CN114958659A - 一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌 - Google Patents

一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌，菌株命名为Paracoccus versutus JUST‑3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022233。本发明筛选分离获得的菌株能够在好氧条件下实现硝化过程和反硝化除磷过程，具有同步去除污水中氮磷的性能：其在高浓度氮磷合成污水中TN、TP初始浓度分别为100mg/L和90mg/L时，菌株对TN和TP 24小时去除率达68.58％和81.02％；在实际市政污水中TN、TP和COD浓度分别为46.43mg/L、3.82mg/L和204mg/L，经过24小时的反应，菌株对污水中TN、TP和COD的去除率达91.84％、82.21％和84.31％。

Description

一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种市政污水处理的生物方法，具体为一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌。
背景技术
氮和磷依旧是我国水体的主要污染指标。随着含氮磷废水排放量的增加，水环境的氮磷污染问题越来越严重，过量的氮磷会引起藻类的过度繁殖，进而导致水体富营养化。此外还会导致水中溶解氧含量急剧降低，引起鱼虾等生物的窒息死亡，破坏水体生态平衡，进而导致水质恶化，甚至间接污染地下水进而危及人体健康。由于世界范围内水体富营养化日趋严重，以控制富营养化为目的的脱氮除磷技术已成为国内外专家学者关注和研究的热点，并且已取得较大成就。尽管如此，脱氮除磷技术仍然存在不少缺陷，比如工艺流程复杂、构筑物繁多、能耗大、剩余污泥量大和同步脱氮除磷效率低等。尤其在对碳、氮和磷比例失调且碳源偏低的城市污水的处理过程中，这些缺陷充分暴露，如何在去除有机物的同时，实现高效脱氮除磷，引起了专家学者的关注，因此生物脱氮除磷理论得到迅速发展，新型工艺不断涌现。目前主要有：短程硝化反硝化、同时硝化反硝化、厌氧氨氧化和反硝化除磷等。
随着好氧硝化反硝化同步脱氮除磷理论的提出，即在好氧条件下，好氧反硝化除磷菌以硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体氧化PHB获得能量促进磷的吸收。该理论中好氧硝化反硝化除磷菌株对碳源和曝气量要求低，且能在好氧条件下进行同步硝化反硝化作用，打破了以往硝化作用和反硝化作用不能同时在好氧条件下进行的局面。因此，迫切需要探索能够同时去除氮和磷的新型好氧硝化反硝化除磷菌株，解决传统脱氮除磷系统中污泥龄矛盾，碳源竞争，同步脱氮除磷效率低等问题。为好氧硝化反硝化除磷技术去除污水中的氮和磷提供一定的理论基础，同时也为剩余污泥减量化和节约能耗提供新思路。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，在好氧池中能够同时高效稳定的去除污水中的氮和磷，本发明提供了一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌。
技术方案：一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌，菌株命名为Paracoccus versutus JUST-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，430072；保藏编号为CCTCC NO：M 2022233，保藏日期：2022年3月9日。菌株为革兰氏染色呈阴性，近球形，直径约0.5～0.8μm。细菌菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑隆起，湿润，粘稠易挑取。
优选的，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示：
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGCACCTTCGGGTGAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATATGCCCTTTGGTACGGAATAGTCCTGGGAAACTGGGGGTAATACCGTATGCGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCCAAAGGATTAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGCAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGACCGGAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTCAAAACTATCGGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCAGGACCGGCCCGGAGACGGGTCTTTCACTTCGGTGACCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACACTTCCAGTTGCCATCATTTGGTTGGGCACTCTGGAAGAACTGCCGATGATAAGTCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGTTAATCCCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGAACAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGACGGCCGTGCGCTAACCAGCAATGGGGGCAGCGGACCACGGTAGGCTCAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCT。
以上序列已提交NCBI，登录号为SRR18191317。采用BLAST分析法将16S rDNA序列与GenBank数据库进行比对分析，发现所述菌株与Paracoccus versutus的亲缘关系最接近，同源性高达99％。
以上任一所述的一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌的分离方法，所述方法包括以下步骤：
S1、取污水处理厂中好氧池的活性污泥，在SBR反应器内驯化培养，取反应器好氧阶段末期的新鲜活性污泥，按污泥与无菌反硝化除磷培养基体积比1:9摇床培养1-2天，再将培养后悬浮液按体积比1:9转移至新鲜无菌反硝化除磷培养基内，每2天重复转移1次，直至培养基均匀且无沉积物；
S2、取S1选择性富集后的菌悬液，用无菌水进行梯度稀释，然后涂布于反硝化除磷琼脂培养基平板上，倒置培养2天；
S3、采用平板划线法对筛选出的单一菌落进行纯化，反复划线纯化5～7代，直至形成均匀单菌落，且无异常菌落出现；
S4、用接种环从平板中刮取一个茁壮单菌落到无菌反硝化除磷培养基中，摇床培养24小时，取菌悬液于离心管中，离心后倾倒上清液，用PBS缓冲液冲洗并重悬制成接种液。
优选的，S2中取1mL的菌悬液，用无菌水分别稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍。
优选的，培养的温度为30～37℃。
优选的，反硝化除磷培养基的组成为：1.0g/L NaCl，0.5g/L MgCl2，0.2g/LKH2PO4，0.3g/L KCl，0.015g/L CaCl2，80mg-N/L KNO3，600mg-C/L乙酸钠和50mL维氏盐溶液，pH值为7.2～7.4。所述维氏盐溶液的组成为：6.55g/L K2HPO4·3H2O，2.5g/L MgSO4·7H2O，2.5g/LNaCl，0.038g/L MnSO4·H2O，0.05g/L FeSO4·7H2O。所述PBS缓冲液的组成为：8.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4，pH为7.4。
以上任一所述一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌在污水处理过程中的应用。
优选的，接种液的OD600值为0.5A，接种液以体积分数1％～5％接种于反硝化除磷培养基中，接种液与污水的体积比为1:100～1:20。
优选的，高浓度氮磷合成污水中TN、TP初始浓度分别为100mg/L和90mg/L时，菌株对TN和TP 24小时去除率达68.58％和81.02％。
优选的，所述实际市政污水中TN、TP和COD浓度分别为46.43mg/L、3.82mg/L和204mg/L，经过24小时的反应，菌株对污水中TN、TP和COD的去除率达91.84％、82.21％和84.31％。
有益效果：本发明筛选分离获得的菌株能够实现同时去除污水中氮磷的性能：其在高浓度氮磷合成污水中TN、TP初始浓度分别为100mg/L和90mg/L时，菌株对TN和TP 24小时去除率达68.58％和81.02％；在实际市政污水中TN、TP和COD浓度分别为46.43mg/L、3.82mg/L和204mg/L，经过24小时的反应，菌株对污水中TN、TP和COD的去除率达91.84％、82.21％和84.31％。
附图说明
图1本发明Paracoccus versutus JUST-3的菌落形态图。
图2本发明Paracoccus versutus JUST-3的革兰氏染色图。
图3本发明Paracoccus versutus JUST-3的形态电镜图。
图4本发明Paracoccus versutus JUST-3与相关种的16S rDNA序列发育树图。
图5本发明Paracoccus versutus JUST-3对富氮富磷合成废水的脱氮除磷效果图。
图6本发明Paracoccus versutus JUST-3对实际生活污水的脱氮除磷效果图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定
(一)材料准备
1、从镇江市征润州污水处理厂好氧池中取得活性污泥，投入实验室稳定运行的SBR反应器中进行驯化培养，在反应器好氧阶段末期采集新鲜活性污泥作为筛选反硝化聚磷菌的来源。
2、培养基
反硝化除磷培养基：1.0g/L NaCl，0.5g/L MgCl2，0.2g/L KH2PO4，0.3g/L KCl，0.015g/LCaCl2，80mg-N/L KNO3，600mg-C/L乙酸钠和50ml维氏盐溶液，pH值为7.2～7.4。
维氏盐溶液：6.55g/L K2HPO4·3H2O，2.5g/L MgSO4·7H2O，2.5g/L NaCl，0.038g/LMnSO4·H2O，0.05g/L FeSO4·7H2O。
3、实验仪器和设备
高压灭菌锅，恒温培养箱，摇床，紫外可见分光光度计，离心机，超净工作台。
(二)菌株的分离筛选与驯化
(1)将10mL新鲜活性污泥转移到含有90mL无菌反硝化除磷培养基中，搅拌得到均匀的悬浮液。经32℃，120rpm摇床培养1～2天后，将10mL的悬浮液转移到90mL的新鲜培养基中。每2天重复转移一次，直到培养基均匀且无沉积物。取完成选择性富集过程的菌悬液1mL，用无菌水做梯度稀释，稀释10，100，1000，10000倍，四个梯度各取200μL稀释液涂布于反硝化除磷琼脂培养基平板上，置于32℃恒温培养箱中倒置培养2天。采用平板划线法对筛选出的单一菌落进行纯化，反复划线纯化5～7代，直至形成均匀单菌落，且无异常菌落出现。用接种环从平板中刮取一个茁壮单菌落到已灭菌的反硝化除磷培养基中，放入32℃，120rpm摇床进行培养，24h后取菌悬液于离心管中，在8000r/min条件下离心5min，倾倒上清液，用PBS缓冲液冲洗三次后重悬制成菌悬液，作为后续实验的接种液，固定菌悬液OD600值约为0.5A。将接种液以2％(v/v)接种量接种于装有100mL反硝化除磷液体培养基的250mL锥形瓶中，置于30℃，160rpm条件下连续培养24h，并于培养的第12h、24h取样测定菌株的生长量(OD600)以及上清液中TN和TP浓度，并计算其TN和TP去除率。
(2)获得稳定的具有好氧硝化反硝化同步脱氮除磷作用的单菌株后，取单菌落在反硝化除磷培养基中扩增，用PBS缓冲液冲洗三次后重悬制成OD600为0.5A的菌悬液，保存在4℃，备用。
(三)菌株特性及鉴定
1、菌落形态特征以及生理生化特性
将上述得到的大小形态一致的单菌落命名为Paracoccus versutus JUST-3，该菌落呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑隆起，湿润，粘稠易挑取，见图1。该菌革兰氏染色呈阴性(图2)，近球形，直径约0.5～0.8μm。最适生长温度为30～37℃，最适生长pH为6～8，细菌形态见扫描电镜图3。
2、Paracoccus versutus JUST-3的16S rRNA分子鉴定
取菌体加入400μL Buffer SCL裂解菌体，65℃水浴1h左右，中间每隔10min混匀1次，直至混合液变澄清。然后离心取上清液进行DNA提取。采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取基因组DNA。将提取的DNA作为模板，采用针对细菌16S rRNA基因的通用引物对27F/1492R进行PCR扩增，所述引物的序列如下：27F(SEQ ID NO.2)，AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R(SEQ ID NO.3)，TACGGYTACCTTGTTACGACTT。将PCR产物送交上海生工进行测序，采用BLAST分析法将16S rDNA序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与Paracoccus versutus的亲缘关系最接近，同源性高达99％，综合菌株的生理生化以及分子鉴定结果，该菌株命名为Paracoccus versutus JUST-3。在GenBank下载同源性较高的序列，利用MEGA中的Neighbor-joining算法构建系统发育树，见图4。
实施例2：Paracoccus versutus JUST-3在富氮富磷合成废水处理中的应用
考察Paracoccus versutus JUST-3对富氮富磷合成废水的处理能力，研究了在合成废水中，Paracoccus versutus JUST-3对总氮和总磷的降解能力。合成废水的各组分为：0.2g/L KH2PO4，6.5g/L K2HPO4·3H2O，0.5g/L(NH4)2SO4，0.77g/L乙酸钠，pH为7.2，121℃高温高压灭菌20min。取100mL合成废水加入到250mL的锥形瓶中，加入2mL OD600值约为0.5A的Paracoccus versutus JUST-3固定菌悬液，30℃、120转/分钟摇床培养24h，第12h，24h各取样一次，测定溶液中总氮和总磷的含量，计算各指标的去除率，如图5所示。结果表明：该菌株在12h对总氮和总磷的去除率分别为30.26％和53.85％，在24h对总氮和总磷的去除率达到最大，分别为68.58％和81.02％。
实施例3：Paracoccus versutus JUST-3在实际生活污水处理中的应用
考察Paracoccus versutus JUST-3处理实际生活污水的能力，研究了将该菌投加到实际生活污水中氮和磷的去除效果。该实际生活污水取自征润州污水处理厂，氨氮、硝态氮、总氮、总磷和COD的浓度分别为31.46mg/L、3.86mg/L、46.43mg/L、3.82mg/L和204mg/L。在500mL规格的血清瓶中，加入250mL生活污水，再进行高压蒸汽灭菌。灭菌结束后，取5mLParacoccus versutus JUST-3菌悬液加入血清瓶中，进行厌氧(4h)和好氧(20h)反应运行，每4小时取样一次，检测反应器中氨氮、硝氮、总氮、总磷和COD的去除率。结果见图6，经过24h反应，该菌株对实际生活污水中总氮、总磷和COD的去除率为91.84％、82.21％和84.31％。
序列表
<110> 江苏科技大学
镇江中微环境科技有限公司
<120> 一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1449
<212> DNA
<213> 善变副球菌(Paracoccus versutus)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc 60
gcaccttcgg gtgagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaatatgccc tttggtacgg 120
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caaaggatta gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcctac caagccgacg 240
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aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900
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cttcggtgac ctggagacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020
ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccaca cttccagttg ccatcatttg gttgggcact 1080
ctggaagaac tgccgatgat aagtcggagg aaggtgtgga tgacgtcaag tcctcatggc 1140
ccttacgggt tgggctacac acgtgctaca atggtggtga cagtgggtta atccccaaaa 1200
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tcgcggaaca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1320
ccatgggagt tgggtctacc cgacggccgt gcgctaacca gcaatggggg cagcggacca 1380
cggtaggctc agcgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag ccgtagggga acctgcggct 1440
ggatcacct 1449
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (10)

1.一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌，其特征在于，菌株命名为Paracoccus versutus JUST-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2022233。
2.根据权利要求1所述的一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌，其特征在于，所述菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1或2所述的一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌的分离方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
S1、取污水处理厂中好氧池的活性污泥，在SBR反应器内驯化培养，取反应器好氧阶段末期的新鲜活性污泥，按污泥与无菌反硝化除磷培养基体积比1:9摇床培养1-2天，再将培养后悬浮液按体积比1:9转移至新鲜无菌反硝化除磷培养基内，每2天重复转移1次，直至培养基均匀且无沉积物；
S2、取S1选择性富集后的菌悬液，用无菌水进行梯度稀释，然后涂布于反硝化除磷琼脂培养基平板上，倒置培养2天；
S3、采用平板划线法对筛选出的单一菌落进行纯化，反复划线纯化5～7代，直至形成均匀单菌落，且无异常菌落出现；
S4、用接种环从平板中刮取一个茁壮单菌落到无菌反硝化除磷培养基中，摇床培养24小时，取菌悬液于离心管中，离心后倾倒上清液，用PBS缓冲液冲洗并重悬制成接种液。
4.根据权利要求3所述的一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌的分离方法，其特征在于，S2中取1mL的菌悬液，用无菌水分别稀释10倍，100倍，1000倍，10000倍。
5.根据权利要求3所述的一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌的分离方法，其特征在于，培养的温度为30～37℃。
6.根据权利要求3所述的一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌的分离方法，其特征在于，反硝化除磷培养基的组成为：1.0g/L NaCl，0.5g/L MgCl2，0.2g/LKH2PO4，0.3g/L KCl，0.015g/L CaCl2，80mg-N/L KNO3，600mg-C/L乙酸钠和50mL维氏盐溶液，pH值为7.2～7.4。
7.权利要求1或2所述一株具有好氧硝化反硝化脱氮除磷性能的善变副球菌在污水处理过程中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，接种液的OD600值为0.5A，接种液以体积分数1％～5％接种于反硝化除磷培养基中，接种液与污水的体积比为1:100～1:20。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，高浓度氮磷合成污水中TN、TP初始浓度分别为100mg/L和90mg/L时，菌株对TN和TP 24小时去除率达68.58％和81.02％。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述实际市政污水中TN、TP和COD浓度分别为46.43mg/L、3.82mg/L和204mg/L，经过24小时的反应，菌株对污水中TN、TP和COD的去除率达91.84％、82.21％和84.31％。
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