CN102167448A

CN102167448A - 降解苯胺菌株3#的应用

Info

Publication number: CN102167448A
Application number: CN 201010570858
Authority: CN
Inventors: 孙红丽; 罗泽娇; 靳孟贵; 梁杏; 廉晶晶
Original assignee: China University of Geosciences
Current assignee: China University of Geosciences
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: CN102167448B

Abstract

本发明涉及一种降解苯胺微生物的应用。降解苯胺菌株3^#的应用，其特征在于所述菌株的应用为绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aerugmosa)CCTCC NO：M2010304应用于含高浓度苯胺废水的处理中。该处理方法为：挑取固体培养基上的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304的单菌落，接种于20mL生长培养基中，25～35℃、pH为6.0～7.5的条件下摇床振荡3～4天，得到菌浊液；按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比为1∶100，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25～35℃恒温培养，pH值为6.0～7.5，反应60-72小时。本发明可处理含高浓度苯胺废水，该菌株在72h内将苯胺降解85％以上。

Description

降解苯胺菌株3#的应用

技术领域

本发明涉及一种降解苯胺微生物的应用。

背景技术

芳香族有机化合物对地表水和地下水的污染已成为人类面临的最大的环境问题之一。苯胺是最简单的一级芳香胺，也是最典型的芳香族化合物。在橡胶、除草剂、染料，医药、有机树脂、油漆、香水、制革、石油加工、塑料等化工行业广泛被采用的原材料，是一种“三致”物质，1989年已被中国列为“环境优先控制污染物”物质之一。随着工业化程度的加剧，全球对苯胺的需求也在不断上升，据资料显示，2003年全球苯胺的消费量约为2900kt，全世界以各种形式排入环境中的废弃苯胺约为30kt。而苯胺废水的生物方法以其运行成本低利于管理而广泛推行。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可处理含高浓度苯胺废水的降解苯胺菌株3^#的应用。

本发明所提供的降解苯胺菌株3^#，为绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCNO：M2010304，已于2010年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M2010304。

降解苯胺菌株3^#的应用，其特征在于所述菌株的应用为绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304应用于含高浓度苯胺废水的处理中。

所述的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCNO：M2010304的单菌落，接种于20mL生长培养基中，25～35℃、150rpm、pH为6.0～7.5的条件下摇床振荡3～4天，得到降解活性较强的菌浊液；按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比为1∶100，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25～35℃恒温培养，pH值为6.0～7.5，反应60-72小时。

固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、琼脂2g、自来水100mL、pH7.0-7.2。

生长培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺2000mg/L。

所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800-2200mg/L的废水。

本发明是从城市污水处理系统脱水活性污泥中驯化、分离、筛选得到的一株在高浓度的苯胺废水中具有一定的生长能力的新菌株。并对其降解苯胺的能力及影响其活性的因素做了研究，结果表明，该菌株在高浓度的苯胺废水(即含高浓度苯胺废水)中，可利用苯胺作为唯一的碳源、氮源、能源，以1800-2200mg/L的苯胺溶液(即苯胺废水)为例，该菌株在72h内将其(苯胺)降解85％以上，说明该菌株可处理含高浓度苯胺废水。

本发明获得的新菌株即可在高浓度的含苯胺废液中生存，也可将苯胺作为唯一的碳氮能源加以降解利用。

附图说明

图1是降解苯胺菌株3^#的PCR产物琼脂糖电泳图；

图2是降解苯胺菌株3^#在苯胺初始浓度不同条件下，对苯胺的降解效率图；

图3是降解苯胺菌株3^#在培养液pH值不同条件下，对苯胺的降解效率图；

图4是降解苯胺菌株3^#在培养温度不同条件下，对苯胺的降解效率图；

图5是降解苯胺菌株3^#在不同氮源供给条件下，对苯胺的降解能力特征图。

具体实施方式

一、一株降解苯胺菌株3^#的筛选方法：

(1)培养基

1)固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、琼脂2g、自来水100mL、pH7.0-7.2。

2)普通营养培养基：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、自来水1000mL、pH7.0-7.2。

3)驯化培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，苯胺浓度逐渐增加至2.5g/L，营养成分逐渐减少，pH值7.0。

4)分离培养基：牛肉膏2g/L，蛋白胨4g/L，氯化钠2g/L，苯胺1g/L，pH值7.0，苯胺1.5g/L，琼脂15～20g/L。

5)筛选培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺一定浓度(1800-2200mg/L)。

6)生长培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺2000mg/L。

7)无机盐溶液：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量。

8)苯胺无机盐溶液：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺250-6000mg/L。

以上培养基分别于121℃高压灭菌30min后备用，需添加苯胺的，将高浓度的苯胺母液(10g/L)用无菌0.45um滤膜过滤除菌后，按比例与已灭好菌的液体培养基混合。

(2)实验仪器和设备

台式高速离心机(安亭科学仪器厂TGL-16G)、紫外可见分光光度计(北京普析通用T6新世纪)、手提式蒸汽消毒器(上海三申YX280B)、光照培养箱(重庆华茂仪器有限公司SHH150G)、光学显微镜(奥林巴斯BX40型)、超净工作台(苏州净化设备有限公司SW-CJ-10)、菌落计数器(上海宏汇电器厂QL-901)、台式恒温摇床(太仓市华美生化仪器厂TH2-C)、电泳仪及电泳槽等。

(3)菌株的分离与筛选

1)活化：菌种来源于污水处理厂浓缩污泥样品，取污泥样品按水泥比100∶1分散于水体中，在30℃，150r/min的条件下培养12小时后备用；

2)驯化：取活化菌浊液1ml接种于普通营养培养基中，梯度加入苯胺溶液，每24小时取1ml菌液接种于驯化培养基中(苯胺溶液浓度梯度增加至约3g/L，苯胺浓度1500mg/L后培养时间增至2天或以上)，备用；

3)筛选：取驯化后的菌浊液，无菌梯度稀释至约2.0×10⁶个/L涂布于分离培养基上，30℃下恒温培养至菌落成熟，挑取菌落特征明显的单菌落划线与分离培养基上；

4)纯化：待分离培养基上的单菌落成熟后，挑取单菌落至生长培养基中培养3天，取步骤1)中菌液接种于2000mg/L的生长培养基中，两天后划线于1000mg/L的分离培养基，待菌落长出后，挑取单菌落划线于新的平板上，如此反复2-3次后，分离得纯种菌，即一株降解苯胺菌株3^#。

二、降解苯胺微生物菌株鉴定：

1.对降解苯胺菌株3^#的鉴定：

对降解苯胺菌株3^#进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平确定菌株的种属。

16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

①细菌核DNA的提取：

1)用高压灭菌的牙签挑单菌落(一株降解苯胺菌株3^#)接种于普通营养培养基内培养过夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清；

2)加STE缓冲液1.5ml洗涤一次，离心弃上清，再加入0.567mlTE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)溶液，重悬细菌；

3)加10wt％SDS30ul和20mg/ml的蛋白酶K3ul，于37℃水浴1h；

4)加入5mol/L氯化钠溶液10ul，CTAB/NaCl 80ul，于65℃育温10min；

5)加入等积体酚氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，4℃、12000g/min离心5min，将上清液转入另一支Eppendorf管中；

6)加入等体积的酚氯仿/异戊醇/(25∶24∶1)混匀，4℃、12000g/min离心5min，提取上清液置于另一只管中，如此反复三次，直至看不到蛋白层为止；

7)加入0.6倍体积的异丙醇，轻柔混合，沉淀DNA，4℃、12000g/min离心5min，弃上清液；

8)用70wt％的乙醇洗涤1min，离心，弃上清，自然凉干，并将DNA溶于100μl 1/10的TE溶液中；

9)加入终浓度为50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存备用。

②16SrDNA基因的PCR扩增

为了进一步确定筛选得到的降解苯胺菌株3^#的种属，对其进行质粒DNA的提取，采用的引物序列为P1正向引物：(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和P2反向引物：(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR产物测序由上海某生物技术有限公司完成，同源性检索利用NCBI数据库，经比对相似序列，分析该菌与已知菌种同源性的高低，并作菌株的系统发育树对照，结合生理生化鉴定结果，进而判断两菌种的菌属。

2、16S rDNA序列测定：

本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1410bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列如下。

ctacacatgc aagtcgagcg gatgaaggga gcttgctcct ggattcagcg gcggacgggt 60

gagtaatgcc taggaatctg cctggtagtg ggggataacg tccggaaacg ggcgctaata 120

ccgcatacgt cctgagggag aaagtggggg atcttcggac ctcacgctat cagatgagcc 180

taggtcggat tagctagttg gtggggtaaa ggcctaccaa ggcgacgatc cgtaactggt 240

ctgagaggat gatcagtcac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 300

cagtggggaa tattggacaa tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgcg tgtgtgaaga 360

aggtcttcgg attgtaaagc actttaagtt gggaggaagg gcagtaagtt aataccttgc 420

tgttttgacg ttaccaacag aataagcacc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 480

acgaagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgcgcgtag gtggttcagc 540

aagttggatg tgaaatcccc gggctcaacc tgggaactgc atccaaaact actgagctag 600

agtacggtag agggtggtgg aatttcctgt gtagcggtga aatgcgtaga tataggaagg 660

aacaccagtg gcgaaggcga ccacctggac tgatactgac actgaggtgc gaaagcgtgg 720

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtcg actagccgtt 780

gggatccttg agatcttagt ggcgcagcta acgcgataag tcgaccgcct ggggagtacg 840

gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 900

tttatttcga agcaacgcga agaaccttac ctggccttga catgctgaga actttccaga 960

gatggattgg tgccttcggg aactcagaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020

tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc ttggtcctta gttaccagca 1080

cctcgggtgg gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140

tcaagtcatc atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag 1200

ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcc cataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt 1260

ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tgaatcagaa tgtcacggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgctccaga 1380

agtagctagt ctaaccgcaa gggggacggt 1410

三、降解苯胺菌株3^#的菌落形态、生理和生化特征见下表1所示。

表1，降解苯胺菌株3^#的菌落形态特征以及主要的生理特征：

四、降解苯胺菌株3^#为新的降解苯胺的菌株：

将降解苯胺菌株3^#的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较发现，降解苯胺菌株3^#与Pseudomonas aeruginosa(绿脓杆菌)多个菌株的同源性高达99％以上。综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，可确定降解苯胺菌株3^#为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，降解苯胺菌株3^#命名为绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)3^#，已于2010年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCCNO：M2010304。

本实验分离、筛选出的降解苯胺菌株3^#，具有较好降解高浓度苯胺废水的功能。这就拓宽了人们对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含高浓度苯胺废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。

五、降解高浓度苯胺废水的应用：

应用实例1：

1、菌株3^#对苯胺废水降解能力：

取事先灭好菌的无机盐溶液(无机盐溶液：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量)和经0.45μm过滤除菌的高浓度苯胺溶液，按混合成苯胺浓度为2000mg/L左右实验用的含高浓度苯胺废水；

挑取固体培养基上的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304的单菌落接种于20mL生长培养基中，30℃、150rpm、pH≈7.0的条件下摇床振荡3～4天，待特征菌生长稳定后，得到降解活性较强的菌浊液[培养后的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)]；

按菌浊液：实验用的含高浓度苯胺废水的体积比＝1∶100，取菌浊液接种于实验用的含高浓度苯胺废水中，30℃恒温培养，pH值为7.0，反应72小时，72h后测量溶液中剩余苯胺量，并计算特征菌对苯胺的降解去除率。

2.影响菌株降解苯胺效率的因子实验：

1)苯胺浓度的影响：配制浓度为250、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000mg/L(以苯胺计)苯胺无机盐溶液中(苯胺无机盐溶液：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺250-6000mg/L)，按苯胺无机盐溶液与菌浊液体积比为100∶1，接种稳定期菌液后，于pH7.0、30℃、150r/min条件下，72h后测量溶液中苯胺浓度，并计算去除率，探讨菌株在不同苯胺浓度下，对苯胺的降解耐受能力。

结果见图2所示，从图2中可知，3d后，特征菌对苯胺近100％的降解利用的最高浓度约为1730mg/L，苯胺初始浓度在2100mg/L左右时，可实现85％的去除率，当初始浓度继续增加时，菌种降解苯胺的能力大幅度降低，细菌活性也被证实为急剧下降。

2)pH的影响：以强酸强碱调节2000mg/L苯胺无机盐的pH值为5、6、7、8、9、10，按同样比例接种菌液与上述培养液中，在pH7.0、30℃、150r/min条件下，72h后测试上述指标，研究菌株降解苯胺的最佳生长温度。

结果见图3所示，从图中可知，菌种在pH为中性(即pH约为7.0)时，降解利用苯胺的能力最佳，降解能力随中性pH值的升高或降低大幅度下降，弱酸性条件下菌种活性强于弱碱性，pH值生长活性范围6.0-7.5。

3)温度的影响：改变2000mg/L苯胺无机盐培养的温度分别为15、20、25、30、35、40℃，按同种比例接种菌液，在pH7.0、150r/min条件下，72h后测量溶液中苯胺浓度，并计算去除率，研究其最佳生长温度。

结果见图4所示，从图4中可知，温度在30℃时，特征菌对溶液中的苯胺具有较好的利用率，稍低的温度可以降低其活性，但仍然对苯胺具有较高的利用率，过高或过低的生长温度还是会严重的抑制特征菌对苯胺的利用能力。

4)氮源的影响：在pH7.0、30℃、150r/min条件下，改变2000mg/L苯胺无机盐培养液中N的来源，以外来氮与原无机盐中氮质量浓度相等为原则，用牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠，硫酸铵及外源氮空白作为其氮源，72h后测量溶液中苯胺浓度，并计算去除率，探讨菌株利用氮源的情况。

结果见图5所示，从图5中可知，氮源不同，特征菌对苯胺的利用特征也有所差异，在营养贫乏的条件下(苯胺、无机氮)，苯胺降解率较富营养条件(牛肉膏、蛋白胨)高，且该菌株以苯胺为氮源时，降解利用苯胺的效率是最高的，在同等条件下。故可以得出如下结论，特征菌利用苯胺作为唯一的碳源、能源的同时，也可利用苯胺作为唯一的氮源。

应用实例2

绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCNO：M2010304的单菌落，接种于20mL生长培养基中，25℃、pH为6.0的条件下摇床振荡3天，得到降解活性较强的菌浊液；按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比为1∶100，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25℃恒温培养，pH值为6.0，反应60小时。

所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800mg/L的废水。

该菌株在60h内将其降解85％以上，说明该菌株可处理含高浓度苯胺废水。

应用实例3

绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCCNO：M2010304的单菌落，接种于20mL生长培养基中，35℃、pH为7.5的条件下摇床振荡4天，得到降解活性较强的菌浊液；按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比为1∶100，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，35℃恒温培养，pH值为7.5，反应72小时。

所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为2200mg/L的废水。

该菌株在72h内将其降解85％以上，说明该菌株可处理含高浓度苯胺废水。

Claims

1.降解苯胺菌株3^#的应用，其特征在于所述菌株的应用为绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304应用于含高浓度苯胺废水的处理中。

2.根据权利要求1所述的降解苯胺菌株3^#的应用，其特征在于：所述的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上的绿脓杆菌3^#(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC NO：M2010304的单菌落，接种于20mL生长培养基中，25～35℃、pH为6.0～7.5的条件下摇床振荡3～4天，得到菌浊液；按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比为1∶100，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25～35℃恒温培养，pH值为6.0～7.5，反应60-72小时。

3.根据权利要求2所述的降解苯胺菌株3^#的应用，其特征在于：固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、琼脂2g、自来水100mL、pH7.0-7.2。

4.根据权利要求2所述的降解苯胺菌株3^#的应用，其特征在于：生长培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺2000mg/L。

5.根据权利要求1或2所述的降解苯胺菌株3^#的应用，其特征在于：所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1500-2200mg/L的废水。