CN103484378B - 一株异养硝化好氧反硝化真菌及其培养方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及环境微生物领域，具体为用于处理废水中氮元素的微生物，特别涉及一株异养硝化好氧反硝化真菌。本发明中的菌株是一种具有脱氮生物活性的真菌，可以单株脱除水体中的氨氮，还可以通过好氧反硝化脱除水体中的亚硝酸氮和硝酸氮，并且能在有机碳源条件下脱氮。在脱氮过程中，没有检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。该菌株为镰刀菌属Fusariumsp.A60。保藏登记号：CGMCC No.7656，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2013年5月28日。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，具体为用于处理废水中含氨氮的微生物，涉及一株异养硝化好氧反硝化的真菌菌株。
背景技术
含氮废水是目前环境污染治理中的重大问题，生物脱氮是目前被公认为废水脱氮中最经济、最有效的方法之一。传统的氨氮废水处理是首先通过自养硝化菌的硝化作用将氮氨转化为硝酸根或亚硝酸根离子，然后通过异养反硝化菌的反硝化作用，将硝酸根或亚硝酸根离子转化为氮气。两者的组合工艺使氨氮最终转化为氮气，反应如下：
该工艺冗长， 由于硝化和反硝化的工艺条件不同，需分别在两个系统中完成， 造成了两方面不足。首先，能耗大，氨氮硝化要耗氧， 也就是要耗能供氧，而且前置反硝化系统需设置硝化液回流，这也增加了能耗。其次，反硝化反应要有碳源作为电子供体，若污水中碳源不足(也就是C/N比过低)，则需投加甲醇等有机碳，这不仅增加了运行费用，还增加了运行管理和后续处理的难度。因此废水处理工程投资大，运行成本高。而且硝化细菌通常是自养菌，增殖缓慢，容易在废水生物处理系统中被流失，由此影响废水生物处理系统脱氮效果的稳定性。因此国内外学者一直在寻找高效低耗的脱氮工艺。
近几十年来，从土壤、深海火山口、污泥、湖水等处分离得到了多种具有硝化活性的异养微生物，包括有细菌、放线菌和真菌等，被称为异养硝化菌。这是一类具有重要应用价值的微生物资源，它们可以利用很多基质，包括无机氮和有机氮，如铵、胺、酰胺、N-烷基羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等。由于许多异养硝化菌也具有好氧反硝化作用，所以硝化反硝化作用可以同步进行，这为研究开发简捷的含氮废水处理新工艺提供了基础，而具有好氧反硝化作用的异养硝化菌就是简捷脱氮新工艺的关键菌株。
异养硝化菌易于培养，增殖较快，底物利用范围广，在废水生物脱氮系统中可以稳定存在。因此采用异养硝化菌开发设计简捷的废水脱氮新工艺，可实现生物脱氮工艺的快速启动和稳定运行，提高脱氮效率，降低运行成本，有望克服传统处理工艺中存在的问题，实现废水高效经济的脱氮，为解决日益严重的含氮化合物对环境的污染问题作出贡献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于处理污水中氮元素的新的微生物菌株。
本发明中的菌株是一种具有脱氮生物活性的真菌，可以单株脱除水体中的氨氮，还可以通过好氧反硝化脱除水体中的亚硝氮和硝氮，并且能在有机碳源条件下脱氮。在脱氮过程中，没有检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。该菌株为镰孢属Fusarium sp.A60。保藏登记号：CGMCC No.7656，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间：2013年5月28日。
本发明菌株的分离鉴定过程如下：
培养基 ：
A.牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，NaCl 5g，蛋白胨10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20分钟。
B.察氏培养基（蔗糖 30g/L，NaNO3 3 g/L，K2HPO4 1 g/L , KCl 0.5 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L。临用时在已熔化的培养基中加入链霉素溶液，以抑制细菌和放线菌的生长，每100mL培养基中加1%的链霉素0.3mL。
上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂2.0％。
以焦化废水处理厂的活性污泥为样品，取10mL 污泥，接入灭过菌的牛肉膏蛋白胨培养基A中，于30℃，120r/min摇床内震荡富集培养三天。然后再接入察氏培养基B中，继续培养三天。取富集培养的菌悬浮液1mL于10mL比色管中，加无菌水至标线混匀，稀释到梯度10-1，再从梯度10-1取1mL于10mL比色管中，加无菌水至标线混匀，稀释到梯度10-2，依次稀释至10-1～10-10十个梯度，各取0.2 mL稀释菌液涂布于察氏培养基B的琼脂平板培养基上。将涂布好的平板放入生化培养箱中，于30℃下培养三天。在无菌条件下将平板上每种菌落分别单独挑入三个装有察氏培养基B的小试管中（小试管共三十个），于30℃，120r/min摇床中继续培养。
每隔24h，从上述每种菌落的小试管中分别取0.5mL培养液至洁净白瓷盘中，分别滴入一滴纳氏试剂、Griess-Ilosvay试剂和二苯胺试剂，以不接菌种的空白培养基作对照，进行脱氮及硝化活性确认。滴入纳氏试剂后，若呈现的黄色越浅，说明水样中剩余的氨氮含量越少，即菌体氨氮的降解或转化效果越好。滴入Griess-Ilosvay试剂后，若显红色乃至褐色，则说明水样中有亚硝酸盐，即菌体经硝化作用产生了亚硝酸盐，颜色越深亚硝酸盐含量越高。滴入二苯胺试剂，若显蓝色，说明有硝酸盐存在，即菌体硝化过程有硝酸盐产生，且蓝色越深硝酸盐含量越高。实验记录数据并进行初步定性分析，确认几个脱氮效果较好（即硝化作用较好）的异养硝化菌。经富集、分离纯化实验，得到1株脱氮效果较好（即硝化作用较好）的菌株，委托大连宝生物有限公司进行的26SrDNA-ITS区基因序列分析，结合其形态和生理生化特征，鉴定该菌株为镰孢属（Fusarium sp.），命名为Fusarium sp.A60，即为本发明已经过保藏的菌株。
所用检测方法如下：
NH4 +-N：采用纳氏试剂光度法。
NO2 --N：采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法。
NO3 --N：采用紫外分光光度法。
以上方法均参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》(第四版)。
该镰刀菌菌株A60菌落形态特征（如图1所示）：菌株A60在固体平板培养基上呈现的菌落特征：菌落为圆形，质地疏松，呈绒状。，初为白色，后期为粉色或紫红色。四天后，菌落直径约为4.5～4.8cm，厚度为1～3mm。
该镰刀菌菌株A60菌体形态特征（如图2所示）：菌丝发达，具隔，有分枝，无色；分生孢子梗较短；分生孢子从小梗顶端溢出，几个不等，分散至四周，呈椭圆形，透明。
所述异养硝化好氧反硝化真菌菌株在污水处理方面的应用。
该镰刀菌菌株A60的脱氮活性：菌株A60具有异养脱氮的能力，并且在脱氮过程中几乎不积累硝酸盐和亚硝酸盐。
该镰刀菌菌株A60的最佳脱氮条件：蔗糖作碳源，硫酸铵作氮源，最佳C/N为8，最适pH为7.0。最佳的异养氨化培养基为改良的察氏培养基，其成分为：蔗糖 9.782g/L，(NH4)2SO4 1.888g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，调pH为 7.0～7.4。
该镰刀菌菌株A60的硝化性能的检测如下：
配制模拟废水I，以硫酸铵为唯一氮源，初始浓度为452mg/L，碳氮质量比为8，在pH为7.0～7.4，摇床转速120r/min，温度30℃条件下处理。经12h培养，将氨氮降解至274mg/L，降解速率高达14.83mg/L/h；60h内，氨氮浓度降至82.60mg/L；96h后，培养基中剩余氨氮浓度为34.99mg/L。其中，模拟废水I：蔗糖 11 g/L，(NH4)2SO4 2.124 g/L，K2HPO4 1 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0. 01 g/L，调pH为7.0～7.4。
氨氮浓度对该镰刀菌菌株A60硝化性能的影响如下：
调整培养基中的氮源浓度，使初始氮浓度分别为100mg/L、450mg/L、800mg/L，其余条件不变。以2％的接种量接种于100mL新鲜液体培养基，30℃、120r/min摇床内振荡培养。初始氨氮浓度为100mg/L时，菌株对氨氮的去除率在24h和48h后分别达到了74%和100%，总氮在48h后剩余1.52mg/L。初始氨氮浓度为450mg/L，四天去除率92.25%。800mg/L时，五天去除率92%，总氮去除效果也达到了同等水平。
镰刀菌菌株A60的好氧反硝化性能的检测如下：
配制模拟废水II，以硝酸钠为唯一氮源，初始氮浓度为119.74mg/L，C/N为8，培养条件同上。NO3 --N浓度在48h内迅速减少，仅剩余13.32mg/L，脱除率达88.88%，第四天，系统内检测到37.07mg/L的氮气。其中，模拟废水II：蔗糖 9.782g，硝酸钠 2.428g，K2HPO4 1 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，调pH为7.0～7.4。
镰刀菌菌株A60以蔗糖与苯酚为复合碳源，并调节两者碳摩尔比分别为8:2，5:5，2:8，其中摩尔比8:2时，苯酚浓度为320mg/L。以硫酸铵为唯一氮源，并使其浓度为200mg/L，培养条件同上。48h后，摩尔比8:2，5:5，2:8的氨氮与苯酚的去除率分别为51.32%和99.52%，85.56%和99.79%，以及98.61和95.58%。
本发明菌株Fusarium sp.A60能够在好氧条件下较好地利用亚硝酸盐、硝酸盐和氨氮作唯一氮源，进行硝化和反硝化活动，并将氮素形式最终转化为氮气。菌株Fusarium sp.A60具有较强的好氧反硝化能力，最高反硝化率约35%左右，约30%-50%左右的氮素用于菌株的生长，转化成细胞内氮。
本发明镰刀菌菌株A60应用在污水处理领域，可耐受低、中、高浓度氨氮的水环境。氨氮去除率最高可达100%，最快脱除速率为14.83mg/L/h，整个过程中几乎没有亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的积累。
本发明镰刀菌菌株A60能同时以蔗糖与苯酚为复合碳源，以硫酸铵为唯一氮源，在好氧反硝化脱氮的同时降解苯酚。在氨氮与苯酚浓度同为200mg/L时，48h后两者的降解率分别达到了85.56%和99.79%。
附图说明
图1是镰刀菌菌株A60的菌落形态特征。
图2是镰刀菌菌株A60在显微镜下的菌体形态特征。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。
实施例1
应用权利要求1所述的异养硝化好氧反硝化真菌菌株的污水处理方法，包括如下步骤：
（1）、取保藏登记号为CGMCC No.7656的异养硝化好氧反硝化真菌菌株，接种于察氏培养基中进行扩大培养，所述察氏培养基的组成如下：每1000mL H2O中含有蔗糖 9.782g、(NH4)2SO4 1.888g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g，pH为7.0～7.4；培养条件为：25～32℃，120r/min振荡培养。
（2）将扩培后的菌液加入污水中进行污水处理。
实施例2
所述异养硝化好氧反硝化真菌菌株的培养方法，配制培养基的组成如下：碳源蔗糖 9.782g/L，氮源硫酸铵 1.888g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L， pH为7.0～7.4；然后在所述培养基中进行常规接种培养。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 0.5g/L，氮源硫酸铵 2.0g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 5g/L，氮源硫酸铵 0.1g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 10g/L，氮源硫酸铵 1g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 1g/L，氮源硫酸铵 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 8g/L，氮源硫酸铵 2.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
实施例3
所述异养硝化好氧反硝化真菌菌株的培养方法，配制培养基的组成如下：碳源蔗糖 2g/L，氮源硝酸钠 0.1g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH为7.0～7.4；然后在所述培养基中进行常规接种培养。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 0.5g/L，氮源硝酸钠0.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 7g/L，氮源硝酸钠2.1g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 10g/L，氮源硝酸钠1.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 1g/L，氮源硝酸钠2.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 5g/L，氮源硝酸钠1.8g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
实施例4
所述的异养硝化好氧反硝化真菌菌株的培养方法，配制培养基的组成如下：碳源蔗糖 9g/L，氮源亚硝酸钠 0.3g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0. 01g/L，pH为7.0～7.4；然后在所述培养基中进行常规接种培养。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 0.5g/L，氮源亚硝酸钠 1.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 1.5g/L，氮源亚硝酸钠 1.2g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 6g/L，氮源亚硝酸钠 1.7g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 2.5g/L，氮源亚硝酸钠 2.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
或者，培养基的组成如下：碳源蔗糖 10g/L，氮源亚硝酸钠 0.1g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L。
实施例5
所述的异养硝化好氧反硝化真菌菌株的培养方法，配制培养基的组成如下：牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，蛋白胨 10g/L，调节PH为7.2～7.4；然后在所述培养基中进行常规接种培养。
实施例6
所述的异养硝化好氧反硝化真菌菌株的培养方法，配制培养基的组成如下：蔗糖0.06～0.6 g/L，苯酚0.04～0.4 g/L，硫酸铵 0.5～1.25g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L；然后在所述培养基中进行常规接种培养。
<110>太原理工大学
<120>一株异养硝化好氧反硝化真菌及其应用方法和用途
<130>专利申请
<160>1
<210>1
<211>514
<212>DNA
<213>镰刀菌属（Fusariumsp.）
<400>
acattaccga gtttacaact cccaaacccc tgtgaacata ccaattgttg cctcggcgga 60
tcagcccgct cccggtaaaa cgggacggcc cgccagagga cccctaaact ctgtttctat 120
atgtaacttc tgagtaaaac cataaataaa tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt 180
ctggcatcga tgaagaacgc agcaaaatgc gataagtaat gtgaattgca gaattcagtg 240
aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc ccgccagtat tctggcgggc atgcctgttc 300
gagcgtcatt tcaaccctca agcccccggg tttggtgttg gggatcggcg agcccttgcg 360
gcaagccggc cccgaaatct agtggcggtc tcgctgcagc ttccattgcg tagtagtaaa 420
accctcgcaa ctggtacgcg gcgcggccaa gccgttaaac ccccaacttc tgaatgttga 480
cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaa 514
Claims (4)
1.一株异养硝化好氧反硝化真菌菌株，于2013年5月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.7656。
2.应用权利要求1所述的异养硝化好氧反硝化真菌菌株的污水处理方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）、取保藏登记号为CGMCC No.7656的异养硝化好氧反硝化真菌菌株，接种于察氏培养基中进行扩大培养，所述察氏培养基的组成如下：每1000mL H2O中含有蔗糖 9.782g、(NH4)2SO4 1.888g、K2HPO4 1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g，pH为7.0～7.4；培养条件为：25～32℃，120r/min振荡培养；
（2）将扩培后的菌液加入污水中进行污水处理。
3.权利要求1所述的异养硝化好氧反硝化真菌菌株的培养方法，其特征在于：配制培养基的组成如下：蔗糖 0.5～10g/L，硫酸铵 0.1～2.5g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH为7.0～7.4；然后在所述培养基中进行常规接种培养。
4.权利要求1所述的异养硝化好氧反硝化真菌菌株的培养方法，其特征在于：配制培养基的组成如下：蔗糖 0.06～0.6 g/L，苯酚 0.04～0.4 g/L，硫酸铵 0.5～1.25g/L，K2HPO4 1g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L；然后在所述培养基中进行常规接种培养。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Ren Ruipeng Inventor after: Lv Yongkang Inventor after: Liu Yuxiang Inventor after: Ye Junling Inventor after: Niu Feilong Inventor before: Lv Yongkang Inventor before: Liu Yuxiang Inventor before: Ye Junling Inventor before: Ren Ruipeng Inventor before: Niu Feilong |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: LV YONGKANG LIU YUXIANG YE JUNLING REN RUIPENG NIU FEILONG TO: REN RUIPENG LV YONGKANG LIU YUXIANG YE JUNLING NIU FEILONG |
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| GR01 | Patent grant | ||
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Granted publication date: 20150812 Termination date: 20210809 |
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