ES2660301T3 - Glicosiltransferasa que glicosila ácido flavokermésico y/o ácido kermésico - Google Patents

Glicosiltransferasa que glicosila ácido flavokermésico y/o ácido kermésico Download PDF

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Abstract

Un polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado capaz de: (I): conjugar glucosa activada con un nucleótido a ácido flavokermésico (FK); y/o (II): conjugar glucosa activada con un nucleótido a ácido kermésico (AK). y donde el polipéptido de tipo glicosiltransferasa es al menos un polipéptido seleccionado del grupo constituido por: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 70% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 70% con los aminoácidos 20-468 de la SEQ ID NO: 2; (c) un polipéptido que está codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de rigurosidad al menos media con (i) los nucleótidos 1-1548 de la SEQ ID NO:1 o (ii) una hebra complementaria de (i); y (d) un fragmento de los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2, que presenta la actividad de glicosiltransferasa que se ha especificado en (I) y/o (II).

Description

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donde el método comprende los siguientes pasos:
(i): insertar una secuencia de polinucleótido que codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 70% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2 (preferentemente un fragmento de una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90% con los aminoácidos 1515 de la SEQ ID NO:2, más preferentemente un fragmento de una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 99% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2) donde el fragmento comprende al menos 75 aminoácidos (preferentemente al menos 100 aminoácidos, más preferentemente al menos 150 aminoácidos y aún más preferentemente al menos 468 aminoácidos), en otra secuencia de polinucleótido derivada de una glicosiltransferasa con el fin de construir de este modo una secuencia de polinucleótido híbrido recombinante novedoso;
(ii): expresar el polipéptido híbrido novedoso que está codificado por la secuencia de polinucleótido híbrido recombinante novedoso del paso (i);
(iii): aislar el polipéptido híbrido novedoso expresado del paso (ii);
(iv): evaluar si el polipéptido híbrido novedoso aislado del paso (iii) es capaz de:
(I): conjugar glucosa con ácido flavokermésico (FK); y/o
(II): conjugar glucosa con ácido kermésico (AK); y
(v) si la prueba del paso (iv) da positivo, entonces se ha construido el polipéptido de tipo glicosiltransferasa híbrido aislado novedoso capaz de:
(I): conjugar glucosa con ácido flavokermésico (FK); y/o
(II): conjugar glucosa con ácido kermésico (AK).
DEFINICIONES
Todas las definiciones de términos relevantes están de acuerdo con lo que sobreentendería el experto respecto al contexto técnico relevante.
El término «aglicón» denota la parte que no es un carbohidrato de la forma glicosilada correspondiente del aglicón. Cuando el azúcar es glucosa, el aglicón se puede denominar aglucón. Además, cuando el azúcar es glucosa, se puede utilizar el término glucosilado en lugar de glicosilado. Cuando el aglicón está glicosilado en un grupo hidroxilo, generalmente se crea lo que se denomina un enlace O-glicosídico, es decir, lo que se denomina un O-glicósido (u Oglucósido si el azúcar es glucosa). Cuando el aglicón está glicosilado mediante un enlace carbono-carbono, se puede denominar un enlace C-glicosídico, es decir, lo que se denomina un C-glicósido (o C-glucósido si el azúcar es glucosa).
El término «glicósido» denota un compuesto que cuando se somete a hidrólisis puede dar un azúcar y un residuo que no es un azúcar (aglicón), p. ej., los glucósidos pueden dar glucosa y los galactósidos pueden dar galactosa.
El término «glicosiltransferasa» denota una enzima capaz de conjugar un azúcar activado con un nucleótido a un compuesto (p. ej., un compuesto de tipo aglicón). El azúcar puede ser, p. ej., los isómeros D y L de la galactosa, glucosamina, N-acetilglusamina, xilosa, ácido glucurónico, ramnosa, arabinosa, manosa o glucosa. Como alternativa, el azúcar puede ser un derivado de tipo carbohidrato tal como, p. ej., inositol, olivosa, rodinosa, etc. disponible como difosfatos de nucleótidos. Además, el azúcar puede ser, p. ej., un monosacárido, un disacárido o un trisacárido. En el caso de oligo-y polisacáridos, los azúcares se enlazan uno a uno, p. ej., implicando el uso de una o varias glicosiltransferasas. Si el azúcar es glucosa, la glicosiltransferasa se puede denominar glucosiltransferasa.
Cuando la glicosiltransferasa conjuga un azúcar activado con un nucleótido a un compuesto mediante un enlace Cglicosídico, se puede denominar una C-glicosiltransferasa.
Cuando la glicosiltransferasa conjuga un azúcar a un aglicón mediante un enlace O-glicosídico, se puede denominar una O-glicosiltransferasa.
La expresión «se hibrida», en relación con un polinucleótido que se hibrida en condiciones de rigurosidad al menos media con (i) los nucleótidos 1-1548 de la SEQ ID NO:1 o (ii) una hebra complementaria de (i), se refiere a la secuencia de nucleótidos que se hibrida con una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o su hebra complementaria en condiciones de rigurosidad de media a muy alta. Las moléculas con las cuales se hibrida la sonda de ácido nucleico en estas condiciones se pueden detectar utilizando, p. ej., una película de rayos X.
En la presente, las condiciones de rigurosidad relevantes para la hibridación son las condiciones de rigurosidad que sobreentendería normalmente el experto que son relevantes, es decir, para las condiciones de rigurosidad media, las condiciones que el experto sobreentendería que son condiciones de rigurosidad media. El experto estará familiarizado
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con las condiciones de rigurosidad relevantes para la hibridación; remítase, p. ej., a (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2.a edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).
De acuerdo con la técnica, para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, unas condiciones de rigurosidad de muy baja a muy alta se definen como una prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, un 0.3% de SDS, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y troceado, y o bien un 25% de formamida para rigurosidades muy bajas y bajas, un 35% de formamida para rigurosidades medias y medias-altas, o un 50% de formamida para rigurosidades altas y muy altas, y a continuación procedimientos de inmunotransferencia de Southern estándar durante 12-24 horas de forma óptima.
Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material portador se lava finalmente tres veces, cada una de ellas durante 15 minutos utilizando 2X SSC y un 0.2% de SDS, preferentemente al menos a 45 °C (rigurosidad muy baja), más preferentemente al menos a 50 °C (rigurosidad baja), más preferentemente al menos a 55 °C (rigurosidad media), más preferentemente al menos a 60 °C (rigurosidad media-alta), aún más preferentemente al menos a 65°C (rigurosidad alta) y de la forma más preferida al menos a 70 °C (rigurosidad muy alta).
La expresión «in vitro» (latín: en vidrio) se refiere a estudios que se llevan a cabo utilizando componentes de un organismo que han sido aislados de su entorno biológico habitual con el fin de permitir un análisis más detallado o más adecuado del que se puede realizar con organismos enteros. Estos experimentos se denominan habitualmente «experimentos de tubo de ensayo». Por el contrario, los estudios in vivo son aquellos que se llevan a cabo con organismos vivos en su estado intacto normal.
La expresión «in vivo» (latín para «dentro del que vive») se refiere a experimentación que utiliza un organismo vivo entero en lugar de un organismo muerto o parcial, o un entorno controlado in vitro («dentro del vidrio», p. ej., en un tubo de ensayo o una cápsula de Petri).
La expresión «polinucleótido aislado» se refiere esencialmente en la presente a que el polinucleótido está aislado de su entorno natural; dicho de otro modo, que el preparado del polinucleótido está esencialmente exento de otro material polinucleotídico con el que se asocia de forma nativa. La secuencia de polinucleótido que codifica la glicosiltransferasa novedosa clonada/aislada descrita en la presente se muestra en la SEQ ID NO: 1 y se aisló del insecto Dactylopius coccus. Por consiguiente, según sobrentiende el experto, la expresión polinucleótido aislado no cubre el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 cuando se encuentra presente de forma natural en el genoma de Dactylopius coccus. La expresión «polinucleótido aislado» se refiere esencialmente a que el polinucleótido aislado se encuentra en una forma adecuada para su uso en sistemas de producción de proteínas modificadas genéticamente. De este modo, un polinucleótido aislado contiene como máximo un 10%, preferentemente como máximo un 8%, más preferentemente como máximo un 6%, más preferentemente como máximo un 5%, más preferentemente como máximo un 4%, más preferentemente como máximo 3%, aún más preferentemente como máximo un 2%, de la forma más preferida como máximo un 1% y de la forma aún más preferida como máximo un 0.5% en peso de otro material polinucleotídico con el que se asocia de forma nativa. La expresión «polinucleótido aislado» se puede denominar de forma alternativa en la presente «polinucleótido clonado».
La expresión «polipéptido aislado» se refiere esencialmente en la presente a que el polipéptido está aislado de su entorno natural. El polipéptido de tipo glicosiltransferasa novedoso que se muestra en la SEQ ID NO: 2 se aisló del insecto Dactylopius coccus. Por consiguiente, según sobrentiende el experto, la expresión «polipéptido aislado» no cubre el polipéptido de tipo glicosiltransferasa de la SEQ ID NO: 2 cuando se encuentra presente de forma natural en el genoma de Dactylopius coccus. La expresión «polipéptido aislado» denota un preparado del polipéptido que contiene como máximo un 10%, preferentemente como máximo un 8%, más preferentemente como máximo un 6%, más preferentemente como máximo un 5%, más preferentemente como máximo un 4%, como máximo 3%, aún más preferentemente como máximo un 2%, de la forma más preferida como máximo un 1% y de la forma aún más preferida como máximo un 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el que se asocia de forma nativa. La expresión «otro material polipeptídico con el que se asocia de forma nativa», en relación con el polipéptido de tipo glicosiltransferasa novedoso que se muestra en la SEQ ID NO: 2, se puede interpretar como que se relaciona con otro material polipeptídico con el que se asocia de forma nativa en Dactylopius coccus. En algún caso, se puede preferir que el «polipéptido aislado» se refiera a un polipéptido con una pureza de al menos un 20%, preferentemente una pureza de al menos un 40%, más preferentemente una pureza de al menos un 60%, aún más preferentemente una pureza de al menos un 80%, de la forma más preferida una pureza de al menos un 90% y de la forma aún más preferida una pureza de al menos un 95%, que se determina mediante SDS-PAGE.
La expresión «constructo de ácido nucleico», tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico, ya sea mono-o bicatenaria, que se aísla de un gen de origen natural o que se modifica para que contenga segmentos de ácidos nucleicos de una manera que no existiría de otro modo en la naturaleza. La expresión constructo de ácido nucleico es sinónima de la expresión «casete de expresión» cuando el constructo de ácido nucleico contiene las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. Según existe constancia en la técnica, las secuencias de control incluyen todos los componentes que son necesarios o favorables para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa o exógena respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Tales secuencias de control incluyen, sin carácter limitante, un líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de
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propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal y un terminador de la transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor y señales de detención de la traducción y la transcripción. Las secuencias de control se pueden proporcionar con conectores con el fin de introducir sitios de restricción específicos que faciliten el ligamento de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido.
La expresión «vector de expresión recombinante» se refiere a vectores de expresión recombinantes que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de detención de la traducción y la transcripción. Los diferentes ácidos nucleicos y secuencias de control que se han descrito anteriormente se pueden unir entre sí para producir un vector de expresión recombinante, el cual puede incluir uno o más sitios de restricción adecuados para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en tales sitios.
La expresión «célula hospedadora recombinante» se debe interpretar en la presente de acuerdo con la técnica. Según existe constancia en la técnica, las moléculas de polinucleótidos recombinantes (p. ej., ADN) son moléculas de polinucleótidos (p. ej., ADN) formadas mediante métodos de laboratorio de recombinación genética (tales como clonación molecular) para agrupar material genético de múltiples fuentes, con lo que se crean secuencias que no se encontrarían de otro modo en organismos biológicos. Según sobreentiende el experto, una célula hospedadora recombinante comprende moléculas de polinucleótidos recombinantes (p. ej., ADN) y, por consiguiente, no se sobreentenderá que una célula hospedadora recombinante cubra una célula de origen natural tal como, p. ej., una célula de Dactylopius coccus de origen natural.
La expresión «Identidad secuencial» se refiere al grado de relación existente entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos.
A los efectos de la presente invención, el grado de identidad secuencial entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 3.0.0 o una versión posterior. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la abertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). El resultado de la «identidad más larga» etiquetada por Needle (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula como se indica continuación:
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A los efectos de la presente invención, el grado de identidad secuencial entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, supra) según se implementa en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferentemente la versión 3.0.0 o una versión posterior. Los parámetros opcionales utilizados son una penalización por la abertura de un hueco de 10, una penalización por la extensión de un hueco de 0.5 y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). El resultado de la «identidad más larga» etiquetada por Needle (que se obtiene utilizando la opción no resumida) se utiliza como el porcentaje de identidad y se calcula como se indica a continuación:
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A continuación se describen las realizaciones de la presente invención únicamente a modo de ejemplo.
DIBUJOS
Figura 1: Presentación esquemática de la actividad de glicosiltransferasa relevante de la glicosiltransferasa novedosa clonada/aislada descrita en la presente de SEQ ID NO:2; según se ilustra en la figura, se determinó que era capaz de conjugar glucosa con los aglicones ácido flavokermésico (FK) y ácido kermésico (AK).
Figura 2: Producción de glucósidos del ácido flavokermésico y el ácido kermésico utilizando OsCGT y SbUGT85B1. Análisis de LC-MS de productos glucosilados formados en ensayos que contienen UDP-glucosa y ácido flavokermésico (FK) o ácido kermésico (AK). Lisado crudo procedente de la cepa Xjb de E.coli (control negativo) incubada con FK (A) o AK (C). Lisado crudo procedente de células Xjb que expresan OsCGT incubadas con FK (B) o AK (D). Lisado crudo procedente de células Xjb que expresan SbUGT85B1 incubadas con FK (E) o AK (F). FK (G) y AK (H) como sustratos solos. Se indican los cromatogramas de iones totales (TIC, por sus siglas en inglés) y cromatogramas de iones extraídos para m/z 313[M-H]-, m/z 329[M-H]-, m/z 475 [M-H]-, m/z 491 [M-H]-, correspondientes a FK, AK, FK-monoglucósido y AK-monoglucósido. Los tiempos de retención de los picos se indican en minutos.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
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Un polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado novedoso según se describe en la presente
Cuando en la presente se hace referencia a un polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado según se describe en la presente, se hace referencia a un polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado del primer aspecto de la invención y/o realizaciones relevantes en la presente de este.
Según se ha discutido anteriormente, la expresión «polipéptido aislado» se refiere esencialmente a que el polipéptido está aislado de su entorno natural. El polipéptido de tipo glicosiltransferasa novedoso que se describe en la presente según se muestra en la SEQ ID NO: 2 se aisló del insecto Dactylopius coccus. Por consiguiente, según sobrentiende el experto en el presente contexto, la expresión «polipéptido aislado» no cubre el polipéptido de tipo glicosiltransferasa de la SEQ ID NO: 2 cuando se encuentra presente de forma natural en el genoma de Dactylopius coccus.
Preferentemente, el polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado según se describe en la presente denota un preparado del polipéptido que contiene como máximo un 10%, preferentemente como máximo un 8%, más preferentemente como máximo un 6%, más preferentemente como máximo un 5%, más preferentemente como máximo un 4%, como máximo un 3%, aún más preferentemente como máximo un 2%, de la forma más preferida como máximo un 1% y de la forma aún más preferida como máximo un 0.5% en peso de otro material polipeptídico con el que se asocia de forma nativa.
Según sobreentiende el experto, la expresión «otro material polipeptídico con el que se asocia de forma nativa», en relación con el polipéptido de tipo glicosiltransferasa novedoso que se muestra en la SEQ ID NO: 2, se puede interpretar como que se relaciona con otro material polipeptídico con el que se asocia de forma nativa en Dactylopius coccus.
En algún caso, se puede preferir que el polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado según se describe en la presente se refiera a un polipéptido con una pureza de al menos un 20%, preferentemente una pureza de al menos un 40%, más preferentemente una pureza de al menos un 60%, aún más preferentemente una pureza de al menos un 80%, de la forma más preferida una pureza de al menos un 90% y de la forma aún más preferida una pureza de al menos un 95%, que se determina mediante SDS-PAGE.
Basándose, p. ej., en la información de la secuencia descrita en la presente, el hecho de obtener un polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado según se describe en la presente es un trabajo rutinario para el experto.
Esto se puede llevar a cabo, p. ej., mediante expresión recombinante en una célula hospedadora recombinante adecuada de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
Por consiguiente, no se cree necesario describir tales procedimientos de expresión recombinante conocidos estándar con gran detalle en la presente.
Preferentemente, el polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado según se describe en la presente es capaz de:
(I): conjugar glucosa con ácido flavokermésico (FK); y
(II): conjugar glucosa con ácido kermésico (AK).
Una realización preferida se refiere a donde el polipéptido de tipo glicosiltransferasa del primer aspecto es:
(a)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 80% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2; más preferentemente
(a)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2; aún más preferentemente (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 95% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2; y de la forma más preferida
(a)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 98% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2.
Puede preferirse que el polipéptido de tipo glicosiltransferasa del primer aspecto sea un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2.
Una realización preferida se refiere a donde el polipéptido de tipo glicosiltransferasa del primer aspecto es:
(b)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 80% con los aminoácidos 20-468 de la SEQ ID NO:2; más preferentemente
(b)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 90% con los aminoácidos 20-468 de la SEQ ID NO:2; aún más preferentemente
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(b)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 95% con los aminoácidos 20-468 de la SEQ ID NO:2; y de la forma más preferida
(b)
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de al menos un 98% con los aminoácidos 20-468 de la SEQ ID NO:2.
Puede preferirse que el polipéptido de tipo glicosiltransferasa del primer aspecto sea un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 20-468 de la SEQ ID NO:2.
Una realización preferida se refiere a donde el polipéptido de tipo glicosiltransferasa del primer aspecto es:
(c)
un polipéptido que está codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de rigurosidad al menos media-alta con (i) los nucleótidos 1-1548 de la SEQ ID NO:1 o (ii) una hebra complementaria de (i); más preferentemente
(c)
un polipéptido que está codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de rigurosidad al menos alta con (i) los nucleótidos 1-1548 de la SEQ ID NO:1 o (ii) una hebra complementaria de (i); y aún más preferentemente
(c)
un polipéptido que está codificado por un polinucleótido que se hibrida en condiciones de al menos mucha rigurosidad con (i) los nucleótidos 1-1548 de la SEQ ID NO:1 o (ii) una hebra complementaria de (i).
El hecho de preparar una variante de un polipéptido de tipo glicosiltransferasa aislado según se describe en la presente, es decir, una variante donde, p. ej., uno o más aminoácidos de, p. ej., la SEQ ID NO:2 haya sido modificado/alterado, es un trabajo rutinario para el experto.
Además, según tiene constancia el experto, si tales cambios de la variante no son demasiado drásticos, será razonable asumir que la enzima mantendría su actividad de GT relevante.
Una realización preferida se refiere a donde el polipéptido de tipo glicosiltransferasa del primer aspecto es:
(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2 o una variante de este, donde la variante comprende una alteración en una o más (varias) posiciones de la SEQ ID NO:2 y donde la variante comprende menos de 50 alteraciones, más preferentemente menos de 40 alteraciones, aún más preferentemente menos de 20 alteraciones y de la forma más preferida menos de 10 alteraciones.
En una realización preferida, la expresión «una alteración en una o más (varias) posiciones de la SEQ ID NO:2» se refiere a de 1 a 10 alteraciones en la SEQ ID NO:2.
De acuerdo con la técnica, el término «variante» significa en la presente un péptido que tiene una actividad de GT relevante que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (varias) posiciones. Una sustitución significa un reemplazo de un aminoácido que ocupa una posición por un aminoácido diferente; una deleción significa la eliminación de un aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa añadir 1-3 aminoácidos adyacentes a un aminoácido que ocupa una posición.
El aminoácido puede ser un aminoácido natural o no natural, por ejemplo, la sustitución con, p. ej., en particular los isómeros D (o formas D) de, p. ej., D-alanina podría ser posible teóricamente.
En una realización preferida, el polipéptido de tipo glicosiltransferasa del primer aspecto es una GT que está unida a la membrana o que es insoluble en agua.
Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de tipo glicosiltransferasa según se describe en la presente
Según se ha discutido anteriormente, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto y/o realizaciones relevantes en la presente de este.
La expresión «polinucleótido aislado» se puede denominar de forma alternativa en la presente «polinucleótido clonado».
Según se ha discutido anteriormente, la expresión «polinucleótido aislado» se refiere esencialmente a que el polinucleótido está aislado de su entorno natural; dicho de otro modo, que el preparado del polinucleótido está esencialmente exento de otro material polinucleotídico con el que se asocia de forma nativa. La secuencia de polinucleótido que codifica la glicosiltransferasa novedosa clonada/aislada descrita se muestra en la SEQ ID NO: 1 y se aisló del insecto Dactylopius coccus. Por consiguiente, según sobreentiende el experto, la expresión polinucleótido aislado no cubre el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 cuando se encuentra presente de forma natural en el genoma de Dactylopius coccus.
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Según se ha discutido anteriormente, un quinto aspecto de la presente invención se refiere a una célula hospedadora recombinante que comprende el constructo de ácido nucleico del tercer aspecto y/o realizaciones relevantes en la presente de esta.
La expresión «célula hospedadora recombinante» se debe interpretar en la presente de acuerdo con la técnica. Según existe constancia en la técnica, las moléculas de polinucleótidos recombinantes (p. ej., ADN) son moléculas de polinucleótidos (p. ej., ADN) formadas mediante métodos de laboratorio de recombinación genética (tales como clonación molecular) para agrupar material genético de múltiples fuentes, con lo que se crean secuencias que no se encontrarían de otro modo en organismos biológicos. Según sobreentiende el experto, una célula hospedadora recombinante comprende moléculas de polinucleótidos recombinantes (p. ej., ADN) y, por consiguiente, no se sobreentenderá que una célula hospedadora recombinante cubra una célula de origen natural tal como, p. ej., una célula de Dactylopius coccus de origen natural.
Basándose, p. ej., en la información de la secuencia que se describe en la presente, el hecho de preparar una célula hospedadora recombinante relevante es un trabajo rutinario para el experto, por ejemplo, basándose en la técnica anterior el experto conoce numerosas células hospedadoras recombinantes adecuadas diferentes que se han utilizado durante años como células hospedadoras recombinantes para, p. ej., la expresión de diferentes polipéptidos de interés.
La célula hospedadora recombinante puede ser cualquier célula adecuada tal como cualquier célula eucariota [p. ej., células de mamífero (tales como, p. ej., células de ovario de hámster chino (CHO)) o una célula vegetal] o cualquier célula procariota.
Se prefiere en particular cuando la célula hospedadora recombinante es una célula vegetal que produce ácido flavokermésico/ácido kermésico u otro compuesto relacionado tal como, p. ej., una célula vegetal de ruibarbo.
Preferentemente, la célula hospedadora recombinante es una célula seleccionada del grupo constituido por una célula de hongo filamentoso y una célula de un microorganismo.
Los hongos filamentosos incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (según definen Hawksworth et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano y otros polisacáridos complejos. Su crecimiento vegetativo se produce mediante la elongación de las hifas y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aeróbico. Por el contrario, el crecimiento vegetativo por parte de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se produce formando brotes a partir de un tallo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
Puede preferirse que la célula de hongo filamentoso sea una célula de una especie de, sin carácter limitante,
Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium y Trichoderma o un telemorfo o sinónimo de estas.
Una célula de Aspergillus preferida es Aspergillus niger o Aspergillus oryzae.
Una célula de un microorganismo preferida en la presente es una célula de un microorganismo seleccionada del grupo constituido por una célula de levadura y una célula procariota.
Una célula de levadura preferida es una célula de levadura seleccionada del grupo constituido por ascomicetos, basidiomicetos y hongos imperfectos. Preferentemente, una célula de levadura seleccionada del grupo constituido por ascomicetos.
Una célula de levadura de ascomicetos preferida seleccionada del grupo constituido por Ashbya, Botryoascus, Debaryomyces, Hansenula, Kluveromyces, Lipomyces, Saccharomyces spp, p. ej., Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp., Schizosaccharomyces spp.
Una célula de levadura preferida es una célula de levadura seleccionada del grupo constituido por Saccharomyces spp, p. ej., Saccharomyces cerevisiae, y Pichia spp.
Una célula procariota preferida se selecciona del grupo constituido por Bacillus, Streptomyces, Corynebacterium, Pseudomonas, bacterias del ácido láctico y una célula de E. coli.
Una célula de Bacillus preferida es B. subtilis, B. amyloliquefaciens o B. licheniformis.
Una célula de Streptomyces preferida es S. setonii o S. coelicolor.
Una célula de Corynebacterium preferida es C. glutamicum.
Una célula de Pseudomonas preferida es P. putida o P. fluorescens.
Un método para producir un glicósido del ácido flavokermésico (FK) y/o un glicósido del ácido kermésico (AK)
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-el glicósido producido en el paso (a1) es el compuesto DcII y se utiliza como intermedio para preparar ácido carmínico.
Según se discute en la presente, en los Ejemplos prácticos se puso en contacto in vitro ácido flavokermésico (FK) y/o ácido kermésico (AK) con la glicosiltransferasa de la SEQ ID NO:2. Para el experto, se puede ver como un trabajo rutinario el hecho de llevar a cabo un paso de puesta en contacto in vitro de este tipo.
La glicosiltransferasa de la SEQ ID NO:2 se expresó recombinantemente en una célula de levadura (remítase al Ejemplo práctico de la presente), por consiguiente, en un Ejemplo práctico de la presente se preparó una célula hospedadora de levadura recombinante que comprendía un gen de glicosiltransferasa recombinante que codificaba una glicosiltransferasa de SEQ ID NO:2.
Se cree que si se añadiera ácido flavokermésico (FK) y/o ácido kermésico (AK) en condiciones adecuadas a un medio de fermentación, el o los compuestos FK y/o AK entrarían en, p. ej., células de levadura fermentadas en el medio; por consiguiente, si, p. ej., las células de levadura son células hospedadoras de levadura recombinantes que comprenden un gen de glicosiltransferasa recombinante que codifica una glicosiltransferasa, entonces se produciría una puesta en contacto in vivo en una célula hospedadora recombinante de FK y/o AK con una glicosiltransferasa.
En una realización preferida, la puesta en contacto del paso (A) se realiza in vivo y la célula hospedadora recombinante es una célula de levadura, preferentemente donde la célula de levadura se selecciona del grupo constituido por Saccharomyces spp (p. ej., Saccharomyces cerevisiae) y Pichia spp.
Anteriormente se han descrito células hospedadoras recombinantes preferidas; estas células hospedadoras recombinantes preferidas también pueden ser células hospedadoras recombinantes preferidas en relación con el método del sexto aspecto de la presente invención.
En el presente contexto, se puede decir que se encuentra dentro del conocimiento común del experto el hecho de identificar una célula hospedadora recombinante adecuada para llevar a cabo el paso (A) de puesta en contacto in vivo del método del sexto aspecto y no se cree que sea necesario describir esto con gran detalle en la presente.
Anteriormente se ha discutido que las células hospedadoras recombinantes preferidas pueden ser, p. ej., una célula de un microorganismo o una célula de hongo filamentoso; estas células pueden ser células hospedadoras recombinantes preferidas en relación con el método del sexto aspecto.
Quizá sea posible obtener una célula hospedadora recombinante (p. ej., una célula hospedadora recombinante de un microorganismo) que comprenda un gen que codifique un producto implicado en la ruta biosintética que conduce al ácido flavokermésico (FK) y/o al ácido kermésico (AK) y una célula hospedadora recombinante de este tipo podría preferirse en la presente.
Por consiguiente, se puede preferir que la puesta en contacto en el paso (A) sea una puesta en contacto in vivo en una célula hospedadora recombinante que comprenda un gen de glicosiltransferasa recombinante que codifique una glicosiltransferasa y un gen que codifique un producto implicado en la ruta biosintética que conduce al ácido flavokermésico(FK) y/o al ácido kermésico (AK).
Según se discute en un Ejemplo práctico de la presente, la GT de SEQ ID NO:2 está unida a la membrana o es hidrófoba/insoluble in vivo y en agua. Cuando las células de producción o fracciones de células que contienen la GT unida a la membrana se separan del producto (p. ej., ácido carmínico), la GT puede no estar esencialmente presente en la fracción en la que esté presente el producto más soluble/producto hidrófilo. Esto supone una ventaja a la hora de obtener un producto final (p. ej., composición/producto de ácido carmínico) que esté de forma esencial totalmente exento de la GT recombinante.
Debido a que los sustratos glicosilados por la GT pueden ser aglicones hidrófobos, cabría esperar que los aglicones se acumularan parcialmente en las membranas y otras partes hidrófobas de las células de producción. Mediante el uso de una GT unida a la membrana, se obtiene una glicosilación más eficaz de los compuestos hidrófobos presentes en, p. ej., las membranas.
Por consiguiente, en una realización preferida, la glicosiltransferasa utilizada en el método del sexto aspecto es una GT que está unida a la membrana o que es insoluble en agua.
En una realización preferida, la glicosiltransferasa en el paso (A) del método del sexto aspecto es una glicosiltransferasa del primer aspecto y/o realizaciones relevantes en la presente de esta.
Según se discute en la presente, los resultados/datos identificados de los Ejemplos prácticos 4 muestran que las enzimas de tipo GT relevantes de la presente se pueden identificar en, p. ej., plantas de arroz y sorgo.
La secuencia del polipéptido de sorgo (número de ID de Genbank: AAF17077.1) se muestra como la SEQ ID NO: 4 de la presente.
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Posteriormente, la secuencia con codones optimizados de DcUGT2 se clonó y se expresó en levadura. La cepa de levadura heteróloga contiene una actividad enzimática unida a la membrana capaz de glucosilar ácido kermésico y ácido flavokermésico.
Después de obtener los datos de la huella de la masa peptídica a partir de una fracción proteica de D. coccus enriquecida con actividad de GT frente al ácido flavokermésico/ácido kermésico, hicimos coincidir las masas peptídicas con el conjunto de datos transcriptómicos e identificamos tres posibles UGT (DcUGT2, DcUGT4 y DcUGT5).
La expresión heteróloga de los tres candidatos en levadura reveló que únicamente una de estas UGT, denominada DcUGT2, era la responsable de la actividad de glucosilación observada frente al ácido flavokermésico/ácido kermésico en la fracción proteica de D. coccus.
Un tratamiento con Viscozyme del glucósido radiomarcado con C-14 generado mostró que era resistente a la hidrólisis, lo cual sugiere además que DcUGT2 es una C-GT, responsable de la producción de DCII y ácido carmínico.
Una LC-MS-MS mostró la formación de productos con el mismo tiempo de retención, espectro, masa molecular y patrón de degradación molecular que DcII y el ácido carmínico, respectivamente.
Conclusión
El resultado de este ejemplo 1 demostró que no era una tarea fácil aislar/clonar la enzima de tipo glicosiltransferasa relevante de la presente de SEQ ID NO: 2, la cual se puede denominar en la presente «DcUGT2».
Por ejemplo, las secuencias génicas identificadas del genoma y transcriptoma de insectos de D. coccus se analizaron para determinar su similitud respecto a secuencias de C-glicosiltransferasa de dominio público relevantes en la presente y el resultado fue negativo en el sentido de que ninguna de las secuencias génicas identificadas del genoma/transcriptoma mostró en la presente una similitud significativa respecto a secuencias de C-glicosiltransferasa relevantes en la presente de dominio público.
Sin embargo, aunque se podría decir que el análisis bioinformático de similitud de secuencias indica que el genoma de Dactylopius coccus no comprendería ningún gen que codifique una glicosiltransferasa relevante en la presente, los inventores de la presente siguieron investigando la cuestión y los inventores de la presente identificaron un extracto de Dactylopius coccus (incluidos extractos de organismos endosimbióticos presentes en D. coccus) con actividad de GT relevante en la presente y, mediante una combinación de pasos de prueba y purificación relevantes en la presente, los inventores fueron finalmente capaces de obtener una composición/fracción relativamente pura a partir de la cual fue posible obtener varias secuencias de aminoácidos parciales de posibles candidatos de enzimas GT.
Los inventores de la presente evaluaron la actividad de la glicosiltransferasa novedosa clonada/aislada descrita en la presente de SEQ ID NO: 2 (DcUGT2) y descubrieron que era capaz de conjugar glucosa con los aglicones ácido flavokermésico (FK) y ácido kermésico (AK); remítase a la Figura 1 de la presente.
Ejemplo 2 Evaluación de la actividad de GT frente a AK de UrdGT2 conocida en la técnica anterior
Según se ha discutido anteriormente, UrdGT2 se describe en el artículo de Baig et al. (Angew Chem Int Ed Engl. 27 de noviembre de 2006;45(46):7842-6).
Según se ha discutido anteriormente, este artículo describe que UrdGT2 es capaz de glicosilar diferentes moléculas de aglicones que se pueden considerar estructuralmente similares a los aglicones ácido kermésico (AK) y ácido flavokermésico (FK) relevantes en la presente.
Se clonó una versión sintética con codones optimizados de UrdGT2 para la expresión en E. coli y se expresó recombinantemente en E. coli. Se obtuvo un extracto proteico soluble crudo que contenía UrdGT2 recombinante, es decir, un extracto que comprendía UrdGT2.
La actividad de UrdGT2 GT se analizó in vitro utilizando o bien UDP-glucosa o TDP-glucosa como dador de azúcar y FK/AK como sustratos de tipo aglicón. No sé detectó ninguna actividad frente a estos aglicones, es decir, no se identificó ninguna actividad de GT relevante en la presente respecto a estos aglicones.
Sin embargo, se confirmó que UrdGT2 recombinante era activa, lo cual se demostró mediante la formación in vitro de un glucósido radiomarcado con C14 derivado de la glucosilación de un compuesto no identificado en el extracto crudo de E. coli.
Ejemplo 3 Actividad de GT en una planta de Aloe y una planta de Haworthia
Aislamiento y prueba de actividad de GT a partir de Aloe
1) La planta se lavó para eliminar partículas de tierra y se separó en: A) Raíz, B) Tejido foliar verde y C) el material de tipo gel procedente de la hoja.
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flavokermésico (MeOFK) y el éster etílico del ácido flavokermésico (EtOFK). Los números corresponden a los tiempos de retención (min) tras la separación mediante HPLC-MS de los glucósidos novedosos formados in vitro (Tabla 2).
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Los valores m/z de 475 y 491 son los mismos valores m/z que se obtienen para DcII y AC, respectivamente, solubilizados en soluciones similares. Ambos valores m/z son 162 (valor m/z de la glucosa en un glucósido) unidades más elevados que los valores m/z del FK y AK, lo cual indica que el resto de glucosa procedente de UDP-glucosa en el tampón de reacción ha sido transferido al aglicón mediante una GT en el extracto. Los valores m/z [M-H] de 489 y 503 también son 162 unidades más elevados que los valores m/z obtenidos con MeOFK y EtOFK, respectivamente, lo cual indica que ha sido añadida una unidad de glucosa tanto a MeOFK como a EtOFK mediante una GT presente en el extracto.
Conclusión
Los resultados de este ejemplo demuestran que las enzimas de tipo glicosiltransferasa (GT) relevantes de la presente pueden ser identificadas en plantas de Aloe y plantas de Haworthia.
Dicho de otro modo, las plantas de Aloe y las plantas de Haworthia comprenden una glicosiltransferasa que es capaz de glicosilar el ácido flavokermésico con el fin de producir un glicósido del ácido flavokermésico; y/o capaz de glicosilar el ácido kermésico con el fin de producir un glicósido del ácido kermésico.
Ejemplo 4 Actividad de GT en una planta de sorgo y de arroz
Según existe constancia en la técnica, las plantas de sorgo y de arroz comprenden glicosiltransferasas.
Según existe constancia en la técnica, algunas de las glicosiltransferasas de sorgo y arroz pueden glicosilar compuestos de tipo aglicón de bajo peso molecular.
Las glicosiltransferasas descritas en la técnica procedentes de plantas de sorgo y arroz presentan una identidad significativamente inferior a un 70% con los aminoácidos 1-515 de la SEQ ID NO:2 que se describe en la presente.
En la técnica existe constancia de si las glicosiltransferasas de plantas de sorgo y/o arroz serían una glicosiltransferasa relevante en la presente, es decir, una glicosiltransferasa capaz de glicosilar el ácido flavokermésico con el fin de producir glicósidos del ácido flavokermésico; y/o capaz de glicosilar el ácido kermésico con el fin de producir glicósidos del ácido kermésico.
Las glicosiltransferasas conocidas de sorgo (Sorghum bicolor), SbUGT85B1, con número de ID de Genbank AF199453.1 (sec. de nucleótidos) / AAF17077.1 (sec. de polipéptido), y de arroz (Oryza sativa), OsCGT, con número de ID de Genbank FM179712.1 (sec. de nucleótidos) / CAQ77160.1 (sec. de polipéptido), se expresaron en la cepa Xjb de E.coli y se prepararon extractos proteicos crudos de E.coli y se evaluaron para determinar su actividad de glucosilación sobre los sustratos ácido kermésico y ácido flavokermésico según describen Kannangara et al. (2011) y Augustin et al. (2012).
La Figura 2 muestra análisis de LC-MS de los productos glucosilados formados en ensayos que contenían un lisado crudo de una cepa Xjb de E.coli que expresaba o bien SbUGT85B1 u OsCGT, UDP-glucosa y ácido flavokermésico (FK) o ácido kermésico (AK). En los ensayos se utilizó como control negativo un extracto crudo procedente de la cepa Xjb de E.coli.
Se identificaron glicósidos de AK (491 m/z [M-H], el valor de m/z [M-H] del AC) para ambas glicosiltransferasas y glicósidos de FK (475 m/z [M-H], el valor m/z[M-H] de DcII) para OsCGT.
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Conclusión
El resultado de este ejemplo demuestra que las enzimas de tipo glicosiltransferasa (GT) relevantes de la presente pueden ser identificadas en plantas de sorgo y/o arroz.
Dicho de otro modo, las plantas de sorgo y/o arroz comprenden una glicosiltransferasa que es capaz de glicosilar el ácido flavokermésico con el fin de producir un glicósido del ácido flavokermésico; y/o capaz de glicosilar el ácido kermésico con el fin de producir un glicósido del ácido kermésico.
Ejemplo 5 Uso de actividad de GT o gen de GT endógenos
Según existe constancia en la técnica, las glicosiltransferasas capaces de glicosilar un peso molecular bajo están presentes en muchos organismos diferentes. Un método para poner en contacto la glicosiltransferasa de las células de un organismo con un compuesto de peso molecular bajo consiste en introducir uno o más genes que dirijan la biosíntesis del compuesto de peso molecular bajo y de este modo se posibilita que las células glicosilen el compuesto de peso molecular bajo. El compuesto de peso molecular bajo puede ser, p. ej., ácido flavokermésico o ácido kermésico o versiones modificadas de estas moléculas.
Se introducen uno o más genes que dirigen la biosíntesis del ácido flavokermésico o ácido kermésico o una versión modificada de estas moléculas en un organismo que contiene una glicosiltransferasa, p. ej., la planta de tabaco,
Nicotiana benthamiana.
Cuando el gen o genes se expresan transitoriamente de acuerdo con los métodos descritos en D'Aoust et al. (2008) en, p. ej., tejido vegetal, se produce el compuesto o compuestos de peso molecular bajo. Se producen células que expresan de forma estable el gen o genes y se seleccionan de acuerdo con los métodos descritos en Gelvin (2003).
En las células que contienen el gen o genes ya sean expresados de forma transitoria y/o expresados de forma estable, los compuestos de peso molecular bajo entran en contacto con las glicosiltransferasas endógenas, lo cual da como resultado la formación de uno o más glicósidos del ácido flavokermésico, ácido kermésico o versiones modificadas de estas moléculas.
La presencia de los glicósidos se demuestra mediante la extracción y los métodos analíticos descritos en el ejemplo
3.
Las muestras se preparan para LC/MS mediante el método de extracción descrito por Rauwald y Sigler (1994).
Conclusión
Los resultados de este ejemplo demuestran que las glicosiltransferasas endógenas presentes en las células de un organismo recombinante se pueden utilizar para convertir ácido flavokermésico, ácido kermésico o versiones modificadas de estas moléculas en glicósidos cuando un gen o genes que dirigen la biosíntesis de los aglicones se introducen en el organismo.
Dicho de otro modo, la introducción de un gen o genes que dirigen la biosíntesis de ácido flavokermésico, ácido kermésico, versiones modificadas de estas moléculas o compuestos relacionados de peso molecular bajo es un método para poner el compuesto de peso molecular bajo en contacto con glicosiltransferasas y, por lo tanto, un método para producir glicósidos del ácido flavokermésico, ácido kermésico o una versión modificada de estos compuestos.
REFERENCIAS
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Claims (1)

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