CN102168037B

CN102168037B - 降解苯胺菌株5-1#的应用

Info

Publication number: CN102168037B
Application number: CN 201010570849
Authority: CN
Inventors: 孙红丽; 罗泽娇; 靳孟贵; 梁杏; 廉晶晶
Original assignee: China University of Geosciences
Current assignee: China University of Geosciences
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: CN102168037A

Abstract

本发明涉及一种降解苯胺微生物的应用。降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于所述菌株的应用为脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO：M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理中。该处理方法为：挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1#CCTCC NO：M2010287的单菌落接种于20ml生长培养基中，25～35℃、pH为6.5～7.5的条件下摇床振荡3～4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；按菌浊液∶含高浓度苯胺废水的体积比＝1∶(80～120)，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25～35℃恒温培养，pH值为6.5～7.5，反应60-72小时。该菌在72h内将其降解85％以上，该菌株可处理含高浓度苯胺废水。

Description

降解苯胺菌株5-1#的应用

技术领域

本发明涉及一种降解苯胺微生物的应用。

背景技术

芳香族有机化合物对地表水和地下水的污染已成为人类面临的最大的环境问题之一。苯胺是最简单的一级芳香胺，也是最典型的芳香族化合物。在橡胶、除草剂、染料，医药、有机树脂、油漆、香水、制革、石油加工、塑料等化工行业广泛被采用的原材料，是一种“三致”物质，1989年已被中国列为“环境优先控制污染物”物质之一。随着工业化程度的加剧，全球对苯胺的需求也在不断上升，据资料显示，2003年全球苯胺的消费量约为2900kt，全世界以各种形式排入环境中的废弃苯胺约为30kt。而苯胺废水的生物方法以其运行成本低利于管理而广泛推行。

发明内容

本发明的目的在于提供一株可处理含高浓度苯胺废水的降解苯胺菌株5-1#的应用。

本发明所提供的降解苯胺菌株5-1#，为脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingiameningoseptica)CCTCC NO：M2010287，已于2010年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M2010287。

降解苯胺菌株5-1#的应用，其特征在于所述菌株的应用为脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO：M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理中。

所述的脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO：M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1#CCTCC NO：M2010287的单菌落接种于20ml生长培养基中，25～35℃、pH为6.5～7.5的条件下摇床振荡3～4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；按菌浊液∶含高浓度苯胺废水的体积比＝1∶(80～120)，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25～35℃恒温培养，pH值为6.5～7.5，反应60-72小时。

固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、琼脂2g、自来水100mL、pH7.0-7.2。

生长培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺2000mg/L。

所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800-2200mg/L的废水。

本发明是从城市污水处理系统脱水活性污泥中驯化、分离、筛选得到的一株在高浓度的苯胺废水中具有一定的生长能力的新菌株。并对其降解苯胺的能力及影响其活性的因素做了研究，结果表明，该菌株在高浓度的苯胺废水中，可利用苯胺作为唯一的碳源、氮源、能源，以1800-2200mg/L的苯胺溶液为例，该菌在72h内将其降解85％以上，该菌株可处理含高浓度苯胺废水。

本发明获得的新菌株即可在高浓度的含苯胺废液中生存，也可将苯胺作为唯一的碳氮能源加以降解利用。

附图说明

图1是降解苯胺菌株5-1#的PCR产物琼脂糖电泳图；

图2是降解苯胺菌株5-1#在苯胺初始浓度不同条件下，对苯胺的降解效率图；

图3是降解苯胺菌株5-1#在培养液pH值不同条件下，对苯胺的降解效率图；

图4是降解苯胺菌株5-1#在培养温度不同条件下，对苯胺的降解效率图；

图5是降解苯胺菌株5-1#在不同氮源供给条件下，对苯胺的降解能力特征图。

具体方法如下：

一、降解苯胺菌株5-1#(苯胺降解特征菌)的筛选方法：

(1)培养基

1)固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、琼脂2g、自来水100mL、pH7.0-7.2。

2)普通营养培养基：胰化蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g、自来水1000mL、pH7.0-7.2。

3)驯化培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，苯胺浓度逐渐增加至2.5g/L，营养成分逐渐减少，pH值7.0。

4)分离培养基：牛肉膏2g/L，蛋白胨4g/L，氯化钠2g/L，苯胺1g/L，pH值7.0，苯胺1.5g/L，琼脂15～20g/L。

5)筛选培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺一定浓度(1800-2200mg/L)。

6)生长培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺2000mg/L。

7)无机盐溶液：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量。

8)苯胺无机盐溶液：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺250-6000mg/L。

以上培养基分别于121℃高压灭菌30min后备用，需添加苯胺的，将高浓度的苯胺母液(约10g/L)用无菌0.45um滤膜过滤除菌后，按比例与已灭好菌的液体培养基混合。

(2)实验仪器和设备

台式高速离心机(安亭科学仪器厂TGL-16G)、紫外可见分光光度计(北京普析通用T6新世纪)、手提式蒸汽消毒器(上海三申YX280B)、光照培养箱(重庆华茂仪器有限公司SHH150G)、光学显微镜(奥林巴斯BX40型)、超净工作台(苏州净化设备有限公司SW-CJ-10)、菌落计数器(上海宏汇电器厂QL-901)、台式恒温摇床(太仓市华美生化仪器厂TH2-C)、电泳仪及电泳槽等。

(3)菌株的分离与筛选

1)活化：菌种来源于污水处理厂浓缩污泥样品，取污泥样品按水泥比100∶1分散于水体中，在30℃，150r/min的条件下培养12小时后备用；

2)驯化：取活化菌浊液1ml接种于普通营养培养基中，梯度加入苯胺溶液，每24小时取1ml菌液接种于驯化培养基中(苯胺溶液浓度梯度增加至约3g/L，苯胺浓度1500mg/L后培养时间增至2天或以上)，备用；驯化培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，苯胺浓度逐渐增加至2.5g/L，营养成分逐渐减少，pH值7.0；

3)筛选：取驯化后的菌浊液，无菌梯度稀释至约2.0×10⁶个/L涂布于分离培养基上，30℃下恒温培养至菌落成熟，挑取菌落特征明显的单菌落划线与分离培养基上；

4)纯化：待分离培养基上的单菌落成熟后，挑取单菌落至生长培养基中培养3天；取步骤1)中菌液接种于2000mg/L的生长培养基中，两天后划线于1000mg/L的分离培养基上，待菌落长出后，挑取单菌落划线于新的平板上，如此反复2-3次后，分离得纯种菌，即一株降解苯胺菌株5-1#。

二、降解苯胺菌株5-1#的鉴定：

1.对降解苯胺菌株5-1#的鉴定：

对苯胺高效降解菌株5-1#进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平确定菌株的种属。

16S rDNA序列分析主要按照以下步骤：

①细菌核DNA的提取：

1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于普通营养培养基内培养过夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清；

2)加STE缓冲液1.5ml洗涤一次，离心弃上清，再加入0.567mlTE(10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，pH8.0)溶液，重悬细菌；

3)加10wt％SDS30ul和20mg/ml的的蛋白酶K3ul，于37℃水浴1h；

4)加入5mol/L氯化钠溶液10ul，CTAB/NaCl 80ul，于65℃育温10min；

5)加入等积体酚氯仿/异戊醇(24∶1)混匀，4℃、12000g/min离心5min，将上清液转入另一支Eppendorf管中；

6)加入等体积的酚氯仿/异戊醇/(25∶24∶1)混匀，4℃、12000g/min离心5min，提取上清液置于另一只管中，如此反复三次，直至看不到蛋白层为止；

7)加入0.6倍体积的异丙醇，轻柔混合，沉淀DNA，4℃、12000g/min离心5min，弃上清液；

8)用70wt％的乙醇洗涤1min，离心，弃上清，自然凉干，并将DNA溶于100μl 1/10的TE溶液中；

9)加入终浓度为50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存备用。

②16SrDNA基因的PCR扩增

为了进一步确定筛选得到的细菌5-1#的种属，对其进行质粒DNA的提取，采用的引物序列为P1正向引物：(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和P2反向引物：(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，PCR产物测序由上海某生物技术有限公司完成，同源性检索利用NCBI数据库，经比对相似序列，分析该菌与已知菌种同源性的高低，并作菌株的系统发育树对照，结合生理生化鉴定结果，进而判断两菌种的菌属。

2、16S rDNA序列测定：

本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1385bp的扩增带(用1％琼脂糖凝胶电泳检测)，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定其全序列如下。

gctaccatgc aagccgagcg gtagattact ttcgggtatt ggaaaggggc gtaggggggc 60

gaaccacgtg ggcacccggc ctttatcggg gggttaccct ttcgaaggga gaataattac 120

ccattattat tttattcggc ttcgggggat tttgaaaact acgggggata aaaaggggcc 180

cccccaaaat tacttagtgg gggaggtacc ggccccccag ggcaacaatc tttagggggc 240

ttgaaggggt gttccccccc ctgggtccgg aaacccgaac caaatcccta cggaaggcac 300

catggagaaa tatggaacaa ggggggaaac ccggacccgg ccttcccgcg ggcagaaaaa 360

cggccctttg gttggaaacc ggtttttatc ggggaataac cctccttcct tgtaattact 420

taagggtccc gaaaaaatag cccccggtta attcctggcc gccgcccccg gaattccgaa 480

gggggcagcc tttatccgaa ttattgggtt taaaggggcc cgagggcgaa ttgatagtcc 540

aggggtgaat tccaccgctt aactggtcaa cttgcaattg ttcttgtaat cctgaagaag 600

ggtgaagggg ccggaaatag gagtggtggg ggtaaattgc ttaaatttaa tttaaacccc 660

aatttgcgaa ggcgggcaat taagtctaaa tgacgctgag gaccaaagcg ggggaagcaa 720

acaggatagg atccccggta gtcccgccgt aaacgatgat tactcgtttt tggtttaatg 780

atcaaagact agccaaagtg ataagtaatc cacctggggg agtacgttcc gcaggatgaa 840

actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgatgat 900

acgcgaggaa ccttgccaag acttaaatgg gaattgacag acgcagaaat gtgtttttct 960

tcggacaatt ttcaaggtgc tgcatggttg tcgtcagctc gtgccgtgag gtgttaggtt 1020

aagtcctgca acgagcgcaa cccctgtcac tagttgctaa cattaagttg aggactctag 1080

tgagactgcc tacgcaagta gagaggaagg tggggatgac gtcaaatcat cacggccctt 1140

acgtcttggg ccacacacgt gctacaatgg ccggtacaga gggcagctac ctagtgatag 1200

gatgcaaatc tcgaaagccg gtctcagttc ggattggagt ctgcaactcg actctatgaa 1260

gctggaatcg ctagtaatcg cgcatcagcc atggcgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1320

tacacaccgc ccgtcaagcc atggaagctg ggggtacctg aagtcggtga ccgtaaaagg 1380

agctg 1385

三、降解苯胺菌株5-1#的菌落形态、生理和生化特征见下表1所示。

表1，降解苯胺菌株5-1#的菌落形态特征以及主要的生理特征：

四、降解苯胺菌株5-1#为新的降解苯胺的菌株：

将降解苯胺菌株5-1#的16S rDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较发现，降解苯胺菌株5-1#与Elizabethkingia meningoseptica(脑膜脓毒性伊丽莎白菌)多个菌株的同源性高达86％以上。综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，可确定降解苯胺菌株5-1#为脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)，降解苯胺菌株5-1#命名为脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1#，已于2010年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏号：CCTCC NO：M2010287。

查阅有关资料，尚无有关脑膜脓毒性伊丽莎白菌属降解高浓度含苯胺废水以及对其耐苯胺能力研究的报道。

本实验分离、筛选出的降解苯胺菌株5-1#，具有较好降解高浓度苯胺废水的功能。这就拓宽了人们对脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)在其功能方面的应用研究思路，并为降解含高浓度苯胺废水提供了有用的菌源和技术，具有较强的实际应用价值。

五、降解高浓度苯胺废水的应用：

应用实例1：

1、降解苯胺菌株5-1#对苯胺废水降解能力：

取事先灭好菌的无机盐溶液(磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量)和经0.45μm过滤除菌的高浓度苯胺溶液，按比例混合成苯胺浓度约2000mg/L的实验用的含高浓度苯胺废水；

挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1#CCTCCNO：M2010287的单菌落接种于20ml苯胺无机盐培养液(苯胺无机盐溶液：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺250-6000mg/L)中，30℃、150rpm、pH≈7.1的条件下摇床振荡3～4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；

按菌浊液：实验用的含高浓度苯胺废水的体积比＝1∶100，取菌浊液接种于实验用的含高浓度苯胺废水中，30℃恒温培养，pH值为7.1，反应72小时，72h后测量溶液中剩余苯胺量，并计算特征菌对苯胺的降解去除率。

2.影响菌株降解苯胺效率的因子实验：

1)苯胺浓度的影响：配制浓度为250、500、1000、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000mg/L(以苯胺计)苯胺无机盐培养液中，按苯胺无机盐培养液与菌浊液的体积比为100∶1，接种稳定期菌液后，于pH7.0、30℃、150r/min条件下，72h后测量溶液中苯胺浓度，并计算去除率，探讨菌株在不同苯胺浓度下，对苯胺的降解耐受能力。

结果见图2所示，从图2中可知，3d后，特征菌对苯胺近100％的降解利用的最高浓度约为1730mg/L，苯胺初始浓度在2100mg/L左右时，可实现85％的去除率，当初始浓度继续增加时，菌种降解苯胺的能力大幅度降低，细菌活性也被证实为急剧下降。

2)pH的影响：以强酸强碱调节2000mg/L苯胺无机盐的pH值为5、6、7、8、9、10，按同样比例接种菌液与上述培养液中，在pH7.0、30℃、150r/min条件下，72h后测试上述指标，研究菌株降解苯胺的最佳生长温度。

结果见图3所示，从图3中可知，菌种在pH为中性时，降解利用苯胺的能力最佳，降解能力随中性pH值的升高或降低大幅度下降。

3)温度的影响：改变2000mg/L苯胺无机盐培养的温度分别为15、20、25、30、35、40℃，按同种比例接种菌液，在pH7.0、150r/min条件下，72h后测量溶液中苯胺浓度，并计算去除率，研究其最佳生长温度。

结果见图4所示，从图4中可知，温度在30℃时，特征菌对溶液中的苯胺具有较好的利用率，稍低的温度可以降低其活性，但仍然对苯胺具有较高的利用率，过高或过低的生长温度还是会严重的抑制特征菌对苯胺的利用能力。

4)氮源的影响：在pH7.0、30℃、150r/min条件下，改变2000mg/L苯胺无机盐培养液中N的来源，以外来氮与原无机盐中氮质量浓度相等为原则，用牛肉膏、蛋白胨、硝酸钠，硫酸铵及外源氮空白作为其氮源，72h后测量溶液中苯胺浓度，并计算去除率，探讨菌株利用氮源的情况。

结果见图5所示，从图5中可知，氮源不同，特征菌对苯胺的利用特征也有差异，在营养贫乏的条件下(苯胺、无机氮)，苯胺降解率较富营养条件高(牛肉膏、蛋白胨)，且可以得出如下结论，特征菌利用苯胺作为唯一的碳源、能源的同时，也可利用苯胺作为唯一的氮源。

应用实例2：

脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO：M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1#CCTCC NO：M2010287的单菌落接种于20ml生长培养基中，25℃、pH为6.5的条件下摇床振荡3天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；

按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比＝1∶80，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25℃恒温培养，pH值为6.5，反应60小时，

所述生长培养基：磷酸氢二钾5.17g/L，磷酸二氢钾1.70g/L，硫酸铵2.63g/L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺2000mg/L。

所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800mg/L的废水。

该菌在60h内将其降解85％以上。

应用实例3：

脑膜脓毒性伊丽莎白菌5-1#(Elizabethkingia meningoseptica)CCTCC NO：M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica)5-1# CCTCC NO：M2010287的单菌落接种于20ml生长培养基中，35℃、pH≈7.5的条件下摇床振荡4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；

按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比＝1∶120，取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，35℃恒温培养，pH值为7.5，反应72小时，

该菌在72h内将其降解85％以上。

Claims

1.降解苯胺菌株5-1^#的应用，其特征在于所述菌株的应用为脑膜脓毒性伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）5-1^#CCTCC NO:M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理中，所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800-2200mg/L的废水。

2.根据权利要求1所述的降解苯胺菌株5-1^#的应用，其特征在于：所述的脑膜脓毒性伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）5-1^#CCTCC NO:M2010287应用于含高浓度苯胺废水的处理方法为：挑取固体培养基上脑膜脓毒性伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）5-1^# CCTCC NO:M2010287的单菌落接种于20ml生长培养基中，25～35℃、pH为6.5～7.5的条件下摇床振荡3～4天，待特征菌生长稳定后，得到菌浊液；按菌浊液：含高浓度苯胺废水的体积比=1︰（80～120），取菌浊液接种于含高浓度苯胺废水中，25～35℃恒温培养， pH值为6.5～7.5，反应60－72小时；所述含高浓度苯胺废水是指含苯胺的浓度为1800-2200mg/L的废水。

3.根据权利要求2所述的降解苯胺菌株5-1^#的应用，其特征在于：固体培养基：牛肉膏0.3g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、琼脂2g、自来水100mL、pH7.0-7.2。

4.根据权利要求2所述的降解苯胺菌株5-1^#的应用，其特征在于：生长培养基：磷酸氢二钾5.17g/ L，磷酸二氢钾1.70g/ L，硫酸铵2.63g/ L，pH值7.0～7.2，Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺痕量，苯胺2000mg/L。