CN105368737A - 一种处理高浓度有机废水的菌株、微生物菌剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种处理高浓度有机废水的菌株、微生物菌剂及其应用。具体包括戈登氏菌(Gordonia？sp.)Y-1(保藏登记号为CGMCC？NO.10791)和微杆菌(Microbacterium？sp.)Y-3(保藏登记号为CGMCC？NO.10792)，以及由戈登氏菌Y-1和微杆菌Y-3按照配比为1:1～3混合进行放大发酵，获得浓度为1×109～1×1011CFU/mL菌剂。本发明的菌株Y-1、Y-3以及微生物菌剂能维持较强的有机物的降解能力，可用于高浓度有机废水的污染物消减和降解处理领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种处理高浓度有机废水的菌株、微生物菌剂及其应用，属于环境保护技术领域，也属于生物强化技术的范畴。
背景技术
生物处理是目前废水处理最常用的方法之一，具有应用范围广、适应性强及运行费用低等优点。炼油、化工等行业均产生大量高浓度有机废水，这类废水不仅含有高浓度难降解有机污染物、成分复杂且含盐量较高，这类废水回收价值不高，若采用物理化学手段处理成本很高，因此对作为首选的生化处理工艺的高效、稳定运行带来极大的难度。
传统生物处理工艺中的微生物对高浓度有机废水中的复杂的难降解污染物的降解和耐受能力不高，处理效果不理想，而且系统受冲击后恢复过程较长。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供能够处理高浓度有机废水的高效菌株、由菌株制备的高效微生物菌剂，使得微生物菌剂具有活性强、抗冲击能力高和处理彻底的优点，能有效处理高浓度有机废水。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明对炼油和化工行业的污水处理设施中的混合污泥样品，利用混合高浓度有机废水进行驯化培养、筛选和分离后，获得两种高效菌株。
一种高效菌株是菌株Y-1，菌株Y-1经过分子生物学鉴定为戈登氏菌属(Gordoniasp.)，该菌株已于2015-5-11日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCCNO.10791。该戈登氏菌Y-1菌落颜色为粉红色；圆形边缘整齐光滑，菌株个体成杆状状，无芽孢，能运动；革兰氏染色为阳性，氧化酶为阴性，能利用多种碳源。
另一种高效菌株是Y-3菌株经过分子生物学鉴定为微杆菌属(Microbacteriumsp.)，该菌株已于2015-5-11日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCCNO.10792。该微杆菌Y-3菌落颜色为乳白色，圆形细小边缘整齐光滑，菌株个体呈微杆状，无芽孢，能运动；革兰氏染色为阳性，接触酶阳性，能利用多种碳源。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂由戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1(保藏登记号为CGMCCNO.10791)和微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3(保藏登记号为CGMCCNO.10792)按照体积配比为1:1～3混合进行放大发酵获得的浓度为1×109～1×1011CFU/mL菌剂。
本发明还提供了上述微生物菌剂在高浓度有机废水处理中的应用，尤其在化工、炼油或炼化废水中的应用。
进一步，本发明还提供了上述微生物菌剂的一种具体制备方法，包括以下内容：
1)将所述戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1和微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3分别接种于BPD液体培养基、30～35℃、150～240rpm好氧条件下震荡培养1～3d至对数生长期，将获得的戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1和微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3种子液混合，配比为1:1～3；
2)按体积百分比1％-10％的接种量将戈登氏菌Y-1和微杆菌Y-3混合种子液移至含有放大发酵培养基的发酵罐进行发酵培养，培养条件为：罐温为30～37℃，罐压为0.03～0.06MPa，通气量为0.8～1.5V/V/min，搅拌速度100～300rpm、发酵时间12～24h，使发酵液中浓度为1×109～1×1011CFU/mL；获得的菌体加入常用保护剂后制备成液态菌剂，或者利用本领域的现有常规技术制成干粉状菌剂；
其中所述放大发酵培养基的配方为：葡萄糖15～30g/L，KH2PO45～10.5g/L，(NH4)2HPO43～6g/L，柠檬酸0.9～1.84g/L，酵母膏9.3～19.5g/L，微量元素溶液5mL，消泡剂0.1％，蒸馏水1000ml，调节pH至6.8-7.2。
本发明提供的高效菌株(戈登氏菌Y-1和微杆菌Y-3)能够处理高浓度有机废水的有机污染物。特别是由上述两种菌株复配制得的微生物菌剂，其耐受的有机负荷高、抗冲击能力强，可用于生化系统快速启动、增效处理和冲击后快速恢复，并可根据现场使用需要提供高活性液态菌剂或长期保存、便于运输的干粉状菌剂。该菌剂的制备方法具备操作简单、使用方便、成本低廉的优点，适合于规模化生产和实际工程应用，可广泛用于对炼油和化工等行业的高浓度有机废水的生物处理。
附图说明
图1本发明实施例1中微生物菌剂连续生物强化过程中反应器的运行情况；
图2本发明实施例2戈登氏菌Y-1单一菌株制剂快速启动情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案进行进一步详细说明。以下实施例仅用于说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1微生物菌剂的制备方法和在苯酚丙酮废水中的应用
本发明的菌株Y-1和Y-3是从炼油、化工、医药和染料等行业的混合污泥样品通过混合高浓度有机废水驯化培养、筛选和分离而获得。
对菌株Y-1和菌株Y-3分别进行16SrDNA鉴定，具体步骤如下：
使用正向引物F1:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引
R1:5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’进行DNA扩增(PCR)。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，72℃最终延伸10min，4℃保存。PCR产物用0.8％的琼脂糖凝胶分离，纯化与回收后测序。所测序列使用NCBIBlast比对分析，确定菌株Y-1从属于戈登氏菌(Gordoniasp.)，菌株Y-3从属于微杆菌(Microbacteriumsp.)。
戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1的16SrDNA序列见序列表中第1个序列，该菌株已于2015-5-11日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCCNO.10791。
微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3的16SrDNA序列见序列表中第2个序列，该菌株已于2015-5-11日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏登记号为CGMCCNO.10792。
本发明的戈登氏菌Y-1和微杆菌Y-3菌株的培养方法，包括如下步骤：
1、种子液的制备
1)配制BPD固体培养基，培养基组成为：牛肉膏：5g，蛋白胨：10g，NaCl：5g，蒸馏水：1000ml，琼脂粉：15g，pH：7.0-7.2；
2)将上述培养基高温蒸气(121℃，30min)灭菌后，在超净台中倒于灭菌的平板上，培养基凝固后待用；
3)分别将菌Y-1和菌Y-3通过划线的方法接种于上述平板上，将平板倒置于30℃培养箱培养3天待菌落长出；
4)用接种环取平板上的生长良好的Y-1和Y-3菌落刮下，分别接种于BPD液体培养基中，三角瓶装液量为50％，在温度30℃、150rpm、培养时间3d至对数生长期，获得Y-1和Y-3的种子液；
2、发酵罐发酵
将上述培养获得的Y-1和Y-3种子液，按照1:1的比例进行混合，并按照发酵液总量5％的接种量移至发酵罐，进行混合发酵培养，条件为：罐温30℃，罐压0.03MPa，通气量1:1V/V/min，搅拌速度150rpm、发酵时间12h，使发酵液中菌浓度为3×109CFU/mL；
发酵液体培养基配方为：葡萄糖：15g/L，KH2PO45g/L，(NH4)2HPO46g/L，柠檬酸0.9g/L，酵母膏19.5g/L，微量元素溶液5mL，消泡剂0.1％，蒸馏水1000mL，调节pH至7.0。微量元素溶液的组成为：FeSO4·7H2O10g/L，ZnSO4·7H2O5.25g/L，CuSO4·5H2O3g/L，H3BO30.3g/L，CoCl2.6H2O0.04g，CaCl22.0g/L，Na2MoO4.2H2O0.15g/L，蒸馏水1000mL，pH7.0。
3、菌剂的保存
将上述获得的发酵菌液中加入本领域常规的液态保护剂制成液态菌剂，以利于长期保存。
4、混合菌剂在高浓度苯酚丙酮废水中的应用
苯酚丙酮生产过程中会产生一定量的含盐高浓度有机废水，主要污染物为2-苯基异丙醇，占总量的50％，其次为苯酚、异丁酸和异丙苯，占总量的44％，其他污染物仅占总量的6％。污染物中的异丙苯、苯基异丙醇属难降解有机物，同时对微生物有较强的毒害作用。目前，通常经过10～20倍稀释后采用生化处理，但有毒有害组分较多，仍易对污水处理厂形成冲击，影响污水处理厂的平稳运行。采用上述方法制备的高效菌剂进行生物强化以达到提高有机负荷和稳定运行的目的。
表1苯酚丙酮废水的水质情况表
| pH | BOD5(mg/L) | CODCr(mg/L) | B/C | 电导率(μs/cm) |
| 3.36 | 1350 | 15500 | 0.09 | 44110 |
苯酚丙酮废水稀释10倍后并调整pH＝7.0，按照COD：N：P＝500:5:1补充氮磷，采用普通活性污泥系统中进行处理，停留时间32h，SV30为25％，启动运行25d后处理效果趋于稳定，反应器出水COD为435mg/L，去除率为71.9％。
后采用上述方法制备的高效菌剂对该生化系统强化，反应器的运行状况见图1。
此次生化系统强化运行共计37d，反应器出水情况如图1所示。初始进水COD为1550mg/L(此时进水电导为5.6ms/cm)，连续运行6d，反应器出水COD比较稳定，基本维持在200mg/L左右，去除率均维持在85％以上。可见，该菌剂具有较好的提效作用。随着反应器进水浓度逐渐提高，反应器能快速适应并稳定运行，在进水浓度提高至3100mg/L、电导为11ms/cm的情况下，反应器的COD去除率仍能维持在80％以上。因此，利用该高效菌剂进行生物强化不仅能提高反应器对苯酚丙酮废水的有机负荷耐受能力，还具有提高去除效率和稳定运行的功效。
实施例2戈登氏菌Y-1单一菌株制剂在高浓度苯酚丙酮废水中的应用
与实施例1的区别是，高效菌剂为戈登氏菌Y-1单株微生物构成。
种子液Y-1的培养方法、放大发酵条件和菌剂保存可参考实施例1，获得2×109CFU/mL菌剂发酵液。为便于实验效果比对，本实施例仍针对高浓度苯酚丙酮废水进行生物强化应用。
苯酚丙酮废水稀释5倍后并调整pH＝7.0，按照COD：N：P＝500:5:1补充氮磷，采用普通活性污泥系统中进行处理，停留时间32h，采用上述方法制备的高效菌剂对该生化系统快速启动，反应器的处理状况见图2。
此次高效菌剂快速启动高浓度苯酚丙酮废水生化系统运行周期为18d，运行过程具体各反应器出水情况如图2所示。进水COD为3059mg/L采用普通活性污泥法进行处理，强化第1天反应器出水COD去除率仅为33.5％，随着菌剂强化进程延长，反应器COD去除率快速提高，经18d强化后可稳定达到75％左右，生物增效作用显著，且比常规自行驯化启动可大大缩短1/2周期。
实施例3微生物菌剂的制备方法和在丙烯酸生产废水中的应用
与实施例1的区别是，实验用水为高浓度丙烯酸废水，高效菌剂的组成比例不同，培养条件不同、菌液中所含的菌落总数较高且菌剂保存方法也有差别。
1、种子液的制备
Y-1和Y-3的种子液制备方法同例1。
2、发酵罐发酵
将上述培养获得的Y-1和Y-3种子液，按照1:3的比例进行混合，并按照发酵液总量5％的接种量移至发酵罐，进行混合发酵培养，条件为：罐温37℃，罐压0.06MPa，通气量1:1.5V/V/min，搅拌速度150rpm、发酵时间12h，使发酵液中菌浓度为1×1011CFU/mL；
发酵液体培养基配方为：葡萄糖：30g/L，KH2PO410.5g/L，(NH4)2HPO46g/L，柠檬酸1.84g/L，酵母膏15g/L，微量元素溶液5mL，消泡剂0.1％，蒸馏水1000mL，调节pH至7.0。微量元素溶液的组成为：FeSO4·7H2O10g/L，ZnSO4·7H2O5.25g/L，CuSO4·5H2O3g/L，H3BO30.3g/L，CoCl2.6H2O0.04g，CaCl22.0g/L，Na2MoO4.2H2O0.15g/L，蒸馏水1000mL，pH7.0。
3、菌剂的保存
将上述获得的发酵菌液按照质量百分比1％加入载体麸皮米糠，充分搅拌均匀后，在室温，5000rpm的条件下离心15min，将离心沉淀物用无菌水洗涤两次，再次离心，即得到菌泥。
本领域常见的冻干保护剂组分，组成为10％脱脂奶粉、2％甘油、1％的蔗糖并与等量水混合均匀，121℃、0.15MPa灭菌20min，备用。
将菌泥放入上述保护剂中搅拌均匀，然后在-40℃的环境中预冻2h，再在无菌条件下真空冷冻干燥24h即可得到微生物冻干菌剂，浓度为3.0×1011CFU/mL，制成的菌剂可有效保存1年以上。
4、混合菌剂在高浓度丙烯酸废水中的强化应用
高浓度丙烯酸废水成分复杂，含有甲醛、丙烯酸、丙烯醛、甲苯、甲醇、2-乙基己醇、丙烯酸钠、对甲苯磺酸钠、辛醇、辛酯、苯甲醛、二己基辛醛、马来酸酐、巴豆酸、二聚物、对甲苯磺酸、糖醛、甲苯磺酸水合物等有毒有害的难降解污染物，处理难度极大。通常工业上高浓度丙烯酸废水采用焚烧法处理，COD在800-1500mg/L范围内的低浓度丙烯酸废水采用生化法进行处理，采用高效生物菌剂强化常规生化系统。
表2废水水质情况浓度单位：(mg/L)
| COD | BOD5 | TOC | 甲醛 | 浊度(NTU) | pH | 电导率(ms/cm) |
| 72883 | 75 | 32840 | 7900 | 12.7 | 4.1 | 17.54 |
采用活性污泥法处理实际丙烯酸生产废水，水质情况见表2，将原水稀释至COD＝1453mg/L，按照COD：N：P＝500:5:1补充氮磷，调整pH＝7.0，进水量为200L/h，HRT为18h，驯化和培养30d，反应器去除率稳定在78.8％左右，出水COD为308mg/L。
采用上述高效菌剂进行强化，投加方案为：1-3d投加高效菌剂100mg/L，4-7d投加菌剂50mg/L。并逐渐提高进水浓度，每次提高负荷，应配合补充菌剂，反应器的去除情况见表3。
表3生物强化反应器出水COD情况
| 进水COD(mg/L) | 强化时间(d) | 出水COD(mg/L) | 去除率(％) |
| 1453 | 0 | 308 | 78.8 |
| 1 | 267 | 81.6 | |
| 3 | 187 | 87.1 | |
| 7 | 68 | 95.3 | |
| 2029 | 1 | 237 | 88.3 |
| 3 | 181 | 91.1 | |
| 7 | 121 | 94.0 | |
| 2429 | 1 | 307 | 87.4 |
| 3 | 223 | 90.8 | |
| 7 | 124 | 94.9 |
表3数据显示，利用该高效菌剂进行生物强化7d，在进水COD为1453mg/L时，反应器出水稳定在60-70mg/L，反应器去除率可达到95％以上，生物强化效果显著；当进水COD至2029mg/L和2429mg/L时均经历出水升高去除率小幅下降至87％左右，但经过短暂调整恢复去除效果至94％左右，该菌剂可实现生化系统的稳定运行，提高系统的耐冲击负荷的能力。
实施例4微杆菌Y-3单一菌株制剂在高浓度丙烯酸废水中的应用
与实施例3的区别是，高效菌剂为微杆菌Y-3单株微生物构成。
种子液Y-3的培养方法、放大发酵条件和菌剂保存可参考实施例3，获得3.0×1011CFU/mL菌剂发酵液。为便于实验效果比对，本实施例仍针对高浓度丙烯酸废水进行生物强化应用。
实验条件、菌剂投加方案均参见实施例3，反应器出水情况见表4。
表4生物强化反应器出水COD情况
| 进水COD(mg/L) | 强化时间(d) | 出水COD(mg/L) | 去除率(％) |
| 1453 | 0 | 352 | 75.8 |
| 1 | 289 | 80.1 | |
| 3 | 202 | 86.1 | |
| 7 | 97 | 93.3 | |
| 2029 | 1 | 463 | 77.2 |
| 3 | 335 | 83.5 | |
| 7 | 140 | 93.1 | |
| 2429 | 1 | 724 | 70.2 |
| 3 | 598 | 75.4 | |
| 7 | 350 | 85.6 |
利用该单一Y-3菌剂进行生物强化，在进水COD为1453mg/L时，反应器出水稳定在100mg/L，反应器去除率可达到93％以上，生物强化效果显著；当进水COD至2029mg/L和2429mg/L时均经历出水升高去除率小幅下降后逐渐升高过程，但去除率仍可稳定在85％以上，该菌剂可实现生化系统的稳定运行，提高系统的耐冲击负荷的能力。但单一菌株的性能与复合菌剂相比略差。
Claims (8)
1.一种戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1，其特征在于，所述的菌株保存登记号CGMCCNO.10791。
2.一种微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3，其特征在于，所述的菌株保藏登记号为CGMCCNO.10792。
3.如权利要求1所述的戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1，其特征在于：所述菌株为革兰氏阳性，氧化酶为阴性；菌落颜色为粉红色圆形边缘整齐光滑，菌株个体成杆状状，无芽孢，能运动。
4.如权利要求2所述的微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3，其特征在于：所述菌株为革兰氏阳性，接触酶阳性；菌落颜色为乳白色，圆形细小边缘整齐光滑，菌株个体呈微杆状，无芽孢，能运动。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，该微生物菌剂由戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1(保藏登记号为CGMCCNO.10791)和微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3(保藏登记号为CGMCCNO.10792按照体积比为1:1～3混合进行放大发酵，获得浓度为1×109～1×1011CFU/mL菌剂。
6.权利要求5所述的微生物菌剂在高浓度有机废水处理中的应用。
7.权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的高浓度有机废水为化工废水、炼油或炼化废水。
8.如权利要求5所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：将所述戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1和微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3分别接种于BPD液体培养基、30～35℃、150～240rpm好氧条件下震荡培养1～3d至对数生长期，将获得的戈登氏菌(Gordoniasp.)Y-1和微杆菌(Microbacteriumsp.)Y-3种子液混合，配比为1:1～3；
按体积百分比1％-10％的接种量将Y-1和Y-3混合种子液移至含有放大发酵培养基的发酵罐进行发酵培养，条件为：罐温为30～37℃，罐压为0.03～0.06MPa，通气量为0.8～1.5V/V/min，搅拌速度100～300rpm、发酵时间12～24h，使发酵液中浓度为1×109～1×1011CFU/mL；获得的菌体加入常用保护剂后制备成液态菌剂，或者利用本领域的现有常规技术制成干粉状菌剂；
所述放大发酵培养基的配方为：葡萄糖15～30g/L，KH2PO45～10.5g/L，(NH4)2HPO43～6g/L，柠檬酸0.9～1.84g/L，酵母膏9.3～19.5g/L，微量元素溶液5mL，消泡剂0.1％，蒸馏水1000ml，调节pH至6.8-7.2。
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