CN104745610A - 一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl及其制备方法和应用，所述EPSP合酶基因AroA-Rl的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO2所示。本发明的EPSP合酶基因AroA-Rl是利用基因合成方法制备而成，该AroA-Rl基因编码的EPSP合酶具有抗草甘膦性能，将其转化植物，能够提高植物对草甘膦除草剂的抗性，可应用于抗草甘膦转基因作物培育中。

Description

一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl及其制备方法和应用。

背景技术

随着化学除草技术的迅速发展，除草剂的应用日益广泛，给农业生产带来了极大的经济效益。有机磷除草剂草甘膦是高效、低毒、灭生性苗后除草剂，近年来随着栽培耕作方式趋向于规模化和集约化，对农药草甘膦的需求量显著增加。近年来，草甘膦销售量以每年增加15％，多年连续占据世界农药销售额的第一位。

草甘膦的杀草原理是它能抑制芳族氨基酸的合成，从而导致杂草死亡。草甘膦阻止芳族氨基酸合成的具体部位是抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）。常规作物的EPSPS对草甘膦很敏感，如果直接接触，草甘膦会杀死常规作物。将编码降解草甘膦的蛋白或草甘膦低敏感的EPSPS转化到作物中，明显提高作物抗草甘膦除草剂的能力，2005年统计显示美国87%大豆，61%棉花和26%玉米为抗草甘膦转基因植物。

目前至少有两类功能不同的抗除草剂基因应用于转基因作物上。第一类是通过降低植物酶对除草剂的敏感性，进而减少除草剂对植物的杀伤能力。例如AroA的突变基因合成的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的脯氨酸被丝氨酸所取代，酶活力不受影响，但是对非选择性除草剂草甘膦的结合力只有原来的25%，从而使植物对除草剂表现不敏感。第二类则是通过解除除草剂对植物酶的抑制实现对除草剂抗性。例如Bar基因，能合成乙酰转移酶，解除选择性除草剂草胺膦对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。常用的抗除草剂基因包括EPSPS基因（产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（产生草甘膦氧化酶，降解草甘膦）、bar基因（产生草胺膦乙酰转移酶，抗草胺膦）、BXN基因（产生溴苯腈水解酶，抗溴苯腈）等。

EPSP合成酶广泛存在于自然界中，目前从不同植物中和微生物中筛选到很多类型的EPSP合成酶基因，但是大多数EPSP合成酶对草甘膦敏感，通过突变可以使EPSP合成酶对草甘膦敏感性降低，然而它与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的亲和力也随之降低，从而导致酶活力下降，如来源于大肠杆菌的EPSPS基因，通过T42M；G96A；T97I；P101L，P101T，和A183T位点突变，均能降低该酶对草甘膦敏感性，但相对酶活力也随之下降，因而尚不能商业化。主要的耐草甘膦作物（商品名叫Roundup Ready作物）含有从微生物转化到作物中的CP4EPSPS基因。该基因来源于农杆菌CP4菌株（Agrobacterium sp.strain CP4）。CP4EPSPS属于II型EPSPS，有不同于植物EPSPS基因的核苷酸顺序，转录翻译后的EPSP合成酶对草甘膦不再敏感，因而具有对草甘膦的耐药性，其催化活性介于植物和大肠杆菌之间。研究表明，第100位的丙氨酸在该酶感受草甘膦中起很大作用，将该位点突变为谷氨酸，对草甘膦敏感性恢复。有些耐草甘膦玉米含有被改变了的并来自玉米的EPSPS基因，由这个改变了的基因转录翻译后的EPSPS合成酶对草甘膦也不敏感，所以对草甘膦也有耐药性，但是这些基因表达的蛋白活性不强，必须通过超量表达来弥补。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于豌豆根瘤菌（Rhizobiumlegum inosarum）的EPSP合酶基因及其制备方法和应用，具体利用基因合成方法对源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因（AroA）进行改造获得可在植物中持续表达的EPSP合酶基因（AroA-Rl），该AroA-Rl基因编码的EPSP合酶具有草甘膦的抗性，转化到植物后能够提高植物对草甘膦除草剂的抗性。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl，其核苷酸序列如SEQ IDNo1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。

一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl的制备方法，具体为：将来源于豌豆根瘤菌中的EPSP合酶基因（AroA）按照植物偏爱密码进行改造，利用PTDS基因合成法【Xiong et al.,Nucl Acids Res,2004,32:e98】，设计引物RLAROAI-1～RLAROAI-34进行PCR扩增合成本发明的EPSP合酶基因（AroA-Rl），其中设计引物RLAROAI-1～RLAROAI-34的具体序列如下：

1.RLAROAI-1:

GGATCCATGC TGAATGGTTC TGCTTCTAAG CCAGCTACTG CTCGTAAGTC TGCTGGTCTG

2.RLAROAI-2:

GAGAGATAGA CTTGTCACCA GGGATACGAA CAGAACCAGT CAGACCAGCA GACTTACGAG

3.RLAROAI-3:

TGGTGACAAG TCTATCTCTC ACCGTTCTTT CATGATTGGT GGTCTCGCTT CTGGTGAGAC

4.RLAROAI-4:

GTTGATAACG TCTTCACCTT CAAGAAGACC AGTGATACGA GTCTCACCAG AAGCGAGACC

5.RLAROAI-5:

AAGGTGAAGA CGTTATCAAC ACTGGTCGTG CTATGCAAGC TATGGGTGCT CGTATTCGTA

6.RLAROAI-6:

CCATTGCCAG TGCCTTCAAT GACCCACTGA GCACCTTCCT TACGAATACG AGCACCCATA

7.RLAROAI-7:

ATTGAAGGCA CTGGCAATGG TGCTCTCCTT GCTCCTGATG CTCCACTCGA CTTCGGCAAT

8.RLAROAI-8:

TGCCAACAAG ACCCATAGTG AGACGAACAC CAGTGCCAGC ATTGCCGAAG TCGAGTGGAG

9.RLAROAI-9:

CACTATGGGT CTTGTTGGCA CCTACGACTT CCACTCTACC TTCATCGGTG ACGCTTCTCT

10.RLAROAI-10:

ACGCAGTGGA TTGAGGACAC GACCCATTGG ACGTTTAGAG AGAGAAGCGT CACCGATGAA

11.RLAROAI-11:

GTGTCCTCAA TCCACTGCGT GAGATGGGTG TTCAGGTCTC TGCATCTGAA GGTGATCGTC

12.RLAROAI-12:

ATTGGAGATG GAGTACCAGG ACCACGAAGA GTGACTGGAA GACGATCACC TTCAGATGCA

13.RLAROAI-13:

CCTGGTACTC CATCTCCAAT CCGTTACCGT GTTCCAATGG CTTCTGCTCA GGTCAAGTCT

14.RLAROAI-14:

TGGTGACACC AGGAGTGTTG AGACCAGCAA GAAGGACAGC AGACTTGACC TGAGCAGAAG

15.RLAROAI-15:

CAACACTCCT GGTGTCACCA CTGTCATTGA ACCTGTCATG ACTCGTGACC ACACTGAGAA

16.RLAROAI-16:

AGTCTCGACA GAGAGAGCAG CACCAAAGCC TTGCAGCATC TTCTCAGTGT GGTCACGAGT

17.RLAROAI-17:

CTGCTCTCTC TGTCGAGACT GATGGTGATG GTGTTCGTAC CATTCGTCTT GAAGGTCGTG

18.RLAROAI-18:

GGATCACCAG GAACATCGAT GACCTGACCA GCGAGCTTGC CACGACCTTC AAGACGAATG

19.RLAROAI-19:

ATCGATGTTC CTGGTGATCC ATCTTCTACT GCCTTTCCAC TTGTTGCTGC TCTGATTGTT

20.RLAROAI-20:

GATTCATCAG AACGTTGACG ATAGTGATGT CAGAGCCAGG AACAATCAGA GCAGCAACAA

21.RLAROAI-21:

CGTCAACGTT CTGATGAATC CTACTCGTAC TGGTCTGATC CTGACTCTGC AAGAGATGGG

22.RLAROAI-22:

ACCACCAGCA AGACGAGCAT TGACAACTTC GATGTCAGCA CCCATCTCTT GCAGAGTCAG

23.RLAROAI-23:

ATGCTCGTCT TGCTGGTGGT GAAGATGTTG CTGATCTTCG TGTTCGTCAT TCTGAACTCA

24.RLAROAI-24:

ATCATAGATG GAGCACGATC TTCTGGAACA GTGACACCCT TGAGTTCAGA ATGACGAACA

25.RLAROAI-25:

GATCGTGCTC CATCTATGAT CGACGAGTAT CCAATCCTTG CTGTTGCTGC CTGCTTCGCT

26.RLAROAI-26:

CACGCAGTTC CTCAAGACCC TTCATGACAG TAGCACCTTC AGCGAAGCAG GCAGCAACAG

27.RLAROAI-27:

GGGTCTTGAG GAACTGCGTG TCAAGGAGTC TGATCGTCTC TCTGCTGTTG CTGATGGTCT

28.RLAROAI-28:

GAAGTCTTCA CCTTCATCAC AATCAACACC GTTCAGCTTC AGACCATCAG CAACAGCAGA

29.RLAROAI-29:

GTGATGAAGG TGAAGACTTC CTCATTGTTC GTGGTCGTCC TGATGGCAAG GGTCTTGGCA

30.RLAROAI-30:

CGATGATCGA GATGAGTAGA GACACGACCA TCAGCAGCAT TGCCAAGACC CTTGCCATCA

31.RLAROAI-31:

TCTACTCATC TCGATCATCG TATTGCTATG TCCTTCCTTG TTCTTGGTCT CGCTTCTGAG

32.RLAROAI-32:

AGGTAGCGAT CATAGCAGCA TCATCGATGGT GACAGCGTGC TCAGAAGCGA GACCAAGAA

33.RLAROAI-33:

TGCTGCTATG ATCGCTACCT CCTTTCCAGAG TTCATGCAAC TGATGACTGG TCTTGGTGC

34.RLAROAI-34:Tm=5451mer

GAGCTCTTAC TCAGCAACAA GTTCGATCTTA GCACCAAGAC CAGTCATCAG

将本发明所述的源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl转入拟南芥，可应用于提高植物的草甘膦抗性，进而可应用于抗草甘膦转基因作物培育中。

将本发明合成的合成AroA-Rl基因与p251表达载体相连接后转入大肠杆菌ER2799中，接种到含0-100mM草甘瞵的M9液体培养基中培养，检测结果表明：携带含AroA-Rl基因的大肠杆菌ER2799能在80mM草甘瞵存在下正常生长，但是，携带空载体p251和无插入片断的质粒的大肠杆菌ER2799则无法生长，这充分说明草甘膦抗性确实是由于转入本发明的AroA-Rl基因引起的。

利用BamHI和SacI进行双酶切后，通过T4DNA连接酶将本发明的AroA-Rl片段与含有双35S启动子的pCAMBIA1301质粒连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因AroA-Rl的重组质粒pCAMAP22。该表达载体还包含潮霉素抗性标记基因。将表达载体经电击法导入到农杆菌菌株（根癌农杆菌为EHA105，LBA4404，GV3101或AGL-1），然后通过农杆菌介导法转化到拟南芥中【Clough et al.,The plant journal，1998，16(6):735-743】，并验证了转基因植物对草甘膦除草剂的抗性明显提高。

本发明的有益效果：

1.本发明采用基因合成法将来源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA重新按照植物偏爱密码进行人工改造，在保持AroA基因的氨基酸序列不变的基础上，设计引物合成了本发明的AroA-Rl基因。通过原核表达及植物转化，结果表明所述AroA-Rl基因是具有较高草甘膦抗性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因。

2.本发明所述AroA-Rl基因可成功转入植物，在植物中持续表达，并能显著提高植物的草甘膦抗性，进而可应用于抗草甘膦转基因作物培育中。

附图说明

图1为本发明实施例2中含AroA-Rl基因的原核表达载体在80mM草甘膦浓度下的耐受性实验结果；

图2为本发明实施例3中AroA-Rl基因用于转化的植物表达载体构建示意图；

图3为本发明实施例4中转基因拟南芥的RT-PCR扩增结果图，其中，WT为野生型植株，AR1，AR2，AR3分别为为三个转基因拟南芥株系；

图4为本发明实施例5中喷施10mM草甘膦除草剂前，野生型拟南芥和转基因拟南芥的生长情况，其中，WT为野生型拟南芥，AR1、AR2、AR3为转基因拟南芥的三个不同株系；

图5为本发明实施例5中喷施10mM草甘膦除草剂后，野生型拟南芥和转基因拟南芥的生长情况，其中，WT为野生型拟南芥，AR1、AR2、AR3为转基因拟南芥的三个不同株系。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制。

本发明所用的试验材料及其来源包括：野生型拟南芥种子（Arabidopsisthaliana），大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α，农杆菌菌株GV3101由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-SimpleT、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、T4DNA连接酶、dNTP、10×PCR buffer购自宝生物工程大连有限公司。其他试剂若未经说明，均购自西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书【J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994】。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。

实施例1基因合成法合成源于豌豆根瘤菌的AroA-Rl基因

利用PTDS法【Xiong et al.,Nucl Acids Res,2004,32:e98】合成豌豆根瘤菌的AroA-Rl基因，所用的引物如下：

1.RLAROAI-1:

GGATCCATGC TGAATGGTTC TGCTTCTAAG CCAGCTACTG CTCGTAAGTC TGCTGGTCTG

2.RLAROAI-2:

GAGAGATAGA CTTGTCACCA GGGATACGAA CAGAACCAGT CAGACCAGCA GACTTACGAG

3.RLAROAI-3:

TGGTGACAAG TCTATCTCTC ACCGTTCTTT CATGATTGGT GGTCTCGCTT CTGGTGAGAC

4.RLAROAI-4:

GTTGATAACG TCTTCACCTT CAAGAAGACC AGTGATACGA GTCTCACCAG AAGCGAGACC

5.RLAROAI-5:

AAGGTGAAGA CGTTATCAAC ACTGGTCGTG CTATGCAAGC TATGGGTGCT CGTATTCGTA

6.RLAROAI-6:

CCATTGCCAG TGCCTTCAAT GACCCACTGA GCACCTTCCT TACGAATACG AGCACCCATA

7.RLAROAI-7:

ATTGAAGGCA CTGGCAATGG TGCTCTCCTT GCTCCTGATG CTCCACTCGA CTTCGGCAAT

8.RLAROAI-8:

TGCCAACAAG ACCCATAGTG AGACGAACAC CAGTGCCAGC ATTGCCGAAG TCGAGTGGAG

9.RLAROAI-9:

CACTATGGGT CTTGTTGGCA CCTACGACTT CCACTCTACC TTCATCGGTG ACGCTTCTCT

10.RLAROAI-10:

ACGCAGTGGA TTGAGGACAC GACCCATTGG ACGTTTAGAG AGAGAAGCGT CACCGATGAA

11.RLAROAI-11:

GTGTCCTCAA TCCACTGCGT GAGATGGGTG TTCAGGTCTC TGCATCTGAA GGTGATCGTC

12.RLAROAI-12:

ATTGGAGATG GAGTACCAGG ACCACGAAGA GTGACTGGAA GACGATCACC TTCAGATGCA

13.RLAROAI-13:

CCTGGTACTC CATCTCCAAT CCGTTACCGT GTTCCAATGG CTTCTGCTCA GGTCAAGTCT

14.RLAROAI-14:

TGGTGACACC AGGAGTGTTG AGACCAGCAA GAAGGACAGC AGACTTGACC TGAGCAGAAG

15.RLAROAI-15:

CAACACTCCT GGTGTCACCA CTGTCATTGA ACCTGTCATG ACTCGTGACC ACACTGAGAA

16.RLAROAI-16:

AGTCTCGACA GAGAGAGCAG CACCAAAGCC TTGCAGCATC TTCTCAGTGT GGTCACGAGT

17.RLAROAI-17:

CTGCTCTCTC TGTCGAGACT GATGGTGATG GTGTTCGTAC CATTCGTCTT GAAGGTCGTG

18.RLAROAI-18:

GGATCACCAG GAACATCGAT GACCTGACCA GCGAGCTTGC CACGACCTTC AAGACGAATG

19.RLAROAI-19:

ATCGATGTTC CTGGTGATCC ATCTTCTACT GCCTTTCCAC TTGTTGCTGC TCTGATTGTT

20.RLAROAI-20:

GATTCATCAG AACGTTGACG ATAGTGATGT CAGAGCCAGG AACAATCAGA GCAGCAACAA

21.RLAROAI-21:

CGTCAACGTT CTGATGAATC CTACTCGTAC TGGTCTGATC CTGACTCTGC AAGAGATGGG

22.RLAROAI-22:

ACCACCAGCA AGACGAGCAT TGACAACTTC GATGTCAGCA CCCATCTCTT GCAGAGTCAG

23.RLAROAI-23:

ATGCTCGTCT TGCTGGTGGT GAAGATGTTG CTGATCTTCG TGTTCGTCAT TCTGAACTCA

24.RLAROAI-24:

ATCATAGATG GAGCACGATC TTCTGGAACA GTGACACCCT TGAGTTCAGA ATGACGAACA

25.RLAROAI-25:

GATCGTGCTC CATCTATGAT CGACGAGTAT CCAATCCTTG CTGTTGCTGC CTGCTTCGCT

26.RLAROAI-26:

CACGCAGTTC CTCAAGACCC TTCATGACAG TAGCACCTTC AGCGAAGCAG GCAGCAACAG

27.RLAROAI-27:

GGGTCTTGAG GAACTGCGTG TCAAGGAGTC TGATCGTCTC TCTGCTGTTG CTGATGGTCT

28.RLAROAI-28:

GAAGTCTTCA CCTTCATCAC AATCAACACC GTTCAGCTTC AGACCATCAG CAACAGCAGA

29.RLAROAI-29:

GTGATGAAGG TGAAGACTTC CTCATTGTTC GTGGTCGTCC TGATGGCAAG GGTCTTGGCA

30.RLAROAI-30:

CGATGATCGA GATGAGTAGA GACACGACCA TCAGCAGCAT TGCCAAGACC CTTGCCATCA

31.RLAROAI-31:

TCTACTCATC TCGATCATCG TATTGCTATG TCCTTCCTTG TTCTTGGTCT CGCTTCTGAG

32.RLAROAI-32:

AGGTAGCGAT CATAGCAGCA TCATCGATGGT GACAGCGTGC TCAGAAGCGA GACCAAGAA

33.RLAROAI-33:

TGCTGCTATG ATCGCTACCT CCTTTCCAGAG TTCATGCAAC TGATGACTGG TCTTGGTGC

34.RLAROAI-34:Tm=5451mer

GAGCTCTTAC TCAGCAACAA GTTCGATCTTA GCACCAAGAC CAGTCATCAG

利用PCR进行β-胡萝卜素全长操纵子扩增，在100μl反应体系中，内侧引物RLAROAI-2～RLAROAI-33共32个引物的添加量分别为2ng，外侧引物RLAROAI-1和RLAROAI-34添加量分别为30ng。以KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本）为Taq DNA聚合酶。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃10min，使用的，共25个循环。PCR结束后，得到了一个1389bp左右的片段，1%（w/v）琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连（宝生物工程（大连）有限公司），4℃连接过夜。高效转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆、测序，成功获得本发明的源于豌豆根瘤菌的AroA-Rl基因，其核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。

实施例2:AroA-Rl基因原核表达抗草甘膦鉴定

将测序鉴定为阳性的AroA-Rl基因克隆用BamHI和SacI双酶解，与p251表达载体连接，用琼脂糖凝胶电泳的方法估计浓度，确保连接反应中外源DNA的浓度至少是载体浓度3-5倍。反应温度16℃，连接时间为10-12h，转化大肠杆菌ER2799，得到含目的基因的原核表达菌株。

将含有目的基因AroA-Rl的大肠杆菌ER2799与携带空载体p251的ER2799菌体接种到含0-100mM草甘瞵的M9液体培养基中，经过37℃、12h的摇床培养，在培养中测定菌体生长情况，在OD600进行比较，同时以无插入片断的质粒的大肠杆菌ER2799为补充空白对照。结果：在0mM条件下，三种菌体生长一致；在80mM草甘膦浓度下，含有目的基因AroA-Rl的大肠杆菌ER2799仍可继续生长，而另外两种均无法生长，具体如图1所示。图1中含有目的基因AroA-Rl的大肠杆菌ER2799标记为aroA-Rl，携带空载体p251的ER2799标记为p251，空白对照标记为ER2799。由此结果可知，本发明合成的源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl具有草甘膦抗性。

实施例3：AroA-Rl基因植物表达载体构建

首先通过PCR方法扩增来自烟草中的叶绿体转运肽(TSP GenBank M61904)序列，引物为TSPR(5′-CGCCTGCAGTGGCACAGATTAGCAGCATG-3′)和TSPF(5′-CAGAGGATCCTCTGTGCAGTGACCACTGAT-3′)，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s；50℃30s；72℃10min，共25个循环。在TSP序列前增加SalI和BamHI酶切位点，将AroA-Rl基因扩增，并在基因的两端加入BamHI和SacI酶切位点，将TSP序列及目的基因的PCR片段回收后一同连接到pGEM3Z(Promega Madison WI USA)载体中，进行序列测定，获得含有TSP和AroA-Rl基因的质粒。抽提质粒DNA，分别用SalI和SacI进行双酶切，回收DNA片段，通过T4连接酶将TSP和AroA-Rl片段与含有双35S启动子的pCAMBIA1301质粒连接，酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因AroA-Rl的重组质粒pCAMAP22，如图2所示。该表达载体还包含潮霉素抗性标记基因。

实施例4：农杆菌培养和植物转化

农杆菌菌株为根癌农杆菌GV3101菌株。质粒经电击法导入农杆菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基（50mg/l利福平）培养过夜，取5ml菌液转接到100ml YEB培养基（50mg/l利福平），培养至OD600=0.7-0.8，菌液冰上放置10分钟，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml10%甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl10%甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管，得到农杆菌感受态细胞。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒pCAMAP22。用去头的黄枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板筛选转化子，28℃培养，筛选出已成功导入重组质粒pCAMAP22的菌株。

将含目的质粒的农杆菌菌株单菌落接菌在5毫升含对应抗生素的LB培养基中28℃培养2天。将5毫升菌液转到500毫升的液体LB培养基中28℃培养16-24小时（OD=1.5-2.0）。液体可以在4℃保存30天。室温下离心收集菌体，4000g离心10分钟。用等体积5%的新鲜蔗糖溶液悬浮，加入0.02%的Silwet-77混匀后转移到烧杯中，得到转化菌液。每个菌株用300毫升转化，转2-3钵。隔7天后再转化1次。将拟南芥倒置后浸入转化菌液中10秒钟。莲座和花序都要侵染。侵染后将转化植株菌液空干3-5秒。用保鲜膜将转化植株圈好，平放16-24小时。转化后不要放置在高温和强光下。揭开保鲜膜，保持一定湿度，再生长1个月后收种子。

取少量种子放入1.5mL离心管中，1mL75%乙醇消毒1min(不停摇晃振荡)，8000rpm离心5秒，倒去酒精。加入1mL过滤后的漂白粉消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000rpm离心5秒，去上清。无菌水洗涤3-4次。将种子均匀的播撒到1/2MS平板（Hyg50μg/mL）上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置两天，22℃，16小时光照培养6天，得到抗性植株。将上述抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行RT-PCR检测，常规表达的Actin基因作为对比，具体结果参见图3。可从图3可看出，转基因拟南芥的Actin基因表达与野生型拟南芥一致，表达量相当。利用特异的目的基因引物RlZ(5’-tgccagaaagtctgctggtc-3’)和RlF(5’-caccaagaccagtcatcagc-3’)，检测出Aroa-Rl基因在野生型拟南芥中不表达，而在三个转基因拟南芥株系中稳定表达，证实目的基因Aroa-Rl已成功转入拟南芥中。

实施例5：转AroA-Rl基因植物的抗草甘膦除草剂检测

将上述成功转入AroA-Rl基因的转基因拟南芥自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，22℃生长三个星期的野生型拟南芥和转AroA-Rl基因拟南芥用于抗草甘膦除草剂检测。具体是将野生型拟南芥与转基因拟南芥喷施10mM草甘膦除草剂，隔3天喷施一次，共二次，喷施完成后，观察植物的抗草甘膦除草剂效果。

22℃生长三个星期的野生型拟南芥和转基因拟南芥均正常生长（如图4所示），喷施两次10mM草甘膦除草剂后，野生型拟南芥的叶子变黄，近乎枯萎，而转基因拟南芥仍正常生长，其叶片不受任何影响，如图5所示。这表明转入本发明的AroA-Rl基因后得到的转基因拟南芥对草甘膦的抗性明显提高，即本发明合成的AroA-Rl基因具有提高植物抗草甘膦的作用，可用于培育抗草甘膦植物的技术领域。

Claims (6)

1.一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。 

2.根据权利要求1所述的源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl，其特征在于，所述EPSP合酶基因AroA-Rl编码的蛋白质序列如SEQ ID NO2所示。 

3.如权利要求1或2所述德源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl的制备方法，其特征在于，是将来源于豌豆根瘤菌中的EPSP合酶基因AroA按照植物偏爱密码进行改造，利用PTDS基因合成法，设计引物RLAROAI-1～RLAROAI-34进行PCR扩增合成所述EPSP合酶基因AroA-Rl；其中，引物的具体序列如下： 

RLAROAI-1: 

GGATCCATGC TGAATGGTTC TGCTTCTAAG CCAGCTACTG CTCGTAAGTC 

TGCTGGTCTG 

RLAROAI-2: 

GAGAGATAGA CTTGTCACCA GGGATACGAA CAGAACCAGT CAGACCAGCA 

GACTTACGAG 

RLAROAI-3: 

TGGTGACAAG TCTATCTCTC ACCGTTCTTT CATGATTGGT GGTCTCGCTT 

CTGGTGAGAC 

RLAROAI-4: 

GTTGATAACG TCTTCACCTT CAAGAAGACC AGTGATACGA GTCTCACCAG 

AAGCGAGACC 

RLAROAI-5: 

AAGGTGAAGA CGTTATCAAC ACTGGTCGTG CTATGCAAGC TATGGGTGCT 

CGTATTCGTA 

RLAROAI-6: 

CCATTGCCAG TGCCTTCAAT GACCCACTGA GCACCTTCCT TACGAATACG 

AGCACCCATA 

RLAROAI-7: 

ATTGAAGGCA CTGGCAATGG TGCTCTCCTT GCTCCTGATG CTCCACTCGA 

CTTCGGCAAT 

RLAROAI-8: 

TGCCAACAAG ACCCATAGTG AGACGAACAC CAGTGCCAGC ATTGCCGAAG 

TCGAGTGGAG 

RLAROAI-9: 

CACTATGGGT CTTGTTGGCA CCTACGACTT CCACTCTACC TTCATCGGTG 

ACGCTTCTCT 

RLAROAI-10: 

ACGCAGTGGA TTGAGGACAC GACCCATTGG ACGTTTAGAG AGAGAAGCGT 

CACCGATGAA 

RLAROAI-11: 

GTGTCCTCAA TCCACTGCGT GAGATGGGTG TTCAGGTCTC TGCATCTGAA 

GGTGATCGTC 

RLAROAI-12: 

ATTGGAGATG GAGTACCAGG ACCACGAAGA GTGACTGGAA GACGATCACC 

TTCAGATGCA 

RLAROAI-13: 

CCTGGTACTC CATCTCCAAT CCGTTACCGT GTTCCAATGG CTTCTGCTCA 

GGTCAAGTCT 

RLAROAI-14: 

TGGTGACACC AGGAGTGTTG AGACCAGCAA GAAGGACAGC AGACTTGACC 

TGAGCAGAAG 

RLAROAI-15: 

CAACACTCCT GGTGTCACCA CTGTCATTGA ACCTGTCATG ACTCGTGACC 

ACACTGAGAA 

RLAROAI-16: 

AGTCTCGACA GAGAGAGCAG CACCAAAGCC TTGCAGCATC TTCTCAGTGT 

GGTCACGAGT 

RLAROAI-17: 

CTGCTCTCTC TGTCGAGACT GATGGTGATG GTGTTCGTAC CATTCGTCTT 

GAAGGTCGTG 

RLAROAI-18: 

GGATCACCAG GAACATCGAT GACCTGACCA GCGAGCTTGC CACGACCTTC 

AAGACGAATG 

RLAROAI-19: 

ATCGATGTTC CTGGTGATCC ATCTTCTACT GCCTTTCCAC TTGTTGCTGC 

TCTGATTGTT 

RLAROAI-20: 

GATTCATCAG AACGTTGACG ATAGTGATGT CAGAGCCAGG AACAATCAGA 

GCAGCAACAA 

RLAROAI-21: 

CGTCAACGTT CTGATGAATC CTACTCGTAC TGGTCTGATC CTGACTCTGC 

AAGAGATGGG 

RLAROAI-22: 

ACCACCAGCA AGACGAGCAT TGACAACTTC GATGTCAGCA CCCATCTCTT 

GCAGAGTCAG 

RLAROAI-23: 

ATGCTCGTCT TGCTGGTGGT GAAGATGTTG CTGATCTTCG TGTTCGTCAT 

TCTGAACTCA 

RLAROAI-24: 

ATCATAGATG GAGCACGATC TTCTGGAACA GTGACACCCT TGAGTTCAGA 

ATGACGAACA 

RLAROAI-25: 

GATCGTGCTC CATCTATGAT CGACGAGTAT CCAATCCTTG CTGTTGCTGC 

CTGCTTCGCT 

RLAROAI-26: 

CACGCAGTTC CTCAAGACCC TTCATGACAG TAGCACCTTC AGCGAAGCAG 

GCAGCAACAG 

RLAROAI-27: 

GGGTCTTGAG GAACTGCGTG TCAAGGAGTC TGATCGTCTC TCTGCTGTTG 

CTGATGGTCT 

RLAROAI-28: 

GAAGTCTTCA CCTTCATCAC AATCAACACC GTTCAGCTTC AGACCATCAG 

CAACAGCAGA 

RLAROAI-29: 

GTGATGAAGG TGAAGACTTC CTCATTGTTC GTGGTCGTCC TGATGGCAAG 

GGTCTTGGCA 

RLAROAI-30: 

CGATGATCGA GATGAGTAGA GACACGACCA TCAGCAGCAT TGCCAAGACC 

CTTGCCATCA 

RLAROAI-31: 

TCTACTCATC TCGATCATCG TATTGCTATG TCCTTCCTTG TTCTTGGTCT 

CGCTTCTGAG 

RLAROAI-32: 

AGGTAGCGAT CATAGCAGCA TCATCGATGGT GACAGCGTGC TCAGAAGCGA 

GACCAAGAA 

RLAROAI-33: 

TGCTGCTATG ATCGCTACCT CCTTTCCAGAG TTCATGCAAC TGATGACTGG 

TCTTGGTGC 

RLAROAI-34:Tm=5451mer 

GAGCTCTTAC TCAGCAACAA GTTCGATCTTA GCACCAAGAC CAGTCATCAG。 

4.如权利要求1至3任一项所述的源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl在植物转化中的应用。 

5.如权利要求1至3任一项所述的源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl在提高植物抗草甘膦除草剂性能中的应用。 

6.如权利要求1至3任一项所述的源于豌豆根瘤菌的的EPSP合酶基因AroA-Rl在培育抗草甘膦转基因作物中的应用。