CN101113413A

CN101113413A - 一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法

Info

Publication number: CN101113413A
Application number: CNA2007100698032A
Authority: CN
Inventors: 陈启和; 何国庆; 朱建良; 阮晖; 章海锋
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2007-07-04
Filing date: 2007-07-04
Publication date: 2008-01-30
Anticipated expiration: 2027-07-04
Also published as: CN101113413B

Abstract

本发明公开了一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法，将黄绿蜜环菌(Armillaria luteo－virens)ZJUQH CGMCC No.1884进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到黄绿蜜环菌纤溶酶。本发明首次发现人工培育的黄绿蜜环菌(Armillaria luteo－virens)ZJUQH CGMCC No.1884能用于生产纤溶酶，生产的黄绿蜜环菌纤溶酶产品以廉价的农副产品豆粕、大豆粉和麸皮为主要原料，安全无毒，采用液体发酵方法生产，是真菌中报道的较高产酶菌株，提取纯化容易，黄绿蜜环菌无害，可以直接开发含菌体和酶液的冻干保健品，为开发利用新型食药用食用菌提供新思路和依据。

Description

一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法

技术领域

本发明专利属于生物工程领域，主要涉及一株产纤溶酶的黄绿蜜环菌及其生产制备方法。

背景技术

食药用真菌作为药物，在我国己有悠久的历史。早在两千多年前的东汉末期，世界上第一部药物专著《神农本草经)》中就记载了灵芝、获荃、猪等等真菌的药效；明代著名医学家李时珍在《本草纲目)》中收载了20多种真菌。现有的研究结果表明，己知对肉瘤和艾氏癌抑制率达60％～100％的真菌有近300种，分属51科70多个属，大多数真菌的抗肿瘤活性是具有特定结构的多糖和蛋白质结合多糖体。食药用真菌在我国资源丰富，是寻找新药物的宝贵资源库，国内外对食药用真菌多糖的开发利用发展很快，而对其它活性物质的研究较少，因此探讨其生物活性物质的人工培养就显得尤为重要。

纤溶酶是一类蛋白酶，对血栓中的纤维蛋白具有一定的降解特异性。已知许多微生物具有分泌蛋白酶的能力，对产生大量蛋白酶的微生物尤其是非致病微生物进行筛选，期望获得产生新型纤溶酶的微生物，具有实际意义。自从1987年日本学者须见洋行从日本传统发酵食品纳豆中提取出一种具有纤溶性质的酶一纳豆激酶(NK)以后，通过微生物发酵方式，特别是从传统发酵食品中生产纤溶酶引起了研究者们极大的兴趣。研究发现，微生物发酵产生的纤溶酶具有较高纤溶活性及良好的抗凝、溶栓作用，且不溶解血细胞，可通过口服给药，有望开发成为新一代溶栓、防栓药物；并且，微生物的生长速度快，生长条件易于控制，因而可以通过人工控制发酵条件来获得大量的目的产物。现在世界各国的发酵工业都比较发达，发酵产物的提取工艺也比较完善。此外，纤溶酶来源于传统食品，安全可靠无毒，适于制成针对血栓疾病患者食用的功能保健食品或药食两用品。因此，对由微生物及所分泌的纤溶酶类的研究将会为溶栓药物及食物的开发提供广阔的前景。

微生物是溶栓药物的重要来源，现已成功筛选到许多产生纤溶活性物质的菌株。如从枯草杆菌、链霉菌、白色假丝酵母、镰孢菌口、根霉、脉孢霉发酵物中均可分离出纤溶酶，其中以枯草芽孢杆菌和霉菌为主。最具代表性的就是豆豉纤溶酶，它是枯草杆菌产丝氨酸蛋白酶，其产生菌并非一种，来源不同的菌种在特性上有一定差异，有的菌种可以认为与纳豆杆菌同属一个菌群，变异较小，但有的则不能认为是同一菌群。由于豆豉纤溶酶具有较高纤溶活性及良好的抗凝、溶栓作用，且副作用小，因而对该酶产生菌的筛选与纯化成为目前研究热点。英国Walton Oaks等从粪链球菌中提取得到一种具有纤溶作用的中性金属内肽酶，分子量为19kD。该酶对产色底物FAGLA有高度契合性，它的活性受TLCKT和TPCK抑制作用不明显，但可被EDTA和Zn²⁺所抑制，体外溶栓实验证明该酶是一种不依赖纤溶酶原-纤溶酶系统的纤溶酶类。但由于该酶热稳定性较并，至今不未有很完善有效的提纯方法。我国研发人员也从链霉菌菌株Y405中，得到一种新型具纤溶活性的酶sw-l，分子量30kD，pH8.5。这种酶在49℃-37℃和pH4.0-9.0时具有较好的稳定性。sw-1可以直接降解纤维蛋白，是一种纤溶酶。通过体内及体外实验证明，sw-1对血栓有显著的降解效果。

密环菌(Armillariella mellea)被以食疗形式来预防与治疗心血管疾病，但一直不清楚其治疗的有效成份。黄绿蜜环菌属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属(Armillaria)一种著名的食药用真菌。主要分布于青海、西藏海拔3000～4300m的草原或高山草甸上，单生至群生，形成蘑菇圈。在天麻(Gastrodia elata Blume)生长过程中，黄绿蜜环菌是必不可少的共生菌。近年来国内外学者对同属的蜜环菌、发光假蜜环菌等研究报道较多，发现蜜环菌菌丝体和发酵液不仅具有与天麻相似的药理作用和临床疗效，而且从蜜环菌菌丝体提取物能在体外具有明显的抗突变能力、抑制肿瘤生长和抗心血管疾病的效果。国内对野生黄绿蜜环菌营养成分进行了初步的分析表明，富含氨基酸、蛋白质、多糖类、多肽类物质等营养及药用成分，具有较高保健和药效价值，被公认为最有开发利用价值的野生食药兼用菌类之一。但黄绿蜜环菌目前处于完全野生的状态，驯化栽培研究尚属起步阶段，其进一步的开发利用还有有待于深入研究。

发明内容

本申请人的在先发明专利申请200610155189.7中公开了一种黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH CGMCC No.1884。经研究发现该菌株既可以在葡萄糖、酵母膏合成培养基上生长，也可以在以麸皮和酵母膏、大豆浸出汁的粗培养基上生长产酶，其主要代谢产物为纤溶酶。

本发明提供一种黄绿蜜环菌纤溶酶及其生产方法。

一种黄绿蜜环菌纤溶酶的生产方法，通过如下方法制得：将黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH CGMCC No.1884进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到黄绿蜜环菌纤溶酶。

所述的发酵培养前菌种采用PDA培养基斜面保存，并在23℃预培养72小时。预培养后将菌种转移到摇瓶发酵培养基或生物发酵罐培养产纤溶酶。

所述的发酵培养采用液体发酵培养基，以重量百分比计，含有如下组份：

葡萄糖或麸皮 1～8％

酵母膏 1～4％

豆汁 10％

KH₂PO₄ 0.1～1.5％

MgSO₄ 0～0.6％

CaCl₂ 0～0.2％

余量的水；

采用1mol/L的盐酸调节培养基初始pH为4.0。

所述的豆汁制备方法：1重量份黄豆在9重量份水中浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁。

另外，液体发酵培养基中添加0.5～2％的吐温-80能提高该菌产纤溶酶能力。

所述的发酵培养接种量为1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，摇床转速为120-140r/min，培养72～120小时。

从发酵液中分离纯化得到黄绿蜜环菌纤溶酶过程分为酶的粗提纯和酶的精提纯。

酶的粗提纯：将发酵液经过高速冷冻离心后去除菌体得到上清液，上清液经分段盐析，将第二次盐析获得的沉淀物采用上清液体积的1/10～1/20的pH 7.5的巴比妥缓冲液溶解得到粗酶液。

所述的分段盐析分为两次，分别采用质量百分比浓度为45％和80％的硫酸铵溶液进行盐析。所述的高速冷冻离心的转速为10000～12000r/min，离心温度为4℃。

酶的精提纯：粗提纯得到的粗酶液经过Sephadex G-100(高150cm，1.5cm)柱层析，采用的洗脱液为pH 7.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液，收集目标酶活性较高(收集酶活在400～500IU/ml，其蛋白质含量在0.1mg/ml～1mg/ml洗脱液)洗脱液，将得到的洗脱液浓缩后使其酶活性提高10倍；浓缩后的洗脱液过DEAE-Sepharose离子柱(高30cm，1.5cm)，上样量控制在2ml，用0.02mol/L pH7.5和0.02mol/L pH8.0巴比妥缓冲液线性梯度洗脱，洗脱流速0.5ml/min，直至洗脱到检测出的蛋白质含量(OD 280nm处检测值接近或等于零)很低或接近没有，将得到的洗脱液浓缩10～20倍后冷冻干燥获得酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶固体粉样品。

采用分步收集器收集洗脱液，并测定收集管的蛋白质含量和酶活性，收集合并酶活较高的洗脱峰管(测定收集液的酶活和蛋白质含量，并确定酶活最大的峰点)。收集酶活在400～500IU/ml，其蛋白质含量在0.01mg/ml～0.1mg/ml洗脱液。

黄绿蜜环菌纤溶酶酶活测定方法采用纤维蛋白平板法，操作如下：

(1)、制备纤维蛋白平板

取0.25g琼脂糖加入50ml生理盐水中，加热溶解后，置45℃水浴中保温30min后，加入200单位/ml的凝血酶1ml，混匀。取0.2g血纤维蛋白原，溶于50ml巴比妥缓冲溶液中，置45℃水浴中保温5min。分别取5ml凝血酶溶液与5m血纤维蛋白原溶液混合均匀后快速倒入Φ9cm平皿中，水平放置30min后放入冰箱中密封备用。

(2)、绘制尿激酶标准曲线

将尿激酶标准(20，40，60，80，100，120，140，160 IU/mL)各10μL点样于新配置的纤维蛋白平板上，放置10min，移入37℃培养箱，保温18h后取出。测定溶圈的垂直直径，计算各溶圈面积。并以溶圈面积为纵坐标，以标准酶活力为横坐标作图，见图1。

(3)、粗酶酶活测定

取10μL粗酶液点于纤维蛋白平板，于37℃保温10～18h，测定溶解圈的大小，计算其最小直径与最大直径之积。求出待测粗酶样品酶活，公式如下：

每毫升样品的酶活力

D-表示标准尿激酶溶纤圈的直径

d-表示样品酶溶栓的直径

本发明的黄绿蜜环菌纤溶酶的表观分子量26kDa，等电点7.0，有直接溶解血栓和激活人纤溶酶原的双重作用。最适宜的作用温度和pH分别为35℃、7.5；酶在30℃-60℃间热稳定性良好，而在65℃以上酶活受到极大的影响；该酶在中性偏酸性环境下稳定性很高，低浓度钙离子、镁离子对于酶的稳定性很重要，EDTA严重抑制该纤溶酶活。

本发明首次发现人工培育的黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-virens)ZJUQH CGMCC No.1884能用于生产纤溶酶，生产的黄绿蜜环菌纤溶酶产品以廉价的农副产品豆粕、大豆粉和麸皮为主要原料，安全无毒，采用液体发酵方法生产，是真菌中报道的较高产酶菌株，提取纯化容易，黄绿蜜环菌无害，可以直接开发含菌体和酶液的冻干保健品，为开发利用新型食药用食用菌提供新思路和依据。

具体实施方式

各实施例均采用黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH CGMCCNo.1884作为原始菌种。

实施例1

培养基、培养方法和提取：

菌种在PDA培养基中斜面保存，首先将菌种在23℃培养72小时，再接种到液体发酵培养基上。

液体发酵培养基含有葡萄糖2％，酵母膏2％，豆汁10％(制备方法：10％黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，取汁)，KH₂PO₄ 1％，MgSO₄0.45％，pH 4。

接种量1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，摇床转速为140r/min，培养120小时，获得的最大酶活为310IU/ml。

酶的粗提纯：将发酵液在转速为12000r/min，温度为4℃，进行高速冷冻离心去除菌体得到上清液，上清液分别采用质量百分比浓度为45％和80％的硫酸胺溶液进行分段盐析，将第二次盐析获得的沉淀物经过pH 7.5的巴比妥缓冲液(体积为高速冷冻离心后得到的上清液的1/10)溶解得到粗酶液。

酶的精提纯：粗提纯得到的粗酶液经过Sephadex G-100(高150cm，1.5cm)柱层析，上样量控制在5ml，采用的洗脱液为pH 7.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液，收集目标酶活性较高的洗脱峰，合并该洗脱液浓缩使酶活提高10倍，浓缩后再过DEAE-Sepharose离子柱(高30cm，1.0cm)，上样量控制在2ml，用0.02mol/L pH7.5和0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液线性梯度洗脱，洗脱流速0.8ml/min，直至洗脱到检测出的蛋白质含量(OD280nm处检测值接近或等于零)很低或接近没有，收集酶活在400～600IU/ml，其蛋白质含量在0.01～0.1mg/ml洗脱液浓缩10倍后冷冻干燥，得到酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶，该酶的比活力为30000 IU/mg蛋白。

实施例2

液体发酵培养基含有麸皮2％，酵母膏2％，豆汁10％(制备方法：10％黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁)，KH₂PO₄ 1％，MgSO₄ 0.45％，0.1％CaCl₂，pH 4。接种量1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，摇床转速为140r/min，发酵120小时获得的最大酶活为450 IU/ml。

按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其表观分子大小为26KDa；该酶的比活力为40000 IU/mg蛋白。

实施例3

液体发酵培养基含有麸皮5％，酵母膏1％，豆汁10％(制备方法：10％黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁)，KH₂PO₄ 1％，MgSO₄ 0.5％，0.1％CaCl₂，pH 4。接种量为1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，摇床转速为140r/min，发酵120小时获得的最大酶活为517IU/ml。

按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其表观分子大小为26KDa；该酶的比活力为50000IU/mg蛋白。

实施例3

采用响应面优化方法获得的液体发酵培养基含有麸皮5％，酵母膏1％，豆汁10％(制备方法：10％黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁)，KH₂PO₄ 1％，MgSO₄ 0.5％，0.1％CaCl₂，吐温-80 1％，pH 4。接种量1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，摇床转速为140r/min，发酵120小时获得的最大酶活为617IU/ml。

按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其表观分子大小为26 KDa；该酶的比活力为61000 IU/mg蛋白。

实施例4

菌种在PDA培养基中斜面保存，首先将菌种在23℃培养72小时，再接种到3L液体发酵培养基中培养。

采用响应面优化方法获得的液体发酵培养基含有麸皮5％，酵母膏1.5％，豆汁10％(制备方法：10％黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁)，KH₂PO₄ 1％，MgSO₄ 0.5％，0.1％CaCl₂，吐温-80 1％，pH 4。5-L发酵罐装液为3L，接种量1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，生物发酵罐搅拌转速为200r/min，通气量1L/min，发酵120小时获得的最大酶活为650IU/ml。

按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其表观分子大小为26KDa；该酶的比活力为64000IU/mg蛋白。

Claims

1.一种黄绿蜜环菌纤溶酶的生产方法，其特征在于：将黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens)ZJUQH CGMCC No.1884进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到黄绿蜜环菌纤溶酶；

葡萄糖或麸皮 1～8％

酵母膏 1～4％

豆汁 10％

KH₂PO₄ 0.1～1.5％

MgSO₄ 0～0.6％

CaCl₂ 0～0.2％

余量为水；

所述的豆汁制备方法：1重量份黄豆在9重量份水中浸泡24h，煮沸30min，过滤取汁。

2.如权利要求1所述的生产方法制备的黄绿蜜环菌纤溶酶。

3.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵培养前菌种采用PDA培养基斜面保存，并在23℃预培养72小时，预培养后将菌种转移到摇瓶发酵培养基或生物发酵罐培养产纤溶酶。

4.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的发酵培养接种量为1×10⁸个孢子/ml，发酵温度28℃，摇床转速为120～140r/min，培养72～120小时。

5.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基采用1mol/L的盐酸调节初始pH为4.0。

6.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的液体发酵培养基中还含有0.5～2％的吐温-80。

7.如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的从发酵液中分离纯化得到黄绿蜜环菌纤溶酶过程分为酶的粗提纯和酶的精提纯；

酶的粗提纯：将发酵液经过高速冷冻离心后去除菌体得到上清液，上清液经分段盐析，将第二次盐析获得的沉淀物用pH7.5的巴比妥缓冲液溶解得到粗酶液；

酶的精提纯：将粗提纯得到的粗酶液经过Sephadex G-100柱层析，采用pH7.5的0.02mol/L磷酸盐缓冲液作为洗脱液，收集酶活在400-500IU/ml，其蛋白质含量在0.1～1mg/ml洗脱液，得到的洗脱液浓缩后过DEAE-Sepharose离子柱，用0.02mol/L pH7.5和0.02mol/L pH8.0巴比妥缓冲液线性梯度洗脱，收集酶活在400～500IU/ml，其蛋白质含量在0.01～0.1mg/ml洗脱液，将得到的洗脱液浓缩10～20倍后冷冻干燥获得酶活性较高的黄绿蜜环菌纤溶酶固体粉样品。

8.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述的高速冷冻离心的转速为10000～12000r/min，离心温度为4℃。

9.如权利要求7所述的生产方法，其特征在于：所述的分段盐析分为两次，分别采用质量百分比浓度为45％和80％的硫酸铵溶液进行盐析。