGT CCC ACC AAT AAC AGT TCC CAA ATT 624
Lys Val Gin Phe Asn Leu Asn Cys Pro Thr Asn Asn Ser Ser Gin Zle
195 200 205
CAA ACT m ,7« m TTA GCC AAT AAC CAT Gu<j GGT ATT CAA CAT GTC GCT 67 2
Gin Thr Phe Leu Ala Asn Asn His Gly Ala Gly Zle Gin His Val Ala
210 215 220
Phe 225 TCC ACT ACG AGT ATT ACG CGA ACT GTG GCT CAT CTG CGG Arg GAA AGG Glu Arg 240 720 í
Ser Thr Thr Ser íle 230 Thr Arg Thr Val Ala 235 His Leu
GGC GTA AAT 'J’TT' TTA AAA ATC CCC ACT GGC TAT TAT CAA CAG CAA AGA 768
Gly Val Asn Phe Leu Lys íle Pro Thr Gly Tyr Tyr Gin Gin Gin Arg
245 250 255
AAC AGT AGC TAT TTT AAT TAT GCA AGT TTG GAT m/*»* luy GAT ACC TTA CAG 816
Asn Ser Ser Tyr Phe Asn Tyr Ala Ser Leu Asp Trp Asp Thr Leu Gin
260 265 270
TGC CTA GAA ATT TTG CTG GAT GAT CAA GAT AAT ACG GGG GAG CGA TTA 864
Cys Leu Glu íle Leu Leu Asp Asp Gin Asp Asn Thr Gly Glu Arg Leu
275 280 285
CTG CTA CAA ATT TTT AGT CAG CCT TGC TAT GGA GTA GGC ACT CTA TTT 912
Leu Leu Gin íle Phe Ser Gin Pro Cys Tyr Gly Val Gly Thr Leu Phe
290 295 300
TGG GAA ATT ATT GAA CGC CGC CAC CGG GCA AAA GGA TTT GGT CAA GGA 960
Trp Glu íle íle Glu Arg Arg His Arg Ala Lys Gly. Phe Gly Gin Gly
305 310 315 320
AAC TTT CAA GCT CTC TAT GAA GCG GTG GAG ACT TTA GAA AAA CAG TTA 1008
Asn Phe Gin Ala Leu Tyr Glu Ala Val Glu Thr Leu Glu Lys Gin Leu
325 330 335
GAA GTG CCA ΤΆΑ Glu Val Pro
1020 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 339 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín
(iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO : 2:
Met Glu Phe Asp Tvr Leu His Leu Tvr ’ Val Asn Asp Tyr Gin Ser Ala
1_ ' 5 10 15
His : Cys Tvr Gin Arg Gin Trp Glv Phe Thr Cys Val Asn Lys íle
20 25 30
íle Thr Ä5D Gin Gly íle Thr Gly íle Tyr Gin Gin Glv Gin íle Leu
35 40 45
Leu Leu íle Ser Ala Ser Glu Ser Ser Leu Ser Ara Tvr Ala Asp Tyx
50 55 SÓ
Leu Gin Lys His Pro Pro Gly Val Gly Glu Val Ala Trp Gin Val Ala
65 70 75 80
Asn Trp > Gin Lys ; íle Gin His Gin > Leu Ser Glu Leu Gin íle Glu Thr
90 95
Thr Pro Val íle H ,is Pro Leu ‘ Thr Lys Ala i Glu i Gly Leu ' Thr : Phe Leu
100 105 110
Leu Trp Gly Asp Val His His Ser íle Tyr Pro Val Arg Ser Glu Leu
115 120 125
Asn Gin Asn Lys ' Thr Leu His Gly Val Gly Leu Thr Thr íle Asp His
130 135 140
Val Val Leu Asn íle Ala Ala Asp Gin Phe Thr Gin Ala Ser Gin Trp
145 150 155 160
Tyr Gin Gin . Val Phe Gly Trp Ser Val Gin Gin Ser Phe Thr Val Asn
165 170 175
Thr Pro His Ser Gly Leu Tyr Ser Glu Ala Leu Ala Ser Ala Asn Gly
180 185 190
Lys Val Gin Phe Asn . Leu Asn Cys Pro Thi Asn . Asn Ser Ser Gin íle
19 5 200 205
Gin Th r Ph e Leu ; Ala Asn Asn His Gly Ala Gly íle Gin His ! Val . Ala
210 215 220
Phe Ser Thr Thr Ser íle Thr Arg Thr Val Ala His Leu Aru Glu Ara
225 230 235 *
Gly Val Asn Phe Leu Lys íle Pro Thr Gly Tyr Tyr Gin Gin Gin Arg
245 250 255
Asn Ser Ser Tyr 260 Phe Asn Tyr Ala Ser 265 Leu Asp Trp Asp Thr 270 Leu Gin
Cys Leu Glu 275 íle Leu Leu Asp Asp 280 Gin Asp Asn Thr Gly 285 Glu Arg Leu
Leu Leu 290 Gin íle Phe Ser Gin 295 Pro Cys Tyr Gly Val 300 Gly Thr Leu Phe
Trp 305 Glu íle íle Glu Arg 310 Arg His Arg Ala Lys 315 Gly Phe Gly Gin Gly 320
Asn Phe Gin Ala Leu 325 Tyr Glu Ala Val Glu 330 Thr Leu Glu Lys Gin 335 Leu
Glu Val Pro (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 2582 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: Pseudomonas fluorenscens (i) ZNAKY:
(I) MENO/OZNAČENIE: CDS (J) POZÍCIA: 1217..2290 (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 3:
ATTAGTCGAA GAATATGCCC ATCCTGTCGC CTGTCGAGCA ACTGCTAATG CAACCTCCGT
CTGATCGCCT CACCTACCTG AAGCTGGCCG CTGTGACCAT GATTTGGGGT GGCACTTTTG
TCGCCGGACG TTACCTGACC AATCAAGTCG ACCCGCTGCT GGCCGCCAGC CTGCGGTTTA
TCCTGGCCAG CCTGGCGCTG CTGCTGTTTA TGCTGTGTGC ACGCATCCCG CTGGCGCGGC
CACGTCCCCG GCAACTGCTG CATCTGGCGG TGCTGGGGTT TTTCGGGATC TTTTTCTACA
ACCTGTGTTT TTTCTACGGC CTGCAGTACA TCAACGCCTC GCGCGCTTCG TTGATCGTGG
CGTTGAATCC GGCGGTGATC GGCCTGGCTT CCTGGTGGTT GTTCAAAGAG CGCCTCGGCA
CTGCCAGGGT GCTGGGTATC GCGTTGTGCC TGGCCGGCGC TGCGACGGTG ATCGTCAGTC
120
180
240
300
360
420
480
GCAACCCGCA GTTGCTGCAA GGTGCATCGA GTACCTGGCA GGGCGACCTG CTGGTGTTCG 540
GCTGTGTGCT GGGGTGGGGG ATTTACTCGT TGTTTTCCCG CGCATTGAAT CAAAGCCTGG-' 600
GGCCGTTGCA AACGGTCACC TGGTCAGTGC TGCTGGGCAC CCTGATGCTG ACGGCTGTCA 660
CCGCGCTCGC’ CGGGCGCTTC ACGCTTGCAG GGCTTGGCAG CCTGCACCTG CCGCAGGTTG 720
TGAGCCTGTT GTATTTGGGC GTGCTCGGCT CCGCGCTGGC GTACATCGGC TATTACGATG 730
GCATCCGGCG TATCGGCGCG ACCCGCGCAG GCGTGTTTAT CGCGCTGAAC CCGCTGACGG 840
CGGTGATCTG CGGCGCGCTG CTGCTTGGCG AACAGCTAAC GTTACCCATG GCGCTCGGCG 900
GCGCGGTGAT CCTGTTGGGC ATCTATCTGT GCAACAAACC CCTTGCGCAG CCCAGCGCAA 960
TAGGGATTTG ATGAGAGTGC' GGACAAATAC TGTTACGCTG TGTAGAATCG ATTTACGCAT 1020
ACAAGAATAT GGACTTGCGC TCACGCAAGC CTCGGCCGTC AGAGACTGAT GTAATCATGA 1080
AGCTACTCGG CTCCCCCCTG ATCTTTGGTG ACTTCCTCGC GCGCAGCGTG CGGGGTCTCT 1140
CGTGCGCGCC ACCCTGCAAC CTCATCCTTG CCTGTAATTG ACTGCTTGCT ACTTACAAGA 1200
ATGATGAGGT GCCGAA ATG Met 1 GCC GAC CAA TAC GAA AAC CCA ATG Ala Asp Gin Tyr Glu Asn Pro Met 5 GGC CTG Gly Leu 10 1249
ATG Met GGC TTT GAA TTT ATT GAA TTC Phe GCA TCG CCG ACT CCG GGC ACC CTG . Pro Gly Thr Leu 25 1297
Gly Phe Glu 15 Phe íle Glu Ala 20 Ser Pro Thr
GAG CCG ATC TTC GAG ATC ATG GGC TTC ACC AAA GTC GCG ACC CAC CGC 1345
Glu Pro íle Phe Glu íle Met Gly Phe Thr Lys Val Ala Thr His Arg
30 35 40
TCC AAG AAT GTG CAC CTG TAC CGC CAG GGC GAG ATC AAC CTG ATC CTC 1393
Ser Lys Asn Val His Leu Tyr Arg Gin Gly Glu íle Asn Leu íle Leu
45 50 55
AAC AAC CAG CCC GAC AGC CTG GCC TCG TAC TTC GCC GCC GAA CAC GGC 1441
Asn Asn Gin Pro Asp Ser Leu Ala Ser Tyr Phe Ala Ala Glu His Gly
60 65 70 75
CCT TCG GTG TGC GGC ATG GCG TTC CGG GTC AAA GAC TCG CAG CAG GCT 1489
Pro Ser Val Cys Gly Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gin Gin Ala
80 85 90
TAC AAC CGC GCG TTG GAA CTG GGC GCC CAG CCG ATT CAT ATC GAA ACC 1537
Tyr Asn Arg Ala Leu G1U Leu Gly Ala Gin Pro íle His íle Glu Thr
95 100 105
GGC CCG ATG GAA CTC AAC CTG CCG GCC ATC AAG GGC ATC GGC GGT GCG 1585
Gly Pro Met Glu Leu Asn Leu Pro Ala íle Lys Gly íle Gly Gly Ala
110 115 120
CCG CTG TAC CTG ATC GAC CGC TTC GGT GAA GGC AGC TCG ATA TAT GAC 1633
Pro Leu Tyr Leu íle Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser íle Tyr Asp
125 130 135
ATC GAC TTC GTG TAC CTC GAA GGT GTC GAC CGC AAC CCG GTÄ GGC GCG 1681
íle Asp Phe Val Tyr Leu Glu Gly Val Asp Arg Asn Pro Val Gly Ala
140 145 150 155
GGC CTC AAG GTC ATC ' GAC CAC i CTG . ACC CAC AAC GTG TAT CGC GGC CGC 1729
Gly Leu Lys Val íle . Asp His ' Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg
160 165 170
ATG GCC TAC TGG GCC AAC TTC TAC GAG AAA CTG TTC AAC TTC CGT GAA 1777
Met Ala Tyr Tro Ala , Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu
175 180 185
GCA CGC TAC TTC GAT ATC AAG GGC GAA TAC ACC GGC CTT ACG TCC AAC- 1825
Ala Arg Tyr Phe Asp íle Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys
190 195 200
GCC ATG AGT GCC CCG GAC GGC ATG ATC CGC ATC CCG CTG AAC GAG GAA 1873
Ala Met Ser Ala Pro Asp Gly Met íle Arg íle Pro Leu Asn Glu Glu
205 210 215
TCG TCC AAG GGC GCC GGC CAG ATC GAA GAG TTC CTG ATG CAG TTC AAC 1921
Ser Ser Lys Gly Ala Gly Gin íle Glu Glu Phe Leu Met Gin Phe Asn
220 225 230 235
GGC GAG GGC ATC CAG CAC GTG GCG TTC CTC ACC GAA GAC CTG GTC AAG 1969
Gly Glu Gly íle Gin His Val Ala Phe Leu Thr Glu Asp Leu Val Lys
240 245 250
ACC TGG GAT GCG TTG AAG AAG ATC GGC ATG CGC TTC ATG ACC GCG CCG 2017
Thr Trp Asp Ala Leu Lys Lys íle Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro
255 260 265
CCG GAC ACC TAC TAC GAA ATG CTC GAA GGC CGC CTG CCA AAC CAC GGC 2065
Pro Asp Thr Tyr Tyr Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly
270 275 280
GAG CCG GTG GAC CAA CTG CAG GCG CGC GGT ATT TTG CTG GAC GGC TCC 2113
Glu Pro Val Asp Gin Leu Gin Ala Arg Gly íle Leu Leu Asp Gly Ser
285 290 295
TCG ATC GAG GGC GAC AAG CGC CTG CTG CTG CAG ATC TTC TCG GAA ACC 2161
Ser íle Glu Gly Asp Lys Arg Leu Leu Leu Gin íle Phe Ser Glu Thr
300 305 310 315
CTG ATG GGC CCG GTG TTC TTC GAA TTC ATC CAG CGC AAA GGC GAC GAT 2209
Leu Met Gly Pro Val Phe Phe Glu Phe íle Gin Arg Lys Gly Asp Asp
320 325 330
GGG TTT GGC GAG GGC AAC : ttc : AAG GCG CTG TTC GAG TCG ATC GAG CGC 2257
Gly ’ Phe : Gly ' G1U . Gly ’ Asn i Phe i Lys Ala Leu Phe Glu Ser íle Glu Arg
335 340 345
GAC : cac ; GTA CGT ' CGC : GGT GTA CTG i ACC : ACC : GAC TAAGCGTCAG CAACAAAAAA 2310
Asp > Gin Val . Arg [ Arg 1 Gly Val . Let i Thr • Thr Asp
350 355
AGCCGGGCTT
TTTAGTGCCT
AGCCCGGCGA
GAAGGTTTTC
GCACGTTTTA
AGCTTTGCGC
2370
TGACGCACCA
AATGTTTGAA
GCCTTCATAC
ACCAGCACCA
TCACGGCCAG
CCAGATCGGG
2430
ATATACGTCA
GCCATTGCCC
GCCCTTGATG
CCTTCGCCCA
ACAACAAGGC
CACAAAGAGC
2490
AGTAATACCG
GCTCCACATA
GCTGÄGCAAC
CCGAACAGGC
TAAAGGCCAA
TAAACGGCTG
2550
GCGATGATGT
AGCTCACCAG
CGCTGAAGCA
CT
2582 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 358 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (iii) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 4:
Met Ala Asp
Gin Tyr Glu Asn
Pro Met Gly Leu Met Gly
Phe tie Glu Phe Ala Ser Pro Thr
Pro Gly Thr Leu Glu Pro 25 íle
Phe Glu íle Met
Gly
Phe Thr Lys Val
His Arg Ser Lys Asn Val
His
Leu Tyr Arg Gin íle Asn Leu íle
Leu Asn Asn Gin
Pro Asp
Ser Leu . Ala Ser Tyr Phe . Ala . Ala Glu His Gly Pro Ser Val Cys Gly
65 70 - 75 80
Met Ala Phe Arg Val Lys Asp Ser Gin Gin Ala Tyr Asn Arg Ala Leu
85 90 95
Glu Leu Gly Ala Gin Pro íle His íle Glu Thr Gly Pro Met Glu Leu
100 105 110
Asn Leu Pro Ala íle Lys Gly íle Gly Gly Ala Pro Leu Tyr Leu íle
115 120 125
Asp Arg Phe Gly Glu Gly Ser Ser íle Tyr Asp íle Asp Phe Val Tyr
130 135 140
Leu Glu Gly Val Asp Arg Asn Pro Val Gly Ala Gly Leu Lys Val íle
145 150 155 160
Asp His Leu Thr His Asn Val Tyr Arg Gly Arg Met Ala Tyr Trp Ala
165 170 175
Asn Phe Tyr Glu Lys Leu Phe Asn Phe Arg Glu Ala Arg Tyr Phe Asp
180 185 190
íle Lys Gly Glu Tyr Thr Gly Leu Thr Ser Lys Ala Met Ser Ala Pro
195 200 205
Asp Gly Met
210 íle Pro Leu Asn Glu Glu
215
Ser Ser Lys
220
Gly Gin íle Glu Glu Phe Leu Met Gin Phe Asn Gly Glu Gly íle Gin
225 230 235 240
His Val Ala Phe Leu Thr Glu Asp Leu Val Lys Thr Trp Asp Ala 255 Leu
245 250
Lys Lys íle Gly Met Arg Phe Met Thr Ala Pro Pro Asp Thr Tyr Tyr
260 265 270
Glu Met Leu Glu Gly Arg Leu Pro Asn His Gly Glu Pro Val Asp Gin
275 280 285
Leu Gin Ala Arg Gly íle Leu Leu Asp Gly Ser Ser íle Glu Gly Asp
290 295 300
Lys Arg Leu Leu Leu Gin íle Phe Ser Glu Thr Leu Met Gly Pro Val
305 310 315 320
Phe Phe Glu Phe íle Gin Arg Lys Gly Asp Asp Gly Phe Gly Glu Gly
325 330 335
Asn Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ser íle Glu Arg Asp Gin Val Arg Arg
340 345 350
Gly Val Leu Thr Thr Asp
355 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primár (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 5:
TATGAGAATC CTATGGG (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie
Civ) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 6:
GCTTTGAAGT TTCCCTC 17 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 46 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 7:
GTTAGGTACC AGTCTAGACT GACCATGGCC GACCAATACG AAAACC (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 43 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 8:
TAGCGGTACC TGATCACCCG GGTTATTAGT CGGTGGTCAG TAC 4 3 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 516 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 9:
Met 1 Ala Gin íle Asn 5 Asn Met Ala Gin Gly íle Gin Thr Leu Asn Pro
10 15
Asn Ser Asn Phe His Lys Pro Gin Val Pro Lys Ser Ser Ser Phe Leu
20 25 30
Val Phe Gly Ser Lys Lys Leu Lys Asn Ser Ala Asn Ser Met Leu Val
35 40 45
Leu Lys 50 Lys Asp Ser íle Phe 55 Met
Ser 65 Ala Ser Val Ala Thr 70 Ala Gin
Pro íle Lys Glu íle 85 Ser Gly Thr
Gin Lys Phe Cys 60 Ser Phe Arg íle
Lys Pro Ser Glu íle Val Leu Gin
75 80
Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser
90 95
Leu Ser Asn Arg 100 íle Leu Leu Leu
Val Val Asd 115 Asn Leu Leu Ser Ser 120
Ala Leu 130 Lys Thr Leu Gly Leu 135 His
Arg 145 Ala Val Val Glu Gly 150 Cys Gly
Ser Lys Glu Glu íle 165 Gin Leu Phe
Ala 105 Ala Leu Ser Glu Gly 110 Thr Thr
Asp Asp íle His Tyr 125 Met Leu Gly
Val Glu Glu Asd 140 Ser Ala. Asn Gin
Gly Leu Phe 155 Pro Val Gly Lys Glu 160
Leu Gly 170 Asn Ala Gly Thr Ala 175 Met
Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr Val Ala Gly Gly Asn Ser Arg Tyr
180 185 190
Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met Arg Glu Arg Pro íle Ser Asp Leu
195 200 205
Val Asp Gly Leu Lys Gin Leu Gly Ala Glu Val Asp Cys Phe Leu Gly
210 215 220
Thr Lys Cys Pro Pro Val Arg íle Val Ser Lys Gly Gly Leu Pro Gly
225 230 235 240
Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser íle Ser Ser Gin Tyr Leu Thr Ala
245 250 255
Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala Leu Gly Asp Val Glu íle Glu íle
260 265 270
íle Asp Lys Leu íle Ser Val Pro Tyr Val Glu Met Thr Leu Lys Leu
275 280 285
Met Glu Arg Phe Gly íle Ser Val Glu His Ser Ser Ser Trp Asp Arg
290 295 300
Phe Phe Val Arg Gly Gly Gin Lys Tyr Lys Ser Pro Gly Lys Ala Phe
305 310 315 320
Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala
325 330 335
Val Thr Gly Gly Thr íle Thr Val Glu Gly Cys Gly Thr Asn Ser Leu
340 345 350
Gin Gly Asp Val Lys
355
Phe Ala Glu Val
360
Leu Glu Lys Met Gly Ala Glu 365
Val Thr Trp Thr Glu Asn Ser Val Thr Val Lys Gly Pro Pro Arg Ser 370 375 380
Ser Ser Gly Arg Lys His Leu Arg Ala íle Asn Val Asn Met Asn Lys
385 390 395 400
Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu Ala Val Val Ala Leu Tyr Ala Asp
405 410 415
Gly Pro Thr Ala íle Arg Asp Val Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr
420 425 430
Glu Arg Met íle Ala íle Cys Thr Glu Leu Arg Lys Leu Gly Ala Thr
435 440 445
Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys íle íle Thr Pro Pro Glu Lys Leu
450 455 4 60
Asn Val Thr Asp íle Asd Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala
465 470 475 480
Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Asp Val Pro Val Thr íle Asn Asp Pro
485 490 4 95
Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro Asn Tyr Phe Asp Val Leu Gin Gin
500 505 510
Tyr Ser Lys His
515 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 10:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 17 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:
AACAAGGTGG CGCAGTT (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 11:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 11:
CATCGCAAGA CCGGCAACAG 20 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 12:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 19 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:
GATCGCTACT AGCTTCCCA 19 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 13:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 13:
AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA 22 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 14:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 14:
AATTACGGAA GCTTCCGT 18 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 15:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15:
AGCTTGTACA CCGGTGTACA 2 0 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 16:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 16:
CGGACAATTA ATTGTCCGGT AC 22 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 17:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:
CATTTGCGGC CGCAAATGGT AC 22 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 18:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 18:
AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG 22 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 19:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 19:
AGCTTGCAGC GGCCGCTGCA 20 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 20:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 20:
AATTCATTTG CGGCCGCAAA TG 22
Ίξ>
(2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 21:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 21:
CTCGAGTATT TTTACAACAA TTACCAAC 28 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 22:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 22:
AATCAAGGTA ACCTTGAATC CA 22 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 23:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 26 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 23:
ACCACCAACG GTGTTCTTGC TGTTGA 26 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 24:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 27 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 24:
GCATTACATG TTAATTATTA CATGCTT 27 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 25:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 25:
GTGATACGAG TTTCACCGCT AGCGAGAC 28 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 26:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 26:
TACCTTGCGT GGACCAAAGA CTCC 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 27:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 27:
ATGGCTTCCG CTCAAGTGAA GTCC 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 28:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 28:
CGAGACCCAT AACGAGGAAG CTCA (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 29:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 29:
ATTGCGTGAT TTCGATCCTA ACTT 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 30:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 30:
GAGAGATGTC GATAGAGGTC TTCT 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 31:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 24 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 31:
GGTGGAGCAC GACACACTTG TCTA 24 (2) INFORMÁCIA PRE SEQ ID NO: 32:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:
(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: /opis = primér (iii) HYPOTETICKÁ: nie (iv) OPAČNÁ ORIENTÁCIA: nie (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:
(A) ORGANIZMUS: primér (i) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 32:
GTCTCAATGT AATGGTTA 18

Claims (30)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Polynukleotid, ktorý obsahuje aspoň prvý úsek kódujúci prvý protein schopný poskytnúť rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú, rezistenciu alebo toleranciu na prvý herbicíd, a druhý úsek kódujúci druhý protein obdobne schopný poskytnúť rastline rezistenciu na druhý herbicíd, a to za podmienok, že (I) polynukleotid nekóduje fúzny protein obsahujúci len 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutatión-S-transferázu (GST), (II) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-S-transferázu (GST) a (III) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce GST a fosfinotricínacetyltransferázu (PAT).
  2. 2. Polynukleotid podlá nároku 1, kde expresia každého z úsekov je riadená promótorom a terminátorom, ktoré sú aktívne v rastline.
  3. 3. Polynukleotid podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde prvý herbicíd je post-emergentný herbicíd a druhý herbicíd je pre-emergentný herbicíd.
  4. 4. Polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde proteíny sú vybraté zo skupiny obsahujúcej glyfozátoxidoreduktázu, 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu, fosfionotricínacetyltransferázu, hydroxyfenylpyruvátdioxygenázu, glutatión-S-transferázu, cytochrom karboxylázu, acetolaktátsyntázu, dihydropteroátsyntázu, polyamínové
    P450, acetylkoenzým-Aprotoporfyrinogenoxidázu, transportné proteíny, superoxiddismutázu, bromoxynilnitrilázu, fytoendesaturázu, produkt génu tfdA získateľného z klcallgenes eutrophus, a známe mutované alebo inak modifikované varianty uvedených proteínov.
  5. 5. Polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorý ďalej obsahuje úsek kódujúci protein schopný poskytnúť rastline rezistenciu alebo toleranciu na hmyz, vysychanie a/alebo hubové, bakteriálne alebo vírusové infekcie.
  6. 6. Polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý obsahuje 5'-koncové sekvencie súvisle susediace s uvedenými úsekmi, ktoré sekvencie kódujú (I) peptid schopný nasmerovať translačné produkty úsekov do plastidov ako napríklad chloroplastov, mitochondrií, iných organel alebo bunkovej steny a/alebo (II) netranslatované sekvencie zosilňujúce transláciu.
  7. 7. Polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, ktorý je modifikovaný tak, že sú odstránené motívy nestability mRNA a/alebo náhodné zostrihové miesta, alebo sú použité kodóny prednostne používané rastlinami, takže expresia takto modifikovaných polynukleotidov v rastlinách vedie k produkcii podstatne podobných proteínov s podstatne podobnou aktivitou/funkciou tým proteínom, ktoré sú získané expresiou nemodifikovaných polynukleotidov v organizme, v ktorom sú úseky nemodifikovaného polynukleotidu kódujúce proteín endogénnymi, a to za predpokladu, že ak takto modifikovaný polynukleotid obsahuje kodóny prednostne používané rastlinami, stupeň identity' medzi úsekmi kódujúcimi proteín v modifikovanom polynukleotide a obdobnými úsekmi kódujúcimi proteín endogénne obsiahnutými v danej rastline a kódujúcimi v podstate identický proteín je menši ako približne 70%.
  8. 8. Polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 3 až 7, kde preemergentné herbicídy je možné vybrať zo skupiny obsahujúcej dinitroanilínové herbicídy, difenyléter, sulfonylmočovinu, fosfosulfonáty, oxyacetamidy, tetrazolinóny a Nkarbamoyltetrazolinóny, imidazolinóny, tiokarbamát, triazolopyrimidíny, uracil, fenylmočovinu, triketón, triazín, izoxazol, acetanilid, oxadiazol, triazionón, sulfonanilid, amid, anilid,
    RP201772, fluorochloridón, norflurazón a herbicídy tetrazolinónového typu, a post-emergentné herbicídy sú vybraté zo skupiny obsahujúcej glyfozát a jeho soli, glufozinát, azulam, bentazon, bialafos, . brómacyl, setoxydim a ďalšie cyklohexándióny, dikamba, fozamín, flupoxam, fenoxyprionát, quizalofop a ďalšie aryloxyfenoxypropanoáty, pikloram, fluormetrón, atrazin a ďalšie triazíny, metribuzín, chlorimurón, chlorsulfurón, flumetzulam, halosulfurón, sulfometrón, imazaquin, imazetapyr, izoxaben, imazamox, metozulam, pyritrobak, rimsulfurón, bensulfurón, nikosulfurón, fomezafén, fluoroglykofén, KIH9201, ET751, karfentrazón, ZA1296, sulkotrión, paraquat, diquat, bromoxynyl a fenoxaprop.
  9. 9. Polynukleotid podlá ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde pre-emergentný herbicíd je vybratý zo skupiny obsahujúcej acetanilidy, triketóny, inhibítory PDS, tiokarbamáty, tetrazolinóny, a post-emergentný herbicíd je vybratý zo skupiny obsahujúcej glyfozát, glufozinát, paraquat a bialafos.
  10. 10. Vektor, ktorý obsahuje polynukleotid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9.
  11. 11. Rastlina, ktorá obsahuje polynukleotid obsahujúci aspoň prvý úsek kódujúci prvý proteín schopný poskytnúť rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú, rezistenciu alebo toleranciu na prvý herbicíd, a polynukleotid obsahujúci druhý úsek kódujúci druhý proteín schopný poskytnúť obdobne rezistenciu alebo toleranciu na druhý herbicíd, a to za podmienok, že (I) polynukleotid nekóduje fúzny proteín obsahujúci len 5-enolpyruvyl-3fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutatión-S-transferázu (GST), (II) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-S-transferázu (GST), (III) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce GST a fosfinotricínacetyltransferázu (PAT), a (IV) že pokiaľ je plodinou cukrová repa, gény poskytujúce rezistenciu alebo toleranciu na herbicíd, ktoré obsahuje, nie sú len gény EPSPS a PAT.
  12. 12. Rastlina podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde prvý herbicíd je pre-emergentný herbicíd a druhý herbicíd je post-emergentný herbicíd.
  13. 13. Rastliny vrátane ich častí, semien a ich potomstva, ktoré sú rezistentné na aspoň dva herbicídy, a ktoré sa získali z materiálu, ktorý bol transformovaný polynukleotidom podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 alebo vektorom podľa nároku 10.
  14. 14. Rastliny podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov vybraté zo skupiny obsahujúcej obilniny, olejniny, technické plodiny pestované pre vlákno, ovocné- plodiny, zeleninu, plantážové plodiny a stromy.
  15. 15. Rastliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 11 až 14, ktoré sú vybraté zo skupiny, do ktorej patrí sója, bavlník, tabak, cukrová repa, repka olejná, kanola, ľan, slnečnica, zemiak, rajčina, lucerna, hlávkový šalát, kukurica, pšenica, cirok, raž, banánovník, jačmeň, ovos, trávnikové trávy, kŕmne trávy, cukrová trstina, hrach, poľná fazuľa, ryža, borovica, topoľ, jabloň, grapefruit, citrus a orech, a tiež potomstvo, semená alebo časti takýchto rastlín.
  16. 16. Spôsob selektívneho ničenia buriny na poli s burinou a plodinou, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje (I) polynukleotid obsahujúci aspoň prvý úsek kódujúci prvý proteín schopný poskytnúť rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú, rezistenciu alebo toleranciu na prvý herbicíd, a druhý úsek kódujúci druhý proteín schopný poskytnúť obdobne rezistenciu alebo toleranciu na druhý herbicíd, a to za podmienok, že (I) polynukleotid nekóduje fúzny proteín obsahujúci len 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutatión-S-transferázu (GST) , (II) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-Stransferázu (GST), (III) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce GST a fosfinotricínacetyltransferázu (PAT), a (IV) že pokiaľ je plodinou cukrová repa, gény poskytujúce rezistenciu alebo toleranciu na herbicíd, ktoré obsahuje, nie sú len gény EPSPS a PAT, alebo (II) polynukleotid obsahujúci aspoň prvý úsek kódujúci prvý proteín schopný poskytnúť rastline alebo pletivu, ktoré ho obsahujú rezistenciu alebo toleranciu na prvý herbicíd, a polynukleotid kódujúci druhý proteín schopný poskytnúť obdobne rezistenciu alebo toleranciu na druhý herbicíd, a to za podmienok, že (I) polynukleotid nekóduje fúzny proteín obsahujúci len 5-enolpyruvyl-3-fosfošikimátsyntetázu (EPSPS) a glutatión-S-transferázu (GST), (II) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce superoxiddismutázu (SOD) a glutatión-Stransferázu (GST), (III) polynukleotid neobsahuje len úseky kódujúce GST a fosfinotricinacetyltransferázu (PAT), a (IV) že pokial je plodinou cukrová repa, gény poskytujúce rezistenciu alebo toleranciu na herbicíd, ktoré obsahuje nie sú len gény EPSPS a PAT, pričom sa na pole aplikuje aspoň jeden z uvedených herbicídov v množstve postačujúcom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  17. 17. Spôsob podľa predchádzajúceho nároku 16, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje gén kódujúci EPSPS a gén kódujúci enzým GST, pričom sa na pole aplikuje glyfozát a acetanilid v množstve postačujúcom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  18. 18. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje gén kódujúci enzým HPPD a gén kódujúci enzým PAT, pričom sa na pole aplikuje triketón a glufozinát v množstve dostatočnom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  19. 19. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje gén kódujúci enzým PAT a gén kódujúci enzým GST, pričom sa na pole aplikuje glufozinát a acetanilid, tiokarbamát a/alebo tetrazolinón v množstve postačujúcom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  20. 20. Spôsob podlá nároku 16, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje gén kódujúci enzým EPSPS a/alebo enzým GOX a gén kódujúci enzým HPPD, pričom sa na pole aplikuje glyfozát a triketón v množstve dostatočnom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  21. 21. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje gén kódujúci enzým PDS a gén kódujúci enzým EPSPS a/alebo enzým GOX, pričom sa na pole aplikuje inhibitor PDS a glyfozát v množstve dostatočnom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  22. 22. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje gén kódujúci enzým EPSPS a/alebo enzým GOX a gén kódujúci enzým PAT, pričom sa na pole aplikuje glyfozát a glufozinát v množstve dostatočnom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny, a to za podmienky, že plodina nie je cukrová repa.
  23. 23. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa, tým, že plodina obsahuje gén kódujúci enzým PDS a gén kódujúci enzým PAT, pričom sa na pole aplikuje inhibitor PDS a glufozinát v množstve dostatočnom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  24. 24. Spôsob podľa nároku 16, vyznačujúci sa tým, že plodina obsahuje gén kódujúci enzým PDS a gén kódujúci enzým GST, pričom sa na pole aplikuje inhibitor PDS a acetanilidový herbicíd v množstve dostatočnom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  25. 25. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 24, vyznačujúci sa tým, že plodina ďalej obsahuje gén kódujúci ALS, SOD alebo BNX, pričom sa na pole aplikuje sulfonylmočovina, paraquat alebo bromoxynilový herbicíd v množstve dostatočnom na zničenie buriny bez podstatného ovplyvnenia plodiny.
  26. 26. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 16 až 25, vyznačujúci sa tým, že sa ďalej na pole aplikuje pesticidne účinné množstvo jedného alebo niekoľkých insekticídov, fungicídov, baktericídov, nematicidov alebo antivirusových prostriedkov.
  27. 27. Spôsob prípravy rastlín, ktoré sú podstatne tolerantné alebo podstatne rezistentné voči dvom alebo -viacerým herbicídom, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky, kedy:
    (I) rastlinný materiál sa transformuje polynukleotidom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 alebo vektorom podľa nároku 10, (II) takto transformovaný materiál sa selektuje a (III) takto selektovaný materiál sa regeneruje do celých morfologicky normálnych fertilných rastlín.
  28. 28. Použitie polynukleotidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 alebo vektora podľa nároku 10 na prípravu rastlinného pletiva a/alebo celých morfologicky normálnych fertilných rastlín (I) , ktoré sú podstatne tolerantné alebo podstatne rezistentné na dva alebo viac herbicídov.
  29. 29. Použitie polynukleotidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 9 alebo vektora podľa nároku 10 na prípravu herbicídového cieľa na vysokokapacitný in vitro skríning potenciálnych herbicídov.
  30. 30. Použitie podľa predchádzajúceho nároku, kde úseky polynukleotidu kódujúceho proteiny sú heterológne exprimované v E. coli alebo v kvasinkách.
SK609-99A 1996-11-07 1997-10-31 Polynucleotide encoding resistance or tolerance to herbicides, vector and plant comprising a polynucleotide, method of selective weed control and use of polynucleotide SK60999A3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9623248.3A GB9623248D0 (en) 1996-11-07 1996-11-07 Herbicide resistant plants
GBGB9625957.7A GB9625957D0 (en) 1996-12-13 1996-12-13 Improvements in or relating to organic compounds
GBGB9703855.8A GB9703855D0 (en) 1997-02-25 1997-02-25 Improvements in or relating to organic compounds
PCT/GB1997/002996 WO1998020144A2 (en) 1996-11-07 1997-10-31 Herbicide resistant plants

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK60999A3 true SK60999A3 (en) 1999-10-08

Family

ID=27268575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK609-99A SK60999A3 (en) 1996-11-07 1997-10-31 Polynucleotide encoding resistance or tolerance to herbicides, vector and plant comprising a polynucleotide, method of selective weed control and use of polynucleotide

Country Status (14)

Country Link
EP (2) EP1728868A2 (sk)
JP (1) JP2001503625A (sk)
KR (1) KR20000053140A (sk)
CN (1) CN1236394A (sk)
AU (1) AU4789597A (sk)
BG (1) BG103462A (sk)
BR (1) BR9712695A (sk)
CA (1) CA2269666A1 (sk)
CZ (1) CZ161699A3 (sk)
IL (1) IL129707A0 (sk)
NZ (1) NZ335101A (sk)
PL (1) PL333131A1 (sk)
SK (1) SK60999A3 (sk)
WO (1) WO1998020144A2 (sk)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6069115A (en) * 1997-11-12 2000-05-30 Rhone-Poulenc Agrochimie Method of controlling weeds in transgenic crops
US6492578B1 (en) 1998-07-10 2002-12-10 Calgene Llc Expression of herbicide tolerance genes in plant plastids
JP2002520024A (ja) * 1998-07-10 2002-07-09 カルジーン エルエルシー 植物色素体における除草剤耐性遺伝子の発現
DE19836659A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Baumwollkulturen
DE19836684A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Reiskulturen
ES2405266T3 (es) 1998-08-13 2013-05-30 Bayer Cropscience Ag Agentes herbicidas para cultivos de maíz tolerantes o resistentes
DE19836700A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Getreidekulturen
DE19836660A1 (de) 1998-08-13 2000-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Herbizide Mittel für tolerante oder resistente Sojakulturen
AU5779499A (en) * 1998-08-28 2000-03-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Organelle targeting sequences
AU2924800A (en) * 1999-03-03 2000-09-21 Syngenta Limited Use of glutathione-s-transferase to increase stress tolerance in plants
US20020079846A1 (en) * 2000-01-18 2002-06-27 Facchini Peter James Novel glutathione-S-transferase nucleic acids and polypeptides and methods of use thereof
US7083967B1 (en) 2000-06-27 2006-08-01 Basf Corporation Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation
AU2001271486B2 (en) * 2000-06-27 2006-11-09 Basf Plant Science Gmbh Cyanobacterial nucleic acid fragments encoding proteins useful for controlling plant traits via nuclear or plastome transformation
AU2002214158B2 (en) 2000-12-07 2007-01-18 Syngenta Limited Plant derived hydroxy phenyl pyruvate dioxygenases (HPPD) resistant against triketone herbicides and transgenic plants containing these dioxygenases
CA2928061C (en) 2001-10-19 2018-10-16 Sumitomo Chemical Company, Limited Weed controller metabolism proteins, genes thereof and use of the same
JP4779283B2 (ja) * 2001-10-19 2011-09-28 住友化学株式会社 雑草防除剤代謝蛋白質、その遺伝子およびその利用
BR0307965A (pt) 2002-02-26 2005-02-01 Syngenta Ltd Processo para produzir seletivamente plantas masculinas ou femininas estéries
CN1330762C (zh) * 2002-05-10 2007-08-08 北京大学 新的草甘膦耐受型5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合酶及其编码基因
EP2308977B2 (en) 2004-04-30 2017-04-26 Dow AgroSciences LLC Novel herbicide resistance gene
JP4720223B2 (ja) * 2004-05-18 2011-07-13 住友化学株式会社 除草活性化合物耐性植物
BRPI0618025B1 (pt) 2005-10-28 2016-12-27 Dow Agrosciences Llc método para controlar ervas daninhas em uma área, polinucleotídeo isolado, célula de planta e planta resistente a herbicida
US20070154963A1 (en) * 2005-12-30 2007-07-05 Danying Cai Method to determine whether a compound is a cellular GSTpi inhibitor
US7855326B2 (en) 2006-06-06 2010-12-21 Monsanto Technology Llc Methods for weed control using plants having dicamba-degrading enzymatic activity
BRPI0712484B1 (pt) 2006-06-06 2017-06-06 Monsanto Technology Llc método para seleção de células transformadas
US7838729B2 (en) * 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
US8030544B2 (en) 2007-03-09 2011-10-04 Monsanto Technology Llc Methods for plant transformation using spectinomycin selection
AP2009004993A0 (en) * 2007-04-04 2009-10-31 Basf Plant Science Gmbh Ahas mutants
AU2008251445B2 (en) * 2007-05-09 2014-04-03 Corteva Agriscience Llc Novel herbicide resistance genes
CN101998988A (zh) 2007-05-30 2011-03-30 先正达参股股份有限公司 赋予除草剂抗性的细胞色素p450基因
US9175305B2 (en) 2009-01-22 2015-11-03 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
WO2010085705A2 (en) 2009-01-22 2010-07-29 Syngenta Participations Ag Mutant hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
AU2010326672A1 (en) 2009-07-10 2011-08-04 Syngenta Participations Ag Novel hydroxyphenylpyruvate dioxygenase polypeptides and methods of use
AU2010334808B2 (en) * 2009-12-23 2015-07-09 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to HPPD inhibitor herbicides
CN102869769A (zh) * 2009-12-23 2013-01-09 拜尔知识产权有限公司 耐受hppd抑制剂型除草剂的植物
BR112012015692A2 (pt) * 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicida inibidor de hppds.
EP2521441A4 (en) * 2010-01-07 2013-10-23 Basf Agro B V Arnhem Nl Zuerich Branch HERBICID TOLERANT PLANTS
JP2012197271A (ja) 2011-03-07 2012-10-18 Sumitomo Chemical Co Ltd 水稲作における雑草防除方法
CN102776158B (zh) * 2012-06-14 2013-10-23 重庆市农业科学院 一种抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS-2及其编码基因与应用
AR092564A1 (es) 2012-09-14 2015-04-22 Bayer Cropscience Lp Variantes de la enzima 4-hidroxifenil piruvato deoxigenasa (hppd) y metodos de uso para conferir tolerancia a herbicidas en plantas
BR112016020889B1 (pt) 2014-03-11 2022-10-04 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Molécula de ácido nucleico recombinante, célula hospedeira bacteriana, proteína hppd recombinante, uso do ácido nucleico recombinante e produto de base
ES2627863B1 (es) * 2014-06-06 2018-06-13 Cornell University Composiciones y métodos para determinar la alimentación por psílidos
AU2015288157A1 (en) * 2014-07-11 2017-01-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions and methods for producing plants resistant to glyphosate herbicide
CN104611304B (zh) * 2014-12-22 2017-05-17 北京大北农生物技术有限公司 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
CN104878094B (zh) * 2015-04-30 2019-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9888的核酸序列及其检测方法
CN104878090B (zh) * 2015-04-30 2019-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9877的核酸序列及其检测方法
CN104878095B (zh) * 2015-04-30 2018-10-26 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9858的核酸序列及其检测方法
CN104830846B (zh) * 2015-04-30 2018-10-30 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9898的核酸序列及其检测方法
CN104830845B (zh) * 2015-04-30 2018-10-30 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9878的核酸序列及其检测方法
CN104878096B (zh) * 2015-04-30 2019-01-15 北京大北农科技集团股份有限公司 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9868的核酸序列及其检测方法
KR20180043838A (ko) 2015-09-11 2018-04-30 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 Ｈｐｐｄ 변이체 및 사용 방법
CN105603047A (zh) * 2015-12-31 2016-05-25 中国烟草总公司郑州烟草研究院 一种适用于植物全蛋白提取液的GSTs活性分析方法
US11624076B2 (en) 2016-04-21 2023-04-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC TAL-effector mediated herbicide tolerance
BR112019018056A2 (pt) 2017-03-07 2020-08-11 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC molécula de ácido nucleico recombinante, cassete de expressão, célula hospedeira, plantas, sementes transgênicas, polipeptídeo recombinante, métodos para conferir tolerância e para controlar ervas daninhas, produto de utilidade e uso da sequência de nucleotídeos
BR112020008092A2 (pt) 2017-10-24 2020-09-15 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
WO2019083808A1 (en) 2017-10-24 2019-05-02 Basf Se IMPROVING HERBICIDE TOLERANCE AGAINST HPPD INHIBITORS BY REGULATION OF PUTATIVE REDUCED 4-HYDROXYPHENYLPYRUVATE REDUCES IN SOYBEANS
WO2019233349A1 (zh) 2018-06-04 2019-12-12 青岛清原化合物有限公司 突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶、其编码核酸以及应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
DE4003045A1 (de) * 1990-02-02 1991-08-08 Hoechst Ag Virus/herbizidresistenz-gene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
AU655197B2 (en) * 1990-06-25 1994-12-08 Monsanto Technology Llc Glyphosate tolerant plants
WO1992004449A1 (en) * 1990-08-31 1992-03-19 Monsanto Company Glyphosate tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5290926A (en) * 1990-09-14 1994-03-01 Ciba-Geigy Corporation Isolated DNA Encoding plant histidinol dehydrogenase
CA2105990A1 (en) * 1991-03-12 1992-09-13 Gunter Donn Maize resistant to aryloxyphenoxyalkanecarboxylic acid herbicides
US5491076A (en) * 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
US5767373A (en) * 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5631152A (en) * 1994-10-26 1997-05-20 Monsanto Company Rapid and efficient regeneration of transgenic plants
GB9515941D0 (en) * 1995-08-03 1995-10-04 Zeneca Ltd DNA constructs
BR9604993B1 (pt) * 1995-04-20 2009-05-05 dna mutante codificando uma proteìna ahas mutante de sìntese de ácido acetohidróxi e proteìnas ahas mutantes.
FR2751347B1 (fr) * 1996-07-16 2001-12-07 Rhone Poulenc Agrochimie Gene chimere a plusieurs genes de tolerance herbicide, cellule vegetale et plante tolerantes a plusieurs herbicides

Also Published As

Publication number Publication date
BR9712695A (pt) 1999-10-19
PL333131A1 (en) 1999-11-22
WO1998020144A3 (en) 1998-07-16
IL129707A0 (en) 2000-02-29
BG103462A (en) 2000-01-31
AU4789597A (en) 1998-05-29
NZ335101A (en) 2000-11-24
EP1728868A2 (en) 2006-12-06
WO1998020144A2 (en) 1998-05-14
CZ161699A3 (cs) 1999-08-11
JP2001503625A (ja) 2001-03-21
KR20000053140A (ko) 2000-08-25
EP0946737A2 (en) 1999-10-06
CN1236394A (zh) 1999-11-24
CA2269666A1 (en) 1998-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK60999A3 (en) Polynucleotide encoding resistance or tolerance to herbicides, vector and plant comprising a polynucleotide, method of selective weed control and use of polynucleotide
US20090229006A1 (en) Herbicide resistant plants
EP2610334A1 (en) Novel selectable marker genes
JP2000506011A (ja) 植物のプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ遺伝子由来のプロモーター
PL190393B1 (pl) Konstrukt chimerowy zawierający gen chimerowy elementarny, wektor, komórka roślinna, roślina, sposób nadawania oporności na herbicydy roślinom, sposób uzyskiwania roślin o tolerancji na wiele herbicydów oraz sposób działania herbicydem na rośliny
HRP960245A2 (en) Dna sequence of a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and production of plants containing a gene of hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase and which are tolerant to certain herbicides
AU2008206450B2 (en) Acetyl-CoA carboxylase herbicide resistant sorghum
JP2000516812A (ja) 植物病原性真菌に対する阻害活性を有するペプチド
RU2628504C2 (ru) Способы повышения урожайности резистентных к 2,4-d сельскохозяйственных культур
CN114854702B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
BRPI0717904B1 (pt) &#34;método para controlar as ervas daninhas, método para produzir uma linhagem vegetal de híbrido de sorgo e método para identificar linhagens vegetais de sorgo&#34;.
CA2321965A1 (en) Method of producing plants which are tolerant or resistant to herbicides
CN115340987B (zh) 除草剂耐受性蛋白质、其编码基因及用途
WO2022237541A1 (zh) 原卟啉原氧化酶的用途
AU2004203646A1 (en) Herbicide resistant plants
MXPA99004200A (en) Herbicide resistant plants
WO2023083972A1 (en) Herbicide resistance
US20130260995A1 (en) Methods of improving the yield of 2,4-d resistant crop plants
CN118434874A (zh) 原卟啉原氧化酶的用途