CN101875909B - 一种异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种高效的异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途。该细菌是红球菌属Rhodococcus sp.DN2.3，保藏登记号为CCTCC M209300，能够有效脱除水体中的氨氮、亚硝酸氮、硝酸氮及其混合物，还可同时去除有机废水中的CODCr，适用于高浓度有机含氮废水的处理，脱氮过程中，不产生亚硝酸盐和硝酸盐的积累。使用该菌株处理废水工艺简单，脱氮效果稳定。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种高效的异养硝化好氧反硝化细菌及其培养方法和用途。
背景技术
含氮废水是目前环境污染治理中的重大问题。生物脱氮是目前被公认为废水脱氮中最经济、最有效的方法之一。传统的氨氮废水处理是通过自养硝化菌的硝化作用与异养反硝化菌的反硝化作用的组合工艺使氨氮转化为氮气。
该工艺冗长，由于硝化和反硝化的工艺条件不同，需分别在两个系统中完成，造成了两方面不足。首先是能耗大，氨氮硝化要耗氧，也就是要耗能供氧，前置反硝化系统需设置回流比较大的混合液内回流，这也增加了能耗。其次，反硝化反应要有碳源作为电子供体，若污水中碳源不足(C/N过低)，则需投加甲醇等有机碳，这不仅增加了运行费用，还增加了运行管理和后续处理的难度。因此废水处理工程投资大，运行成本高。而且硝化细菌通常是自养硝化菌，增殖缓慢，容易在废水生物处理系统中被淘汰，由此影响废水生物处理系统脱氮效果的稳定性。因此国内外学者一直在寻找高效低耗的脱氮工艺。
近几十年来，从土壤、深海火山口、污泥、湖水等处分离得到了多种具有硝化活性的异养微生物，包括有细菌、放线菌和真菌等，被称为异养硝化菌。这是一类具有重要应用价值的微生物资源，它们可以利用很多基质，包括无机N和有机N：如铵、胺、酰胺、N一烷基羟胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等。由于许多异养硝化菌也具有好氧反硝化作用，在氧化过程中形成多种无机和有机N化合物，包括一些气态N产物如氧化亚氮等直接脱出水溶液系统，这为研究开发简捷的含氮废水处理新工艺提供了基础，而具有好氧反硝化作用的异养硝化菌就是简捷脱氮新工艺的关键菌株。
异养硝化菌易于培养，增殖较快，底物利用范围广，在废水生物脱氮系统中可以稳定存在。因此采用异养硝化菌开发设计简捷的废水脱氮新工艺，可实现生物脱氮工艺的快速启动和稳定运行，提高脱氮效率，降低运行成本。有望克服传统处理工艺在处理效率与经济适用两方面的矛盾，实现废水高效经济的脱氮，为解决日益严重的含氮化合物对环境的污染问题作出贡献。
发明内容
本发明的目的就在于针对以上问题和不足，提供一株具有异养硝化和好氧反硝化活性的细菌。
本发明的另一个目的是提供该菌株的培养方法和使用方法，使该细菌发挥好氧条件下一步脱除水体中氮素的能力。
本发明提供该菌在水体生物脱氮中的应用，使用本发明提供的细菌可有效的脱除水体中的氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮。
本发明可以通过以下方式得以实现：
1.本发明中的菌株是一种具有脱氮生物活性的细菌，可以单株脱除水体中的氨氮，还可以通过好氧反硝化脱除水体中的亚硝酸氮和硝酸氮。该菌株既可以异养生长，又能自养生长；并且能在有机碳源条件下脱氮。在脱氮过程中，没有检测到亚硝酸盐和硝酸盐的积累。更具体地，该菌株为红球菌属Rhodococcus sp.DN2.3。保藏登记号：CCTCC NO：M209300，保藏地点：中国典型培养物保藏中心，保藏时间：2009年12月11日。
2.本发明菌株的分离鉴定：
(1)培养基：
A.自养硝化培养基(g/L)：(NH4)2SO4 2，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O0.4，NaCl 2。装瓶后按质量百分比为0.5％的比例加入CaCO3，最后用1％的NaOH溶液调pH到7.2，121℃灭菌20分钟。
B.硅胶平板的制作：将Na2SiO3·9H2O配成比重为1.10的溶液，并过滤澄清。将等体积的上述溶液缓慢倒入比重为1.09的盐酸中，不断搅拌，使其混合均匀。在溶液混合均匀的情况下倒平板。静置24小时，待其凝固。用缓慢流水冲洗2～3天，以便除去Cl-。加AgNO3检测，直到无白色产生为止。用煮沸的蒸馏水冲洗3次灭菌。
C.分离培养基：在每一个硅胶平板培养皿中加入培养基A2mL，轻轻转动培养皿，使培养液均匀分布，打开烘箱在50℃烘箱烘至无水流动为止。
D.牛肉膏培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。
上述培养基如制成固体培养基，则添加琼脂1.5％～2.0％。
(2)红球菌菌株DN2.3的分离纯化
以发明人实验室长期运行的废水脱氮生物反应器中的污泥为样品，取100mL污泥，静置10分钟，去掉上清液，用剩下的污泥作为原液进行梯度稀释为100、10-1、10-2。采用(1)中所述的分离培养基C平板培养，用移液枪在每个平板中加入100、10-1、10-2样品各0.2mL，然后用灭菌玻璃珠均匀涂布。倒置放入加了水的干燥器中，以防硅胶平板干裂，30℃培养直至硅胶平板上长出单菌落。挑取单菌落采用培养基A平板划线，进一步纯化得到本发明中的菌株Rhodococcus sp.DN2.3。后来发现该细菌能在培养基D中生长，于是采用培养基D进行菌种保藏。
(3)红球菌菌株DN2.3菌落形态特征(附图1)：在培养基A平板上培养2d后，解剖镜下观察到菌落直径约0.3mm，橙红色，菌落呈圆形，表面湿润凸起、边缘不光滑。在培养基D平板上培养3d后，观察到菌落直径约0.5mm，橙红色，菌落圆形，表面湿润凸起，边缘不光滑。
(4)红球菌菌株DN2.3菌体形态特征(附图2)：扫描电镜的观察表明，菌体呈不规则短杆状或杆状，大小为0.5～0.8μm×1～3μm。
(5)红球菌菌株DN2.3的生理生化特征：
最适培养温度范围30～37℃，pH7.0～7.5。主要的生理生化特性见表1。
表1DN2.3菌株的主要生理生化特性
注：+表示阳性反应或能利用；-表示阴性反应或不能利用
(6)16S rDNA的PCR扩增与测序：
实验仪器：BIO-RAD MJ Mini Thermal Cycler(PCR仪)，BIO-RAD PowerPac 3000稳压电泳仪，GDS8000，Gene Company Limited凝胶成像仪
实验方法：热裂解菌悬液，以基因组DNA为模板扩增16S rDNA，扩增引物采用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1505R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，分别对应于大肠杆菌(Escherichia coli)16S rDNA 8～27位和1487～1505位的核苷酸，引物合成由宝生物公司(TAKARA)完成。PCR反应体系采用50μl反应体系：10×缓冲液(含Mg2+)5μl，4μl dNTP(各2.5m mol/L)，10μmol/L引物各1μl，rTaq酶(5U/μl)0.5μl，10ng/μl DNA模板1μl，去离子水37.5μl。PCR扩增条件：94℃预变性5min；94℃ 1min，53℃ 1min，72℃1min30s，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃放置。扩增的PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分离，验证后切下胶条，用DNA胶回收试剂盒(杭州V-gene)纯化PCR产物。回收产物与载体pMD18-T(TAKARA)16℃连接过夜，转化感受态大肠杆菌JM109，在含氨苄青霉素Amp(100ng/L)的LB平板上涂板，挑取单菌落培养并筛选阳性克隆，送公司测序，测序工作由上海英俊生物公司完成。
(7)16S rDNA序列分析与系统发育分析：
测序后得到DN2.3的16S rDNA序列1484bp，提交NCBI进行BLAST序列比对(登陆号：EU382217)，发现DN2.3与红球菌属(Rhodococcus)中多株红球菌(如Rhodococcus sp.P14等)的16S rDNA序列相似性水平达到99％，据此可初步确定DN2.3属于红球菌属Rhodococcus；结合菌株的形态学和生理生化鉴定特征，可初步确定DN2.3为Rhodococcus，命名为Rhodococcussp.DN2.3。
3.红球菌菌株DN2.3的脱氮活性：
菌株DN2.3具有异养脱氮的能力，并且在脱氮过程中不积累硝酸盐和亚硝酸盐。
以葡萄糖为碳源，硫酸铵为氮源，DN2.3能去除氨氮，并且培养体系中始终没有检测出硝酸氮、亚硝酸氮的积累。培养基组分为碳源葡萄糖0.5～10.0g/L，氮源硫酸铵0.1～2.5g/L，其余成分为KH2PO4 0.7g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，蒸馏水1000mL；NaOH调pH 7.0～7.4，121℃灭菌20分钟。
以乙酸钠为碳源，硫酸铵为氮源，DN2.3能去除氨氮，并且在整个培养过程中，没有检测出硝酸氮和亚硝酸氮的明显积累。培养基组分为碳源乙酸钠1.0～5.0g/L，氮源为硫酸铵0.2～1.0g/L，其余成分为KH2PO4 0.7g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，蒸馏水1000mL；NaOH调pH 7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。
本发明菌株还可以在有机碳源条件下进行以NaNO2、KNO3为底物的好氧反硝化。
以葡萄糖为碳源，亚硝酸钠为氮源时，本发明菌株可以进行好氧反硝化。培养基组分为碳源葡萄糖0.5～2.0g/L，氮源为亚硝酸钠1.25～5.0g/L，其余成分为KH2PO4 0.7g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，蒸馏水1000mL；NaOH调pH 7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。
以葡萄糖为碳源，硝酸钾为氮源时，本发明菌株可以进行好氧反硝化。培养基组分为碳源葡萄糖0.5～2.0g/L，氮源为硝酸钾2.0～7.0g/L，其余成分为KH2PO4 0.7g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，蒸馏水1000mL；NaOH调pH 7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。
以乙酸钠为碳源，亚硝酸钠为氮源时，本发明菌株可以进行好氧反硝化。培养基组分为碳源乙酸钠0.6～5.0g/L，氮源为亚硝酸钠1.25～5.0g/L，其余成分为KH2PO4 0.7g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，蒸馏水1000mL；NaOH调pH 7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。
以乙酸钠为碳源，硝酸钾为氮源时，本发明菌株可以进行好氧反硝化。培养基组分为碳源乙酸钠0.6～5.0g/L，氮源为硝酸钾2.0～7.0g/L，其余成分为KH2PO4 0.7g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L，蒸馏水1000mL；NaOH调pH 7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。
本发明中的菌株DN2.3在存在氮素如氨态氮和/或硝酸盐氮和/或亚硝酸氮的水体中，均有脱除氮素的活性。这样，本发明菌株可用于多种含氮废水的处理。
4.本发明中红球菌菌株DN2.3的培养
(1)所使用的培养基：
A.牛肉膏培养基(g/L)：牛肉膏5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。
B.有机碳源脱氮培养基(g/L)：KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.5，(NH4)2SO4 0.5，葡萄糖2.0，NaOH调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。
上述培养基如制成固体培养基，则添加加琼脂1.5％～2.0％。
(2)本发明中红球菌菌株DN2.3培养条件
将牛肉膏培养基斜面上保存的Rhodococcus sp.DN2.3用接种环刮取一环菌分别接种于牛肉膏液体培养基或有机碳源脱氮液体培养基中，30～37℃，170～200rpm振荡培养，在24～36h内可收获菌液。
5.本发明中红球菌菌株DN2.3的使用方法
本发明提供该菌在水体生物脱氮中的应用，使用本发明提供的细菌可有效地脱除水体中的氨氮、硝酸氮和亚硝酸氮。
(1)使用前用有机碳源脱氮培养基活化菌株。从牛肉膏培养基斜面上刮取一环菌苔，接种入装有30mL～50mL有机碳源脱氮液体培养基的250mL锥形瓶中，30～37℃，170～200rpm振荡培养24～36h，即可完成菌株活化。
(2)将活化后的菌液按2％～10％比例接种于待处理模拟含氮废水中，30～37℃，170～200rpm振荡或曝气培养，或采用填料挂膜、载体吸附或好氧颗粒污泥等固定化技术固定后，曝气培养，定时取样检测NH4 +-N、NO2 --N、NO3 --N、TN、CODCr等去除情况。
(3)检测方法
NH4 +-N：采用水杨酸-次氯酸盐分光光度法
NO2 --N：采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法
NO3 --N：采用DMP分光光度法
TN：采用碱性过硫酸钾法消解紫外分光光度法
CODCr：采用重铬酸钾消解分光光度法
以上方法均参照中国环境科学出版社出版的《水和废水检测分析方法》(第四版)。
NH4 +-N、NO2 --N、NO3 --N、TN、CODCr等的测定采用德国WTW多功能水质分析仪(TheSpectroquant Analysis System PhotoLab S12)，型号PhotoLab S12，工作电压12V。消煮使用WTW公司产CR 2200加热器。测试试剂为默克公司生产的配套试剂。
本发明具有以下优点：
(1)本发明菌株既可自养生长，又可异养生长，基质利用范围广，易于培养，水质适应范围广。
(2)本发明菌株能在异养条件下脱氮，并且在脱氮过程中没有硝酸盐和亚硝酸盐的积累。
(3)本发明菌株可以脱除水体中多种形态的氮，包括氨态氮、硝酸态氮和亚硝酸态氮。
(4)本发明菌株可同时去除有机废水中的氮和CODCr。
(5)本发明菌株适用于有机含氮废水的处理，可以在一个处理系统中完成快捷脱氮，不同于传统的硝化-反硝化多步脱氮途径。因此，使用该菌株处理废水，工艺简单、工艺路线短，并且脱氮效果稳定。
附图说明
附图1红球菌DN2.3在牛肉膏培养平皿上生长的菌落图
附图2红球菌DN2.3菌体扫描电镜显微照片
下面结合具体实施例进一步阐明本发明，应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
具体实施方式
实施例1：本发明菌株的培养
(1)牛肉膏培养基和有机碳源脱氮培养基，121℃，灭菌20分钟。
(2)将菌株红球菌DN2.3接种至灭菌的牛肉膏斜面上，37℃活化培养24～36h备用。
(3)将活化后的菌种接种于牛肉膏液体培养基或有机碳源脱氮液体培养基中，250mL三角瓶中装量50mL培养基，37℃，170～200rpm振荡培养24～36h。
(4)4000rpm，10min离心收获菌体或直接将菌悬液转接于待处理的废水样品中。
实施例2：本发明菌株在乙酸钠为有机碳源条件下对氨氮和CODCr的去除
模拟废水(g/L)：KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.5，(NH4)2SO4 0.5，乙酸钠2.6，NaOH调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。
配制以乙酸钠为碳源、硫酸铵为氮源的模拟废水，初始CODCr约2000mg/L，氨氮约100mg/L。接种2％的菌悬液(培养方法见实施例1)，对照用同体积灭菌水代替，37℃，170rpm振荡培养，定时取样测定氨氮、硝酸氮、亚硝酸氮浓度的变化。结果见表1。从表1中可以看出，在乙酸钠为有机碳源时，DN2.3能去除氨氮。在初始氨氮浓度为103mg/L的有机碳源培养基中，DN2.3经过144小时的培养，将体系中的氨氮降到了32mg/L，CODCr降至300mg/L，氨氮去除率为71.9％，COD去除率为85.5％。在此过程中，培养体系中没有检测到明显的硝酸氮、亚硝酸氮积累(浓度≤0.02mg/L)。这与文献“好氧同时硝化-反硝化菌的分离鉴定及系统发育分析”(张光亚、方柏山等，2005)中报道的菌株Rhodococcus sp.SDN在乙酸钠和硫酸铵分别为碳源和氮源时，对数生长期(28～36h)可以检测到130～140μmol/L的亚硝酸(换算成亚硝酸氮浓度为1.82～1.96mg/L)不同。
表1DN2.3在乙酸钠为机碳源条件下对氨氮和CODCr的去除
实施例3：本发明菌株在葡萄糖为有机碳源条件下对氨氮和CODCr的去除
模拟废水(g/L)：KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.5，(NH4)2SO4 0.5，葡萄糖2.0，NaOH调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。
配制葡萄糖为有机碳源、硫酸铵为氮源的模拟废水，初始CODCr浓度为2000mg/L，氨氮约为100mg/L。接种2％菌悬液(培养方法见实施例1)，对照用同体积灭菌水代替，30℃，200rpm振荡培养，定时测定CODCr和氨氮含量。实验结果见表2。从表2可看出，DN2.3在初始CODCr浓度在2000mg/L时，培养48h，氨氮和CODCr都得到了较好的去除，去除率分别为54.4％和37.9％。培养液中均未检出硝酸氮和亚硝酸氮。因此，DN2.3能利用葡萄糖作为外加有机碳源进行异养生长，并能同步去除CODCr和氨氮。
表2DN2.3在葡萄糖为有机碳源条件下对氨氮和CODCr的同时去除
实施例4：本发明菌株以葡萄糖为碳源对NaNO2、KNO3为底物的好氧反硝化脱氮
培养基(g/L)：KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.5，KNO3/NaNO2按需浓度配制，葡萄糖1.0，NaOH调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。
以亚硝酸钠、硝酸钾为氮源分别配制两种不同的反硝化培养基1#、2#，NaNO2/KNO3 3.6mM，氮元素浓度为50mg/L，其他培养基成分相同(碳源均为0.1％葡萄糖)，接种菌悬液量均为5％(培养方法见实施例1)，37℃，200rpm振荡培养，定时测定氮的去除情况。实验结果见表3。从表3中可看出，DN2.3在此条件下对亚硝酸氮和硝酸氮都能进行反硝化，表明DN2.3具有好氧反硝化能力。
表3DN2.3以葡萄糖为碳源的好氧反硝化脱氮作用
*1#培养基中出现硝酸氮估计是由于亚硝酸钠药品在空气中部分氧化的原因
实施例5：本发明菌株以乙酸钠为碳源对NaNO2、KNO3的好氧反硝化脱氮
培养基(g/L)：KH2PO4 0.7，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl2·2H2O 0.5，NaNO2/KNO3按需浓度配制，乙酸钠2.0，NaOH调pH 7.2～7.4，121℃灭菌20分钟。
以亚硝酸钠、硝酸钾为氮源分别配制两种不同的反硝化培养基1#、2#，KNO3/NaNO2 0.2％，氮元素浓度约为40mg/L，其他培养基成分相同(碳源均为0.2％乙酸钠)，接种菌悬液量均为5％(培养方法见实施例1)，37℃，200rpm振荡培养，定时测定氮的去除情况。实验结果见表4。从表4中可看出，DN2.3在此条件下对亚硝酸氮和硝酸氮都能进行反硝化，表明DN2.3具有好氧反硝化能力，这与文献“好氧反硝化菌的分离鉴定及特性研究”(张光亚，陈培钦，2005)中所报道的，菌株Rhodococcus sp.DN在0.2％乙酸钠为碳源，0.2％亚硝酸钠为氮源的培养基中不生长的情况明显不同。
表4DN2.3以乙酸钠为碳源的好氧反硝化脱氮作用
*1#培养基中出现硝酸氮估计是由于亚硝酸钠药品在空气中部分氧化的原因
Claims (3)
1.一株异养硝化好氧反硝化细菌，该细菌为红球菌属(Rhodococcus sp.)DN2.3，保藏登记号：CCTCC NO：M209300，保藏地点：中国典型培养物保藏中心，保藏时间：2009年12月11日。
2.一种培养权利要求1所述细菌的方法，其特征是：将Rhodococcus sp.DN2.3接种于培养基中，30-37℃，170-200rpm振荡培养，培养基组分为牛肉膏5.0g/L，蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L，蒸馏水1000mL；调pH 7.2-7.4，121℃灭菌20分钟。
3.权利要求1所述的细菌及其培养物的用途，用于水体生物脱氮，将培养得到的菌液按2％-10％比例接种于待处理含氮废水中，170-200rpm振荡培养或采用填料挂膜、载体吸附或好氧颗粒污泥固定化技术固定后曝气培养。
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