CN104450563B - 一种解鸟氨酸拉乌尔菌gj‑5菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ‑5菌株及其应用，菌株保藏号为：CGMCC NO.9837；16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。将解鸟氨酸拉乌尔菌在固体分离培养基上划线，于30℃下培养24h；取单菌落接入100mL LB培养基，30℃，150r·min‑1恒温摇床中培养24h；然后再接种到不同条件下的液体培养基，于30℃，150r·min‑1恒温摇床培养24h，然后测定氨氮的去除效率及OD600值。本发明菌株当C/N为6时，氨氮去除率为52.8％，在好氧的条件下具有良好的亚硝化作用和脱氮效果，易于灭活。

Description

一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株及其应用
技术领域
本发明属于菌株及其应用领域，特别涉及一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株及其应用。
背景技术
我国水体富营养化问题日益严重，对水体中氮污染物的排放标准也愈加严格。2012年，环保部对氨氮废水排放量大、氨氮含量较高的行业，如：合成氨工业、纺织染整工业、炼焦工业、畜禽养殖业等行业的污水排放标准有一定幅度的提高，尤其是对氨氮、总氮的要求愈发严格。大量氨氮废水排入水体易导致水体富营养化、引发水华赤潮，威胁饮水安全。
微生物吸收氨氮和硝态氮，并将这些无机氮转化为蛋白质等有机氮，构筑细胞和组织结构，从而达到除氮目的。硝化包含两个氧化阶段：一是氨氮氧化成亚硝态氮(氨氧化)；二是亚硝态氮转化成硝态氮(亚硝酸盐氧化)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株及其应用，该菌株在好氧的条件下具有良好的亚硝化作用和脱氮效果，易于灭活，且制备方法简单。
本发明的一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株，其特征在于：所述解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)GJ-5菌株保藏号为：CGMCC NO.9837；16SrDNA序列如SEQID NO.1所示。
本发明的菌株经16SrDNA序列测定和分析比较，鉴定为解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica),其同源性达到96％。
解鸟氨酸拉乌尔菌菌株的菌落特征为：圆形，乳白色，不透明，湿润，边缘整齐，为革兰氏阴性菌。
本发明的一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株的应用：将解鸟氨酸拉乌尔菌在固体分离培养基上划线，于30℃下培养24h；取单菌落接入100mL LB培养基，30℃，150r·min-1恒温摇床中培养24h；然后再接种到不同条件下的液体培养基，于30℃，150r·min-1恒温摇床培养24h，然后测定氨氮的去除效率及OD600值。
不同条件下的液体培养基为不同氨氮浓度、不同pH值、碳源或不同碳氮比(培养基其他成分与亚硝化菌富集培养基相同)。
所述固体分离培养基为(NH4)2SO42g·L-1，柠檬酸三钠5g·L-1，MgSO4·7H2O0.03g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.325g·L-1，K2HPO4·2H2O 0.89g·L-1，MnSO4·H2O 0.0076g·L-1，1.8％W/V琼脂，pH 7.2。
所述不同氨氮浓度为0-1000mg·L-1。
不同氨氮浓度为：0、50、100、200、300、400、600、800、1000mg·L-1。
优选0-200mg·L-1。
所述不同pH值为：5.0-9.0。优选5.0-7.5。
所述的碳源为：葡萄糖、蔗糖、柠檬酸三钠、乙酸钠、丁二酸钠、甲醇、乙醇；优选柠檬酸三钠。
所述不同碳氮比为：0、3、6、9、12、15；优选3-9。
亚硝化细菌富集培养基为：(NH4)2SO42g·L-1，柠檬酸三钠5g·L-1，MgSO4·7H2O0.03g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.325g·L-1，K2HPO4·2H2O 0.89g·L-1，MnSO4·H2O 0.0076g·L-1，pH 7.2。
本发明的鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultella ornithinolytica)GJ-5菌株，已于2014年10月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.9837。
有益效果
本发明的菌株当C/N为6时，氨氮去除率为52.8％，在好氧的条件下具有良好的亚硝化作用和脱氮效果，易于灭活，且制备方法简单。
附图说明
图1解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5的系统发育树；
图2解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5不同氨氮初始浓度的氨氮去除效果；
图3解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5不同pH条件下的氨氮去除效果；
图4解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5不同碳源条件下的氨氮去除效果；
图5解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5不同碳氮比条件下的氨氮去除效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
高效亚硝化菌的分离筛选与鉴定：
(1)将活性污泥上清液5mL加入121℃下灭菌30min后的100mL亚硝化细菌富集培养基中，于30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养24h。
(2)采用格里斯试剂检测上述培养基中是否有亚硝酸盐，若呈红色则说明有亚硝酸盐生成。然后从上述培养基中取2mL培养液，加入新鲜的亚硝化富集培养基中，按上述条件继续培养并检测是否有亚硝酸盐生成，该过程重复3次。
(3)取三次培养后的菌液，采用稀释平板涂布法转接固体分离培养基，置于恒温箱中于30℃下恒温培养，2天后挑选单菌落进行纯化。
固体分离培养基为：(NH4)2SO42g·L-1，柠檬酸三钠5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.03g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.325g·L-1，K2HPO4·2H2O 0.89g·L-1，MnSO4·H2O 0.0076g·L-1，1.8％W/V琼脂，pH 7.2。
(4)将纯化后的所有菌株富集培养24h后，取2mL接种于富集培养基中，通过测定氨氮浓度筛选出脱氮效果最强的菌株GJ-5。
亚硝化富集培养基：(NH4)2SO42g·L-1，柠檬酸三钠5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.03g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.325g·L-1，K2HPO4·2H2O 0.89g·L-1，MnSO4·H2O 0.0076g·L-1，pH7.2。
实施例2
高效亚硝化菌的最佳条件：
挑取平板分离单菌落接种于LB培养基中，30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养24h。(1)取上述培养基2mL加入不同初始氨氮浓度培养基中(培养基其他成分与亚硝化菌富集培养基相同)，于30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养24h，测定培养基中氨氮浓度及OD600值。当NH4-N浓度低于100mg·L-1时，氨氮去除效果高于80％。尤其，当氨氮浓度为50mg·L-1时，氨氮的去除率达100％。但随着初始氨氮浓度的升高，该菌对氨氮的降解效果呈下降趋势。NH4-N浓度在200～1000mg·L-1范围内，氨氮去除率与氨氮初始浓度呈线性相关，相关系数为0.886。氨氮浓度高至1000mg·L-1时，氨氮去除率降至最低，为20％。不同初始氨氮浓度的OD600值测定结果显示，氨氮浓度在0～200mg·L-1范围内，微生物的生长呈上升趋势，但随着氨氮浓度的持续增长，微生物生长受抑制。这表明，低浓度的氨氮能够为微生物提供生长所需的氮源，但是高浓度氨氮对微生物有一定的影响，且都不及无氮源对微生物生长繁殖的影响大。
(2)取上述培养基2mL加入不同初始pH值的培养基中(初始氨氮浓度为212mg·L-1)，于30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养24h，测定培养基中氨氮浓度及OD600值。该菌在初始pH条件为5.0～7.0的环境下OD600值明显高于7.5～9.0。pH范围为5.0～7.5时，氨氮去除率随pH值的升高呈上升趋势，且在pH为7.0和7.5时，氨氮去除率最高，为57.5％。当pH由7.5上升至9.0时，氨氮去除率下降，且在pH为9.0时最低，为34％。结果表明：中性偏酸性的环境有利于该亚硝化细菌的生长繁殖，同时也有利于其对氨氮的去除。
(3)取上述培养基2mL加入不同碳源(葡萄糖、蔗糖、柠檬酸三钠、乙酸钠、丁二酸钠、甲醇、乙醇)的培养基中(初始氨氮浓度为212mg·L-1)，于30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养24h，测定培养基中氨氮浓度及OD600值。结果显示：柠檬酸三钠为外加碳源时，该亚硝化菌的OD600值和氨氮去除率明显高于其它碳源作为该微生物的外加碳源。此时，氨氮的去除率为55.2％。其余六种碳源作为外加碳源时的氨氮去除效果优劣顺序为：葡萄糖＞蔗糖＞丁二酸钠＞蔗糖＝乙酸钠＞甲醇。
(4)取上述培养基2mL加入不同初始C/N的培养基中(初始氨氮浓度为212mg·L-1，碳源为柠檬酸三钠)，于30℃、150r·min-1的恒温摇床中振荡培养24h，测定培养基中氨氮浓度及OD600值。随着C/N的升高，氨氮去除率和OD600呈上升趋势，且当C/N高于6后，氨氮去除率上升平缓。当C/N为6时，氨氮去除率为52.8％，C/N为15时，氨氮去除率为64.6％。从经济角度来说，利用该菌降解高氨氮废水时，投加碳源，使得C/N控制在6左右为宜。

Claims (6)

1.一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株，其特征在于：所述解鸟氨酸拉乌尔菌(Raoultellaornithinolytica)GJ-5菌株的保藏号为：CGMCC NO.9837；16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述的解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株的应用，其特征在于：将解鸟氨酸拉乌尔菌在固体分离培养基上划线，于30℃下培养24h；取单菌落接入100mL LB培养基，30℃，150r·min-1恒温摇床中培养24h；然后再接种到不同条件下的液体培养基，于30℃，150r·min-1恒温摇床培养24h，然后测定氨氮的去除效率及OD600值；其中所述不同条件下的液体培养基为：不同氨氮浓度、pH值、碳源或碳氮比，其中碳源为柠檬酸三钠，碳氮比为：6～15。
3.根据权利要求2所述的一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株的应用，其特征在于：所述固体分离培养基为：(NH4)2SO4 2g·L-1，柠檬酸三钠5g·L-1，MgSO4·7H2O 0.03g·L-1，NaH2PO4·2H2O 0.325g·L-1，K2HPO4·2H2O 0.89g·L-1，MnSO4·H2O 0.0076g·L-1，1.8％W/V琼脂，pH 7.2。
4.根据权利要求2所述的一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株的应用，其特征在于：所述LB培养基为：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,调pH 7.0,用去离子水定容至1L。
5.根据权利要求2所述的一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株的应用，其特征在于：所述氨氮浓度为：0～200mg·L-1。
6.根据权利要求2所述的一种解鸟氨酸拉乌尔菌GJ-5菌株的应用，其特征在于：所述pH值为5.0～7.5。
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