发明内容
本发明的目的在于提供一种净化养殖水体无机氮的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1,该菌株XHNA1对养殖水体中的无机氮具有较强的净化能力,且环境适应性良好,对养殖鱼虾无不良影响。
本发明的目的还在于提供上述海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1在净化养殖水体中无机氮中的应用。
本发明的第一个目的是通过如下技术方案实现的:一种净化养殖水体无机氮的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1,该菌株XHNA1的保藏名称为:海水硝酸盐还原菌XHNA1,分类命名为:Nitratireductor aquimarinus XHNA1,保藏单位为:中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国武汉,保藏日期为:2017年9月1日,保藏编号为:CCTCC NO:M 2017464。
本发明中的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1的筛选分离鉴定过程为:选取对虾集约化高密度养殖池塘的中后期养殖水体(养殖50~75天),以0.22μm的混合纤维素酯滤膜过滤水样,再将聚集了微生物样品的滤膜置于光合细菌液体培养基中震荡培养3~5天,温度25~30℃,光照强度2500~4000lx;将培养好的菌液在光合细菌固体平板培养基上进行划线培养,培养3~5天,挑选不同形态的单菌落,分离纯化获得生长性能好的菌株。然后把菌株接种至光合细菌液体培养基,28~30℃,光照强度2500~4000lx,150~200rpm进行摇床扩大培养3~5天。把不同的菌液分别添加到调整了NH4Cl浓度的灭菌养殖水中(以NH4Cl调节水体中氨的浓度至10~30mg/L),28~30℃,光照强度2500~4000lx,150~200rpm进行摇床扩大培养3~5天。选取可有效降低水体氨浓度的菌株进行菌种鉴定和保种备用。
从集约化养殖池塘的养殖中后期水体中分离获得菌株并进行纯培养,在将菌液放入以NH4Cl调配的含高浓度氨(以NH4Cl调节水体中氨的浓度至10~30mg/L)的养殖水体中,分析菌株对水体中氨的净化效果影响,获得能高效净化养殖水体氨的菌株,并确定该菌株的培养条件。
该海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1在温度15~35℃、盐度15~45、pH6~9均可正常生长,最佳条件为温度15~30℃,盐度25~45,pH7~9。在最佳条件下与养殖水体营养环境中生长2~3天左右可达到峰值,3~9天期间维持在109CFU/mL的数量水平。该菌株适宜在大部分池塘应用。
本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的:上述海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1在净化养殖水体中无机氮中的应用。
该海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1在养殖水体营养环境下生长2~3天左右可达到峰值,3~9天期间维持在109CFU/mL的数量水平。该菌株适宜在大部分池塘应用。把培养好的菌液分别添加到灭菌养殖水中(为验证其净化效果,以NH4Cl人为调高水体中氨的浓度),当水体盐度为25~45时,温度30℃,加菌组水体中氨的去除率4天可达到75~96%;当盐度大于35时水体氨的去除率可达近90%以上。当水温为15~35℃,盐度25,加菌组水体中氨的去除率4天可达到70~97%;水温15~30℃时氨的去除率在97%以上;但是当水温低于15℃或高于40℃时海水硝酸盐还原菌XHNA1的除氨效果受到明显抑制。
为进一步验证该菌株对水体中无机氮的净化效果,再将作用时间延长并以NaNO2和NaNO3,人为调高养殖水体中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度,把菌液接种至其中,水体盐度为25,温度30℃。结果培养26天后,水体中的亚硝酸盐和硝酸盐的浓度分别较第4天时下降了42%和71%以上;但水体中氨的浓度则升高了106%以上。因此,在净化水体中的亚硝酸盐和硝酸盐时应将该菌株的作用时间延长至20天以上,若需净化水体中的氨则需将菌株的作用时间控制在4~5天以内。
在养殖水体中以106CFU/mL浓度施用该菌时,测试凡纳滨对虾和鲈鱼的7天成活率均可达到95%以上,表明其对养殖生物无明显不良影响。
本发明中养殖池塘环境与背景技术中的水体环境存在巨大差异,有必要以养殖水体环境为基础,从中筛选获得具有无机氮净化功能的土著菌株,并分析评估菌株的环境适应性、生态功能效率、应用安全性等特点,进而研发适宜水产养殖生产实际应用的菌剂产品和应用技术。而非简单套用污水处理工程技术中的相关细节,忽视养殖生物与生产对安全、高效、可持续发展的具体实际需求。因此,本发明通过在养殖环境中分离、筛选的海水硝酸盐还原菌XHNA1,并明确其对养殖水体中的无机氮具有明显的去除作用,且对凡纳滨对虾和鲈鱼没有明显不良影响。为进一步研发适用于水产养殖实际应用的菌剂与配套技术提供了理论和技术支持。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)本发明中的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1对集约化养殖水体中无机氮的去除效果显著,但应用过程中应根据水体中所需净化氮素的具体状况来确定净化效应时间,若需净化水体中的亚硝酸盐和硝酸盐时将该菌株的作用时间应在20天以上,若需净化水体中的氨则须将菌株的作用时间控制在4~5天以内;
(2)本发明中的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1筛选自集约化养殖中后期的水体,具有良好的环境适应性,且对养殖生物无不良影响,适宜大部分的养殖池塘水体应用;
(3)本发明中的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1应用于集约化养殖的水质净化调控可达到良好的应用效果,有利于大幅减少养殖生产过程中的水体更换,还可不必配置价格昂贵的水质净化设备,能为进一步研发或实施养殖水环境定向调控技术,推动实现生态环保的水产高效健康养殖产业发展提供技术储备与支持。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明,但不以任何形式限制本发明。
实施例1净化养殖水体无机氮的海水硝酸盐还原菌XHNA1的筛选与培养
1、材料准备
1.1、菌源
在广东汕尾红海湾的集约化对虾养殖池塘采集养殖50~75天的水样,用光合细菌培养基平板进行分离培养。
1.2、培养基
(1)光合细菌液体培养基:CH3COONa:1g、酵母膏:1g、MgSO4·7H2O:0.4g、NaCl:0.1g、CaCl2·2H2O:0.05g、NaHCO3:0.3g、KH2PO4:1g、微量元素溶液1mL,以上药品分别溶于蒸馏水中,并定溶至1000mL,pH7.0。
微量元素溶液:EDTA:2.5g、ZnSO4·7H2O:10.95g、MnSO4·H2O:1.54g、CuSO4·5H2O:0.39g、CoCl2·6H2O:0.2g、FeSO4·7H2O:7g,以上药品分别溶于蒸馏水中,并定溶至1000mL,pH7.0。
(2)光合细菌固体平板培养基:在光合细菌液体培养基的基础上加入琼脂粉20g/L,制备成固体平板培养基。
2、菌株的筛选培养
选取对虾集约化高密度养殖池塘的中后期养殖水体(养殖50~75天),以0.22μm的混合纤维素酯滤膜过滤水样,再将聚集了微生物样品的滤膜置于光合细菌液体培养基中震荡培养3~5天,温度25~30℃,光照强度2500~4000lx;将培养好的菌液在光合细菌固体平板培养基上进行划线培养,培养3~5天,挑选不同形态的单菌落,分离纯化获得生长性能好的菌株。然后把菌株接种至光合细菌液体培养基,28~30℃,光照强度2500~4000lx,150~200rpm进行摇床扩大培养3~5天。把不同的菌液分别添加到调整了NH4Cl浓度的灭菌养殖水中(以NH4Cl调节水体中氨的浓度至10~30mg/L),28~30℃,光照强度2500~4000lx,150~200rpm进行摇床扩大培养3~5天。选取可有效降低水体氨浓度的菌株进行菌种鉴定。
从集约化养殖池塘的养殖中后期水体中分离获得菌株并进行纯培养,在将菌液放入以NH4Cl调配的含高浓度氨的养殖水体中,分析菌株对水体中氨的净化效果影响,获得能高效净化养殖水体氨的菌株,并确定该菌株的培养条件。
实施例2净化养殖水体无机氮的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1的鉴定
本发明对净化养殖水体氨的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1进行了16SrDNA分子的鉴定,从分子水平,并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤:
1、细菌基因组DNA的提取
(1)用无菌牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养;
(2)取细菌培养液1.5mL,10000rpm(11,500g)离心1分钟,尽量吸净上清;
(3)向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA,振荡至菌体彻底悬浮,加入180μL终浓度为20mg/mL的溶菌酶,37℃处理30分钟以上;
(4)向管中加入20μL蛋白酶K溶液,混匀;
(5)加入220μL缓冲液GB,振荡15秒,70℃放置10分钟,溶液变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠;
(6)加220μL无水乙醇,充分振荡混匀15秒,简短离心以去除管盖内壁的水珠;
(7)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中),12000rpm(13,400×g)离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中;
(8)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD,12000rpm(13,400g)离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中;
(9)向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW,12000rpm(13,400g)离心30秒,倒掉废液,吸附柱CB3放入收集管中;
(10)向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW,12000rpm(13,400g)离心30秒,倒掉废液,将吸附柱CB3放入收集管中;
(11)将吸附柱CB3放回收集管中,12000rpm(13,400g)离心2分钟,倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;
(12)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μL洗脱缓冲液TE,室温放置2~5分钟,12000rpm(13,400g)离心2分钟,将溶液收集到离心管中;
(13)回收得到的DNA片段用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
2、16S rDNA基因的PCR扩增
16S rDNA的扩增所采用的细菌通用引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司公司合成,正向引物(8f)为:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物(1492r)为:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。50μL PCR反应体系包括:灭菌双蒸水37μL,引物各1μL,dNTPs(2.5mmol/L),Tap酶1μL,10×PCR buffer 5μL,DNA模板1μL。PCR反应条件:95℃3分钟,95℃1分钟,48℃1分钟,72℃2分钟,共30个循环;72℃10分钟。
3、16S rDNA序列测定
扩增结束,PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,送英潍捷基(上海)贸易有限公司公司测序。测得其序列:
4、净化养殖水体无机氮的海水硝酸盐还原菌XHNA1菌落形态、生理特征
海水硝酸盐还原菌XHNA1菌落形态、生理特征见下表1。
表1海水硝酸盐还原菌XHNA1菌落形态、生理特征
5、海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1的鉴定
将该菌16S rDNA基因序列与GenBank中已登录的基因序列进行比对分析,结果显示该菌株为海水硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)。综合16S rDNA基因序列分析、生化鉴定,以及形态特质等各项结果。认定菌株XHNA1为海水硝酸盐还原菌(Nitratireductor aquimarinus)。查阅有关资料,尚无以海水硝酸盐还原菌净化对虾池水体氨的研究报道。
该菌株的保藏名称为海水硝酸盐还原菌XHNA1,分类命名为:Nitratireductoraquimarinus XHNA1,保藏单位为:中国典型培养物保藏中心,保藏地址为:中国武汉(湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心),保藏日期为:2017年9月1日,保藏编号为:CCTCC NO:M 2017464。
实施例3菌株XHNA1对养殖水体中氨的去除效果
1、菌株的生长
将实施例1获得的菌株海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1按107CFU/mL接种至灭菌养殖池塘水中,2天左右菌量即可增长至109CFU/mL,其后3~9天期间内的菌量稳定在109CFU/mL数量水平,菌株XHNA1的生长曲线如图1中所示。
2、菌株在不同盐度养殖水体中氨的去除效果
将灭菌养殖池塘水(水体盐度25)为基础测试水体,以NH4Cl调节水体中氨的浓度至于24mg/L左右,以蒸馏水和海盐调节水体盐度为5、15、25、35、45。将实施例1获得的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1按106CFU/mL接种至实验水体中,于30℃,光照强度2500~4000lx,150~200rpm进行摇床培养4天。每天监测水体中氨浓度的变化状况。结果如图2所示,当水体盐度为25~45时,加菌组水体中氨的去除率4天可达到75%~96%;当盐度大于35时水体氨的去除率可达近90%以上,在整个监测过程中对照组(以盐度为25的测试培养体系为参照,其中未添加海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1)的氨浓度变化不大。可见,XHNA1菌株适用于盐度大于25以上的海水养殖水体中,相较而言,盐度大于30以上时,养殖海水中氨的净化效果更佳。
3、菌株在不同温度养殖水体中氨的去除效果
将灭菌养殖池塘水(水体盐度28)为基础测试水体,以NH4Cl调节水体中氨的浓度至于24mg/L左右。将实施例1获得的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1按106CFU/mL接种至实验水体中,培养温度分别设置为5℃、15℃、25℃、30℃、35℃、45℃,于光照强度2500~4000lx,150~200rpm条件下进行摇床培养4天。每天监测水体中氨浓度的变化状况。结果如图3所示,当水温为15~35℃时加菌组水体中氨的去除率4天可达到70~97%;水温15~30℃时氨的去除率在97%以上;但是当水温低于15℃或高于40℃时海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1的除氨效果受到明显抑制,在整个监测过程中对照组(以温度为30℃的测试培养体系为参照,其中未添加海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1)的氨浓度变化不大。总体而言,在养殖生产期间XHNA1菌株可适应养殖水体温度条件,具备良好的温度适应性,将其科学应用于水体调控技术环节中能有效降低水体中氨的浓度,达到优化养殖水质的效果。
实施例4菌株对养殖水体中高浓度无机氮的去除
为进一步验证该菌株对水体中无机氮的净化效果,以灭菌养殖池塘水(水体盐度25)为基础测试水体,以NaNO2和NaNO3溶液人为调高水体中亚硝酸盐和硝酸盐的浓度,把实施例1获得菌株XHNA1的菌液接种至其中,使测试水体初始菌浓度达到106CFU/mL,于光照强度2500~4000lx,温度30℃,150~200rpm条件下进行摇床培养26天。第4天后不定期监测水体中亚硝酸盐、硝酸盐和氨的浓度变化。结果如图4~6所示,培养26天后,水体中的亚硝酸盐和硝酸盐的浓度分别较第4天时下降了42%和71%以上;但水体中氨的浓度则升高了106%以上。因此,在该菌株的应用过程中应根据水体中所需净化无机氮的具体状况进而确定净化效应时间,若需净化水体中的亚硝酸盐和硝酸盐时应将该菌株的作用时间延长至20天以上,若需净化水体中的氨则需将菌株的作用时间控制在4~5天以内。
实施例5菌株对凡纳滨对虾和鲈鱼的影响
在汕尾和深圳养殖基地测试菌株对凡纳滨对虾和鲈鱼的影响。养殖水体盐度为10~15,pH7.5~8.1,溶氧6.0~6.7mg/L,温度28~32℃,水体容积为200L。实验组以106CFU/mL浓度施用该菌,对照组不加菌,每组均设3个平行。测试海鲈的初始体重为32.5±5.0g,凡纳滨对虾初始体长为6.7±0.5cm,体重为2.8±0.2g。测试周期7天。结果如图7所示,测试结束时加菌组和对照组的对虾成活率分别为91%和93%,鲈鱼分别为97%和100%。可见,在养殖水体中以106CFU/mL浓度施用该菌时,测试凡纳滨对虾和鲈鱼的7天成活率均可达到90%以上,表明其对养殖生物无明显不良影响。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内,上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明,而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上,本领域技术人员根据前文的描述,就能够根据各自需要找到不同的调整方案,这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
潮州市正诚农业科技有限公司
<120> 一种净化养殖水体无机氮的海水硝酸盐还原菌菌株XHNA1及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1355
<212> DNA
<213> 海水硝酸盐还原菌XHNA1(Nitratireductor aquimarinus XHNA1)
<400> 1
atgcaagtcg agcgccccct cgggggagcg gcagacgggt gagtaatgca tgggaatcta 60
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