CN104769121A - 香草醛合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于产生香草醛及相关化合物的方法。所述方法包括使用能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的香草醛合酶。本发明还涉及表达可用于所述方法的这种香草醛合酶的宿主生物。

Description

香草醛合酶
技术领域
本发明涉及用于产生香草醛的方法以及宿主生物，例如用于此种产生的微生物或植物。
背景技术
香草香精(Vanilla)是世界上最流行的香料化合物并用于众多的商业产品，包括许多食物。天然香草是附生攀爬兰花类香荚兰(Vanillaplanifolia Andrews)和塔希提香荚兰(Vanilla tahitensis)的豆荚中获得的，所述香荚兰属于包括在单子叶植物内的兰目(order Orchidales)中的香草属(genus Vanilla)。香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)是从发酵的香草豆荚中获得的香草提取物中主要的香料化合物。在高浓度下，香草醛是对活细胞有毒的。在豆荚中，所述香草醛作为无毒的植物抗菌物(phytoanticipin)香草醛葡糖苷而积累，当组织损伤时，所述香草醛葡糖苷转化为主动防御化合物。在发酵和加工处理香草豆荚以用作香料成分期间，将香草醛葡糖苷的主要部分水解以提供游离的香草醛。估计香草醛的总世界市场为每年10500吨。从香草豆荚中产生天然的香草醛是一个费力、缓慢且成本昂贵的过程。产生1千克香草醛需要约500千克的香草豆荚，对应于约40,000朵花的授粉。目前，全球的香草醛产量只有3％是来自香草豆荚。绝大多数香草醛是从不同的化石碳氢化合物像丁香酚中经合成产生的或通过木质素的酸水解产生的。尚未实现利用编码香荚兰花途径中的基因之异源表达而在微生物中通过生物技术产生香草醛，因为还未确定基因。事实上，已经通过表达来自其他生物的基因在酵母、真菌、细菌和体外细胞培养物中产生香草醛，所述基因编码组合以从结构上与香草醛相关的外源添加物质来形成香草醛的酶。
基于其碳骨架将苯丙氨酸衍生的挥发物分类为C6-C1、C6-C2、C6-C3化合物。在成熟的香草豆荚中发现的两种最丰富的化合物香草醛葡糖苷和对羟基苯甲醛葡糖苷两者都是C6-C1化合物。
在天然香草中两种主要的芳香化合物是对-羟基苯甲醛和香草醛。因为对羟基苯甲醛包含一些香草醛的相同结构要素，认为其是作为香草醛的前体。已经推测来自香草醛的途径构成了所有衍生自苯丙氨酸的代谢物的代谢网格。US2003/0070188描述了可用于在来自香荚兰(Vanillaplanifolia)的胚胎细胞培养物中产生对羟基苯甲醛的方法。在US2003/0070188中描述了一种利用4-羟基-苯甲醛合酶(4-HBS)(将其描述为能够催化对香豆酸的链缩短)来产生对羟基苯甲醛的方法。该文件还描述了4-HBS在匍匐翦股颖(creeping bentgrass)中的表达，但是并没有提供有关这种表达的结果的信息。其还描述了在表达4-HBS的酵母中检测不到4-羟基苯甲醛。
Podstolski等在2002年描述了在存在硫醇试剂但不需要辅因子的情况下，4-羟基-苯甲醛合酶(4-HBS)将4-香豆酸非氧化地转化为4-羟基苯甲醛。
发明内容
因此，需要用于产生香草醛的方法，特别是用于在植物或微生物中产生香草醛的方法。
本发明提供了酶(本文中定名为香草醛合酶)，所述酶能够将阿魏酸或阿魏酸衍生物转变成香草醛。可将这种酶用于在许多不同的宿主生物中以及在体外产生香草醛。
因此，本发明的一个方面是提供从阿魏酸产生香草醛的方法，其中所述方法包括使用表达香草醛合酶的宿主生物，并且其中可将所述阿魏酸添加至所述宿主生物或者所述宿主生物能够产生阿魏酸。
因此，本发明提供了产生香草醛的方法，所述方法包括：
a)提供微生物，其中所述微生物
i.能够产生阿魏酸；并且
ii.包含编码SEQ ID NO：1的香草醛合酶(VpVAN)或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物的异源核酸；以及
b)在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛和/或香草醛葡糖苷。
本发明还提供了产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷的方法，所述方法包括：
a)提供微生物，其中所述微生物
i.能够产生阿魏酸和/或阿魏酸衍生物；并且
ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛和/或香草醛葡糖苷。
本发明的另一个方面是提供微生物，其中所述微生物
i.能够产生阿魏酸；并且
ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ ID NO：1的VpVAN或与其共享至少70％、例如至少80％的序列同一性的其功能同源物。
本发明的另一个方面是提供产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其中所述微生物包含编码SEQ ID NO：1的香草醛合酶(VpVAN)或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物的异源核酸；以及
b)在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；以及
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛和/或香草醛葡糖苷。
本发明的另一个方面是提供产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其中所述微生物包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；以及
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。
本发明的另一个方面是提供用于产生香草醛的方法，所述方法包括：
a)提供阿魏酸和/或阿魏酸衍生物，
b)使所述阿魏酸和/或阿魏酸衍生物与香草醛合酶相接触，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ ID NO：1的(VpVAN)或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物，
从而产生香草醛。
本发明的另一个方面是提供产生香草醛的方法，所述方法包括：
a)提供包含编码SEQ ID NO：1的VpVAN或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物的异源核酸的植物；以及
b)培养所述植物；以及
c)从所述植物中分离香草醛。
本发明的另一个方面是提供产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷的方法，所述方法包括：
a)提供包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)培养所述植物；以及
c)从所述植物中分离香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。
本发明的又一个方面是提供产生动物饲料的方法，所述方法包括：
a)提供包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ IDNO：1的VpVAN或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物；以及
b)培养所述植物；以及
c)将所述植物加工成动物饲料。
本发明的另一个方面是提供产生食物产品的方法，所述方法包括：
a)提供包含可食用部分的植物，其中所述植物包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ ID NO：1的VpVAN或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物；以及
b)培养所述植物；以及
c)收获所述可食用部分；
从而得到具有香草醛口味的食物产品。
附图说明
图1示出了来自体外供应的VpVAN的LC-MS色谱图。该图示出所述酶能够催化阿魏酸断裂两个碳成为香草醛。该反应不需要CoASH、ATP和NAD+作为辅因子。具有在30℃下在2.5mM DTT中用5mM阿魏酸供应1小时的VpVAN之蛋白质溶液的离子色谱图。此外，在ATP、NAD+的存在下，VAN能够催化阿魏酸CoA断裂两个碳成为香草醛。具有在30℃下在2.5mM DTT、0.1mM ATP和0.1mM NAD+中用5mM阿魏酸CoA供应1小时的VAN之蛋白质溶液的提取离子色谱图。(EIC 153：提取离子色谱图m/z(香草醛mw+H+)
(a)供应有阿魏酸的VpVAN，供应有阿魏酸的阴性对照
(b)供应有阿魏酸CoA的VpVAN，供应有阿魏酰CoA的阴性对照
(c)在7.5分钟处的香草醛的碎裂图样。
图2示出了通过具有与拟南芥(Arabidopsis thaliana)UGT72E2一起稳定地整合到酵母染色体中的VpVAN之酵母菌株来形成香草醛葡糖苷。使酵母菌株在补充有8％糖蜜(molasses)的代尔夫特(Delft)培养基中培养，之后通过LC-MS测定代谢物谱。(EIC 317-提取离子色谱图m/z香草醛葡糖苷mv+22)
(a)Wt VpVAN
(b)酵母密码子优化的VpVAN
(c)阴性对照(酵母菌株Y06460)
图3示出了用包含稳定整合的Wt VpVAN、密码子优化以用于酵母表达的VpVAN、缺失信号肽的截短的VpVAN(wt vpΔsp van)以及用具有缺失信号肽且密码子优化以用于酵母表达的截短的VpVAN(vpΔsp van)的酵母进行的生物合成研究的结果。将酵母菌株与不同的推定底物在合成培养基中孵育72小时，之后通过LC-MS测定代谢物谱。用供应有阿魏酸的酵母来观察香草醛葡糖苷的形成。(EIC 337-提取离子色谱图m/z香草醛葡糖苷mw+22)。
(a)Wt VpVAN
(b)密码子优化以用于酵母表达的VpVAN
(c)wt vpΔsp van-缺失信号肽的Wt VpVAN
(d)vp△sp van-缺失信号肽的且密码子优化以用于酵母表达的VpVAN
(e)阴性对照(酵母菌株Y06460)
图4示出了用阿魏酸和阿魏酸葡糖苷测试的VpVAN的底物特异性。LC-MS提取离子色谱图示出了VpVAN能够催化阿魏酸和阿魏酸葡糖苷两者的链断裂。(EIC 337-提取离子色谱图m/z香草醛葡糖苷mw+22)。
(a)供应有阿魏酸的阴性对照
(b)供应有阿魏酸的VpVAN：：VpUGT72U1
(c)供应有阿魏酸的VpVAN
(d)供应有阿魏酸的VpVAN：：AtUGT72E2
(e)供应有阿魏酸葡糖苷的阴性对照
(f)供应有阿魏酸葡糖苷的VpVAN：：VpUGT72
(g)供应有阿魏酸葡糖苷的VpVAN
(h)供应有阿魏酸葡糖苷的VpVAN：：AtUGT72E2
图5示出在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中瞬时表达之后，香草醛合酶的生物学活性。将VpVAN转移到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中并将其与包含p19基因沉默抑制子的根癌农杆菌菌株共浸润到本氏烟草叶中。在接种之后四天，收获共浸润的烟草叶并通过LC-MS进行代谢物谱分析。该谱示出了VpVAN依赖的香草醇葡糖苷的形成。(EIC 339-提取离子色谱图m/z香草醇葡糖苷(vanillin alcohol glucoside)mw+22)。
图6示出了来自体外的偶联转录和翻译(TNT)测定的LC-MS色谱图。该图示出了在体外与阿魏酸葡糖苷孵育之后产生显著量的香草醛葡糖苷(在6分钟处出峰)。
(a)Wt VpVAN(SEQ ID NO：1)
(b)wt vp△sp van(SEQ ID NO：1的第22-356位氨基酸)
(c)vp△137van(SEQ ID NO：1的第138-356位氨基酸)
(d)vp△61van(SEQ ID NO：1的第62-356位氨基酸)
(e)阴性对照
图7A)示出了在本氏烟草叶中瞬时表达之后，香草醛合酶的生物学活性。本氏烟草已用编码以下的核酸转化：
a)Wt VpVAN(SEQ ID NO：1)
b)wt vpΔ137van(SEQ ID NO：1的第138-356位氨基酸)
c)wt vpΔ66van(SEQ ID NO：1的第138-356位氨基酸)
d)阴性对照(p19浸润的烟草叶)
该图示出了香草醇葡糖苷的形成。在表达香草醛合酶或截短的香草醛合酶的提取物中的(EIC 339-提取离子色谱m/z香草醇葡糖苷mw+22)。
图7B示出了在本氏烟草叶中瞬时表达之后，与野生型VpVAN相比，嵌合的香草醛合酶的生物学活性。本氏烟草已用编码以下的核酸转化：
a)嵌合的香草醛合酶(vp nb△sp△137van)(参见实施例8)
b)Wt VpVAN(SEQ ID NO：1)
c)阴性对照(p19浸润的烟草叶)
该图示出了a)中大多数香草醇葡糖苷的形成。在表达香草醛合酶或截短的香草醛合酶的提取物中的(EIC 339-提取离子色谱图m/z香草醇葡糖苷mw+22)。
图8示出了在本氏烟草叶中瞬时表达之后，欧活血丹(Glechomahederacea)的香草醛合酶(GhVAN)的生物学活性。本氏烟草已用编码GhVAN的核酸转化(上图)。下图示出了阴性对照。该图示出了香草醇葡糖苷的形成。
图9示出了在表达VpVAN(SEQ ID NO：1)的酵母中产生4-乙烯基愈创木酚葡糖苷以及在表达VpVAN(SEQ ID NO：1)且缺失pad1和fad1基因的酵母中不存在该不期望的副产物。
图10示出本氏烟草的半胱氨酸蛋白酶和香荚兰的香草醛合酶(VpVAN)之间的比对。在下面给出了两个序列之间的共有序列。通过＊标记非保守的氨基酸。
图11示出了欧活血丹的香草醛合酶(GhVAN)和香荚兰的香草醛合酶(VpVAN)之间的比对。在下面给出了两个序列之间的共有序列。通过＊标记非保守的氨基酸。
图12示出了当在包含2.5mM阿魏酸的合成培养基上培养时，表达拟南芥UGT72E2(SEQ ID NO：3)的酵母细胞合成阿魏酸葡糖苷。
发明详述
香草醛合酶
本发明涉及香草醛合酶及其用途。因此，本发明特别地涉及使用根据本发明的表达香草醛合酶的宿主生物来产生香草醛或香草醛葡糖苷的方法。所述宿主生物可以是在下文“微生物”部分中所描述的任意一种宿主生物或者所述宿主生物可以是在下文“植物”部分中所描述的任意一种植物。一般而言，所述宿主生物将包含编码香草醛合酶的异源核酸并且还任选地包含如下文所述的一种或更多种其他的异源核酸。
根据本发明的香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶。特别地，优选的是，根据本发明的香草醛合酶是能够在植物体内催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶。还优选的是，香草醛合酶是能够在微生物内催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶。
本文中使用的术语香草醛是指3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，其具有以下结构：
在下文“阿魏酸”部分中提供了阿魏酸的结构。
用于本发明的香草醛合酶可以是来自任何合适来源的香草醛合酶，优选地，所述香草醛合酶是植物的香草醛合酶，其中所述植物天然地产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷。因此，在一个实施方案中，所述香草醛合酶是香荚兰的香草醛合酶。
因此，用于本发明的优选的香草醛合酶是SEQ ID NO：1的香草醛合酶或与其共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。优选地，香草醛合酶是SEQ IDNO：1的香草醛合酶。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的来计算。给定序列的香草醛合酶的功能同源物共享上述序列同一性并且能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来鉴定其他可用的香草醛合酶，例如通过包括以下步骤的方法：
a)提供植物，其产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷，
b)从所述植物中获得核酸(例如DNA或cDNA)，
c)鉴定编码具有与SEQ ID NO：1至少50％、例如至少60％、例如至少70％序列同一性之序列的多肽的核酸，
d)测试由所述核酸编码的多肽是否能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
所述方法还可包括以下步骤：
b)提供来自植物的核酸的序列信息，所述植物产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷，
c)鉴定编码具有与SEQ ID NO：1至少50％、例如至少60％、例如至少70％序列同一性之序列的多肽的核酸，
d)测试由所述核酸编码的多肽是否能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
如果如在上述任一个步骤d)中所测试的多肽能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛，则所述多肽是香草醛合酶，其可用于本发明。
用于本发明的另一种香草醛合酶是SEQ ID NO：21的香草醛合酶或与其共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。优选地，香草醛合酶是SEQ IDNO：21的香草醛合酶。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的来计算。给定序列的香草醛合酶的功能同源物共享上述序列同一性并且能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
除了共享上述的序列同一性之外，另外还优选的是，功能同源物保留尽可能多的在不同香草醛合酶之间保守的氨基酸。因此，优选的是，SEQID NO：1的功能同源物包含至少90％，更优选为至少95％，还更优选至少98％的，例如图11的共有序列的所有氨基酸，例如至少90％，更优选为至少95％，还更优选为至少98％的，例如在图11中所示的比对中未以＊标记的所有氨基酸。
类似地，优选的是，SEQ ID NO：21的功能同源物包含图11的共有序列的至少90％，更优选为至少95％、还更优选为至少98％、例如所有的氨基酸，在图11中所示的比对中未以＊标记的例如至少90％，更优选为至少95％、还更优选为至少98％、例如所有的氨基酸。
用于本发明的香草醛合酶还可以是缺失信号肽的香草醛合酶。这特别是在其中将编码香草醛合酶的核酸序列引入微生物细胞的本发明的实施方案的情况下。因此，在一个优选实施方案中，用于本发明的香草醛合酶是缺失全部或至少部分信号肽的香草醛合酶，所述信号肽指导蛋白质进入植物的内质网。因此，香草醛合酶可包含至少SEQ ID NO：1的第22至356位氨基酸或甚至由SEQ ID NO：1的第22至356位氨基酸组成或者包含与其共享至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％序列同一性的其功能同源物。在一个实施方案中，用于本发明的香草醛合酶是SEQ ID NO：17的香草醛合酶或与其共享至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。
用于本发明的香草醛合酶还可以是截短的香草醛合酶，其能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。因此，香草醛合酶可缺失一个或更多个N端氨基酸，例如香草醛合酶可以是：
a.缺失最N端1至150个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
b.缺失最N端21至137个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
c.缺失最N端120至140个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
d.缺失最N端130至140个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
e.缺失最N端21至140个氨基酸的SEQ ID NO：21的香草醛合酶，
f.缺失最N端21个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
g.缺失最N端61个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
h.缺失最N端137个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
i.缺失最N端21个氨基酸的SEQ ID NO：21的香草醛合酶，
j.缺失最N端140个氨基酸的SEQ ID NO：21的香草醛合酶，
k.与a)至j)中任一项共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％序列同一性的功能同源物，其中所述功能同源物能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
还包括在本发明中的是，截短香草醛合酶可以是：
a)包含SEQ ID NO：1的第22至356位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
b)包含SEQ ID NO：1的第138至356位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
c)包含SEQ ID NO：21的第22至359位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
d)包含SEQ ID NO：21的第141至359位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
e)与a)至d)中任一项共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％序列同一性的功能同源物，其中所述功能同源物能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
在本发明的另一个实施方案中，香草醛合酶是包含来自天然香草醛合酶的序列以及其他序列的嵌合蛋白质。在本发明的这些实施方案中，香草醛合酶可以是下式的多肽：
[信号肽]-X-[断裂位点]-[截短的香草醛合酶]
所述信号肽可以是任何信号肽。本领域的技术人员能够例如使用易于从丹麦技术大学生物学序列分析中心获得的SignalP 4.1软件来鉴定信号肽。
特别地，优选的是，所述信号肽是对宿主生物(即，含有编码所述香草醛合酶的异源核酸的宿主生物)为内源性的信号肽。更优选地，所述信号肽是来自对宿主生物为内源性的半胱氨酸蛋白酶的信号肽。甚至更优选地，所述信号肽是来自属于CA氏族(Clan CA)、更优选地属于C1家族(Family C1)、甚至更优选地属于A亚族(Subfamily A)的半胱氨酸蛋白酶的信号肽，其中所述半胱氨酸蛋白酶是对宿主生物为内源性的。所述氏族、家族和亚族如由MEROPS数据库所定义的。例如，半胱氨酸蛋白酶可以是属于aleurain半胱氨酸蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶。上述关于来自半胱氨酸蛋白酶的信号肽特别适用于其中所述宿主生物是植物的本发明的一些实施方案。
因此，可通过包括以下步骤的方法来鉴定所述信号肽：
a)提供编码多肽的核酸或者编码多肽的核酸的序列信息或所述宿主生物的多肽的序列信息，
b)鉴定具有与SEQ ID NO：1至少50％、例如至少60％、例如至少70％序列同一性的序列的多肽，并且所述多肽是半胱氨酸蛋白酶，
c)例如使用SignalP 4.1软件来鉴定所述半胱氨酸蛋白酶的信号肽，从而鉴定信号肽。
X可以是连接信号肽与断裂位点的任何接头序列。在一个实施方案中，所述接头序列X可以是来自天然香草醛合酶的序列。因此，例如X可以是SEQ ID NO：1的第22至134位氨基酸或与其在整个长度上共享至少70％、例如至少80％、至少例如85％、例如至少90％、例如至少95％，例如至少98％序列同一性的其功能同源物。
断裂位点可以是任何蛋白酶断裂位点。特别地，优选的是，所述断裂位点是对宿主生物内源性的。更优选地，所述断裂位点是来自对宿主生物内源性的半胱氨酸蛋白酶的断裂位点。甚至更优选地，所述断裂位点是来自属于CA氏族、更优选地是属于C1家族、甚至更优选地是属于A亚族的半胱氨酸蛋白酶的断裂位点，其中所述半胱氨酸蛋白酶是对宿主生物内源性的。所述氏族、家族和亚族如由MEROPS数据库所定义的。例如，半胱氨酸蛋白酶可以是属于aleurain半胱氨酸蛋白酶类的半胱氨酸蛋白酶。上述关于来自半胱氨酸蛋白酶的断裂位点特别适用于其中所述宿主生物是植物的本发明的实一些施方案。
可通过包括以下步骤的方法来鉴定断裂位点：
a)提供编码多肽的核酸或者编码多肽的核酸的序列信息或所述宿主生物的多肽的序列信息，
b)鉴定具有与SEQ ID NO：1至少50％、例如至少60％、例如至少70％序列同一性的多肽，并且所述多肽是半胱氨酸蛋白酶，
c)准备SEQ ID NO：1与根据b)所鉴定的所述多肽之间的比对，
d)鉴定所述多肽中对应于SEQ ID NO：1的第135至141位氨基酸的氨基酸，其中对应于SEQ ID NO：1的第135至141位氨基酸的氨基酸是断裂位点。
截短的香草醛合酶可以是上文所述的截短的香草醛合酶的任意一种。特别地，所述截短的香草醛合酶可包含SEQ IDNO：1的第142至356位氨基酸或由SEQ ID NO：1的第142至356位氨基酸组成或者包含与其在全长上共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％的序列同一性的其功能同源物。
所述异源核酸可以是编码在本部分所述的香草醛合酶的任何异源核酸。例如，异源核酸可以是包含SEQ ID NO：2的核酸或者能够与SEQ IDNO：2的互补序列杂交的核酸。
然而，在本发明的一些优选实施方案中，已经将编码香草醛合酶的异源核酸完全地或部分地进行密码子优化以用于包含异源核酸的特定的微生物。用于此目的几个软件包是公众可获取的，例如在Puigbò等，2007，OPTIMIZER：A web server for optimizing the codon usage of DNAsequences，Nucleic Acids Research，35：W126-W131和Puigbò等，2008，HEG-DB：a database of predict highly expressed genes in prokaryoticcomplete genomes under translational selection，Nucleic Acids Research.36：D524-7中描述的“Optimizer”或者在Grote等，2005，JCat：a novel toolto adapt codon usage of a target gene to its potential expression host，Nucleic Acids Research，第33卷，增刊第2期，第W526-W531页中描述的“JCat”或者在Supek F和Vlahovicek K：Comparison of codon usagemeasures and their applicability in prediction of microbial geneexpressivity；BMC Bioinformatics(2005)6：182中描述的“INCA”。
因此，在涉及使用微生物的本发明的一些实施方案中，可将编码香草醛合酶的异源核酸进行密码子优化以用于所使用的特定的微生物。因此，可将编码香草醛合酶的异源核酸部分地进行密码子优化以用于所使用的特定微生物，或者可将编码香草醛合酶的异源核酸完全地进行密码子优化以用于所使用的特定的微生物。例如，在涉及使用酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))的本发明的一些实施方案中，则可将编码香草醛合酶的异源核酸进行密码子优化以用于酵母，例如用于酿酒酵母，例如，编码香草醛合酶的异源核酸可包含SEQ ID NO：18或者甚至由SEQ ID NO：18组成。
方法
在一方面，本发明涉及用于产生香草醛的方法。所述方法包括使用香草醛合酶，所述香草醛合酶可以是在上文“香草醛合酶”部分中所描述的任意一种香草醛合酶。一般而言，所述方法包括使用表达香草醛合酶的宿主生物。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及产生香草醛、香草醇和/或其葡糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其中所述微生物
i.能够产生阿魏酸和/或阿魏酸衍生物；并且
ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ ID NO：1的(VpVAN)或与其共享至少70％、例如至少80％序列同一性的其功能同源物；以及
b)在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。
在该实施方案中，所述微生物可以是在下文“微生物”部分中所描述的任意一种微生物。所述微生物能够产生阿魏酸或阿魏酸衍生物(例如，阿魏酸葡糖苷)。优选地，所述微生物能够产生阿魏酸。这可以以多种方式来实现。例如，所述微生物可包含编码参与阿魏酸合成的一种或更多种酶的核酸序列，例如在下文“参与合成阿魏酸的酶”部分中所述的任意一种酶。编码香草醛合酶的核酸可编码在上文“香草醛合酶”部分所描述的任意一种香草醛合酶。优选的是，所述方法是制备香草醛的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及产生香草醛、香草醇和/或其葡糖苷的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其中所述微生物包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ ID NO：1的(VpVAN)或与其共享至少70％，例如至少80％序列同一性的其功能同源物；以及
b)在阿魏酸或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛和/或香草醛葡糖苷。
在该实施方案中，所述微生物可以是在下文“微生物”部分中所描述的任意一种微生物。编码香草醛合酶的核酸可以编码在上文“香草醛合酶”部分中所述的任意一种香草醛合酶。所述培养基可包含来源于任何合适来源的阿魏酸和/或所述培养基可包含阿魏酸衍生物，例如阿魏酸葡糖苷。特别地，可以以在下文“阿魏酸”部分所描述的任意一种方式来提供所述阿魏酸。优选地，所述方法是产生香草醛的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其中所述微生物
i.能够产生阿魏酸和/或阿魏酸衍生物；并且
ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ ID NO：1的(VpVAN)或与其共享至少70％，例如至少80％序列同一性的其功能同源物；并且
iii.能够使香草醛葡糖基化；以及
b)在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
c)从所述微生物中和/或从所述培养基中分离香草醛葡糖苷；以及
d)使所述香草醛葡糖苷去葡糖基化。
在该实施方案中，所述微生物可以是在下文“微生物”部分所描述的任意一种微生物。所述微生物能够产生阿魏酸或阿魏酸衍生物(例如，阿魏酸葡糖苷)。优选地，所述微生物能够产生阿魏酸。这可以以多种方式来实现。例如，所述微生物可包含编码参与阿魏酸合成的一种或更多种酶的核酸，例如在下文“参与合成阿魏酸的酶”部分中所描述的任意一种酶。所述微生物还能够使香草醛葡糖基化。这可以以多种方式来实现。例如，所述微生物可包含编码葡糖基转移酶的核酸序列，优选地，所述微生物包含编码在下文“糖基转移酶”部分中所描述的任意一种葡糖基转移酶的核酸序列。编码香草醛合酶的核酸可以是编码在上文“香草醛合酶”部分中所描述的任意一种香草醛合酶。可按下文所述进行所述香草醛葡糖苷的去葡糖基化。
在另一个实施方案中，本发明涉及产生香草醛的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其中所述微生物
i.包含编码香草醛合酶的异源核酸序列，其中所述的香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，例如SEQ IDNO：1的(VpVAN)或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物；并且
iii.能够使香草醛葡糖基化；以及
b)在阿魏酸或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
c)从所述微生物中和/或从所述培养基中分离香草醛葡糖苷；以及
d)使所述香草醛葡糖苷去葡糖基化。
在该实施方案中，所述微生物可以是在下文“微生物”部分中所描述的任意一种微生物。编码香草醛合酶的核酸可以编码在上文“香草醛合酶”部分中所描述的任意一种香草醛合酶。所述培养基可包含阿魏酸和/或阿魏酸衍生物(例如，阿魏酸葡糖苷)。优选地，所述培养基包含阿魏酸。所述阿魏酸可来源于任何合适的来源，特别地，可以以在下文“阿魏酸”部分所描述的任意一种方式来提供所述阿魏酸。可按下文所述进行香草醛葡糖苷的去葡糖基化。
可在适于培养微生物的任何培养基中培养所述微生物。技术人员能够根据特定的微生物而选择合适的培养基。特别地，应选择培养条件以使得香草醛合酶在所述微生物中表达。可使所述微生物以补料分批或者连续的方法进行培养。通常，在限定的温度下，使所述微生物在发酵罐中培养期望的时间段。根据在方法中所使用的特定的微生物，还可存在并表达编码参与阿魏酸合成的酶和/或葡糖苷转移酶的其他异源核酸。
在一些实施方案中，可使用供应阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的全细胞来产生香草醛或香草醛葡糖苷，所述阿魏酸和/或阿魏酸衍生物可以以在下文“阿魏酸”部分中所描述的任意一种方式来提供。在培养基中包含阿魏酸，所述阿魏酸可在细胞培养期间或细胞培养之后供应。优选地，所述培养基包含阿魏酸。所述微生物可以在悬浮液中培养或固定化培养。在其中所述微生物是细菌或真菌(例如酵母)的本发明的一些实施方案中，则优选地，微生物是在悬液中培养的。
在本发明的一个实施方案中，优选的是，培养基不含高水平的香豆酸，例如，培养基可包含至多1mM、例如至多0.5mM、例如至多0.01mM、例如不可检出的香豆酸。
在本发明的一个实施方案中，优选的是，在不太还原性的条件下产生香草醛。因此，在一个实施方案中，优选的是，培养基包含小于5mM、优选地小于3mM DTT。在其中在体外制备香草醛的本发明的一些实施方案中，优选的是，在至多5mM、优选地至多3mM DTT的存在下，将阿魏酸和/或阿魏酸衍生物与香草醛合酶进行孵育。
所述方法涉及产生香草醛或香草醛葡糖苷，所述香草醛葡糖苷优选为香草醛β-D-葡糖苷。所产生的香草醛或香草醛葡糖苷的量可以为约1mg/L至约1500mg/L或更高。例如，约1mg/L至约10mg/L、约3mg/L至约10mg/L、约5mg/L至约20mg/L、约10mg/L至约50mg/L、约10mg/L至约100mg/L、约25mg/L至约500mg/L、约100mg/L至约1,500mg/L、或约200mg/L至约1,000mg/L的香草醛或香草醛葡糖苷，或者可产生约250mg/L至约5,000mg/L、约1,000mg/L至约15,000mg/L、或约2,000mg/L至约10,000mg/L、约2000mg/L至约50000mg/L或甚至约2,000mg/L至约100000mg/L或甚至约5000mg/L至200,000mg/L。一般而言，较长的培养时间会导致更大量的产物。因此，可将微生物培养1天至7天、1天至5天、3天至5天、约3天、约4天、或约5天。
在将所述微生物在培养物中培养期望的时间段之后，则可使用本领域中已知的任何可用的技术从培养物中回收香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。例如，用于分离香草醛和/或香草醛葡糖苷的方法可包括渗滤技术或超临界二氧化碳萃取以及用于浓缩的反渗透法。还可通过包括通过萃取、真空蒸馏和从水溶液中多级重结晶以及超滤的分离和纯化的方法来回收香草醛和/或香草醛葡糖苷(例如，如Boddeker等(1997)J.Membrane Sci.137：155-158；Borges da Silva等(2009)Chem.Eng.Des.87：1276-1292中所述)。还可将两相萃取方法(采用巯基化合物例如二硫苏糖醇、二硫赤藓醇、谷胱甘肽或者L-半胱氨酸(美国专利No.5,128,253)或者碱性KOH溶液(WO 94/13614))用于回收香草醛和/或香草醛葡糖苷以及用于从其他芳香族物质中对其进行分离。还可将使用聚醚-聚酰胺共聚物膜从生物转化介质中来吸附和渗透蒸发香草醛用于分离香草醛和/或香草醛葡糖苷(例如，如由Boddeker等(1997)同上；或Zucchi等(1998)J.Microbiol.Biotechnol.8：719-′22所述)。还可将具有交联聚苯乙烯骨架的大孔吸附树脂用于从水溶液中回收溶解的香草醛和/或香草醛葡糖苷(Zhang等.(2008)Eur.Food Res.Technol.226：377-383)。还可将超滤和膜接触器(MC)技术用于回收香草醛和/或香草醛葡糖苷(Zabkova等，(2007)J.Membr.Sci.301：221-237；Scuibba等(2009)Desalination 241：357-364)。或者，可使用常规技术，例如渗滤或超临界二氧化碳萃取以及用于浓缩的反渗透。
如果重组宿主是植物或植物细胞，可使用本领域已知的多种技术从植物组织中提取香草醛或香草醛葡糖苷。
在一些实施方案中，将所述香草醛或香草醛葡糖苷分离并纯化至均质(例如，至少90％、92％、94％、96％或98％的纯度)。在另一些实施方案中，作为微生物的提取物来提供所述香草醛或香草醛葡糖苷。在这一方面，可以分离香草醛或香草醛葡糖苷，但不一定纯化至均质。
例如，分离且任选地纯化的香草醛或香草醛葡糖苷的提取物可用于调味消费品，例如食物产品、膳食补充剂、营养品、药物组合物、牙齿保健组合物和化妆品。
在本发明的一些实施方案中，其中所述微生物能够使香草醛去葡糖基化，则所述方法可能经常还包括使所述香草醛葡糖苷去葡糖基化的步骤。该步骤可在分离香草醛葡糖苷之前进行或在分离香草醛葡糖苷之后进行。
可根据本领域中已知的方法通过化学水解或者通过例如使用具有葡糖苷酶活性之酶的酶促方法来进行该步骤。特别地，可使用β-葡糖苷酶。许多合适的β-糖苷酶是技术人员已知的。可例如通过以下步骤实现去葡糖基化：首先，例如通过在合适的溶剂(例如甲醇)中对其进行萃取从而回收香草醛葡糖苷，或者通过在从产生的微生物或植物中分泌之后收集香草醛葡糖苷。其次，可纯化葡糖基化的中间体并使其在体外暴露于β-葡糖苷酶或暴露于适当的化学水解。
可以以多种形式提供葡糖苷酶，例如，可以以表达葡糖苷酶并且优选地分泌所述葡糖苷酶的微生物的形式来提供葡糖苷酶。这样的微生物可与包含本发明的香草醛合酶的微生物一起共培养。还可以以表达葡糖苷酶的生物之提取物的形式提供葡糖苷酶。所述提取物可以是粗提取物或部分纯化的提取物。还可以作为纯化的酶来提供葡糖苷酶。在其中作为提取物、粗提物或作为纯化酶来提供葡糖苷酶的一些实施方案中，则在培养包含香草醛合酶的微生物期间，可将葡糖苷酶直接添加到培养基中。然而，优选地，其在培养之后添加。因此，可以在培养包含香草醛合酶的微生物之后，将葡糖苷酶直接添加到培养基中，或者可将其添加到部分纯化的香草醛葡糖苷中或甚至纯化的香草醛葡糖苷中。因此，可用所述提取物、所述部分纯化的提取物或所述纯化的葡糖苷酶来处理经分离的香草醛葡糖苷。
香草醛的葡糖基化也可促进分离：可通过两相分配移除在积累香草醛葡糖苷的培养基中的疏水杂质，其中香草醛葡糖苷将分配到水相中而疏水杂质可分配到有机相中。去葡糖基化(例如通过β-葡糖苷酶处理)之后，可重复两相分配过程以完成亲水污染物的移除。
因此，所述纯化可包括以下步骤：
a)在培养之后获得包含香草醛葡糖苷的微生物的培养基和/或提取物和/或获得包含香草醛葡糖苷的植物的提取物；以及
b)使所述培养基或提取物与有机相接触并混合，
c)从有机相中分离水相；以及
d)弃去有机相；以及
e)使香草醛葡糖苷去葡糖基化，例如，通过葡糖苷酶处理，例如，如上文所述的葡糖苷酶处理，从而获得包含香草醛的液体；以及
f)使所述包含香草醛的液体与有机相接触并混合；以及
g)回收包含香草醛的有机相；以及
h)任选地进一步从所述有机相中纯化香草醛。
所述有机相可以是任何可用的有机相，例如，所述有机相可由己烷、乙醚、乙酸乙酯或氯仿构成。
在一个实施方案中，本发明涉及产生香草醛、香草醇和/或其葡糖苷的方法，所述方法包括：
a)提供植物，所述植物包含编码SEQ ID NO：1的VpVAN或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物的异源核酸；以及
b)培养所述植物；以及
c)从所述植物中分离香草醛、香草醇和/或其葡糖苷。
在该实施方案中，所述植物可以是在下文“植物”部分中所描述的任意一种植物。编码香草醛合酶的核酸可编码在上文“香草醛合酶”部分中所描述的任意一种香草醛合酶。在一个优选的实施方案中，所述方法是产生香草醛的方法。
在另一个实施方案中，本发明涉及产生香草醛葡糖苷的方法，所述方法包括：
a)提供植物，所述植物包含编码SEQ ID NO：1的VpVAN或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物的异源核酸；以及
b)培养所述植物；以及
c)从所述植物中分离香草醛葡糖苷，
d)使所述香草醛葡糖苷去葡糖基化。
可以以适于培养特定植物的任何方式培养所述植物。技术人员将能够选择用于培养特定植物的合适条件。
可从植物的任何可用部分，例如从叶、从果实、从种子、从根或从茎中分离香草醛、香草醇和/或香草醛葡糖苷。经常地，可从植物的叶、种子或果实中分离香草醛、香草醇或香草醛葡糖苷。例如，在其中植物是红花烟草的本发明的一些实施方案中，则可从叶中分离香草醛或香草醛葡糖苷。通常，分离包括提取的步骤，然后其可任选地跟随一个或更多个纯化的步骤，例如在该部分上文中所描述的任何纯化步骤。也可按该部分上文中所描述的方法使香草醛葡糖苷去葡糖基化。
在一个实施方案中，优选的是，与不包含编码所述香草醛合酶的异源核酸的同一植物相比，所述植物产生至少3倍、例如至少4倍、例如至少5倍、例如至少10倍更多的香草醛。
按照本发明的描述所制备的包含香草醛的提取物或者经分离香草醛例如可用于调味消费品，例如食品、膳食补充剂、营养保健品、药物组合物、牙齿保健组合物和化妆品。在WO2013/022881中第[0030]至[0046]段中描述了此类消费品的有用实例。WO2013/022881通过引用并入本文。
微生物
在一个方面中，本发明涉及包含编码香草醛合酶的异源核酸的微生物以及其在产生香草醛和/或香草醛葡糖苷中的用途。所述香草醛合酶可以是在上文“香草醛合酶”部分中所描述的任意一种香草醛合酶。
除了编码所述香草醛合酶的异源核酸之外，所述微生物还可包含另外的异源核酸，例如编码参与阿魏酸合成的一种或更多种酶(例如，在下文“参与阿魏酸合成的酶”部分中所描述的参与阿魏合成的任意一种酶)或者葡糖基转移酶(例如，在下文“葡糖基转移酶”部分中所描述的任意一种葡糖基转移酶)的异源核酸。
应当理解的是，本文所讨论的多种基因和模块(module)可存在于两种或更多种微生物中，而不是单一的微生物中。因此，例如，一种微生物可包含编码参与阿魏酸合成的酶的一种或更多种异源核酸，使得所述微生物能产生阿魏酸，而另一种微生物可包含编码香草醛合酶的异源核酸。当使用多种微生物时，可使其培养在混合培养物中以产生香草醛和/或香草醛葡糖苷。在这种情况下，合适转运体的共表达可有利于将中间体导出到生长培养基中并促进摄取到产生香草醛或香草醛葡糖苷的微生物中。
本发明的微生物细胞可以是适于异源核酸表达的任何细胞。在一个实施方案中，本发明的微生物细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞，例如酵母或丝状真菌。特别地，所述宿主细胞可以是酵母细胞。
在另一个实施方案中，所述酵母细胞选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、光滑假丝酵母(Candida glabrata)、棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)、产朊假丝酵母(Cyberlindnera jadinii)和白色念珠菌(Candida albicans)。一般而言，酵母和真菌是可用于本发明的优良的微生物细胞。其提供所期望的容易的遗传操作并且在廉价培养基上迅速生长至高细胞密度。例如，酵母在广泛范围的碳源上生长，并且不限于葡萄糖。因此，用于本发明的微生物可选自以下所述的酵母的组：
Arxula adeninivorans(Blastobotrys adeninivorans)是具有独特的生化特性的二态酵母(其在高达42℃的温度下作为像面包酵母一样的芽殖酵母生长，超过该阈值其以丝状的形式生长)。其可以在广泛范围的底物上生长并且可吸收硝酸盐。已将其成功地应用于生成可产生天然塑料的菌株或开发用于环境样品中雌激素的生物传感器。
博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)是甲基营养型酵母(Methylotrophic yeast)(其可以在甲醇中生长)。像其他的甲基营养型物种例如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)一样，其提供了用于产生异源蛋白质的优良平台。已经报道了所分泌的外源蛋白质的产量在克数范围内。计算方法，IPRO，最近预测了将博伊丁氏假丝酵母木糖还原酶的辅因子特异性从NADPH实验性地转换到NADH之突变。将在以下文件中概述如何下载执行Python和预测的实验测试的软件的详细信息。
多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha，安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta))是另一种甲基营养型酵母(参见博伊丁氏假丝酵母)。此外，其还可在广泛范围的其他基质上生长；其是耐热的并且能吸收硝酸盐(也参见乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))。已将其应用于产生乙型肝炎疫苗、胰岛素和用于治疗丙型肝炎的干扰素α-2a，此外还应用于一系列技术酶。
乳酸克鲁维酵母是常规用于产生酸乳酒曲(kefir)的酵母。其可在数种糖上生长，最重要的是在存在于乳和乳清中的乳糖上生长。除此之外，已将其成功地应用于产生凝乳酶(通常存在于小牛胃中的酶)从而用于产生奶酪。在发酵罐中的生产为40,000L的规模。
巴斯德毕赤酵母是甲基营养型酵母(参见博伊丁氏假丝酵母和多形汉逊酵母)。其提供了用于产生外源蛋白质的高效平台。平台元件可用作试剂盒，将其在全球范围内用于学术界以用于产生蛋白质。已改造菌株使其可产生复杂的人N-聚糖(酵母聚糖是类似的但与见于人类中的那些并不相同)。
酿酒酵母是已知用于酿造和烘烤以及用于产生醇的传统面包酵母。作为蛋白质工厂，已将其已经成功地应用于产生技术酶和产生像胰岛素和乙型肝炎疫苗那样的药品。
解脂耶氏酵母是可在广泛范围的基质上生长的二态酵母(参见Arxula adeninivorans)。其具有高潜力的工业应用性，但还没有市售的重组产品。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞是微藻(microalgae)，例如小球藻属(Chlorella)和原壁菌属(Prototheca)。
在本发明的另一个实施方案中，所述宿主细胞是丝状真菌，例如曲霉。
在本发明的另一个实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞。所述宿主细胞可以是高等植物的细胞，但是所述宿主细胞还可以是来自不属于高等植物的生物的细胞，例如来自藓类小立碗藓(Physcomitrella patens)的细胞。
在另一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞、猫细胞、猪细胞、猿猴细胞、犬细胞、鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或兔细胞。
所述宿主细胞还可选自CHO细胞、CHO-K1细胞、HEI193T细胞、HEK293细胞、COS细胞、PC12细胞、HiB5细胞、RN33b细胞、BHK细胞。
如上所提及的，所述宿主细胞还可以是原核细胞，例如细菌细胞。如果所述细胞是原核细胞，则所述细胞可以选自但不限制于大肠杆菌(E.coli)、棒状杆菌(Corynebacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)和链霉菌(Streptomyces)细胞。
植物
在一些实施方案中，将编码本发明的香草醛合酶的核酸引入植物或植物细胞中以实现在所述植物或植物细胞中产生香草醛或香草醛葡糖苷或香草醇或香草醇糖苷。特别地，可将所述核酸引入到除了香荚兰之外的植物中以在这些植物中获得香草醛的产生。
除了编码香草醛合酶的异源核酸之外，所述植物还包含其他的异源核酸，例如编码参与阿魏酸合成的一种或更多种酶或葡糖基转移酶的异源核酸。
可通过将异源核酸整合到植物或植物细胞基因组中将其转化，即，可将其稳定转化。通常，稳定转化的细胞在每次细胞分裂中保留了所引入的核酸。还可将植物或植物细胞瞬时转化以使得未将所述重组基因整合到其基因组中。通常，瞬时转化的细胞在每次细胞分裂中失去全部或部分所引入的核酸，以使得在进行一定数量的细胞分裂之后不能在子细胞中检测到所引入的核酸。可将瞬时转化和稳定转化两者的转基因植物和植物细胞用于本文所述的方法中。
用于本文所述的方法中的包含编码香草醛合酶的核酸的植物细胞可构成整个植物的一部分或全部。可以以适于所考虑的物种的方式将这样的植物在生长室、温室/或田地中培育。植物还可以是包含编码香草醛合酶的核酸的初始的植物的后代，只要所述后代遗传异源核酸即可。可将通过转基因植物产生的种子培育，然后自交(或异型杂交和自交)以获得对于核酸构建体来说纯合的种子。
可将用于本发明的植物在悬浮培养物或组织或器官培养物中培育。为了本发明的目的，可以使用固体和/或液体组织培养技术。当使用固体培养基时，可将植物细胞直接放置在培养基上或可将其放置在过滤器上，然后将所述过滤器与培养基相接触。当使用液体培养基时，可将转基因植物细胞放置到浮选装置上，例如，与液体培养基相接触的多孔膜。
当使用瞬时转化的植物细胞时，可将编码具有报道分子(reporter)活性的报道多肽的报道序列包含在转化过程中，在转化之后的适当时间内可进行报告活性或表达的测定。进行测定的合适的时间通常是转化后的约1天至21天，例如约1天至14天、约1天至7天、或约1天至3天。瞬时测定的使用对于在不同物种中进行迅速分析或者确认异源多肽的表达(其表达先前没有在特定的接受体细胞中被证实)是特别方便的。
将核酸引入单子叶植物和双子叶植物的技术是本领域中已知的，并且包括但不限制于：农杆菌(Agrobacterium)介导的转化、病毒载体介导的转化、电穿孔和粒子枪转化，美国专利No.5,538,880；No.5,204,253；No.6,329,571；和No.6,013,863。如果将细胞或培养的组织用作用于转化的接受体组织，则如期望，可通过本领域技术人员已知的技术将植物从转化的培养物中再生。可将编码香草醛合酶的异源核酸引入到谷类植物(例如大麦)中，如由Hebelstrup等(2010)UCE：A uracil excision(USER(TM))-based toolbox for transformation of cereals.Plant Methods，6：15或由Holme等(2012)Cisgenic barley with improved phytase activity.Plant Biotechnol J 10，237-247所述。
可在植物种群中筛选和/或选择那些携带编码香草醛合酶的异源核酸的那些种群成员。例如，可在单个转化事件的后代种群中筛选具有所期望的表达水平的香草醛合酶的那些植物。可将物理和生物化学方法用于确定表达水平。这些方法包括用于检测多核苷酸的Southern分析或PCR扩增；用于检测RNA转录物的Northern印迹、S1 RNA酶保护、引物延伸或RT-PCR扩增；用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶测定；以及检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定法。其他技术，例如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测多肽和/或核酸的存在或表达。进行所有所引用技术的方法是已知的。作为一个替代方案，可在包含独立转化事件的植物群体中筛选携带所有和/或表达所有的不同的异源核酸的那些植物。可经过一代或更多代和/或在多于一个地理位置上进行选择和/或筛选。在一些情况下，可在植物中诱导期望的表型或者其他产生期望表型所必需的条件下培育和选择所述植物。此外，可在其中期望通过植物来表达异源核酸的特定发育阶段期间施加选择和/或筛选。可进行选择和/或筛选以选择那些转基因植物，与缺乏编码香草醛合酶的异源核酸的对照植物相比，所述转基因植物在香草醛或香草醛β-D-葡糖苷水平上具有在统计学上的显著差异。
根据本发明的包括植物细胞的植物还可作为所述植物产生的种子来提供。
用于本发明的包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物可例如选自：玉米(玉蜀黍(Zea.mays))、油菜(甘蓝型油菜(Brassica napus)，芜菁属(Brassica papa ssp.))、苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))、水稻(Oryzasativa)、黑麦(Secale cerale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、向日葵(Helianthus annuas)、小麦(Tritium aestivum及其他物种)、黑小麦(Triticale)、黑麦(黑麦属)、大豆(Glycine max)、红花烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Impomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(咖啡属)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Anana comosus)、柑橘(柑橘属)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasenensis)、香蕉(芭蕉属)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficus casica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Man gier indica)、橄榄(Olea europaea)、木瓜(番木瓜(Carica papaya))、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)、扁桃(Primus amygdalus)、苹果(苹果属)、梨(梨属)、李子和樱桃树(李属)、茶藨子科(醋栗等)、葡萄、菊芋(Jerusalem artichoke，半日花属)、非谷类禾草(禾本科)、糖用和饲用甜菜(Beta vulgaris)、菊苣(chicory)、燕麦、大麦、蔬菜和观赏植物。
在本发明的一个实施方案中，所述植物是包含可食部分的植物。特别地，所述植物可以是具有味道的植物，其中与香草味道的组合可设想为是理想的。因此，所述植物可以是包含食用果实的植物，其中，理想的是，除了所述果实的天然味道之外，所述果实还含有香草气味。这样的植物的一个非限制性的实例是番茄。例如，本发明的植物是农作物植物(例如，谷物和豆类、玉米、小麦、马铃薯、木薯、大米、高粱、小米、木薯、大麦、豌豆、糖用甜菜、甘蔗、大豆、油菜、向日葵和其他块根、块茎或种子作物。其他重要的植物可以是果树、作物树木、森林树木或种植用作香料或医药产品的植物(薄荷属、丁香、蒿属、百里香属、薰衣草属、葱属、金丝桃属、长春花属、蔓长春花属、罂粟属、洋地黄属、萝芙木属、香草属、欧芹属(Petrusilium)、桉属、茶树、云杉属、松属、冷杉属、刺柏属)。可用于本发明的园艺植物可包括莴苣(lettuce)、菊苣(endive)和芸苔属蔬菜(包括卷心菜、西兰花和花椰菜)、胡萝卜和康乃馨以及天竺葵。
所述植物还可选自烟草、葫芦、胡萝卜、草莓、向日葵、番茄、辣椒(pepper)和菊花。
所述植物还可以是谷物植物，例如油料种子植物或豆科植物。感兴趣的种子包括谷类种子，例如玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、刺槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、青豆、蚕豆、扁豆、鹰嘴豆。
在本发明的另一个的实施方案中，所述植物是选择以下的组：玉米、水稻、小麦、糖用甜菜、甘蔗、烟草、油菜、马铃薯和大豆。因此，所述植物可以是例如水稻。
已经对拟南芥(Arabidopsis thaliana)植物的全基因组进行测序(Paquette，S等，Phytochemistry 62(2003)399-413)。因此，可得到该植物的非常详细的知识，因此，其可以是用来使用的可用的植物。
因此，可用于本发明一种植物是拟南芥属，特别是拟南芥。
令人感兴趣的是，本发明证明可改造甚至与香荚兰截然不同的植物以产生香草醛、香草醇和/或香草醛葡糖苷。因此，虽然香荚兰是单子叶植物，更具体的是附生攀爬兰花，然而本发明出人意料地证明，甚至双子叶植物也能产生香草醛、香草醇和/或香草醛葡糖苷。因此，在本发明的一个实施方案中，所述宿主生物是双子叶植物。在本发明的一个优选实施方案中，所述植物是茄目的植物。特别地，所述植物可以是烟草属的植物，例如所述植物可以是红花烟草。
在一个实施方案中，本发明涉及包含编码本发明的香草醛合酶的异源核酸的植物，其中所述植物是用作动物饲料的植物。对于用作动物饲料的植物可能有利的是包含香草醛，因为香草醛可诱发动物食欲并且还可改善从植物制备的饲料的可口性，由此诱导提高动物对饲料的摄取。此外，令人感兴趣的是，包含编码本发明的香草醛合酶的异源核酸的植物还可具有降低的木质素含量或者具有提供有利特性(例如物理强度或生物降解性)的不同组成的木质素。不受限于理论，推断根据本发明的香草醛合酶的表达缩减了可用于木质素的生物合成的阿魏酸的库(pool)，因为将至少一部分阿魏酸转化成了香草醛。
用作动物饲料的植物可以是可用作动物饲料的任何植物。一般而言，所述植物可以是草本植物，例如，禾本科植物或豆类。所述禾本科植物可以是任何禾草，例如禾本科(Poaceae或Gramineae)的“真禾本科植物”以及莎草科的莎草或灯心草科的灯心草。可用的真禾本科植物的实例包括谷类、竹子和草坪(草皮)和草地的禾本科植物，例如柳枝稷(Switchgrass)。
在本发明一个优选的实施方案中，所述植物是具有高内源含量的阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的植物物种的植物。特别地，所述植物可以是具有高内源含量的阿魏酸和/或阿魏酸葡糖苷的植物物种的植物。在本发明的一个实施方案中，所述植物是积累了高水平的游离的和/或易接近的阿魏酸或阿魏酸葡糖苷的植物物种的植物。单子叶植物的鸭跖草目(commelinoid order)和藜科(例如糖用甜菜和菠菜)的初生细胞壁在其非木质化细胞壁中含有大量的游离苯丙素类。这些苯丙素类的主要级分是阿魏酸。因此，在一个实施方案中，所述植物可以是单子叶植物的鸭跖草目或藜科的植物。在一个实施方案中，所述植物是包含至少50μg、例如至少100μg、例如至少200μg阿魏酸和/或阿魏酸衍生物每g干物质的植物。
可优选的是，所述植物不是香荚兰。还可优选的是，所述植物不是匍匐翦股颖(Creeping Bentgrass)。
葡糖基转移酶
包含编码香草醛合酶的异源核酸的所述微生物还能够使香草醛去葡糖基化。大多数微生物(例如细菌和真菌)不是生来就能够使香草醛葡糖基化。因此，所述微生物可包含至少一种编码葡糖基转移酶(优选能够高效地催化香草醛葡糖基化的葡糖基转移酶)的异源核酸。
类似地，包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物可也能够使香草醛葡糖基化。所述植物可包含能够使香草醛葡糖基化的内源性葡糖基转移酶活性。然而，优选地，所述植物可包含编码葡糖基转移酶(优选能够高效地催化香草醛葡糖基化的葡糖基转移酶)的至少一个异源核酸。
香草醛的葡糖基化是特别有用的。香草醛-β-D-葡糖苷是在香草豆荚中发现的香草醛的储存形式。其对包括酵母的大多数生物是无毒的并且与香草醛相比，在水中具有更高的溶解度。相反，香草醛对于许多宿主是有毒的。此外，香草醛-β-D-葡糖苷的形成最可能拉动在香草醛产生方向的进一步生物合成。此外，香草醛的葡糖基化可促进分离。
葡糖基转移酶可以是能够催化香草醛葡糖基化(即，能够催化葡萄糖残基缀合到香草醛上)的任何葡糖基转移酶。特别地，所述葡糖基转移酶可以是UDP-葡萄糖：糖苷配基葡糖基转移酶。优选地，葡糖基转移酶可催化香草醛葡糖基化以产生香草醛β-D-葡糖苷。因此，葡糖基转移酶可以是家族1的葡糖基转移酶。根据本发明的优选的葡糖基转移酶是分类在EC 2.4.1下的酶。合适的葡糖基转移酶包括UGT71C2、UGT72B1、UGT72E2、UGT84A2、UGT89B1、UGT85B1和熊果苷合酶多肽。因此，用于本发明的葡糖基转移酶可以是例如具有GenBank登记号AC0005496、NM_116337或NM_126067的任意一种葡糖基转移酶。因此，重组宿主可包含编码UGT71C2、UGT72B1、UGT72E2、UGT84A2、UGT89B1、UGT85B1或熊果苷合酶或与其共享至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％序列同一性的上述任意一种的功能同源物的异源核酸。在WO 01/40491中，例如在WO 01/40491第2至5页上描述了另一些可用的UGT。
拟南芥UGT72E2是特别有用的。UGT72E2表现出对香草醛的高底物特异性。与该观察一致的是，其在产生香草醛的酵母中的表达导致将几乎所有的香草醛转化成香草醛-β-D-葡糖苷。在体内将香草醛转化成香草醛-β-D-葡糖苷的能力是重要的，因为游离香草醛的毒性会阻碍超出0.5-1g/升规模的非葡糖基化香草醛的微生物产生。葡糖基化用来防止抑制作用。
因此，葡糖基转移酶可以是SEQ ID NO：3的UGT72E2或与其共享至少80％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分所描述的进行计算。UGT72E2的功能同源物也能够催化香草醛葡糖基化以形成香草醛-β-D-葡糖苷。催化除了葡萄糖之外的其他糖，例如半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖的转移的糖基转移酶是已知的并且还可将其引入以得到香草醛的新的糖衍生物。
参与阿魏酸合成的酶
本发明涉及在香草醛合酶的帮助下从阿魏酸产生香草醛的方法。所述方法可利用产生阿魏酸的微生物或植物，或者可将阿魏酸外源地添加到所述微生物或所述植物中。
一些微生物和许多植物天然地产生并积累阿魏酸。然而，其他微生物(例如大多数的细菌或真菌)并不是天然地产生阿魏酸。因此，在本发明的一些实施方案中，所述实施方案涉及不天然地表达编码所有用于内源性产生阿魏酸的所需酶之基因的细菌或真菌，所述方法可包括使所述细菌或真菌与阿魏酸相接触，例如，通过将阿魏酸添加到生长培养基中。在涉及不天然地产生阿魏酸的细菌或真菌的本发明的另一些实施方案中，可改造所述细菌或真菌以表达参与阿魏酸合成的一种或更多种酶。还包含在本发明中的是，可将改造以表达参与阿魏酸合成的一种或更多种酶的微生物与包含编码香草醛合酶的异源核酸的微生物一起使用，例如，可将其共培养。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及微生物和使用所述微生物的方法，其中所述微生物包含编码参与阿魏酸合成的酶的至少一种异源核酸。
参与阿魏酸合成的酶可以例如选自：苯丙氨酸氨裂合酶、反式肉桂酸4-单加氧酶、酪氨酸氨裂合酶、4-香豆酰-3-羟化酶、咖啡酸O-甲基转移酶、苯丙氨酸氨裂合酶、反式肉桂酸4-单加氧酶、香豆酸-CoA连接酶、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶、4-香豆酰-3-羟化酶、咖啡酰-CoA O-甲基转移酶、咖啡酸O-甲基转移酶和黄酮3′-O-甲基转移酶。在下文中更详细地描述了这些酶中的每一种。
获得阿魏酸的不同途径是已知的。在Schoch等，2006，Environ ChemLett，4：127-136(在此通过引用并入本文)的图6中描述了许多获得阿魏酸的途径。因此，宿主生物可包含途径之一的所有酶以获得在Schoch等，2006的图6中示出的阿魏酸。
用于生物合成阿魏酸的一个途径(本文指定为阿魏酸途径1)包含以下的酶：
步骤1：苯丙氨酸氨裂合酶，其可以是下文所述的任意一种苯丙氨酸氨裂合酶。
步骤2：反-肉桂酸-4-单加氧酶(肉桂酸-4-羟化酶)，其可以是下文所述的任意一种反式肉桂酸4-单加氧酶。
步骤3：4-香豆酰-3羟化酶，其可以是下文所述的任意一种4-香豆酰-3-羟化酶。
步骤4：咖啡酸O-甲基转移酶或黄酮3′-O-甲基转移酶，其可以是下文所述的咖啡酸O-甲基转移酶或黄酮3′-O-甲基转移酶的任意一种。
本发明的微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含编码阿魏酸途径1的一种酶的至少一种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径1的不同酶的至少两种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径1的不同酶的至少3种核酸。特别地，所述微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含各自编码阿魏酸途径1的不同酶的4种异源核酸。
用于生物合成阿魏酸的另一个途径(本文指定为阿魏酸途径2)包含以下的酶：
步骤1+2：酪氨酸氨裂合酶，其可以是下文所述的任意一种酪氨酸氨裂合酶。
步骤3：4-香豆酰-3-羟化酶，其可以是下文所述的任意一种4-香豆酰-3-羟化酶。
步骤4：咖啡酸O-甲基转移酶或黄酮3′-O-甲基转移酶，其可以是下文所述的咖啡酸O-甲基转移酶或黄酮3′-O-甲基转移酶的任意一种。
本发明的微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含编码阿魏酸途径2的一种酶的至少一种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径2的不同酶的至少两种异源核酸。特别地，所述微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含各自编码阿魏酸途径2的不同酶的3种异源核酸。
用于生物合成阿魏酸的又一个途径(本文指定为阿魏酸途径3)包含以下的酶：
步骤1：苯丙氨酸氨裂合酶，其可以是下文所述的任意一种苯丙氨酸氨裂合酶。
步骤2：反式肉桂酸4-单加氧酶(肉桂酸-4-羟化酶)，其可以是下文所述的任意一种反式肉桂酸4-单加氧酶。
步骤3：4-香豆酸CoA连接酶，其可以是下文所述的任意一种4-香豆酸-CoA连接酶。
步骤4：莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶，其可以是下文所述的任意一种莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶。
步骤5：4-香豆酰-3-羟化酶，其可以是下文所述的任意一种4-香豆酰3-羟化酶。
步骤6：莽草酸-O羟基肉桂酰转移酶，其可以是下文所述的任意一种莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶。
步骤7：咖啡酰-CoA O-甲基转移酶，其可以是下文所述的任意一种咖啡酰-CoA O-甲基转移酶。
本发明的微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含编码阿魏酸途径3的一种酶的至少一种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径3的不同酶的至少两种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径3的不同酶的至少3种核酸，例如各自编码阿魏酸途径3的不同酶的至少4种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径3的不同酶的至少5种核酸，例如各自编码阿魏酸途径3的不同酶的至少6种异源核酸。特别地，所述微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含各自编码阿魏酸途径3的不同酶的7种异源核酸。
用于生物合成阿魏酸的另一个途径(本文指定为阿魏酸途径4)包含以下的酶：
步骤1+2：酪氨酸氨裂合酶，其可以是下文所述的任意一种酪氨酸氨裂合酶。
步骤3：4-香豆酸-CoA连接酶，其可以是下文所述的任意一种4-香豆酸-CoA连接酶。
步骤4：莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶，其可以是下文所述的任意一种莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶。
步骤5：4-香豆酰-3-羟化酶，其可以是下文所述的任意一种4-香豆酰-3-羟化酶。
步骤6：莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶，其可以是下文所述的任意一种莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶。
步骤7：咖啡酰-CoA O-甲基转移酶，其可以是下文所述的任意一种咖啡酰-CoA O-甲基转移酶。
用于生物合成阿魏酸的又一途径(本文指定为阿魏酸途径5)包含以下的酶：
1)香草醇氧化酶(VAO)，其可以是下文所述任意一种VAO。
这个途径起始于丁香酚。因此，如果所述微生物不合成丁香酚，则优选的是，在丁香酚的存在下培养所述微生物。除了VAO之外，所述微生物优选地包含能够催化松柏醇转化以形成阿魏酸的酶。这样的酶内源地存在于许多微生物(例如在酿酒酵母)中。在Lambert等，2013，Flavor andFragrance Journal，DOI 10.1002/ffj.3171中提供了有关阿魏酸途径5的详情。
本发明的微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含编码阿魏酸途径4的一种酶的至少一种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径4的不同酶的至少两种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径4的不同酶的至少3种核酸，例如各自编码阿魏酸途径4的不同酶的至少4种异源核酸，例如各自编码阿魏酸途径4的不同酶的至少5种核酸。特别地，所述微生物(例如酵母细胞或细菌)可包含各自编码阿魏酸途径的4不同酶的6种异源核酸。
苯丙氨酸氨裂合酶
用于本发明的苯丙氨酸氨裂合酶可以是技术人员已知的任何苯丙氨酸氨裂合酶。特别地，所述苯丙氨酸氨裂合酶可以是在EC 4.3.1.24分类下的任何酶。
因此，根据本发明的苯丙氨酸氨裂合酶优选为能够催化以下反应的酶：
苯丙氨酸氨裂合酶可以是来自多种来源(例如，来自植物)的苯丙氨酸氨裂合酶。在Vannelli等2006和Shin等2012中描述了可用的苯丙氨酸氨裂合酶的实例。
因此，苯丙氨酸氨裂合酶可以是SEQ ID NO：4的苯丙氨酸氨裂合酶或与其共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
苯丙氨酸氨裂合酶的功能同源物也能够催化以下反应：
反式肉桂酸4-单加氧酶
用于本发明的反式肉桂酸4-单加氧酶可以是技术人员已知的任何反式肉桂酸4-单加氧酶。还可将反式肉桂酸4-单加氧酶也可被指定为肉桂酸-4-羟化酶。特别地，反式肉桂酸4-单加氧酶可以是在EC1.14.13.11分类下的任何酶。因此，反式肉桂酸4-单加氧酶优选为能够催化以下反应的酶：
反式肉桂酸4-单加氧酶可以是来自多种来源(例如来自植物)的反式肉桂酸4-单加氧酶。有用的反式肉桂酸4-单加氧酶的实例是拟南芥CYP73A5(GenBank登录号：U37235)。因此，反式肉桂酸4-单加氧酶可以是SEQ ID NO：5的反式肉桂酸4-单加氧酶或与其共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
反式肉桂酸4-单加氧酶的功能同源物也能够催化以下反应：
酪氨酸氨裂合酶
用于本发明的酪氨酸氨裂合酶可以是技术人员已知的任何酪氨酸氨裂合酶。特别地，所述酪氨酸氨裂合酶可以是在EC4.3.1.23分类下的任何酶。因此，酪氨酸氨裂合酶优选为能够催化以下反应的酶：
酪氨酸氨裂合酶可以是来自多种来源(例如来自植物)的酪氨酸氨裂合酶。在Vannelli等2006和Shin等2012中描述了可用的酪氨酸氨裂合酶的实例。来自多种粘菌的酪氨酸氨裂合酶也可用于本发明。
因此，酪氨酸氨裂合酶可以是SEQ ID NO：6的酪氨酸氨裂合酶或与其共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
酪氨酸氨裂合酶的功能同源物也能够催化以下反应：
4-香豆酰-3-羟化酶
用于本发明的4-香豆酰-3-羟化酶可以是技术人员已知的任何4-香豆酰-3-羟化酶。特别地，4-香豆酰-3-羟化酶可以是在EC 1.14.-.-分类下的任何酶。
4-香豆酰-3-羟化酶可以是来自多种来源(例如来自植物)的4-香豆酰-3-羟化酶。可用的4-香豆酰-3-羟化酶的实例包括红三叶草(Red clover)香豆酸3′-羟化酶(CYP98A44)、拟南芥对-香豆酸3-羟化酶(CYP98A3)(SEQ ID NO：7)、拟南芥的CYP98A8对-香豆酸3-羟化酶(SEQ IDNO：8)或拟南芥的CYP98A9对-香豆酸3-羟化酶(SEQ ID NO：9)。
因此，4-香豆酰-3-羟化酶可以是SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQID NO：9的4-香豆酰-3-羟化酶或与上述任何一个共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
咖啡酸O-甲基转移酶
用于本发明的咖啡酸O-甲基转移酶可以是技术人员已知的任何咖啡酸O-甲基转移酶。特别地，所述咖啡酸O-甲基转移酶可以是在EC 2.1.1.68分类下的任何酶。因此，咖啡酸O-甲基转移酶优选为能够催化以下反应的酶：
S-腺苷-L-高半胱氨酸+3-甲氧基-4-羟基-反式-肉桂酸
黄酮3′-O-甲基转移酶
用于本发明的黄酮3′-O-甲基转移酶可以是技术人员已知的任何黄酮3′-O-甲基转移酶。特别地，所述黄酮3′-O-甲基转移酶可以是在EC 2.1.1.42分类下的任何酶。因此，黄酮3′-O-甲基转移酶是优选能够催化以下反应的酶：
4-香豆酸-CoA连接酶
用于本发明的4-香豆酸-CoA连接酶可以是技术人员已知的任何4-香豆酸-CoA连接酶。特别地，4-香豆酸-CoA连接酶可以是在分类EC6.2.1.12下的任何酶。因此，4-香豆酸-CoA连接酶优选为能够催化以下反应的酶：
4-香豆酸-CoA连接酶可以是来自多种来源(例如来自植物)的4-香豆酸-CoA连接酶。有用的4-香豆酸-CoA连接酶的实例包括拟南芥4-香豆酸：CoA连接酶3(SEQ ID NO：10)或红花烟草的4-香豆酸：辅酶A连接酶(SEQ ID NO：11)。
因此，4-香豆酸-CoA连接酶可以是SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11的4-香豆酸-CoA连接酶或与其共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
4-香豆酸-CoA连接酶的功能同源物也能够催化以下反应：
莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶
用于本发明莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶可以是技术人员已知的任何莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶。特别地，所述莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶可以是在EC2.3.1.133分类下的任何酶。因此，莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶优选为能够催化以下反应的酶：
莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶可以是来自多种来源(例如来自植物)的莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶。所述的有用的莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶的实例包括：红花烟草莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶(SEQ ID NO：12)，小果咖啡(Coffea arabica)羟基肉桂酰转移酶(SEQ ID NO：13)或毛果杨(Populus trichocarpa)羟基肉桂酰CoA莽草酸/奎尼酸羟基肉桂酰转移酶(SEQ ID NO：14)。
因此，莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶可以是SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14的莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶或与上述任意一个共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶的功能同源物也能够催化以下反应：
咖啡酰-CoA O-甲基转移酶
用于本发明的咖啡酰CoA O-甲基转移酶可以是技术人员已知的任何咖啡酰-CoA邻-甲基转移酶。特别地，所述咖啡酰CoA O-甲基转移酶可以是在EC2.1.1.104分类下的任何酶。因此，咖啡酰CoA O-甲基转移酶优选为能够催化下述反应的酶：
所述咖啡酰-CoA O-甲基转移酶可以是来自多种来源(例如来自植物)的咖啡酰-CoA O-甲基转移酶。可用的咖啡酰CoA O-甲基转移酶的实例包括拟南芥咖啡酰-CoA O-甲基转移酶(SEQ ID NO：15)或红花烟草的咖啡酰-CoA O-甲基转移酶(SEQ ID NO：16)。
因此，咖啡酰-CoA O-甲基转移酶可以是SEQ ID NO：6的咖啡酰-CoAO-甲基转移酶或与其共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
咖啡酰-CoA O-甲基的功能同源物也能催化以下反应：
香草醇氧化酶
用于本发明的香草醇氧化酶(VAO)可以是技术人员已知的任何VAO。特别地，所述VAO可以是在EC1.1.3.38分类下的任何酶。所述VAO可以来自多种来源(例如来自真菌)的VAO。可用的VAO的实例包括简青霉(Penicillium simplicissimum)VAO。
因此，VAO可以是具有NCBI数据库(如在2013年11月5日获得的)中参考号CAA75722的序列的VAO或与其共享至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少91％、例如至少92％、例如至少93％、例如至少94％、例如至少95％、例如至少96％、例如至少97％、例如至少98％、例如至少99％、例如100％序列同一性的其功能同源物。序列同一性优选地如在下文“序列同一性”部分中所描述的进行计算。
序列同一性
高水平的序列同一性表示第一序列来源于第二序列的可能性。氨基酸的序列同一性需要两个比对序列之间的相同氨基酸序列。因此，与参考序列共享80％氨基酸同一性的候选序列需要以下的比对：在候选序列中80％的氨基酸与参照序列中相应的氨基酸相同。根据本发明的同一性是在计算机分析的帮助下测定的，例如但不限制于ClustalW计算机比对程序(Higgins D.，Thompson J.，Gibson T.，Thompson J.D.，Higgins D.G.，GibsonT.J.，1994.CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiplesequence alignment through sequence weighting，position-specific gappenalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Res.22：4673-4680)以及其中建议的默认参数。ClustalW软件可从欧洲生物信息学研究所ClustalW WWW服务器http：//www.ebi.ac.uk/clustalw上获得。使用这种具有其默认设置的程序来对查询多肽和参考多肽的成熟(生物学活性)部分进行比对。对完全保守的残基的数目进行计数并除以参考多肽的长度。
可将ClustalW算法类似地用于比对核苷酸序列。可以以类似于氨基酸序列所表示的方式计算序列同一性。在一个重要的实施方案中，本发明的细胞包含如本文所定义的核酸编码序列。
启动子序列
本发明涉及微生物和植物，其包含编码香草醛合酶的异源核酸并且任选地还包含编码参与合成阿魏酸的酶和/或葡糖基转移酶的其他的一种或更多种异源核酸序列。为了确保所述异源核酸的适当表达，通常将所述编码异源核酸可操作地连接到在微生物细胞或植物中指导表达的启动子序列上。
启动子是促进特定基因转录的DNA的区域。启动子位于靠近其所调控的同一条链上的基因并且通常位于上游(朝向有义链的5′区域)。为了使使转录发生，合成RNA的酶(称为RNA聚合酶)必须连接到靠近基因的DNA上。启动子包含特定的DNA序列和响应元件，所述响应元件为RNA聚合酶和用于募集RNA聚合酶的称为转录因子的蛋白质提供了安全的初始结合位点。这些转录因子具有相应核苷酸的特异性激活子或抑制子序列，其连接到特定的启动子上并调节基因表达。
启动子序列通常可位于紧邻于编码性异源核酸。
根据本发明的启动子序列通常包含至少一个核心启动子，所述核心启动子是适当地启始转录所需的启动子的最小部分。此外，所述启动子序列可包含一个或更多个以下启动子元件：
○转录起始位点(TSS)
○RNA聚合酶结合位点
○通用转录因子结合位点
○倾向于包含主要调控元件的基因上游的近端启动子序列
○特异性转录因子结合位点
○可包含另外调控元件的基因上游的远端启动子序列，其往往具有比近端启动子更弱的影响
○阻遏蛋白的结合位点
苯基丙烯酸酯脱羧酶的降低的表达
在其中所述微生物或植物表达高水平的使用阿魏酸作为底物之酶的本发明的一些实施方案中，降低此类酶的表达可以是有利的。
某些微生物(例如酵母)表达阿魏酸脱羧酶，所述阿魏酸脱羧酶能够催化阿魏酸脱羧从而得到4-乙烯基愈创木酚。因此，优选的是，如果所述微生物表达阿魏酸脱羧酶，那么所述阿魏酸脱羧酶的表达降低。
降低表达可使用技术人员已知的多种常规技术来实现降低的表达。例如，可将核酸(例如抑制阿魏酸脱羧酶的表达的反义核酸)包含在将其转化到微生物中的重组构建物中。或者，可将基于PCR的诱变技术用于在阿魏酸脱羧酶的基因中产生突变或者可使用基于PCR的基因缺失策略(例如，改自Baudin等1993中描述的策略)使整个阿魏酸羧化酶基因缺失。简言之，将PCR产生的DNA分子引入微生物中并通过同源重组将其并入到基因组中，所述PCR产生的DNA分子由与基因组阿魏酸脱羧酶基因具有短侧翼同源区域的标记盒组成。来自多种生物的阿魏酸脱羧酶基因的基因组序列是可获得的。例如，在GenBank登录号BK006938.2下可获得阿魏酸脱羧酶基因的基因组序列。
阿魏酸
本文中使用的术语阿魏酸是指以下结构的化合物：
在本发明的某些实施方案中，用于产生香草醛和/或香草醛葡糖苷的方法包括使用于产生的微生物或植物与阿魏酸和/或阿魏酸衍生物相接触。优选的是，使所述微生物或植物与阿魏酸相接触。特别地，这涉及其中所述微生物或植物不能产生阿魏酸的本发明的一些实施方案。大多数细菌和真菌不能产生阿魏酸。因此，在其中微生物是细菌或真菌(例如酵母)的本发明的实施方案中，可能特别地涉及使所述微生物与阿魏酸和/或阿魏酸衍生物相接触。
优选地，在阿魏酸的存在下(例如，培养基中可包含阿魏酸)培养所述微生物。因此，所述培养基可优选地包含至少1mM、优选为至少3mM、例如至少5mM的阿魏酸。
或者，在阿魏酸衍生物或阿魏酸与阿魏酸衍生物的混合物的存在下(例如，所述培养基可包含阿魏酸衍生物和/或阿魏酸)培养所述微生物。因此，所述培养基可优选地包含至少1mM、优选为至少3mM、例如至少5mM的阿魏酸和/或阿魏酸衍生物。
在一个实施方案中，本发明涉及通过使阿魏酸和/或阿魏酸衍生物与香草醛合酶相接触而在体外制备香草醛，所述香草醛合酶可以是在上文“香草醛合酶”部分中所描述的任意一种香草醛合酶。可以以纯化形式或以提取物(例如，从表达香草醛合酶的微生物制备的提取物)来提供所述香草醛合酶，所述微生物例如上文“微生物”部分所描述的任意一种微生物。可使用任何可用浓度的阿魏酸和/或阿魏酸衍生物，例如阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的浓度可以为1mM、优选为至少3mM、例如至少5mM的阿魏酸/阿魏酸衍生物。
可以以任何有用的形式提供阿魏酸。例如，糖蜜通常含有大量的阿魏酸，因此培养基可包含糖蜜或甚至由糖蜜组成。糖蜜可以是，例如糖用甜菜或甘蔗的糖蜜。
还可通过提供包含阿魏酸或其提取物的植物或植物部分来提供阿魏酸。
例如，可以以阿魏胶(来自巨茴香的干燥胶乳)或其提取物的形式来提供阿魏酸。还可以作为咖啡、苹果、洋蓟、花生或橙子的种子或者作为其提取物来提供阿魏酸。还可以作为鸭跖草植物(commelinid plant)或其部分来阿魏酸。所述说鸭跖草植物可以是例如水稻、小麦、燕麦、中国荸荠或菠萝。还可以以油的形式提供阿魏酸。
阿魏酸还可以是经纯化的阿魏酸，例如，其可以是从上述任何的来源纯化的或者可通过有机化学方法制备阿魏酸。
还可从能够产生阿魏酸的微生物来提供阿魏酸。例如，微生物可优选地含有编码参与阿魏酸合成的酶的一种或更多种异源核酸，例如，所述微生物可包含编码在上文“参与阿魏酸合成的酶”部分中所描述的酶的核酸。能够产生阿魏酸的微生物可与包含编码香草醛合酶的异源核酸的微生物一起共培养。或者，可将来自培养能够产生阿魏酸的微生物的粗培养基或部分纯化的或纯化的培养基添加到用于培养包含编码香草醛合酶之异源核酸的微生物的培养基中。
阿魏酸衍生物可以是阿魏酸的任何衍生物，其可充当香草醛合酶的底物。优选地，所述阿魏酸衍生物是以下通式的化合物
其中R例如可以是烷基(例如C 1-6 烷基)、烷氧基(例如C 1-6 烷氧基)、葡萄糖酯、糖苷、S-CoA、莽草酸或奎尼酸。
所述糖苷酯可包括任何糖，例如葡萄糖。所述糖苷优选为葡糖苷。
因此，阿魏酸衍生物例如可选自：阿魏酸葡萄糖酯、阿魏酸葡糖苷、阿魏酰-CoA、阿魏酸莽草酸和阿魏酰-奎尼酸。
序列表
实施例
实施例1
香草醛合酶(VpVAN)
基于可从US2003/0070188获取的序列信息，获得了4-HBS的编码序列(SEQ ID NO：2)。
将用于PCR产生的DNA的TNT快速偶联转录/翻译(Quick CoupledTranscription/Translation)PROMEGA试剂盒用于从经分离的4-HBSPCR产生的基因来产生蛋白质(用S35标记所表达的蛋白质以检查体外翻译是否成功)。为了研究该酶的底物特异性，在供应试验中，作为推定的底物测试了2.5mM的对香豆酸、阿魏酸和咖啡酸。在分别施用含有推定的底物的蛋白质溶液1小时和24小时之后，在存在和缺乏4-HBS的情况下，通过LC-MS分析所得的代谢图谱。可以清楚地看出，4-HBS催化阿魏酸的链缩短为香草醛但不能催化对香豆酸或咖啡酸的链缩短。图1(a)示出了在30摄氏度下在400mM pH8的Tris/HCI、20mM的MgCl2、2.5mM的二硫苏糖醇(DTT)中用5mM阿魏酸供应1小时的蛋白质溶液的提取离子色谱图。在7.5分钟处观察到香草醛峰，所述峰在相同条件下在其中没有用4-HBS处理的蛋白质溶液的阴性对照中是不存在的(参见图1(b))。图1(c)示出了在30℃下在2.5mM DTT、0.1mM ATP和0.1mM NAD+中用5mM阿魏酸CoA供应1小时的蛋白质溶液的提取离子色谱图。此处也观测到了香草醛峰，所述峰在阴性对照中是不存在的(参见图1(d))。图1(e)示出了在7.5分钟处的香草醛碎裂图样。
因此，将4-HBS改名为香草醛合酶或VpVAN。
实施例2
在酵母中表达VpVAN以从阿魏酸制备香草醛葡糖苷
该实施例描述了在酵母中通过香荚兰VpVAN的异源表达的从阿魏酸到香草醛葡糖苷的生物合成。通过在酿酒酵母菌株Fsb99中的瞬时表达和稳定表达，进一步证实了香草醛合酶的底物特异性。用插入到半乳糖诱导的酵母表达载体P416 TEF(本文中所述细胞也被称为VpVAN转化的酵母)中的编码SEQ ID NO：1的VpVAN的核酸来转化酵母。使VpVAN转化的酵母在含有半乳糖和5mM推定底物的合成培养基中培养。在施用阿魏酸之后观察到了香草醛的形成，而没有观察到对-香豆酸和咖啡酸的代谢。在一个独立的方法中，在酵母中，SEQ ID NO：1的VpVAN与拟南芥UGT72E2(SEQ ID NO：3)一起表达。拟南芥UGT72E2催化阿魏酸葡糖基化，使得能够测试香草醛合酶利用阿魏酸葡糖苷作为底物的能力。图12示出当在包含2.5mM阿魏酸的合成培养基上培养时，表达拟南芥UGT72E2(SEQ ID NO：3)的酵母细胞合成了阿魏酸葡糖苷(参见图12)。用包含密码子优化以用于酵母表达的稳定整合的VAN或者具有缺失信号肽的截短的VAN(SEQ ID NO：17；在本文中还指定为vpΔsp van)或者用缺失信号肽且密码子优化以用于酵母表达的截短的VAN的酵母进行了生物合成研究(图3)。将酵母菌株用不同的推定底物孵育72小时，之后通过LC-MS测定代谢物谱。用阿魏酸作为底物并用所测试的两个形式的VAN观察到了香草醛葡糖苷的形成。使用截短形式的△sp van获得了最高的转化。在任何情况下都没有观察到咖啡酸或对-香豆酸的碳链缩短。结果在图3中示出。向酵母施用阿魏酸还导致芳香族化合物4-乙烯基愈创木酚葡糖苷的产生。因此，可通过供应阿魏酸或产生阿魏酸在酵母中在两个步骤内制备香草醛葡糖苷。
在来自糖用甜菜、甘蔗或高粱的糖的产生中，获得了作为粘性副产品的糖蜜。已知糖蜜含有包括阿魏酸的羟基肉桂酸。为了检查这种廉价的废产品是否可以用作产生香草醛葡糖苷的起始原料，使包含密码子优化以用于酵母之稳定整合的VAN(即编码SEQ ID NO：1的VpVAN)的酵母在糖蜜上培养。观察到香草醛葡糖苷的形成，突出了该酶使用廉价的起始原料以用于工业的天然香草醛葡糖苷生产的潜力(图2)。
用阿魏酸和阿魏酸葡糖苷进一步测试了VpVAN的底物特异性。进行该实验以检测香草醛葡糖苷的形成。VpUGT72U1能够使香草醛葡糖基化但不能使阿魏酸葡糖基化，而AtUGT72E2能够使阿魏酸和香草醛两者葡糖基化。包括VpUGT72U1的酵母构建体能够测试VpVAN对阿魏酸和阿魏酸葡糖苷的底物特异性。LC-MS提取离子色谱图示出VpVAN能够催化阿魏酸和阿魏酸葡糖苷两者的链断裂(参见图4)。
实施例3
在本氏烟草中瞬时表达VpVAN以从固有的阿魏酸制备香草醛
本实施例描述了可在通常不产生香草醛的植物中使用VpVAN来产生香草醛。通过在本氏烟草叶中的瞬时表达评估了在不同于香荚兰的植物中的VpVAN活性。将编码SEQ ID NO：1的VpVAN的基因表达构建体转移到根癌农杆菌中并将其与包含p19基因沉默抑制子的根癌农杆菌菌株共浸润到本氏烟草叶中。在接种之后四天，收获浸润的烟草叶并通过LC-MS对代谢物进行图谱分析。结果在图5中示出。图谱示出仅在来自用编码VpVAN的基因表达构建体转染的植物的烟草叶中形成了香草醛葡糖苷。在活细胞中，香草醇是香草醛的已知代谢物，可能是为了降低醛香草醛的细胞毒性而产生的。因此，这些结果示出可在从除了香荚兰之外的其他植物中由阿魏酸来产生香草醛。
实施例4
在烟草中稳定表达VpVAN以用于香草醛葡糖苷产生
本实施例描述了在烟草(红花烟草)的稳定转化系中香草醛葡糖苷的从头形成。为了确保在植物中积累香草醛葡糖苷而不是香草醇葡糖苷，优选的是，将VpVAN酶与适当的高效香草醛糖基转移酶共表达。因此，在红花烟草转化系中，VpVAN(SEQ ID NO：1)与拟南芥UGT72E2(SEQID NO：3)稳定地共表达。首先，将编码SEQ ID NO：3的UGT72E2的核酸克隆到植物转化载体(例如来自pCAMBIA系列的一种)的多克隆位点，使得在植物中基因是在强的组成型花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的控制下进行表达的。所述载体包含细菌选择基因和植物选择基因两者。通过如在Wen-Jun等1983中所描述的电穿孔将包含编码SEQ IDNO：3的UGT72E2的核酸的载体转化到根癌农杆菌C58C1/pGV3850中。使农杆菌细胞在的选择性培养基上生长并使阳性转化子生长过夜。将来自平板的细菌悬浮于20mL的最小的A培养基中，将密度调节至OD600为0.9至1.0并且将大约(ca.)20片0.5cm的正方形本氏烟草叶(4周龄至5周龄的组织培养生长的植物)转移到细菌溶液(深孔培养皿)中。将正方形叶在溶液涡旋并放置5分钟，之后，将溶液移除并吸干，然后以近轴面转移到固体RMOP上，每平板约10片。将平板在28℃下在黑暗中孵育：2天至3天，根癌农杆菌中5天，在此之后，将叶块转移到固体RMOP-TCH上，使其远轴面与培养基相接触，然后在28℃下在光中孵育2-3周，每天16小时日光。每2周将材料进行亚培养或者直到芽出现，然后将小植株转移到MST-TCH罐中并在16小时日光下孵育1-2周，并且当根形成时，在温室中，将植物转移到土壤中。将来自表达UGT72E2的转基因烟草植物的植物材料用于下一转化。将编码SEQ ID NO：1的VpVAN的核酸克隆到如上所述的植物表达载体中，并重复整个过程从而最终获得共表达UGT72E2和VpVAN的转基因烟草植物。收获来自最终转基因植物的植物材料并将其裂解并且测定来自转基因植物的叶材料中的香草醛葡糖苷含量。野生型烟草植物中未见香草醛葡糖苷。
实施例5
提高香草醛的产生
由于酵母阿魏脱羧酶活性，向酵母施加如实施例2中所述的阿魏酸还导致产生高浓度的芳香族化合物4-乙烯基愈创木酚。酿酒酵母的阿魏酸脱羧酶(FADase)属于超家族PAD并通过非氧化脱羧作用催化阿魏酸转化为4-乙烯基愈创木酚。
为了提高香草醛的产生，使用常规技术在VpVAN转化的酵母中敲除FADase基因。特别地，在上文实施例2中所述的酵母菌株中敲除FADase基因。
分别使用具有与PAD1和FDC1前端和末端同源的74-77bp尾部的引物，通过PCR扩增乳酸克鲁维酵母菌(Klyveromyces lactis)LEU2(亮氨酸营养缺陷型选择标记物)来中断酿酒酵母的相邻的PAD1和FDC1基因。然后用PCR产物转化酵母菌株，从而产生不具有PAD1和FDC1活性并能在未补充有亮氨酸的平板上生长的转化株。
使用以下引物：
LEU2△pad1△fad1_F
AACATAATGCTGCAAATATAGATTGATTTCAATCTACGGAGTCCAACGCATTGAGCAGCTTCAATTGAGTAGATatgtctaagaatatcgttgtcctaccgg(SEQ ID NO：19)
LEU2△pad1△fad1_R
CGTGGAGTATAAAAGTTCGGAAAATTTTATTTAAAATCTGATTATATGGTTTTTCTTCCGTAGAAAGTCTATGGCAAttaagccaagatttccttgacagccttggcgatagc(SEQ ID NO：20)
测定在表达VpVAN(SEQ ID NO：1)和UGT72E2(SEQ ID NO：3)两者但具有中断的PAD1和FDC1基因的酵母(在本文中，也将该酵母菌株称为VpVAN+AtUGt72E2△pad1△fad1)中产生的4-乙烯基愈创木酚葡糖苷。结果在图9中提供。显然，VpVAN+AtUGt72E2△pad1△fad1酵母菌株不产生4-乙烯基愈创木酚葡糖苷，而表达VpVAN(SEQ IDNO：1)和UGT72E2(SEQ ID NO：3)的酵母(称为VpVAN+AtUGt72E2)具有高表达。
实施例6
在酵母中产生香草醛
为了不用向培养基中添加阿魏酸就能产生香草醛，用编码参与阿魏酸合成的酶的核酸进一步转化VpVAN转化的酵母。
菌株1
用如实施例3所述制备的编码SEQ ID NO：1的VpVAN之核酸和编码SEQ ID NO：3的拟南芥UGT72E2之核酸转化的酿酒酵母，其中以下的核酸各自在启动子的控制下，所述启动子指导在酿酒酵母中的表达：
1.苯丙氨酸氨裂合酶(Vannelli等2006，Shin等2012)
2.拟南芥CYP73A5(GenBank登录号：U37235)
3.酪氨酸氨裂合酶(Vannelli等2006，Shin等2012)
4.4-香豆酸-CoA连接酶拟南芥4-香豆酸：CoA连接酶3(GenBank登录号AF106088_1)
5.红花烟草莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶(GenBank登录号Q8GSM7)
6.拟南芥对-香豆酸3-羟化酶(CYP98A3)(GenBank登录号：AEC09893.1)
7.拟南芥咖啡酰-CoA O-甲基转移酶(GenBank登录号Q9C5D7)
菌株2
用如实施例3所述制备的编码SEQ ID NO：1的VpVAN的核酸和编码拟南芥SEQ ID NO：3的UGT72E2的核酸转化的酿酒酵母，其中以下的核酸各自在启动子的控制下，所述启动子指导在酿酒酵母中的表达：
1.苯丙氨酸氨裂合酶(Vannelli等2006，Shin等2012)
2.拟南芥CYP73A5(GenBank登录号：U37235)
3.4-香豆酸-CoA连接酶拟南芥4-香豆酸：CoA连接酶3(GenBank登录号AF106088_1)
4.红花烟草莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶(GenBank登录号Q8GSM7)
5.拟南芥对-香豆酸3-羟化酶(CYP98A3)(GenBank登录号：AEC09893.1)
6.拟南芥对-香豆酸3-羟化酶(CYP98A3)(SEQ ID NO：7)，
使所转化的酵母细胞在含有半乳糖的合成培养基中培养并从生长培养基中分离香草醛葡糖苷。
实施例7
在推定的前肽存在和缺乏的情况下香草醛合酶的催化活性
使用GenBank的一般序列同一性搜索表明VpVAN序列示出了与半胱氨酸蛋白酶的高序列同一性。发现属于半胱氨酸蛋白酶的aleurain类(MEROPS-肽酶数据库)的油棕(Elaeis guineensis)半胱氨酸蛋白酶具有最高序列同一性(77％)。有趣的是，比对明确地证明VpVAN序列含有蛋白酶活性所需的三个关键的活性位点残基(Fan，J等Expression of asenescence-associated cysteine protease gene related to peel pitting ofnavel orange(Citrus sinensis L.Osbeck.Plant Cell Tiss Org 98，281-289(2009))。为了测试在缺乏前肽的情况下酶活性是否增强或者其是否改变了底物特异性，我们从VpVAN上截短前137个氨基酸(vp△137van)并从VpVAN上截短前61个氨基酸。使用偶联转录/翻译(TNT)测定在体外测试了酶的活性。因此，Wt VpVAN编码SEQ ID NO：1的多肽，wt vp△sp van编码SEQ IDNO：17的多肽，vp△137van编码SEQ ID NO：1的第138至356位氨基酸并且vp△61van编码SEQ ID NO：1的第62至356位氨基酸。
将用于PCR产生的DNA的快速偶联转录/翻译试剂盒(Promega)用于直接从PCR产物产生目标蛋白质。包括L-[35S]-甲硫氨酸以允许监测放射性标记的蛋白质，所述放射性标记的蛋白质在通过SDS-PAGE分离之后形成并通过在磷屏屏幕上孵育干燥的凝胶48小时可视化，用STORM 860分子成像仪(Molecular Dynamics)来扫描所述磷屏屏幕。
在400mM Tris/HCL(pH 8)、20mM MgCl2和2.5mM二硫苏糖醇(DTT)(总体积：50μL)中，通过用0.5mM至5mM的以下底物孵育等分试样(10μl)来分析在偶联的体外转录/翻译测定中产生的蛋白质的酶催化能力：阿魏酸(Sigma)、对香豆酸(Sigma)、咖啡酸(Sigma)、阿魏酸葡糖苷、对-香豆酰葡糖苷、咖啡酸葡糖苷、咖啡酰-辅酶A(MicroCombiChem e.K)、对-香豆酰-辅酶A(MicroCombiChem e.K)、阿魏酰-辅酶A(MicroCombiChem e.K)或者芥子基-辅酶A(MicroCombiChem e.K)。在2.5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1mM ATP和0.1mM NAD+存在和缺乏的情况下进行酶测定。在特定时间点取出等分试样(10μl)，通过添加MeOH(25μL，25％(v/v))并加热(45℃，15分钟)来终止酶活性。将样品在冰上冷却(30分钟)，在微量滴定过滤板(Merck Millipore)中离心(10.000转，10分钟)，最后通过LC-MS分析滤液。
结果在图6中示出。实验表明通过除去N-末端序列的VpVan的处理对于阿魏酸葡糖苷酶的活性不是必需的(参见图6)。
实施例8
在体内存在和缺乏推定的前肽的情况下如在烟草中瞬时表达之后所分析的香草醛合酶的催化活性
在缺乏任何外源添加的底物的情况下，还通过在本氏烟草叶中的瞬时表达来评估体内VpVAN(包括ER靶向信号肽)表达后所观察的生物学活性。将基因构建体转移到根癌土壤杆菌中并将其与包含p19基因沉默抑制子的根癌农杆菌菌株共浸润。LC-MS图谱示出了VpVAN依赖的香草醇葡糖苷的形成。所述香草醇葡糖苷通过醇脱氢酶(EC1.1.1.1)和后续的香草醇的伯醇基葡糖基化来还原香草醛而产生。对于在非香荚兰属植物中通过引入香草醛合酶之香草醛葡糖苷的生物技术产生，则优选的是，所述宿主生物共表达UGT，在将所形成的游离的香草醛还原为香草醇之前，所述UGT有效地使所形成的游离的香草醛葡糖基化为相应的葡糖苷。
此外，在本研究中还包括wt vpΔ137van(编码SEQ ID NO：1的第138至356位氨基酸)和wt vpΔ66van(编码SEQ ID NO：1的第67至356位氨基酸)以研究VAN二级修饰的重要性。
如下获得了上文所述的本氏烟草叶中的VpVAN及其截短形式的瞬时表达。通过离心收获含有包含目标cDNA(Wt VpVAN或wt vpΔ137van或wt vpΔ61van)的重组pJAM1502载体的根癌农杆菌菌株AGL1和携带包含基因沉默抑制子蛋白19(p19)的重组pJAM1502载体的根癌菌农杆菌株AGL1的过夜培养物，并将其重悬(OD600＝2.0)在10mM pH 5.5的MES、10mM MgCl2和100μM乙酰丁香酮中。在孵育(4小时，室温)之后，用两种根癌农杆菌菌株共浸润在24℃(白天)和17℃(夜间)下生长的3周龄的本氏烟草植物叶。在4天或5天之后，从浸润的叶中冲压出叶子圆片(直径1cm)并用60％(v/v)的MeOH萃取代谢产物以用于LC-MS分析。结果在图7A)中示出。
发现所有三个构建体的引入均导致香草醇葡糖苷的产生。
VpVAN序列示出了与属于半胱氨酸蛋白酶家族(参见上文)的蛋白质的高序列同一性。我们鉴定了属于烟草的半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白质，其中氨基酸序列与VpVAN的同一性为71％(SEQ ID NO：22)。准备比对(参见图10)。制备构建体，其中将VpVAN的信号肽(SEQ ID NO：1的第1至21位氨基酸)替换为使用signalP 4.1软件(可得自生物序列分析中心，丹麦技术大学)鉴定的SEQ ID NO：22的信号肽。该信号肽是SEQ ID NO：22的第1至21位氨基酸。鉴定断裂位点在SEQ ID NO：1的第135至141位氨基酸，其中断裂在第137位残基(DGV/LPVT)之后。使用图10的比对将与SEQ ID NO：1的第135至141位氨基酸对应的SEQID NO：22的氨基酸鉴定为SEQ ID NO：22的第140至146位氨基酸并且用SEQ ID NO：22的第140至146位氨基酸来替换SEQ ID NO：1的第135至141位氨基酸。因此，用来自烟草半胱氨酸蛋白酶的信号肽和蛋白酶断裂位点来替换所述信号肽和蛋白酶断裂位点。由此得到的多肽由[SEQ IDNO：22的第1至21位氨基酸]-[SEQ ID NO：1的第22至134位氨基酸-[SEQ ID NO：22的第140至146位氨基酸]-[SE ID NO1的第142至356位氨基酸]组成。本文将编码该蛋白的核酸称为vp nbΔspΔ137van并作为SEQ ID NO：24提供。对于野生型VpVAN，基本上如本实施例的上文中所述的将该基因构建体转移到根瘤农杆菌中并浸润到烟草中，并通过LC-MS图谱来分析香草醇葡糖苷产生。结果在图7B中示出。
实施例9
在烟草中瞬时表达之后在体内监测的GhVAN(来自欧活血丹的香草醛合酶)的催化活性
发现VpVAN序列示出了与GhVAN的71％的氨基酸序列同一性，所述GhVAN为从属于唇形科的欧活血丹(地面常春藤)克隆的新基因。将GhVAN的序列作为SEQ ID NO：21提供。由欧活血丹释放的挥发性组分的研究表明这种植物释放香草醛的痕迹(N Radulovic 2010)。
基本上如实施例8中所述进行的在烟草中GhVAN的瞬时表达，证明该基因的表达导致在烟草中香草醇葡糖苷的积累，即，所述酶与VpVAN具有相似的功能特性(参见图8)。
参考文献
Radulovic N，Dordevic N，Markovic M，Palic R.Volatile constituents of Glechomahirsute Waldst.&Kit.and G.hederacea L.(Lamiaceae).Bulletin of the ChemicalSociety of Ethiopia 24：67-76
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Wen-Jun S.，Forde B.G.(1983)Nucleic Acids Res.17：8385.

Claims (42)

1.产生香草醛、香草醇、香草醛葡糖苷和/或香草醇葡糖苷的方法，所述方法包括：
a)提供微生物，其中所述微生物
i.能够产生阿魏酸和/或阿魏酸葡糖苷；并且
ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养基包含至多1mM，例如至多0.5mM、例如至多0.01mM的香豆酸，例如不合可检测的香豆酸。
3.微生物，其中所述微生物：
i.能够产生阿魏酸；并且
ii.包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法或微生物，其中所述微生物选自细菌和真菌。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法或微生物，其中所述微生物是酵母。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法或微生物，其中所述微生物包含编码参与阿魏酸合成的酶的至少一种异源核酸。
7.根据权利要求6所述的方法或细胞，其中所述参与阿魏酸合成的酶选自：苯丙氨酸氨裂合酶、反式肉桂酸4-单加氧酶、酪氨酸氨裂合酶、4-香豆酰-3-羟化酶、咖啡酸O-甲基转移酶、苯丙氨酸氨裂合酶、反式肉桂酸4-单加氧酶、香豆酸-CoA连接酶、莽草酸O-羟基肉桂酰转移酶、4-香豆酰-3-羟化酶、咖啡酰-CoA O-甲基转移酶、咖啡酸O-甲基转移酶和黄酮3′-O-甲基转移酶。
8.根据权利要求中任一项所述的方法或根据权利要求中任一项所述的细胞，其中所述参与阿魏酸合成的酶是香草醇氧化酶。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括在包含丁香酚的培养基中培养所述微生物。
10.产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供微生物，其中所述微生物包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)在阿魏酸和/或阿魏酸衍生物的存在下，在支持所述微生物生长的培养基中培养所述微生物；以及
c)从所述微生物和/或从所述培养基中分离香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤b)包括在阿魏酸的存在下培养所述微生物。
12.根据权利要求8至9中任一项所述的方法，其中所述培养基包含至少1mM、优选至少3mM、例如至少5mM的阿魏酸。
13.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中所述培养基包含糖蜜或由糖蜜组成。
14.用于产生香草醛和/或香草醛衍生物的方法，所述方法包括：
a)提供阿魏酸和/或阿魏酸衍生物；
b)使所述阿魏酸和/或阿魏酸衍生物与香草醛合酶相接触，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶，
从而生产香草醛和/或香草醛衍生物。
15.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法在体外进行。
16.根据权利要求中任一项所述的方法，其中所述阿魏酸衍生物是阿魏酸葡糖苷并且所述香草醛衍生物是香草醛葡糖苷。
17.产生香草醛、香草醇、香草醇葡糖苷和/或香草醛葡糖苷的方法，所述方法包括：
a)提供包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)培养所述植物；以及
c)从所述植物中分离香草醛。
18.植物，其包含编码香草醛合酶的异源核酸和编码葡糖基转移酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶。
19.根据权利要求17所述的方法或根据权利要求18所述的植物，其中所述植物是双子叶植物。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的方法或植物，其中所述植物是红花烟草(Nicotiana tabacum)。
21.根据权利要求17至19中任一项所述的方法或植物，其中所述植物选自鸭跖草类和藜科(chenopodiaceae)。
22.产生动物饲料的方法，所述方法包括：
a)提供包含编码香草醛合酶的异源核酸的植物，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)培养所述植物；以及
c)将所述植物加工成动物饲料。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物为禾本科(Poaceae或Gramineae)。
24.产生食物产品的方法，所述方法包括：
a)提供包含可食用部分的植物，其中所述植物包含编码香草醛合酶的异源核酸，其中所述香草醛合酶是能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛的酶；以及
b)培养所述植物；以及
c)收获所述可食用部分；
从而得到具有香草醛口味的食物产品。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述植物是番茄。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法、微生物或植物，其中所述香草醛合酶是SEQ ID NO：1的香草醛合酶或其功能同源物，所述功能同源物与所述SEQ ID NO：1的香草醛合酶共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％的序列同一性。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的方法、植物或微生物，其中所述香草醛合酶是SEQ ID NO：21的香草醛合酶或其功能同源物，所述功能同源物与所述SEQ ID NO：21的香草醛合酶共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％的序列同一性。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的方法、植物或微生物，其中香草醛合酶是截短的香草醛合酶，其能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛，并且其中所述截短的香草醛合酶是：
a.缺失最N端1至150个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
b.缺失最N端21至137个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
c.缺失最N端120至140个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
d.缺失最N端130至140个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
e.缺失最N端21至140个氨基酸的SEQ ID NO：21的香草醛合酶，
f.缺失最N端21个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
g.缺失最N端61个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
h.缺失最N端137个氨基酸的SEQ ID NO：1的香草醛合酶，
i.缺失最N端21个氨基酸的SEQ ID NO：21的香草醛合酶，
j.缺失最N端140个氨基酸的SEQ ID NO：21的香草醛合酶，
k.与a)至j)中任一种共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％的序列的同一性的功能同源物，其中所述功能同源物能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
29.根据权利要求1至25中任一项所述的方法、植物或微生物，其中香草醛合酶是截短香草醛合酶，其能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛，并且其中所述截短的香草醛合酶是：
a)包含SEQ ID NO：1的第22至356位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
b)包含SEQ ID NO：1的第138至356位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
c)包含SEQ ID NO：21的第22至359位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
d)包含SEQ ID NO：21的第141至359位氨基酸或由其组成的香草醛合酶，
e)与a)至d)中任一种共享至少70％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少98％的序列同一性的功能同源物，其中所述功能同源物能够催化阿魏酸的侧链断裂以形成香草醛。
30.根据权利要求1至25中任一项所述的方法、植物或微生物，其中所述香草醛合酶是下式的多肽：
[信号肽]-X-[断裂位点]-[截短的香草醛合酶]
其中X是接头序列。
31.根据权利要求30所述的方法、植物或微生物，其中所述截短的香草醛合酶如权利要求27至28中任一项所限定。
32.根据权利要求30至31中任一项所述的方法、植物或微生物，其中所述信号肽是对宿主生物为内源性的蛋白质的信号肽。
33.根据权利要求30至32中任一项所述的方法、植物或微生物，其中所述断裂位点是对于宿主生物为内源性的蛋白质的断裂位点。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法、植物或微生物，其中所述微生物或所述植物还包含编码葡糖基转移酶的异源核酸。
35.根据权利要求34所述的方法、植物或微生物，其中所述葡糖基转移酶是UDP-葡萄糖：糖苷配基-葡糖基转移酶。
36.根据权利要求34至35中任一项所述的方法、植物或微生物，其中所述葡糖基转移酶是能够催化葡萄糖转移至香草醛从而形成香草醛葡糖苷的葡糖基转移酶。
37.根据权利要求34所述的方法或微生物，其中所述葡糖基转移酶是SEQ ID NO：3的UGT72E2或与其共享至少80％序列同一性的其功能同源物。
38.根据权利要求1至2、4至17和19至37中任一项所述的方法，其中所述方法是产生香草醛的方法。
39.根据权利要求1至2、4至17和19至38中任一项所述的方法，其中所述方法包括从所述微生物和/或从所述培养基和/或从所述植物中分离香草醛葡糖苷的步骤，并且其中所述方法包括使所述香草醛葡糖苷去葡糖基化的另外的步骤。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述使香草醛葡糖苷去葡糖基化的步骤包括使所述香草醛葡糖苷与葡糖苷酶相接触。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述葡糖苷酶是β-葡糖苷酶。
42.根据权利要求1至2、4至17和19至37中任一项所述的方法，其中所述方法是产生香草醛葡糖苷的方法。
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