CN104212721A - 一种海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株及产出的纤溶活性化合物 - Google Patents

一种海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株及产出的纤溶活性化合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株海洋分离到的产纤溶活性化合物FGFC1的海洋微生物长孢葡萄穗霉菌FG216。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为CCTCC：M2012227。本发明还公开了利用该海洋微生物长孢葡萄穗霉菌FG216产出的纤溶活性化合物。该纤溶活性化合物FGFC1可极大地促进纤溶酶的溶纤活性，具有极好的成药性,在医药工业上有进一步研究和应用的前景。

Description

一种海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株及产出的纤溶活性化合物
技术领域
本发明涉及海洋微生物技术领域，特别是涉及一种海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株及由该海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株产出的纤溶活性化合物。
背景技术
血栓性疾病如急性心肌梗塞、脑血栓、肺血栓等是严重威胁人类健康，甚至危及生命的主要疾患之一。在发达国家，占人口死亡率的首位疾病是由于血栓所引的疾病及其并发症。目前，溶栓疗法是心肌梗塞和其它血栓性疾病的常规治疗方法，因此，溶栓药物的研究在国际上受到高度重视。现在使用的溶栓药物如链激酶(Streptokinase，SK)，尿激酶(Uropkinase，UK)和组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator，t-PA)等都存在半衰期短、易产生再栓塞，并且价格昂贵等问题，而且它们对纤维蛋白无特异性，产生血栓溶解的同时常伴有出血危险性。
针对溶栓药物应用中出现的上述问题，除了通过蛋白质工程、基因工程等对原有溶栓药物进行各种结构和功能上的改造，以开发新型的溶栓药物以外，探索具有新型溶血栓作用机理的促溶血栓化合物是心血管疾病研究的重要方向。
海洋是一个巨大的生物资源库，近年来从海洋动植物中分离提取了大量的具有新型生物活性物质。海洋中微生物数量巨大，因其所处的独特环境，产生的代谢产物与陆物微生物有较大差别，因此，海洋细菌、放线菌、真菌、微藻等成为筛选新型活性物质的重要来源。从海洋微生物代谢产物中发现和研究低分子纤溶促进化合物已成为探索新型纤溶疗法药物的重要途径。
发明内容
本发明的目的在于寻找生存在自然环境中特别是海洋中产纤溶活性化合物的微生物,经发明人广泛的采样和大量的筛选,从930株分离得到的微生物中,得到一株产纤溶活性化合物（FGFC1）活性很高的菌株,该菌株已于2012年7月12日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株（Stachybotrys longispora）FG216（简称菌株FG216），保藏号：CCTCC：M2012227，地址：中国武汉武汉大学。
本发明提供的海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株（Stachybotrys longispora）FG216，是从舟山群岛海域离岸100米附近收集的31个样品中分离得。对菌株FG216基因组DNA提取，使用通用引物PCR扩增真菌的ITS全长序列,经华大基因公司测序，并将序列提交NCBI的GenBank进行比。菌株FG216序列与葡萄穗霉菌属的微生物同源性高，与Stachybotrys longispora18S rDNA序列的同源性为100%,并据此构建了系统发育树。
本发明的海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株FG216的形态特征为：菌丝体呈白色绒毛状,其菌丝400倍光学显微镜观察粗状、有隔、分枝（参见图1）。其孢子在400倍光学显微镜观察呈椭圆形的外部形态特征（参见图2）。培养特征：在马铃薯蔗糖培养基上生长良好。培养温度25℃。摇瓶培养用改良察氏培养基：蔗糖50g,硝酸钠3g,磷酸氢二钾0.1g,硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g,酵母提取物1g,氯化钴0.0025g,硫酸亚铁0.015g,氯化钙0.0065g,蒸馏水1000mL,pH5.8。培养温度25℃。
菌株FC216的ITS序列测定：采用改进的CTAB法对菌株FG216基因组提取，使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,19bp)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,20bp)扩增真菌全长序列的ITS，PCR反应产物经1%的琼脂糖凝胶电流分离后，用Axyprep DNA Gel ExtractionKit(Axygen Biosciences,USA)纯化PCR产物，将纯化后的产物连接pGEM-T载体（Promega公司），连接产物转化入Eschericha coli DH5α，用蓝白斑筛选并用M13F和M13R引物PCR扩增检测阳性克隆，选取阳性克隆送华大基因公司测序。将测得的序列（参见图4）提交NCBI的GenBank进行比对。下载相似序列，并以Neighbor-Joining方法构建系统发育树（见图3）。
本发明由该海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株产出的溶活性化合物，是通过以下步骤制备的：
1）.菌种分离：含1%琼脂的马铃薯蔗糖培养基，用海水配制，pH自然，121℃灭菌20分钟，例平板，冷却后以200μl的样品量涂布每个平板，25℃培养5天后分离得到单菌。
2.分离得到的单菌落保藏于马铃薯蔗糖斜面培养基；
3.发酵培养基的制备：蔗糖50g,硝酸钠3g,磷酸氢二钾0.1g,硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g,酵母提取物1g,氯化钴0.0025g,硫酸亚铁0.015g,氯化钙0.0065g,蒸馏水1000mL,pH5.8；
4.菌株培养：培养温度25℃，180rpm，培养3天后加入培养液体积1%的赖氨酸，继续培养2天；
5.活性物质提取：加入等体积的纯甲醇，超声提取15分钟，10000rpm离心15分钟，上清液在40－60℃条件下减压浓缩至干，浓缩物真空干燥；
6.96孔平板孔内注入纤溶酶原溶液、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂溶液、牛血清白蛋白和发色底物溶液各10μl，其浓度分别为0.1、0.1mg/mL、500nmol/mL和1mmol/mL,加入样品溶液10μl后成50μl反应体系；在37℃于405nm处连续150分钟测定吸光度的变化；
7.促纤溶活性化合物的纯化：FG216发酵培养结束后，三角瓶中加入等体积的100%的甲醇，超声提取15min，在转速10000rpm的条件下离心15min，过滤，弃去沉淀，上清液在40-60℃的条件下减压浓缩至干，浓缩物真空干燥12h，残留物溶于少量甲醇，过滤弃去沉淀，收集上清液，再减压浓缩，真空干燥；所得残留物溶于少量甲醇，用于HPLC分离采用岛津SCL-10Avp HPLC分离系统，样品在流速10mL/min，检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2×250mm，10m)两次精制，第一次流动相为甲醇∶0.05mol/L乙酸铵=80∶20，第二次流动相为乙腈∶0.1%甲酸=40∶60，用Sepax HP-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5m)鉴定所得化合物的纯度。
本发明的菌株FG216的发酵液具有促纤溶活性，纤溶活性随着其代谢化合物的含量的增加而增加。
本发明采用发色底物法评定微生物华诞产物的纤溶促进作用。在纤溶酶原（Plasminogen,Plg）、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（single chain urokinase-typeplasminogen activator,Pro-uPA）、牛血清白蛋白（Bull Serum Albumin,BSA）、发色底物和待测样品构成的体系中，连续测定纤溶酶的生成引起的吸光度的变化以评定化合物的活性。
附图说明
图1为FG216菌丝的形态（400倍）示意图。
图2为FG216菌株孢子形态图(400倍)示意图。
图3为菌株FG216的ITS－5.8S rDNA区域序列的系统发育树示意图。
图4为本发明菌株FG216的菌株FC216的ITS序列示意图。
图5为本发明产溶活性化合物提取流程图。
图6为本发明产溶活性化合物的HPLC图谱。
具体实施方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
1.菌种分离：含1%琼脂的马铃薯蔗糖培养基，用海水配制，pH自然，121℃灭菌20分钟，例平板，冷却后以200μl的样品量涂布每个平板，25℃培养5天。
2.分离得到的单菌落保藏于马铃薯蔗糖斜面培养基。
3.发酵培养基的制备：蔗糖50g,硝酸钠3g,磷酸氢二钾0.1g,硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g,酵母提取物1g,氯化钴0.0025g,硫酸亚铁0.015g,氯化钙0.0065g,蒸馏水1000mL,pH5.8。
4.菌株培养：培养温度25℃，180rpm，培养3天后加入培养液体积1%的赖氨酸。继续培养2天。
5.活性物质提取：加入等体积的纯甲醇，超声提取15分钟，10000rpm离心15分钟，上清液在40－60℃条件下减压浓缩至干，浓缩物真空干燥。
6.96孔平板孔内注入纤溶酶原溶液、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂溶液、牛血清白蛋白和发色底物溶液各10μl，其浓度分别为0.1、0.1mg/mL、500nmol/mL和1mmol/mL,加入样品溶液10μl后成50μl反应体系。在37℃于405nm处连续150分钟测定吸光度的变化。吸光度值变化大，纤溶活性高。
7.菌株FG216的发酵液具有促纤溶活性，纤溶活性随着其代谢化合物的含量的增加而增加。
8.促纤溶活性化合物的纯化：FG216发酵培养结束后，三角瓶中加入等体积的100%的甲醇，超声提取15min，在转速10000rpm的条件下离心15min，过滤，弃去沉淀，上清液在40-60℃的条件下减压浓缩至干，浓缩物真空干燥12h，残留物溶于少量甲醇，过滤弃去沉淀，收集上清液，再减压浓缩，真空干燥，流程图见图5。所得残留物溶于少量甲醇，用于HPLC分离采用岛津SCL-10Avp HPLC分离系统，样品在流速10mL/min，检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2×250mm，10m)两次精制，第一次流动相为甲醇∶0.05mol/L乙酸铵=80∶20，第二次流动相为乙腈∶0.1%甲酸=40∶60，用Sepax HP-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5m)鉴定所得化合物的纯度。FGFC1的HPLC图谱见图6。

Claims (7)

1.一种海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株,其特征在于，海洋微生物长孢葡萄穗霉菌株（Stachybotrys longispora）FG216，,保藏号为CCTCC：M2012227。 
2.一种权利要求1海洋微生物菌株FG216产生的纤溶活性化合物，其特征在于，是通过以下步骤制备的： 
1）.菌种分离：含1%琼脂的马铃薯蔗糖培养基，用海水配制，pH自然，121℃灭菌20分钟，例平板，冷却后以200μl的样品量涂布每个平板，25℃培养5天后分离得到单菌。 
2）.分离得到的单菌落保藏于马铃薯蔗糖斜面培养基。 
3.发酵培养基的制备：蔗糖50g,硝酸钠3g,磷酸氢二钾0.1g,硫酸镁0.5g,氯化钾0.5g,酵母提取物1g,氯化钴0.0025g,硫酸亚铁0.015g,氯化钙0.0065g,蒸馏水1000mL,pH5.8。 
4.菌株培养：培养温度25℃，180rpm，培养3天后加入培养液体积1%的赖氨酸，继续培养2天。 
5.活性物质提取：加入等体积的纯甲醇，超声提取15分钟，10000rpm离心15分钟，上清液在40－60℃条件下减压浓缩至干，浓缩物真空干燥。 
6.96孔平板孔内注入纤溶酶原溶液、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂溶液、牛血清白蛋白和发色底物溶液各10μl，其浓度分别为0.1、0.1mg/mL、500nmol/mL和1mmol/mL,加入样品溶液10μl后成50μl反应体系；在37℃于405nm处连续150分钟测定吸光度的变化。 
7.促纤溶活性化合物的纯化：FG216发酵培养结束后，三角瓶中加入等体积的100%的甲醇，超声提取15min，在转速10000rpm的条件下离心15min，过滤，弃去沉淀，上清液在40-60℃的条件下减压浓缩至干，浓缩物真空干燥12h，残留物溶于少量甲醇，过滤弃去沉淀，收集上清液，再减压浓缩，真空干燥；所得残留物溶于少量甲醇，用于HPLC分离采用岛津SCL-10Avp HPLC分离系统，样品在流速10mL/min，检测波长265nm的条件下被色谱柱Sepax HP-C18柱(21.2×250mm，10m)两次精制，第一次流动相为甲醇∶0.05mol/L乙酸铵=80∶20，第二次流动相为乙腈∶ 0.1%甲酸=40∶60，用Sepax HP-C18色谱柱(4.6mm×150mm，5m)鉴定所得化合物的纯度。 
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